JP7219387B1 - ４－（２，４－ジフルオロフェニル）－２－（１ｈ－インドール－３－イル）－４－オキソ－ブタン酸のｒ体 - Google Patents

Abstract

【課題】動物細胞内のＮＡＤ＋量を増加する作用を有し、かつ動物細胞に対する細胞毒性が低い低分子化合物の提供。【解決手段】以下の式（Ａ－１）で表される化合物又はその生理的に許容される塩。【化１】TIFF0007219387000011.tif4650【選択図】なし

Description

本発明は、４－（２，４－ジフルオロフェニル）－２－（１Ｈ－インドール－３－イル）－４－オキソ－ブタン酸（以下、「ＭＡ５」ということがある）のエナンチオマーであるＲ体又はその生理的に許容される塩；ＭＡ５のＲ体又はその生理的に許容される塩を含む、哺乳動物細胞における酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの生成促進剤（以下、「本件生成促進剤」ということがある）；ＭＡ５のＲ体又はその生理的に許容される塩を含む、ミトコンドリア病の治療剤若しくは予防剤（以下、「本件ミトコンドリア病治療／予防剤」ということがある）；ＭＡ５のＲ体又はその生理的に許容される塩を含む、加齢に伴う症状若しくは疾患の治療剤又は予防剤（以下、「本件抗加齢剤」ということがある）；等に関する。

本発明者らは、４－（２，４－ジフルオロフェニル）－２－（１Ｈ－インドール－３－イル）－４－オキソ－ブタン酸（すなわち、ＭＡ５）のラセミ体が、エリスロポエチン発現増強効果及びミトコンドリア病の治療効果（特許文献１）、臓器線維化抑制効果（特許文献２）、難聴の予防又は改善効果（特許文献３）を有することを報告している。しかしながら、ＭＡ５のエナンチオマーであるＲ体が、動物細胞内の酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ；nicotinamide adenine dinucleotide）（ＮＡＤ^＋）量を増加する作用を有することはこれまで知られていなかった。

国際公開第２０１４／０８０６４０号パンフレット 特開２０１５－１８９６７０号公報 特開２０１９－１１６４５３号公報

本発明の課題は、動物細胞内のＮＡＤ^＋量を増加する作用を有し、かつ動物細胞に対する細胞毒性が低い低分子化合物を提供することにある。

本発明は、上記課題を解決すべく鋭意研究を続けている。その過程において、動物細胞を、ＭＡ５のラセミ体の存在下で培養しても、ＭＡ５のラセミ体非存在下で培養した場合と比べ、細胞内のＮＡＤ^＋量はほとんど変わらなかったのに対して、ＭＡ５のラセミ体を、ＭＡ５のＲ体と、ＭＡ５のＳ体に分離し、それぞれの存在下で動物細胞を培養したところ、ＭＡ５のＳ体は、動物細胞におけるＮＡＤ^＋量を減少させる作用を有するのに対して、ＭＡ５のＲ体は、逆に、動物細胞におけるＮＡＤ^＋量を増加させる作用を有することを見いだした。すなわち、ＭＡ５が、見かけ上、動物細胞におけるＮＡＤ^＋の生成を促進する作用を有さないように見えたのは、ＭＡ５のＲ体とＭＡ５のＳ体が、驚いたことに互いに相反する作用を有していた結果、作用効果が相殺されたためであり、今回、光学分割することにより、その事実が初めて明らかとなった。

また、ＭＡ５のＲ体は、ＭＡ５のＳ体と比べ、生体内において毒性物質（グルクロン酸抱合体）に代謝されにくく、血中で保持されやすく、かつ動物細胞に対する細胞毒性が低いことも確認した。また、ＭＡ５のＲ体は、ＭＡ５のＳ体とは異なり、動物細胞におけるＳＩＲＴ（Sirtuin）の発現量を増加させる作用を有することも確認した。

さらに、細胞におけるミトコンドリア機能を改善する作用を有するものは、ＭＡ５のＳ体ではなく、ＭＡ５のＲ体であることも確認した。本発明は、これらの知見に基づいて完成するに至ったものである。

すなわち、本発明は、以下のとおりである。
〔１〕以下の式（Ａ－１）で表される化合物又はその生理的に許容される塩。

〔２〕上記〔１〕に記載の化合物又はその生理的に許容される塩を含む、哺乳動物細胞における酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの生成促進剤。
〔３〕上記〔１〕に記載の化合物又はその生理的に許容される塩を含む、ミトコンドリア病の治療剤若しくは予防剤。
〔４〕上記〔１〕に記載の化合物又はその生理的に許容される塩を含む、加齢に伴う症状若しくは疾患の治療剤又は予防剤。
〔５〕加齢に伴う症状若しくは疾患が難聴である、上記〔４〕に記載の治療剤又は予防剤。

また本発明の実施の他の形態として、
ＭＡ５のＲ体又はその生理的に許容される塩を、ミトコンドリア病を治療若しくは予防する必要がある動物（対象）に投与するステップを含む、ミトコンドリア病を治療又は予防する方法；
ミトコンドリア病の治療又は予防における使用のための、ＭＡ５のＲ体若しくはその生理的に許容される塩；
ミトコンドリア病の治療剤又は予防剤の製造における、ＭＡ５のＲ体若しくはその生理的に許容される塩の使用；
ＭＡ５のＲ体又はその生理的に許容される塩を、加齢に伴う症状若しくは疾患を治療又は予防する必要がある動物（対象）に投与するステップを含む、加齢に伴う症状若しくは疾患を治療又は予防する方法；
加齢に伴う症状又は疾患の治療若しくは予防における使用のための、ＭＡ５のＲ体又はその生理的に許容される塩；
加齢に伴う症状又は疾患の治療剤若しくは予防剤の製造における、ＭＡ５のＲ体若しくはその生理的に許容される塩の使用；
ＭＡ５のＲ体又はその生理的に許容される塩を、動物細胞におけるＮＡＤ^＋の生成を促進する必要がある動物（対象）に投与するステップを含む、動物（対象）細胞におけるＮＡＤ^＋の生成を促進する方法；
動物細胞を、ＭＡ５のＲ体又はその生理的に許容される塩の存在下で培養するステップを含む、動物細胞におけるＮＡＤ^＋の生成をインビトロで促進する方法（以下、「本件促進方法」ということがある）；
ＭＡ５のＲ体又はその生理的に許容される塩を含む、動物におけるミトコンドリア機能賦活剤（以下、「本件ミトコンドリア機能賦活剤」ということがある）；
ＭＡ５のＲ体又はその生理的に許容される塩を、ミトコンドリア機能を賦活する必要がある動物（対象）に投与するステップを含む、動物におけるミトコンドリア機能を賦活する方法；
ＭＡ５のＲ体又はその生理的に許容される塩を含む、動物の運動機能障害の改善剤；
ＭＡ５のＲ体又はその生理的に許容される塩を、運動機能障害を改善する必要がある動物（対象）に投与するステップを含む、動物の運動機能障害を改善する方法；
を挙げることができる。なお、本明細書において、ＭＡ５のＲ体又はその生理的に許容される塩を含む剤を、総称して「本件剤」ということがある。

本発明の化合物であるＭＡ５のＲ体は、ＭＡ５のラセミ体やＭＡ５のＳ体とは異なり、動物細胞におけるＮＡＤ^＋量を増加させる作用を有する。また、ＭＡ５のＲ体は、ＭＡ５のＳ体とは異なり、動物細胞におけるＳＩＲＴの発現量を増加させる作用を有する。さらに、ＭＡ５のＲ体は、ＭＡ５のＳ体と比べ、生体内において毒性物質（グルクロン酸抱合体）に代謝されにくく、血中で保持されやすく、かつ動物細胞に対する細胞毒性が低い。

一方、動物細胞内のＮＡＤ^＋レベルは加齢とともに低下することや、加齢に関連する疾患の発症に重要な役割を担っていることが知られている。また、ＮＡＤ^＋量を増加させると、線虫（C. elegans）においては寿命を延長し、マウスにおいては代謝性疾患に対する保護作用をもたらすことが報告されている（文献「Nature. 2018 563(7731) 354-359.」参照）。また、線虫は、ヒト老化のモデル生物として利用されている（文献「東海大学先進生命科学研究所紀要 第１巻 ２０１７年３月」参照）。

このため、ＭＡ５のＲ体を動物に投与すると、副作用などの悪影響を及ぼすことなく、動物細胞におけるＮＡＤ^＋量を増加させた結果、寿命を延長したり、加齢に伴う症状又は疾患や代謝性疾患などの症状若しくは疾患を治療又は予防できることが十分期待できる。

さらに、本発明の化合物であるＭＡ５のＲ体は、細胞におけるミトコンドリア機能を改善する作用を有することから、ミトコンドリア機能賦活剤やミトコンドリア病の治療剤又は予防剤として有用である。

ラット膵β細胞株（ＩＮＳ－１Ｅ細胞株）を、０．１％のＤＭＳＯ（図中の「０」）又は各種濃度（３ｐＭ、１０ｐＭ、３０ｐＭ、１００ｐＭ、３００ｐＭ、１ｎＭ、若しくは３ｎＭ）の３種類の化合物（ＭＡ５のラセミ体［図１Ａ］、ＭＡ５のＲ体［図１Ｂ］、若しくはＭＡ５のＳ体［図１Ｃ］）の存在下で６時間培養し、細胞内のＮＡＤ^＋量（平均値±標準偏差［ＳＥ］）を測定した結果を示す図である。図中の「＊」及び「＊＊」は、化合物非存在下の結果と比べ、統計学的に有意に増加したこと（それぞれｐ＜０．０５及びｐ＜０．０１）を示し、図中の「＃」及び「＃＃」は、０．１％のＤＭＳＯの結果と比べ、統計学的に有意に減少したこと（それぞれｐ＜０．０５及びｐ＜０．０１）を示す。 ヒト肝ミクロソームを、３種類の化合物（ＭＡ５のラセミ体［図中の「racemi」］、ＭＡ５のＲ体［図中の「Ｒ」］、若しくはＭＡ５のＳ体［図中の「Ｓ」］）の存在下、又はこれら化合物の非存在下（図中の「Ｃｏｎｔｒｏｌ」）でインキュベートし、生成された代謝物を質量分析法により解析した結果を示す図である。 ヒト膀胱上皮由来細胞株（ＨＢｌＥｐＣ細胞株）を、０．１％のＤＭＳＯ（図中の「０」）又は各種濃度（３０ｎＭ、１００ｎＭ、３００ｎＭ、１μＭ、３μＭ、１０μＭ、３０μＭ、１００μＭ、３００μＭ、又は１ｍＭ）の３種類の化合物（ＭＡ５のラセミ体［図３Ａ］、ＭＡ５のＲ体［図３Ｂ］、若しくはＭＡ５のＳ体［図３Ｃ］）の存在下で培養し、生細胞レベル（平均値±ＳＥ）を解析した結果を示す図である。縦軸の「生細胞レベル」は、ＷＳＴ－８アッセイにより波長４５０ｎｍにおける光学密度（ＯＤ_４５０）を測定した値を示す。図中の「＊」及び「＊＊」は、０．１％のＤＭＳＯの結果と比べ、統計学的に有意差があること（それぞれｐ＜０．０５及びｐ＜０．０１）を示す。 リー脳症患者由来線維芽細胞株（ＭＴ-ＮＤ３変異細胞株）を、０．１％のＤＭＳＯ（図中の「０」）、又は各種濃度（０．００３μＭ、０．０１μＭ、０．０３μＭ、０．１μＭ、０．３μＭ、１μＭ、３μＭ、１０μＭ、３０μＭ、又は１００μＭ）のＭＡ５の各エナンチオマー（Ｒ体［図中の「Ｒ」］又はＳ体［図中の「Ｓ」］）の存在下で培養し、生細胞レベル（平均値±ＳＥ）を測定した結果を示す図である。図中の「＊」は、０．１％のＤＭＳＯの結果と比べ、統計学的に有意差があること（ｐ＜０．０５）を示す。 ＭＴ-ＮＤ３変異細胞株を、０．１％のＤＭＳＯ（図中の０」）又は各種濃度（０．１μＭ又は１μＭ）の３種類の化合物（ＭＡ５のラセミ体［図中の「racemi」］、ＭＡ５のＲ体［図中の「Ｒ」］、若しくはＭＡ５のＳ体［図中の「Ｓ」］）の存在下で培養し、培養液中に産生されたＡＴＰ量を測定した結果を示す図である。図中の「＊」は、０．１％のＤＭＳＯの結果と比べ、統計学的に有意差があること（ｐ＜０．０５）を示す。 ｃｃＩｓ４２５１の野生型線虫（図中の「ＷＴ」；ｎ＝１８）、あるいは、４種類の物質（ＤＭＳＯ又は１０μＭのＭＡ５のラセミ体、ＭＡ５のＲ体、若しくはＭＡ５のＳ体）の存在下で飼育したimmt-1／mitofilin変異体（それぞれ、図中の「immt-1／mitofilin変異体 mock」；ｎ＝４１、「immt-1／mitofilin変異体 ＭＡ－５（racemi）」；ｎ＝３７、「immt-1／mitofilin変異体 ＭＡ－５ R」；ｎ＝６１、及び「immt-1／mitofilin変異体 ＭＡ－５ S」；ｎ＝３４）について、体壁筋細胞におけるミトコンドリアの蛍光画像である。 図６の蛍光画像を基に、体壁筋細胞におけるミトコンドリアの膨潤（swelling）レベルを解析した結果を示す図である。 図６の蛍光画像を基に、体壁筋細胞におけるミトコンドリアのswellingレベルを解析した結果を示す図である。図中の「ａ」及び「ｂ」の間では、統計的な有意差があること（ｐ＜０．０５）を示す。図中の「×」は平均値を示し、図中の「〇」は外れ値を示す。 ＭＡ５のＲ体及びＭＡ５のＳ体を、それぞれカニクイザルに経口投与し、投与後の血漿中におけるＭＡ５のＲ体及びＭＡ５のＳ体の濃度を測定した結果を示す図である。 ＭＡ５のＲ体及びＭＡ５のＳ体を、それぞれカニクイザルに経口投与し、投与後の血漿中におけるＭＡ５の還元代謝物（式（Ｂ）で表される化合物［以下、「Ｒｅｄ－ＭＡ５」ともいう］）の濃度を測定した結果を示す図である。 リー脳症患者由来線維芽細胞株（ＫＣＭＣ１０細胞株）を、０．１％のＤＭＳＯ（図中の「０」）、又は各種濃度（３ｎＭ、１０ｎＭ、３０ｎＭ、１００ｎＭ、３００ｎＭ、１μＭ、３μＭ、１０μＭ、又は３０μＭ）の２種類の化合物（ＭＡ５のラセミ体［図１１Ａ］又はＲｅｄ－ＭＡ５［図１１Ｂ］）の存在下で培養し、生細胞レベル（平均値±ＳＥ）を測定した結果を示す図である。図中の「＊」は、０．１％のＤＭＳＯの結果と比べ、統計学的に有意差があること（ｐ＜０．０５）を示す。 マウス内耳細胞株（ＨＥＩ－ＯＣ１細胞株）を、０．１％のＤＭＳＯ、又は各種濃度（１μＭ、３μＭ、１０μＭ、又は３０μＭ）のＭＡ５のラセミ体の存在下で培養し、細胞内の各種ＳＩＲＴ（ＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ２のアイソフォーム１、ＳＩＲＴ２のアイソフォーム２、及びＳＩＲＴ３）の発現レベルを、ウエスタンブロット法により解析した結果を示す図である。下のグラフは、上の結果における各バンド強度を、コントロールである０．１％のＤＭＳＯにおけるバンド強度を１としたときの相対値で表した結果である。 ＨＥＩ－ＯＣ１細胞株を、０．１％のＤＭＳＯ、又は各種濃度（１μＭ、３μＭ、１０μＭ、又は３０μＭ）のＭＡ５のラセミ体の存在下で培養し、細胞内の各種ＳＩＲＴ（ＳＩＲＴ５、ＳＩＲＴ６、及びＳＩＲＴ７）の発現量及びβ－アクチンの発現量（図１３Ｄ）を、ウエスタンブロット法により解析した結果を示す図である。下のグラフは、上の結果における各バンド強度を、コントロールである０．１％のＤＭＳＯにおけるバンド強度を１としたときの相対値で表した結果である。 ＨＥＩ－ＯＣ１細胞株を、０．１％のＤＭＳＯ、又は各種濃度（１μＭ、３μＭ、１０μＭ、又は３０μＭ）のＭＡ５のＲ体の存在下で培養し、細胞内の各種ＳＩＲＴ（ＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ２のアイソフォーム１、ＳＩＲＴ２のアイソフォーム２、及びＳＩＲＴ３）の発現レベルを、ウエスタンブロット法により解析した結果を示す図である。下のグラフは、上の結果における各バンド強度を、コントロールである０．１％のＤＭＳＯにおけるバンド強度を１としたときの相対値で表した結果である。 ＨＥＩ－ＯＣ１細胞株を、０．１％のＤＭＳＯ、又は各種濃度（１μＭ、３μＭ、１０μＭ、又は３０μＭ）のＭＡ５のＲ体の存在下で培養し、細胞内の各種ＳＩＲＴ（ＳＩＲＴ５、ＳＩＲＴ６、及びＳＩＲＴ７）の発現量及びβ－アクチンの発現量を、ウエスタンブロット法により解析した結果を示す図である。下のグラフは、上の結果における各バンド強度を、コントロールである０．１％のＤＭＳＯにおけるバンド強度を１としたときの相対値で表した結果である。 ＨＥＩ－ＯＣ１細胞株を、０．１％のＤＭＳＯ、又は各種濃度（１μＭ、３μＭ、１０μＭ、又は３０μＭ）のＭＡ５のＳ体の存在下で培養し、細胞内の各種ＳＩＲＴ（ＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ２のアイソフォーム１、ＳＩＲＴ２のアイソフォーム２、及びＳＩＲＴ３）の発現レベルを、ウエスタンブロット法により解析した結果を示す図である。下のグラフは、上の結果における各バンド強度を、コントロールである０．１％のＤＭＳＯにおけるバンド強度を１としたときの相対値で表した結果である。 ＨＥＩ－ＯＣ１細胞株を、０．１％のＤＭＳＯ、又は各種濃度（１μＭ、３μＭ、１０μＭ、又は３０μＭ）のＭＡ５のＳ体の存在下で培養し、細胞内の各種ＳＩＲＴ（ＳＩＲＴ５、ＳＩＲＴ６、及びＳＩＲＴ７）の発現量及びβ－アクチンの発現量を、ウエスタンブロット法により解析した結果を示す図である。下のグラフは、上の結果における各バンド強度を、コントロールである０．１％のＤＭＳＯにおけるバンド強度を１としたときの相対値で表した結果である。

本発明の化合物は、以下の式（Ａ－１）で表される化合物（すなわち、以下の式（Ａ）で表される化合物（４－（２，４－ジフルオロフェニル）－２－（１Ｈ－インドール－３－イル）－４－オキソ－ブタン酸のエナンチオマーであるＲ体）又はその生理的に許容される塩である。

本明細書において、「生理的に許容される塩」とは、妥当な医学的、薬学的、又は生物学的判断の範囲内で、動物の組織と接触して用いるのに、過度の毒性、刺激性、アレルギー応答、及びその他の問題や合併症を伴うことなく、適度な受益性／危険性比率に相応して適している塩を意味する。生理的に許容される塩としては、例えば、アンモニウム塩；ナトリウム塩、リチウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩；アルミニウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩；ジシクロヘキシルアミン塩、Ｎ－メチル－Ｄ－グルカミン等の有機塩基との塩；アルギニン、リシン、オルニチン等のアミノ酸との塩；塩基性窒素含有基により生じる塩；などを挙げることができる。

本発明における式（Ａ－１）で表される化合物は、公知の有機化学反応を用いる有機合成手法、例えば、後述する実施例における「１．ＭＡ５のＲ体の生成」の項目に記載の方法に従って得ることができる。

本件生成促進剤は、「動物細胞におけるＮＡＤ^＋の生成を促進するため」という用途に特定された、ＭＡ５のＲ体又はその生理的に許容される塩を含有する剤である。また、本件ミトコンドリア病治療／予防剤は、「ミトコンドリア病を治療又は予防するため」という用途に特定された、ＭＡ５のＲ体又はその生理的に許容される塩を含有する剤である。また、本件抗加齢剤は、「加齢に伴う症状又は疾患を治療若しくは予防するため」という用途に特定された、ＭＡ５のＲ体又はその生理的に許容される塩を含有する剤である。また、また、本件ミトコンドリア機能賦活剤は、「動物におけるミトコンドリア機能を賦活（化）するため」という用途に特定された、ＭＡ５のＲ体又はその生理的に許容される塩を含有する剤である。本件剤は、有効成分であるＭＡ５のＲ体又はその生理的に許容される塩を、単独で飲食品又は医薬品（製剤）として使用してもよいし、さらに添加剤を混合し、組成物の形態（飲食品組成物又は医薬組成物）として使用してもよい。例えば、本件剤は、実質的にＭＡ５のＳ体又はその生理的に許容される塩を含まない、ＭＡ５のＲ体又はその生理的に許容される塩を有効成分としてなる、医薬組成物、又は飲食品組成物であり、実質的にＭＡ５のＳ体又はその生理的に許容される塩を含まない、ＭＡ５のＲ体又はその生理的に許容される塩を含有する医薬組成物、又は飲食品組成物である。かかる飲食品としては、例えば、健康食品（機能性食品、栄養補助食品、健康補助食品、栄養強化食品、栄養調整食品、サプリメント等）、保健機能食品（特定保健用食品、栄養機能食品、機能性表示食品等）を挙げることができる。

本明細書において、動物としては、哺乳類（ヒト又は非ヒト哺乳動物）、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、無脊椎動物等を挙げることができる。また、動物の他の態様として、ヒト、家畜を挙げることができる。ここで「家畜」とは、ヒトが飼育し、繁殖させた動物を意味する。かかる家畜としては、非ヒト哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類；ウサギ等のウサギ目；ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ等の有蹄目；イヌ、ネコ等のネコ目など）、鳥類（例えば、ニワトリ、ウズラ、シチメンチョウ、ハト、アヒル、ガチョウ等）、魚類（例えば、コイ、キンギョ等）、無脊椎動物（例えば、カイコ、ミツバチ等）などを例示することができる。

本件剤の添加剤としては、生理的に許容される通常の担体、結合剤、安定化剤、賦形剤、希釈剤、ｐＨ緩衝剤、崩壊剤、等張剤、添加剤、被覆剤、可溶化剤、潤滑剤、滑走剤、溶解補助剤、滑沢剤、風味剤、甘味剤、溶剤、ゲル化剤、栄養剤等の配合成分を例示することができる。かかる配合成分としては、具体的に、水、生理食塩水、動物性脂肪及び油、植物油、乳糖、デンプン、ゼラチン、結晶性セルロース、ガム、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリアルキレングリコール、ポリビニルアルコール、グリセリンを例示することができる。

本件生成促進剤の投与対象としては、動物細胞におけるＮＡＤ^＋の生成を促進する必要がある動物（対象）であればよく、また、本件ミトコンドリア病治療／予防剤の投与対象としては、ミトコンドリア病を治療若しくは予防する必要がある動物（対象）であればよく、また、本件抗加齢剤の投与対象としては、加齢に伴う症状若しくは疾患を治療又は予防する必要がある動物（対象）であればよく、また、本件ミトコンドリア機能賦活剤の投与対象としては、ミトコンドリア機能を賦活する必要がある動物（対象）であればよい。

上記「ミトコンドリア病」としては、細胞核ＤＮＡやミトコンドリアＤＮＡにおける遺伝子変異等により、ＡＴＰ産生、アポトーシスの調節、カルシウムイオンや鉄の細胞内濃度の調節等のミトコンドリア機能が低下することが原因の症状であればよく、具体的にはＣＰＥＯ（慢性進行性外眼麻痺症候群）、ＭＥＬＡＳ（メラス：脳筋症・乳酸アシドーシス・脳卒中様症候群）、ＭＥＲＲＦ（マーフ：赤色ぼろ線維・ミオクローヌスてんかん症候群）、Ｌｅｉｇｈ脳症（リー脳症：亜急性壊死性脳脊髄症）、Ｌｅｂｅｒ病（レーバー病:レーバー遺伝性視神経症［ＬＨＯＮ］）、カーンズ・セイヤー症候群（ＫＳＳ）、バース症候群、Ｐｅａｒｓｏｎ病（ピアソン病）、フリードライヒ失調症（ＦＲＤＡ）を挙げることができる。

上記「加齢に伴う症状若又は疾患」としては、例えば、薄毛又は脱毛（より具体的には、加齢性薄毛又は脱毛）、難聴（より具体的には、加齢性難聴）、視力障害（より具体的には、加齢性視力障害）、貧血（より具体的には、加齢性貧血）、筋力低下（より具体的には、加齢性筋力低下）、寿命短縮（より具体的には、加齢性寿命短縮）等を挙げることができる。

本明細書において、「動物細胞におけるＮＡＤ^＋の生成を促進する必要がある動物（対象）」としては、例えば、寿命を延長する必要がある対象（長寿を必要とする対象）；神経疾患（パーキンソン、うつ、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症［ＡＬＳ］など）患者；循環器疾患（心不全、不整脈など）患者；筋肉疾患（サルコペニア、封入体筋炎、筋ジストロフィーなど）患者；腎疾患（慢性腎臓病、腎不全、糖尿病性腎症、腎炎など）患者；代謝性疾患（糖尿病、肝機能障害、アルコール性肝障害、非アルコール性脂肪性肝疾患［ＮＡＦＬＤ；non-alcoholic fatty liver disease］）、非アルコール性脂肪肝炎［ＮＡＳＨ；non-alcoholic steatohepatitis］、甲状腺・副腎疾患など）患者；消化器系疾患（炎症性腸疾患など）患者；癌患者；加齢に伴う症状又は疾患（薄毛又は脱毛、難聴、視力障害、貧血、筋力低下、寿命短縮など）患者；放射線障害患者；等を挙げることができる。本件生成促進剤をこれら対象に投与すると、これら対象の細胞におけるＮＡＤ^＋の生成が促進した結果、寿命を延長したり、上記疾患や障害を予防又は治療することができる。

本明細書において、「ミトコンドリア機能を賦活する必要がある動物（対象）」としては、例えば、ミトコンドリア機能の減弱又は不全に関連する若しくは起因する疾患に罹患した患者を挙げることができ、具体的には、糖尿病、ミトコンドリア病、脳疾患などに罹患した患者を挙げることができる。

本件剤の投与形態としては、粉末、顆粒、錠剤、カプセル剤、シロップ剤、懸濁液などの剤型で投与する経口投与や、溶液、乳剤、懸濁液などの剤型を注射（例えば、皮下注射、静脈内注射、筋肉内注射）、又はスプレー剤の型で鼻孔内投与する非経口投与を挙げることができる。

本件剤におけるＭＡ５のＲ体又はその生理的に許容される塩の投与量は、年齢、体重、性別、症状、薬剤への感受性等に応じて適宜決定され、例えば、１μｇ～２００ｍｇ／ｋｇ（体重）／日の投与量の範囲である。なお、本件剤は、一日あたり単回又は複数回（例えば、２～４回）に分けて投与することができる。本件剤には、ＭＡ５のＳ体又はその生理的に許容される塩をさらに含むものであってもよいが、その効果を効果的に発揮する観点から、含まないものが好ましい。

本件促進方法における動物細胞の培養温度は、通常３０～４０℃の範囲内であり、好ましくは約３７℃（３６～３８℃）である。また、培養時のＣＯ_２濃度は、通常約１～１０％の範囲内であり、好ましくは約５％（４～６％）である。また、培養時のＯ_２濃度は、通常約１０～４０％の範囲内であり、好ましくは約２１％（２０～２２％）である。

本件促進方法において、動物細胞を培養するときに使用する培養液としては、例えば、血清含有又は無血清培養液、生理食塩水、リン酸緩衝化生理食塩水、トリス緩衝化生理食塩水、ＨＥＰＥＳ緩衝化生理食塩水、リンゲル液（乳酸リンゲル液、酢酸リンゲル液、重炭酸リンゲル液等）、５％グルコース水溶液等の生理的水溶液を挙げることができ、ここで血清含有培養液としては、０．１～３０（ｖ／ｖ）％の血清（ウシ胎児血清［Fetal bovine serum；ＦＢＳ］、子牛血清［Calf bovineserum；ＣＳ］等）を含有する哺乳動物細胞培養用培養液（ＤＭＥＭ、ＥＭＥＭ、ＩＭＤＭ、ＲＰＭＩ－１６４０、αＭＥＭ、Ｆ－１２、Ｆ－１０、Ｍ－１９９、ＡＩＭ－Ｖ等）を挙げることができ、また、上記無血清培養液としては、市販のＢ２７サプリメント（－インスリン）（Life Technologies社製）、Ｎ２サプリメント（Life Technologies社製）、Ｂ２７サプリメント（Life Technologies社製）、Knockout Serum Replacement（Invitrogen社製）等の血清代替物を適量（例えば、１～３０％）添加した上記哺乳動物細胞培養用培養液などを挙げることができる。

以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。なお、ＩＮＳ－１Ｅ細胞株は、１１．１ｍＭグルコース、１０％ ＦＢＳ、１ｍＭ ピルビン酸ナトリウム、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２ｍＭ グルタミン、５０μＭ βメルカプトエタノール、１００Ｕ／ｍＬ ペニシリン、及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシを含むＲＰＭＩ－１６４０培養液（GIBCO社製）（以下、単に「ＲＰＭＩ－１６４０培養液」という）の存在下、インキュベーター（３７℃、２１％Ｏ_２、５％ＣＯ_２）内で培養した。また、リー脳症患者由来線維芽細胞株（ＭＴ-ＮＤ３変異細胞株［Leigh synd., m.10191 T>C〔p.Ser45Pro〕］）は、１％ ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ低グルコース（GIBCO社製）培養液（以下、「ＤＭＥＭ低グルコース培養液」という）の存在下、上記インキュベーター内で培養した。また、ＨＢｌＥｐＣ細胞株は、１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬ ペニシリン、１００μｇ／ｍＬ ストレプトマイシ、及びHBlEpC Growth Supplement（Cell Application社製）を含むHuman Bladder Epithelial Cell Basal medium（Cell Application社製）培養液（以下、「ＨＢｌＥｐＣ培養液」という）の存在下、上記インキュベーター内で培養した。

１．ＭＡ５のＲ体の生成
１－１ トランス－４－（２，４－ジフルオロフェニル）－４－オキソ－２－ブテン酸の生成

５０ｍＬ丸底フラスコに窒素充填下で１，３－ジフルオロベンゼン（０．５１ｇ，４．４７ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（２０ｍＬ）に溶解させ、無水マレイン酸（０．４３ｇ，４．４６ｍｍｏｌ）と塩化アルミニウム（１．２０ｇ，９．０１ｍｍｏｌ）を加え、室温で４時間攪拌した。反応液に１Ｎ塩酸（１０ｍＬ）を加えｐＨ１にして酢酸エチル（４０ｍＬ）で３回抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで脱水した。溶媒を減圧留去した後、ベンゼンで再結晶で精製を行いトランス－４－（２，４－ジフルオロフェニル）－４－オキソ－２－ブテン酸を得た。（０．５７ｇ，収率５６％）：融点１１４．８－１１９．６℃；^１Ｈ ＮＭＲ（アセトン－ｄ_６）：δ ７．９８（ｍ，１Ｈ），７．７１（ｄｄ，Ｊ_Ｈ－Ｆ＝１５．６，３．４Ｈｚ，１Ｈ），７．２３（ｍ，２Ｈ），６．７５（ｄｄ，Ｊ_Ｈ－Ｆ＝１５．６，１．２Ｈｚ，１Ｈ）；^１３Ｃ ＮＭＲ（アセトン－ｄ_６）：δ １８７．２（ｄ，Ｊ_Ｃ－Ｆ＝２．６Ｈｚ），１６６．９（ｄｄ，Ｊ_Ｃ－Ｆ＝２５４．５，１２．３Ｈｚ），１６６．４，１６３．４（ｄｄ，Ｊ_Ｃ－Ｆ＝２５４．５，１２．９Ｈｚ），１４０．０（ｄ，Ｊ_Ｃ－Ｆ＝６．１Ｈｚ），１３４．０（ｄｄ，Ｊ_Ｃ－Ｆ＝１０．９，３．６Ｈｚ），１３３．０（ｄ，Ｊ_Ｃ－Ｆ＝１．６Ｈｚ），１２３．３（ｄｄ，Ｊ_Ｃ－Ｆ＝１２．４，３．６Ｈｚ），１１３．４（ｄｄ，Ｊ_Ｃ－Ｆ＝２１．５，３．６Ｈｚ），１０５．８（ｄｄ，Ｊ_Ｃ－Ｆ＝２７．３，２６．３Ｈｚ）；ＩＲ（ｎｅａｔ）：２９１７，１６９７，１６６１ｃｍ^－１；ＦＡＢ－ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ^＋］ｃａｌｃｄ ｆｏｒ ２１３（Ｃ_１１Ｈ_１０Ｏ_３），ｆｏｕｎｄ ２１３．

１－２ ＭＡ５のラセミ体の生成

３０ｍＬ丸底フラスコにトランス－４－（２，４－ジフルオロフェニル）－４－オキソ－２－ブテン酸（０．３９ｇ，１．８４ｍｍｏｌ）をベンゼン（１０ｍＬ）で溶解させ、インドール（０．２６ｇ，２．１９ｍｍｏｌ）を加えて、８０℃で８時間撹拌し、室温になるまで攪拌した。反応液を減圧留去し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝２０：１）を用いて精製を行い４－（２，４－ジフルオロフェニル）－２－（１Ｈ－インドール－３－イル）－４－オキソ－ブタン酸（ＭＡ５のラセミ体）（表１参照）を得た。（０．３０ｇ，収率５１％）：融点１８０．２－１８４．６℃；^１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ－ｄ_６）：δ ７．９８（ｍ，１Ｈ），７．６５（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，１Ｈ），７．３７（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），７．４２（ｍ，１Ｈ），７．２８（ｄ，Ｊ＝２．３Ｈｚ，１Ｈ），７．２４（ｍ，１Ｈ），７．０９（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，１Ｈ），７．０１（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），４．３４（ｄｄ，Ｊ＝１０．５，３．５Ｈｚ，１Ｈ），３．９０（ｄｄｄ，Ｊ_Ｈ－Ｆ＝１８．５，１０．６，２．４Ｈｚ，１Ｈ），３．３０（ｄｄｄ，Ｊ_Ｈ－Ｆ＝１８．５，６．１，３．５Ｈｚ，１Ｈ）；^１３Ｃ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ－ｄ_６）：δ １９５．２（ｄ，Ｊ_Ｃ－Ｆ＝４．１Ｈｚ），１７４．８，１６５．２（ｄ，Ｊ_Ｃ－Ｆ＝２５３．０，１３．４Ｈｚ），１６２．２（ｄ，Ｊ_Ｃ－Ｆ＝２５５．５，１３．４Ｈｚ），１３６．４，１３２．７（ｄｄ，Ｊ_Ｃ－Ｆ＝１０．８，４．１Ｈｚ），１２６．３，１２３．３，１２２．２（ｄｄ，Ｊ_Ｃ－Ｆ＝１２．３，３．６Ｈｚ），１２１．４，１１９．１，１１８．８，１１２．６（ｄｄ，Ｊ_Ｃ－Ｆ＝２１．１，３．６Ｈｚ），１１１．９，１１１．８，１０５．４（ｄｄ，Ｊ_Ｃ－Ｆ＝２６．１Ｈｚ），４５．６（ｄ，Ｊ_Ｃ－Ｆ＝６．３Ｈｚ），３７．９；ＩＲ（ｎｅａｔ）：３３８２，２９１９，１６７８ｃｍ^－１；ＨＲＦＡＢ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］^＋ｃａｌｃｄ ｆｏｒ ３３２．１０３６（Ｃ_１９Ｈ_１７ＮＯ_３），ｆｏｕｎｄ ３１２．１０２８．

１－３ ＭＡ５のＲ体の分取
合成したＭＡ５のラセミ体からＭＡ５のＲ体の分取は、分取装置LC-Forte（ワイエムシィ社製）を用いて行った。また、分取カラ厶は、CHIRALPAK AD-H（カラム内径２ｃｍ、カラム長さ２５ｃｍ、ダイセル社製)を用いた。Ａ液（０．０５％ＴＦＡ／ヘキサン）、Ｂ液（０．０５％ＴＦＡ／２－プロパノール）、Ａ液／Ｂ液＝６０／４０の単一組成の移動相によって、流速１０ｍＬ／分で４０分かけて溶出させた。なお、移動相の流速は２０ｍＬ／分で行うこともでき、溶出時間は半分の２０分にすることも可能である。ＭＡ５の検出波長は２２０ｎｍに設定した。ＭＡ５のＲ体及びＳ体（表１参照）の保持時間は、それぞれ１７．３分及び２９．８分（流速１０ｍＬ／分）であった。カラム分離により、ＭＡ５のＲ体を光学純度１００％で得た。

２．動物細胞内のＮＡＤ^＋量の評価
動物細胞内のＮＡＤ^＋量に及ぼすＭＡ５のＲ体の影響を調べるために、以下の「２－１」の項目に記載の方法に従って解析した。

２－１ 方法
リジンコートした９６ウェルプレートに、１ウェルあたり２×１０^４個のＩＮＳ－１Ｅ細胞株（文献「Drug Metab. Pharmacokinet. 25 (3): 274-282 (2010).」参照）を播種し、ＲＰＭＩ－１６４０培養液の存在下で４８時間培養後、培養液を除去し、化合物の溶媒である０．１％のＤＭＳＯを含むＲＰＭＩ－１６４０培養液、又は各種濃度（３ｐＭ、１０ｐＭ、３０ｐＭ、１００ｐＭ、３００ｐＭ、１ｎＭ、若しくは３ｎＭ）の３種類の化合物（ＭＡ５のラセミ体、ＭＡ５のＲ体、若しくはＭＡ５のＳ体）を含むＲＰＭＩ－１６４０培養液を、それぞれ１００μＬずつ添加し、６時間培養した。その後、NAD/NADH-Glo Assay（G9071、Promega社製）を用いて、細胞内のＮＡＤ^＋量を測定した。

２－２ 結果
ＩＮＳ－１Ｅ細胞株を、ＭＡ５のラセミ体の存在下で培養しても、ＭＡ５のラセミ体非存在下で培養した場合と比べ、細胞内のＮＡＤ^＋量はほとんど変わらなかった（図１Ａ参照）。一方、ＩＮＳ－１Ｅ細胞株を、ＭＡ５のＳ体の存在下で培養すると、ＭＡ５のＳ体非存在下で培養した場合と比べ、細胞内のＮＡＤ^＋量が培養時間依存的に減少した（図１Ｃ参照）。また、ＩＮＳ－１Ｅ細胞株を、ＭＡ５のＲ体の存在下で培養すると、ＭＡ５のＲ体非存在下で培養した場合と比べ、細胞内のＮＡＤ^＋量が培養時間依存的に増加した（図１Ｂ参照）。

これらの結果は、ＭＡ５のＳ体は、動物細胞内のＮＡＤ^＋量を減少させる作用を有するのに対して、ＭＡ５のＲ体は、逆に、動物細胞内のＮＡＤ^＋量を増加させる作用（すなわち、動物細胞におけるＮＡＤ^＋の生成を促進する作用）を有することを示している。

３．生体内への投与試験１
ＭＡ５のＲ体を生体内に投与したとき、キラル反転（コンバージョン）が起こるかどうかと、血漿中のＭＡ５のＲ体の濃度の推移について、以下の「３－１」の項目に記載の方法に従って解析した。

３－１ 方法
ＭＡ５の各エナンチオマー（Ｒ体又はＳ体）を、生理食塩水と０．１Ｎの水酸化ナトリウムの混合液（９：１）に溶解させ、０．２２μｍのフィルターを用いてろ過滅菌を行い、２ｍＬ／ｋｇのＭＡ５の各エナンチオマーを含む液を調製した。次いで、４～５歳齢の雄性カニクイザル３匹に、それぞれ、ＭＡ５の各エナンチオマーを含む液を、１ｍｇ／ｋｇの用量で単回静脈内投与した。なお、コントロールとしてＭＡ５の各エナンチオマーを含まない液も同様に投与した。投与後５分、１５分、３０分、１時間、２時間、４時間、６時間、及び２４時間に採決を行い、血漿を採取し、血漿における、ＭＡ５の各エナンチオマーの濃度を、ＬＣ―ＭＳ／ＭＳ（液体クロマトグラフィー/タンデム質量分析法 (liquid chromatography/tandem mass spectrometry)により測定し、血中濃度－時間曲線下面積（ＡＵＣ）（μｇ・ｈｒ／ｍＬ）を算出した。ＬＣ―ＭＳ／ＭＳの分析条件は、以下のとおりである。

イオン化部として、ＥＳＩプローブを装着した三連四重極型質量分析（TSQ Quantum Ultra、Thermo Fisher Scientific社製）に高速液体クロマトグラフとしてNANOSPACESI-2（Osaka soda社製）を接続した装置を使用した。分析対象物質であるＭＡ５のＲ体（（Ｒ）－ＭＡ５）及びＭＡ５のＳ体（（Ｓ）－ＭＡ５）に対し、それぞれの安定同位体である（Ｒ）－ＭＡ５－ｄ_６及び（Ｓ）－ＭＡ５－ｄ_６用いた内部標準法で定量解析を行った。分析カラムにはCHIRALPAK AD-3R（150 x 2.1 mm i.d., 3.0 μm particle size、ダイセル社製）を、ガードカラムにはCAPCELL C8UG120（10 x 2.0 mm i.d., 5.0 μmparticlesize、Osaka soda社製）を使用した。カラムオーブン温度は３５℃とした。移動相は、ギ酸／水（０．１／１００［ｖ／ｖ］)（Ａ液）／アセトニトリル（Ｂ液）を用い、流速は２００μＬ／分とした。Ａ液／Ｂ液（５７／４３［ｖ／ｖ］）の単一組成により溶出させるアイソクラティック条件で測定を行った。分析時間９．５分までＡ液／Ｂ液（５７／４３［ｖ／ｖ］）とし、分析時間９．７分でＡ液／Ｂ液（１０／９０［ｖ／ｖ］）とした。また、分析時間９．７分～１１．７分は、Ａ液／Ｂ液（１０／９０［ｖ／ｖ］）にてカラムの洗浄を行う系を組み込み、１１．８分～１５分は、Ａ液／Ｂ液（５７／４３［ｖ／ｖ］）でカラムの平衡化を行った。保持時間は、（Ｒ）－ＭＡ５が６．９５分、（Ｒ）－ＭＡ５－ｄ_６が６．８０分、（Ｓ）－ＭＡ５が８．６９分、（Ｓ）－ＭＡ５－ｄ_６が８．５６分であった。

ＭＳ条件は、ネガティブイオンモードで検出し、spray voltage、vaporizer temperature、及びion transfer tubetemperatureを、それぞれ２．５ｋＶ、２５０℃、及び２５０℃に設定した。プリカーサーイオン＞プロダクトイオンのＳＲＭチャネルは、ＭＡ５については「m/z 328.0＞116.2」に設定し、ＭＡ５－ｄ_６については、「m/z 334.0＞121.1」に設定した。プロダクトイオンを生成させるためのcollision energyは、ＭＡ５については１２ｅＶに設定し、ＭＡ５－ｄ_６については１７ｅＶに設定した。波形解析及び内部標準法による定量計算は、Xcalibur（Thermo Fisher Scientific社製）により行った。

３－２ 結果
ＭＡ５のＲ体を投与直後（投与後５分）から、血液中のＭＡ５のＲ体が消失する投与後２４時間までの間、ＭＡ５のＳ体は検出されず、ＭＡ５のＲ体のみが検出された。この結果は、ＭＡ５のＲ体は、生体内においてキラルコンバージョンを起こさないことを示している。

また、ＭＡ５のＳ体を投与したときのＡＵＣ値は、１２（μｇ・ｈｒ／ｍＬ）であったのに対して、ＭＡ５のＲ体を投与したときのＡＵＣ値は、３０（μｇ・ｈｒ／ｍＬ）であった（表２参照）。この結果は、ＭＡ５のＲ体が、ＭＡ５のＳ体よりも２．５倍以上血中で保持されやすいことを示しており、ＭＡ５のＲ体の投与量を、ＭＡ５のＳ体よりも少なくできることを示唆している。

４．ヒト肝ミクロソームを用いた代謝試験
生体内において、ＭＡ５のＲ体が、ＭＡ５のＳ体よりも血中で保持されやすかったことから、ＭＡ５の各エナンチオマーについて、代謝率に違いがあるかどうかを、以下の「４－１」の項目に記載の方法に従って解析した。

４－１ 方法
ＭＡ５のＲ体又はＳ体を、アセトニトリル（ＬＣ－ＭＳ用、関東化学社製）に溶解し、それぞれ１０ｍＭに調整した。スクロース（富士フイルム和光純薬社製）８５５ｍｇを、水１０ｍＬに溶解し、２５０ｍＭのスクロース溶液を調整した後、かかる溶液を用いて、２０ｍｇ／ｍＬのヒト肝ミクロソーム（8-donor-pool、Sekisui XenoTech社製）含有液を４倍希釈し、５ｍｇ／ｍＬのヒト肝ミクロソーム懸濁液を調整した。１ｍＬチューブにて、ヒト肝ミクロソーム懸濁液５０μＬに、５μＬの３種類の被験液（１０ｍＭのＭＡ５のＲ体を含むスクロース溶液、１０ｍＭのＭＡ５のＳ体を含むスクロース溶液、又はコントロールであるVehicle［スクロース溶液］）と、５μＬのNADPH RegeneratingSystem Solution B（Corning社製）、１００μＬのUGT Reaction Mix Solution B（Corning社製）、及び２７５μＬの水とを加え、３０秒震盪し、３７℃で５分間プレインキュベートした。その後、２５μＬのNADPH Regenerating System Solution A（Corning社製）及び４０μＬのUGT Reaction Mix Solution A（Corning社製）を加え、３０秒震盪し、３７℃で１時間インキュベートした。０．１％のギ酸を含む氷冷アセトニトリル溶液５００μＬを加えて反応を停止し、３０秒震盪、１０分超音波処理した後、２０，０００×ｇ、４℃で１０分間遠心処理した。新しい１ｍＬチューブに上清５０μＬを回収し、２，０００ｒｐｍ、室温（２５～３５℃）で３０分間遠心濃縮し、－８０℃で凍結した。これを凍結乾燥機で３０分間乾燥し、０．１％のギ酸を含む２０％メタノール（ＬＣ－ＭＳ用、関東化学社製）２５μＬにて再溶解の後、そのうち２μＬをＬＣ／ＨＲＭＳに付した。なお、サンプル数はｎ＝３で実施し、可能な限り氷上で操作を行った。

ＬＣ／ＨＲＭＳ測定
ＬＣ装置としてNanospace si-2（Osakasoda社製）を用いた。カラムとしてDevelosil C30-ug-3（2.1 x 150 mm, 3.0 μm particle size、Nomura Chemical社製）を用い、移動相Ａ液に１０ｍＭのＮＨ_５ＣＯ_３／Ｈ_２Ｏ、移動相Ｂ液にメタノールを用い、流速２００μＬ／分でリニアグラジエント溶出をおこなった（１５－６５％Ｂ液（０．０－２２．０分）、６５－９０％Ｂ液（２２．０－２４．４分）、１００％Ｂ液（２４．５－２９．０分）、１５％Ｂ液（３０．０－４０．０分））。カラムオーブンは４０℃、サンプル注入量は２μＬに設定し、Wash液に１０％メタノール、Wash port液に５０％アセトニトリルを選択した。

ＨＲＭＳ装置としてQ-Exactive（Thermo Fisher Scientific社製）を用いた。ＥＳＩ条件として、スプレー電圧；３０００Ｖ、シースガス圧；４０ｐｓｉ、オグジュアリーガス圧；１０ｐｓｉ、キャピラリー温度・ヴェイポライザー温度；３００°Ｃに設定した。検出のため、正負両イオンのFull scan-ddMS²（topN）モードを選択した。各種パラメータは以下のとおりである：Full scan; Resolution 70,000, AGC target 3e6, Maximum IT 100 ms,Scan range 80-1,200, ddMS²; Resolution 17,500, AGC target 5e4,Maximum IT50 ms, topN N=20, Isolation window 4.0 m/z, NCE 20（50% stepped NCE）。追加のＭＳ^２データは、正負両イオンのtarget MS²モードで測定した。各種パラメータは以下のとおりである:Resolution 35,000, AGC target 6e5, Maximum IT 200 ms, Isolationwindow 4.0 m/z, NCE 20（50% stepped NCE）。

データ解析
データの解析は、Compound Discoverer（Thermo Fisher Scientific社製）及びXcalibur（Thermo Fisher Scientific社製）を用いて行った。ピーク抽出には、Metabolism w/ FlSh ワークフローを選択し、「Compound」にＭＡ５の構造情報を登録した。下限ピーク強度は各サンプル中のＭＡ５平均ピーク強度の１万分の１に設定した。代謝物予測ノードのイオンアダクトに、［Ｍ＋Ｎａ］^＋、［Ｍ＋ＮＨ_４］^＋、［Ｍ－Ｈ_２Ｏ＋Ｈ］^＋、［Ｍ＋Ｃｌ］^－を追加した。また代謝経路に、トリプトファン＞キヌレニン経路［－Ｃ＋Ｏ］、ＡＭＰ抱合［＋Ｃ_１０Ｈ_１２Ｎ_５Ｏ_６Ｐ］、ＣｏＡ抱合［＋Ｃ_２１Ｈ_３４Ｎ_７Ｏ_１５Ｐ_３Ｓ］を追加した。

４－２ 結果
ヒト肝ミクロソームを、ＭＡ５のラセミ体又はＭＡ５のＳ体の存在下でインキュベートした場合、グルクロン酸抱合体（＋Ｃ６Ｈ８Ｏ６［＋１．７ｍｉｎ、＋２．６ｍｉｎ］）が検出されたのに対して、ヒト肝ミクロソームを、ＭＡ５のＲ体の存在下でインキュベートした場合、かかるグルクロン酸抱合体はほとんど又はコントロールと変わらないレベルでしか検出されなかった（図２参照）。
この結果は、ＭＡ５のＳ体の方がＭＡ５のＲ体よりも、１０倍以上グルクロン酸抱合されやすいことを示しており、上記「４．ヒト肝ミクロソームを用いた代謝試験」の項目の結果、すなわち、生体内において、ＭＡ５のＲ体が、ＭＡ５のＳ体よりも血中で保持されやすかったという結果を支持している。

さらに、ＧＬＰ準拠非臨床試験からラット４週間反復投与毒性試験及びサル４週間反復投与毒性試験を行った結果、高用量投与群で尿路上皮に対する毒性所見が認められた。その原因を明らかにするため、尿中代謝物について評価したところ、サルでは尿中ＭＡ５のラセミ体のグルクロン酸抱合体、ラットではＭＡ５のラセミ体の硫酸抱合体の尿中濃度が毒性発現と相関し、毒性の本体であると推定された。

肝臓の代謝酵素や腎臓トランスポーターはサルとラットの間で種差があり、ヒトの肝代謝はサルに近いことが明らかになったことから、ヒトにおける副作用の本体もグルクロン酸抱合体であると推定される。ＭＡ５のＲ体は、上記ヒト肝ミクロソームを用いた代謝試験から、Ｓ体に比べてグルクロン酸抱合体がほとんど（１／１０以下）産生されないことから、ＭＡ５のＲ体は、ＭＡ５のＳ体に比べてより副作用がない安全な化合物と言える。

５．細胞毒性評価１
動物細胞に対するＭＡ５のＲ体の毒性を評価するために、以下の「５－１」の項目に記載の方法に従って解析した。

５－１ 方法
９６ウェルプレートに、１ウェルあたり２×１０^３個のＨＢｌＥｐＣ細胞株（CellApplication社製）を播種し、化合物の溶媒である０．１％のＤＭＳＯ、又は各種濃度（３０ｎＭ、１００ｎＭ、３００ｎＭ、１μＭ、３μＭ、１０μＭ、３０μＭ、１００μＭ、３００μＭ、又は１ｍＭ）の３種類の化合物（ＭＡ５のラセミ体、ＭＡ５のＲ体、若しくはＭＡ５のＳ体）をＨＢｌＥｐＣ培養液に添加し、４８時間培養した。なお、コントロールとして何も添加しなかった場合の実験も行った（図３中の「－」）。培養後の生細胞レベル（生細胞数レベル）を、Cell Count Reagent SF（Nacalai tesque社製）を用いたＷＳＴ－８アッセイにより測定した。

５－２ 結果
ＨＢｌＥｐＣ細胞株を、ＭＡ５のラセミ体あるいはエナンチオマー（Ｒ体又はＳ体）の存在下で培養すると、ＭＡ５のラセミ体の存在下で培養した場合と比べ、細胞の生存率が高く、特に、ＭＡ５のＲ体の方が、ＭＡ５のＳ体よりも細胞の生存率が高かった（図３参照）。この結果は、ＭＡ５のＲ体は、ＭＡ５のラセミ体やＭＡ５のＳ体よりも動物細胞に対する細胞毒性が低いことを示している。

６．細胞毒性評価２
動物細胞に対するＭＡ５のＲ体の毒性を評価するために、以下の「６－１」の項目に記載の方法に従って解析した。

６－１ 方法
９６ウェルプレートに、１ウェルあたり２×１０^３個のＭＴ-ＮＤ３変異細胞株を播種し、ＤＭＥＭ低グルコース培養液の存在下で２日間培養後、化合物の溶媒である０．１％のＤＭＳＯ、又は各種濃度（０．００３μＭ、０．０１μＭ、０．０３μＭ、０．１μＭ、０．３μＭ、１μＭ、３μＭ、１０μＭ、３０μＭ、又は１００μＭ）のＭＡ５の各エナンチオマー（Ｒ体又はＳ体）を添加し、さらに５日間培養後、細胞生存レベルを測定した。具体的には、細胞生存レベルは、Cell Counting Kit-8（同仁化学研究所社製）を用いたＭＴＴアッセイにより測定した。すなわち、各ウェルにCell Count Reagent SFを１００μＬずつ添加し、２時間インキュベートし、マイクロプレートリーダーで３秒間撹拌した後、吸光度４５０ｎｍ（リファレンス７５０ｎｍ)を測定した（図４参照）。なお、コントロールとして何も添加しなかった場合の実験も行った（図４中の「－」）。

６－２ 結果
ＭＴ-ＮＤ３変異細胞株を、高濃度（３０μＭや１００μＭ）のＭＡ５のＲ体の存在下で培養しても、生細胞レベルの低下は認められなかった（図４Ａ参照）。一方、ＭＴ-ＮＤ３変異細胞株を、高濃度（３０μＭや１００μＭ）のＭＡ５のＳ体の存在下で培養すると、生細胞レベルの有意な低下が認められた（図４Ｂ参照）。この結果は、ＭＡ５のＲ体は、ＭＡ５のＳ体よりも動物細胞に対する細胞毒性が低いことを示しており、上記「５．細胞毒性評価１」の項目の結果を支持している。

７．動物細胞におけるＡＴＰ産生能の評価
ＭＡ５のラセミ体は、動物細胞におけるＡＴＰ産生能を増強する作用を有することを報告している（例えば、国際公開第２０１４／０８０６４０号パンフレット参照）。そこで、ＭＡ５のＲ体及びＭＡ５のＳ体の間で、ＡＴＰ産生能の増強作用に違いがあるかどうかを確認するために、以下の「７－１」の項目に記載の方法に従って解析した。

７－１ 方法
９６ウェルプレートに、１ウェルあたり２×１０^３個のＭＴ-ＮＤ３変異細胞株を播種し、ＤＭＥＭ低グルコース培養液の存在下で２４時間培養後、化合物の溶媒である０．１％のＤＭＳＯ、又は各種濃度（０．１μＭ又は１μＭ）の３種類の化合物（ＭＡ５のラセミ体、ＭＡ５のＲ体、若しくはＭＡ５のＳ体）を添加し、６時間培養後、培養液中に産生されたＡＴＰの濃度を、『細胞の』ＡＴＰ測定試薬（東洋ビーネット社製）を用いてGloMa 96 Microplate Luminometer（Promega社製）により測定した。

７－２ 結果
ＭＡ５のＲ体及びＭＡ５のＳ体の間で、動物細胞におけるＡＴＰ産生レベルに違いは認められなかった（図５参照）。

８．寿命の評価
ＭＡ５のＲ体が、生物の寿命を延長する効果を有することを確認するために、例えば、以下の［方法１］や［方法２］の項目に記載の方法に従って解析する。

［方法１］
〔１〕神経変性モデルハエ（Bloomington Drosophila Stock Centerより入手）を交配し、生まれたタマゴを１８℃で飼育する。
〔２〕成虫に羽化して１～３日後に２９℃のインキュベーターに入れる。
〔３〕５％のスクロース溶液、又は各種濃度（１００ｎＭ若しくは１０００ｎＭ）の３種類の化合物（ＭＡ５のラセミ体、ＭＡ５のＲ体、若しくはＭＡ５のＳ体）を含む５％のスクロース溶液を入れたバイアルを用意し、それぞれに２０匹のオス（♂）ハエ及びメス（♀）ハエを移し、それぞれの溶液を摂取させる（遮光して２９℃で２０時間）。
〔４〕通常のエサを入れた別のバイアルにハエを移し、通常のエサを摂取させる。（１日間）
〔５〕翌日以降、上記手順〔３〕～〔４〕を繰り返す。
〔６〕上記手順〔３〕～〔４〕の際に、死んだハエを取り除き、その数を記録するとともに、死んだハエの寿命を記録する。バイアルが空になったら（すなわち、バイアルの中に生きたハエがいなくなったら）、記録した死ハエの数の総計を元の数として生存数を計算し、死んだ個々ハエの寿命と、生存したハエの総数を基に、ハエの平均寿命を算出する。なお、１８℃から２９℃に移す理由は、温度感受性の遺伝子発現システムを使っているためであり、発生過程では神経変性タンパク質を発現せず、成虫に羽化してから神経変性タンパク質を発現させているからである（発生過程で全ての神経細胞に神経変性タンパク質を発現させると致死のケースが多い）。
ハエは、ヒト疾患のモデル生物として利用されたり（文献「Hum MolGenet. 2019. PMID: 31227826」参照）、ヒト老化のモデル生物として利用されている（文献「FEBS OpenBio. 2022. PMID: 34854258」参照）。このため、ハエにおいて、ＭＡ５のＲ体による寿命延長効果が認められれば、その効果はヒトにも適用できると言える。

［方法２］
〔１〕生後２８日のα-klotho homo KOマウス（オス［♂］、４週齢、ｎ＝３、２反復）を、日本クレア社より入手し、２日間環境馴化させる。
〔２〕生後３０日目に、水で懸濁した３種類の化合物（ＭＡ５のラセミ体、ＭＡ５のＲ体、又はＭＡ５のＳ体）を、１０ｍｇ／ｋｇ体重／１００μＬ／日の用量で上記ＫＯマウスに経口投与する。
〔３〕１週間に一度、ＫＯマウスの体重を測定し、死亡が確認されるまで記録する。なお、コントロールとして、上記３種類の化合物を経口投与しなかったＫＯマウスについても同様に、死亡が確認されるまで体重を測定する。

９．ミトコンドリア機能の評価
ミトコンドリア内膜タンパク質（ミトフィリン［Mitofilin］）の線虫オーソログであるimmt-1欠損変異型線虫（以下、「immt-1／mitofilin変異体」という）では、筋細胞におけるミトコンドリアがswellingすることが報告されている（文献「Journal of CellularPhysiology. 224 (2010) 748-756」、文献「Molecular Biology ofthe Cell. 22 (2011) 831-841.」参照）。そこで、immt-1／mitofilin変異体に対して、３種類の化合物（ＭＡ５のラセミ体、ＭＡ５のＲ体、又はＭＡ５のＳ体）を投与した場合、ミトコンドリアのswellingが緩和されるかどうかを解析した。

具体的には、ミトコンドリアＤＮＡ及びゲノムＤＮＡをＧＦＰで可視化できるように遺伝子操作したｃｃＩｓ４２５１（Pmyo-3::GFP::LacZ::NLS, Pmyo-3::mitochondrial-GFP+dpy-20(+)、文献「Cell 139 (2009) 623-633」）のimmt-1／mitofilin変異体（ＮＢＲＰ［National Bio Resource Project］ 線虫［東京女子医科大学］）を、コントロールであるＤＭＳＯ（溶媒）を散布した培養プレート（E. coli OP-50 NGM寒天培地）、又は上記３種類の化合物（ＭＡ５のラセミ体、ＭＡ５のＲ体、又はＭＡ５のＳ体）を、終濃度が１０μＭとなるように散布した上記培養プレート上で、Ｌ４幼虫期から５日間（すなわち、４日齢成虫まで）飼育し、４日齢成虫において体壁筋細胞を観察し（図６参照）、異常なミトコンドリア（swellingしたミトコンドリア）の数と、異常なミトコンドリアが認められた体壁筋細胞の割合を測定した（図７及び８参照）。なお、比較対照として、ｃｃＩｓ４２５１の野生型線虫（ＣＧＣ［Caenorhabditis Genetics Center］より入手）を培養プレート上で飼育後、同様に解析した。

その結果、immt-1／mitofilin変異体を、ＭＡ５のＲ体の存在下で飼育すると、コントロールであるＤＭＳＯの存在下で飼育した場合や、ＭＡ５のＳ体の存在下で飼育した場合と比べ、体壁筋細胞当たり５個以上のswellingミトコンドリアが認められた体壁筋細胞の割合が大幅に減少するとともに（図７参照）、体壁筋細胞当たりのswellingミトコンドリアの数も大幅に減少した（図８参照）。また、immt-1／mitofilin変異体を、ＭＡ５のＳ体の存在下で飼育すると、コントロールであるＤＭＳＯの存在下で飼育した場合と比べ、体壁筋細胞当たり５個以上のswellingミトコンドリアが認められた体壁筋細胞の割合や、体壁筋細胞当たりのswellingミトコンドリアの数は、ほとんど変わらないかわずかの減少にとどまった（図７及び８参照）。

この結果は、ＭＡ５のＳ体には、ミトコンドリアのswellingを緩和する作用はほとんどなく、ＭＡ５のＲ体がミトコンドリアのswellingを緩和する作用を有することを示している。すなわち、ＭＡ５のＲ体が、線虫におけるミトコンドリア機能を改善する作用を有することを示している。また、線虫は、ヒトのミトコンドリア機能を解析するモデル生物として利用されていることから（文献「Nature. 2018.PMID: 30356218」参照）、ＭＡ５のＲ体は、ヒトに対するミトコンドリア機能賦活剤やミトコンドリア病の治療剤又は予防剤に有用であることが示されたと言える。

１０．生体内への投与試験２
上記「３．生体内への投与試験１」において、静脈内投与したＭＡ５のＲ体が、静脈内投与したＭＡ５のＳ体よりも血中で保持されやすいことが確認されたが、経口投与した場合も同様の結果となるかどうかを確認した。具体的には、上記「３－１ 方法」に記載の方法に従って、ＭＡ５の各エナンチオマー（Ｒ体又はＳ体）を含む液を、１００ｍｇ／ｋｇの用量で雄性カニクイザルに単回経口投与し、血漿における、ＭＡ５の各エナンチオマーの濃度と、ＭＡ５の各エナンチオマーの還元代謝物（式（Ｂ）で表される化合物［すなわち、Ｒｅｄ－ＭＡ５］）の濃度を測定した。

その結果、経口投与後、血漿におけるＭＡ５のＲ体の濃度は、血漿におけるＭＡ５のＳ体の濃度よりも高かった（図９参照）。また、血漿における還元代謝物（式（Ｂ）で表される化合物、すなわち、Ｒｅｄ－ＭＡ５）は、ＭＡ５のＳ体を経口投与した場合、検出されたのに対して、ＭＡ５のＲ体を経口投与した場合は、ほとんど検出されなかった（図１０参照）。

これらの結果は、ＭＡ５のＲ体を経口投与した場合も、ＭＡ５のＳ体を経口投与した場合よりも血中で保持されやすく、また、ＭＡ５のＲ体の方がＭＡ５のＳ体よりも代謝されにくいことから、ＭＡ５のＲ体は、ＭＡ５のＳ体よりも、その効果を生体内で持続的に発揮できることを示している。

１１．細胞毒性評価３
動物細胞に対するＲｅｄ－ＭＡ５の毒性を評価するために、以下の「１１－１」の項目に記載の方法に従って解析した。

１１－１ 方法
９６ウェルプレートに、１ウェルあたり３×１０^３個のＫＣＭＣ１０細胞株を播種し、化合物の溶媒である０．１％のＤＭＳＯ、又は各種濃度（３ｎＭ、１０ｎＭ、３０ｎＭ、１００ｎＭ、３００ｎＭ、１μＭ、３μＭ、１０μＭ、又は３０μＭ）の２種類の化合物（ＭＡ５のラセミ体又はＲｅｄ－ＭＡ５）の存在下で２４時間培養後、細胞生存レベルを測定した。具体的には、細胞生存レベルは、Cell Counting Kit-8（同仁化学研究所社製）を用いたＭＴＴアッセイにより測定した。すなわち、各ウェルにCell Count Reagent SFを１００μＬずつ添加し、２時間インキュベートし、マイクロプレートリーダーで３秒間撹拌した後、吸光度４５０ｎｍ（リファレンス７５０ｎｍ)を測定した（図１１参照）。なお、コントロールとして何も添加しなかった場合の実験も行った（図１１中の「－」）。

１１－２ 結果
ＫＣＭＣ１０細胞株を、３０μＭのＭＡ５のラセミ体の存在下で培養しても、生細胞レベルの低下は認められなかったのに対して（図１１Ａ参照）、３０μＭのＲｅｄ－ＭＡ５の存在下で培養すると、生細胞レベルの有意な低下が認められた（図１１Ｂ参照）。この結果は。Ｒｅｄ－ＭＡ５よりもＭＡ５の方が、細胞毒性が低いことを示している。すなわち、上記「１０．生体内への投与試験２」の結果と総合すると、生体内に投与したＭＡ５のＲ体の方が、生体内に投与したＭＡ５のＳ体よりも細胞毒性が低いことを示している。

１２．動物細胞内のＳＩＲＴ発現量の評価
細胞内において、ＮＡＤ^＋量とＳＩＲＴ発現量との間には、正の相関関係があることが知られている（文献「Nat RevNephrol. 2017. PMID: 28163307」参照）。また、内耳細胞におけるＳＩＲＴの発現増加と、難聴の改善との関連性が報告されている（文献「Front Cell Dev Biol. 2021. PMID: 34869361」、文献「Exp Cell Res. 2022 Jul 11:113280.」、文献「Hindawi Neural Plasticity Volume 2021, Article ID 5520794」参照）。そこで、ＭＡ５のＲ体が、細胞内のＮＡＤ^＋量を増加させることによって、内耳細胞内のＳＩＲＴの発現量が増加し、難聴の改善に有用であるかどうかを調べるために、以下の「１２－１」の項目に記載の方法に従って解析した。

１２－１ 方法
１０ｍＬの培養液（１０重量％のＦＢＳを添加したグルコース低含有ＤＭＥＭ培地［グルコース濃度１．０ｇ／ｄＬ］）を含むディッシュに、１×１０^６ｃｅｌｌ／ｄｉｓｈのマウス内耳細胞株（ＨＥＩ－ＯＣ１細胞株）を播種して培養した。１日後に、化合物の溶媒である０．１％のＤＭＳＯ、又は各種濃度（１μＭ、３μＭ、１０μＭ、又は３０μＭ）の３種類の化合物（ＭＡ５のラセミ体、ＭＡ５のＲ体、又はＭＡ５のＳ体）を添加し、２４時間培養した。培養終了後、細胞を回収し、常法によって細胞を破壊して細胞内の各種ＳＩＲＴ（ＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ２、ＳＩＲＴ３、ＳＩＲＴ５、ＳＩＲＴ６、及びＳＩＲＴ７）の発現レベルをウエスタンブロット法により解析した（図１２～１４［図１２－１～図１４－２］参照）。

１２－２ 結果
ＨＥＩ－ＯＣ１細胞株を、ＭＡ５のＳ体の存在下で培養しても、ＭＡ５のＳ体の非存在下で培養した場合と比べ、細胞内の各種ＳＩＲＴ（ＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ２、ＳＩＲＴ３、ＳＩＲＴ５、ＳＩＲＴ６、及びＳＩＲＴ７）の発現量は、ほとんど変わらなかったのに対して（図１４［図１４－１及び図１４－２］参照）、ＨＥＩ－ＯＣ１細胞株を、ＭＡ５のＲ体の存在下で培養すると、ＭＡ５のＲ体の非存在下で培養した場合と比べ、細胞内の各種ＳＩＲＴの発現量が増加した（図１３［図１３－１及び図１３－２］参照）。
この結果は、上記「２．動物細胞内のＮＡＤ^＋量の評価」の結果と総合すると、ＭＡ５のＲ体が、細胞内のＮＡＤ^＋量を増加させた結果、細胞内のＳＩＲＴの発現量が増加し、難聴の改善に有用であることを示している。

１３．動物の運動機能の評価
ＭＡ５のＲ体が、動物の運動機能障害を改善する効果を有することを確認するために、例えば、以下の［老化マウス］や［幼若マウス］の項目に記載のマウスを用い、以下の［方法１］～［方法３］の項目に記載の方法に従って解析する。

［老化マウス］
３種類の化合物（ＭＡ５のラセミ体、ＭＡ５のＲ体、若しくはＭＡ５のＳ体）を含む水を、それぞれ５０ｍｇ／ｋｇ体重／日の用量で老化マウス（９２週）（５匹）に９週間経口投与する。また、コントロールとして、水を老化マウス（６匹）に９週間経口投与する。

［幼若マウス］
３種類の化合物（ＭＡ５のラセミ体、ＭＡ５のＲ体、若しくはＭＡ５のＳ体）を含む水を、それぞれ１０ｍｇ／ｋｇ体重／日（低用量）又は５０ｍｇ／ｋｇ体重（高用量）の用量で幼若マウス（４か月）（６匹）に９週間経口投与する。また、コントロールとして、水を幼若マウス（６匹）に９週間経口投与する。

［方法１：トレッドミル検査］
〔１〕マウス用のトレッドミル装置（ＭＫ－６９０、室町機械社製、以下同じ）を用いて、トレッドミル検査の練習を行う。老化マウスの場合、１日目；８ｍ／分の速度で１０分間×２回、２日目；１０ｍ／分の速度で１０分間×２回、及び３日目；１２ｍ／分の速度で１０分間×２回の計３日間行う。一方、幼若マウスの場合、１日目；８ｍ／分の速度で１０分間×２回、２日目；９ｍ／分の速度で１０分間×２回、３日目；１０ｍ／分の速度で１０分間×２回、４日目；１１ｍ／分の速度で１０分間×２回、及び５日目；１２ｍ／分の速度で１０分間×２回の計５日間行う。
〔２〕マウス用のトレッドミル装置を用いて、トレッドミル検査の本番を、以下の条件で最大２時間行う。５ｍ／分の速度で開始し、３分毎に５ｍ／分ずつ速度を上げて、最終的には２８ｍ／分の速度まで上げる（すなわち、５ｍ／分→１０ｍ／分→１５ｍ／分→２０ｍ／分→２５ｍ／分→２８ｍ／分）。
〔３〕刷毛で尾部を刺激しても前進せず、通電された棒の上で１０秒以上移動しなかった場合に力尽きたと判定する。２時間以上走行した場合は、打ち切りとし２時間と記録する。

［方法２：逆格子吊り下げ試験］
マウスの逆格子吊り下げ試験は、直径３７ｃｍで８ｍｍ四方の金網を使用して行う。金網の周囲には、マウス脱出を防ぐ目的で１２ｃｍのプラスチック製の壁を作製する。マウス順応のために、１分間金網の上に置く。金網の中央にマウスがいる状態で金網をひっくり返し、マウスが落下するまでの時間（分）を測定する。地面から６０ｃｍの高さで金網を保持する。落下した時のマウスの怪我の防止のため、下には飼育用の床敷を敷く。３０秒未満で落下した場合は、事故による落下と判断し３０秒以上になるまで追加で測定する。別日に２回測定し、その平均値を使用する。また、マウス体重を測定し、「Hanging Impulse Score」（捕まった時間［分］×体重［分］）を算出する。

［方法３：握力］
マウスの握力測定は、マウス用の握力測定装置（ＧＰＭ－１０１、Melquest社製）を使用して行う。前脚の握力測定には、前脚用のグリップを使用し、四肢の握力測定には、四肢用の金網をセットして使用する。前脚の握力測定から行い、横方向と縦方向で測定する。横方向の測定のために、マウスの両前脚がグリップを把持した状態で水平方向に引っ張り、手が離れるまで引っ張る。縦方向の測定のために、マウスの両前脚がグリップを把持した状態で垂直方向に引っ張り、手が離れるまで引っ張る。５回連続で行った最大値を計測する。四肢用の測定は、マウスの四肢が金網にのった状態で、手が離れるまで尾を水平方向に引っ張り、５回連続で行った最大値を計測する。

本発明は、加齢に伴う症状又は疾患、代謝性疾患、ミトコンドリア病などの症状若しくは疾患の予防又は治療や、寿命の延長に資するものである。

Claims (8)

1. 実質的にＳ体を含まない、以下の式（Ａ－１）で表される化合物又はその生理的に許容される塩を有効成分としてなる、医薬組成物。
   

   
2. ミトコンドリア病の治療又は予防のためのものである、請求項１に記載の医薬組成物。
3. 加齢に伴う症状若しくは疾患の治療又は予防のためのものである、請求項１に記載の医薬組成物。
4. 加齢に伴う症状若しくは疾患が難聴である、請求項３に記載の医薬組成物。
5. 実質的にＳ体を含まない、以下の式（Ａ－１）で表される化合物又はその生理的に許容される塩を有効成分としてなる、飲食品組成物。
   

   
6. ミトコンドリア病を治療又は予防する必要がある対象のためのものである、請求項５に記載の飲食品組成物。
7. 加齢に伴う症状若しくは疾患を治療又は予防する必要がある対象のためのものである、請求項５に記載の飲食品組成物。
8. 加齢に伴う症状若しくは疾患が難聴である、請求項７に記載の飲食品組成物。

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