KR101712184B1

KR101712184B1 - Nrf2 활성화 효능의 세스퀴터핀 화합물 및 이를 유효성분으로 포함하는 약학조성물

Info

Publication number: KR101712184B1
Application number: KR1020150190890A
Authority: KR
Inventors: 박기덕; 배애님; 박종현; 최지원; 김동진; 김윤경
Original assignee: 한국과학기술연구원
Priority date: 2015-12-31
Filing date: 2015-12-31
Publication date: 2017-03-06

Abstract

본 발명은 NF-E2-related factor-2(Nrf2) 활성에 작용하여 신경세포 사멸 억제 또는 시신경 척수염 질환에 약학적 활성을 보이는 천연물 유래의 세스퀴터핀 화합물 및 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 그리고 이들 화합물을 유효성분으로 함유하는 약학조성물에 관한 것이다.

Description

Nrf2 활성화 효능의 세스퀴터핀 화합물 및 이를 유효성분으로 포함하는 약학조성물{Dimeric Sesquiterpene Compound as Nrf2 Activator and Phamaceutical Composition Conprising the Same}

시신경 척수염(neuromyelits optica, NMO)는 대표적인 불치 뇌질환 중 하나로, 중추신경과 시신경에 영향을 주는 염증성 탈수초성 자가면역질환이다. 시신경 척수염은 성상 세포에서 주로 발현되는 아쿠아포린 4라는 수분 전달 통로 단백질에 대한 시신경 척수염 특이항체인 NMO-IgG의 유무로 다른 질병과 구별될 수 있다. 상기 시신경 척수염 특이항체는 환자의 약 75%에서 발견된다. 아쿠아포린 4 단백질은 NMO-IgG의 주 항원으로 뇌와 중추신경을 염증세포로부터 보호하는 혈 뇌 장벽을 구성하고 있는 성상세포에 주로 분포되어 있다. NMO-IgG와 아쿠아포린 4의 결합은 시신경척수염 발병 과정에서 핵심이 되는 주요 기전이다. 시신경 척수염 특이항체인 NMO-IgG 가 항원인 아쿠아포린 4에 결합을 하면서 도움체 매개 세포독성 혹은 항체의존성 세포매개성 세포독성을 유발하여 성상세포에 손상을 주게 되어 시신경 척수염을 발병시킨다.

현재 시신경 척수염의 치료제로는 대부분 항암제나 면역 억제제, 면역 조절제, 혈액 정화 요법이 쓰이고 있고, 이큘리주맙이라는 항체에 대한 안정성 임상시험이 진행단계에 있다. 하지만 면역 억제제들은 강한 독성을 띄고 중추신경계 감염, 백혈병, 심장독성, 또는 사망과 같은 심한 부작용을 동반하기 때문에, 이런 부작용들을 최소화하고 효능을 극대화시킬 수 있는 치료제를 개발하는 것이 아주 시급하고 중요하다. 그럼에도 불구하고 심한 뇌 질환의 병리기전은 아직까지도 정확히 알려진 바가 없기 때문에 기본적인 치료방법이 없고, 시신경 척수염과 같은 희귀 질병에는 치료에 활성을 띄는 화합물의 개발도 미비한 상태이다.

신경 척수염이나 다발성 경화증과 같은 자가면역질환에서는 자가 항체에 의해 신경세포독성을 유발하여 신경세포 및 성상세포 사멸을 유도하고 이에 따라서 질병이 악화되어 간다. NF-E2-related factor-2(Nrf2)는 외부 스트레스나 독성에 대응하여 세포를 보호하는 능력을 유도할 수 있는 전사인자(transcriptional factor)로써 세포질(cytoplasm)에서 Kelch-like ECH-associated protein1(Keap1)과 결합한 상태로 존재하지만 Keap1과의 결합이 떨어지는 경우 핵으로 이동한다[1) Itoh et al. Genes Dev. 1999, 13, 76-86; 2) Eggler et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2005, 102, 10070-10075; 3) Kobayashi et al. Mol. Cell. Biol. 2006, 26, 221-229; 4) Tong et al. Biol. Chem. 2006, 387, 1311-1320]. 핵에서 ARE와 결합하여 항산화 효소 및 항염증 효소의 발현을 유도함으로써 인체방어에 중요한 역할을 한다. 2013년 다발성 경화증 치료제로 승인받은 dimethyl fumarate가 대표적인 Nrf2 활성화 약물이다. 본 발명에서는 천연물 유래의 Nrf2 활성화 물질을 발굴하여, 인체 방어관련 항산화 및 항염증 효소를 발현시킬 수 있고, 이를 통해 시신경 척수염에 효능을 나타낼 수 있는 물질을 탐색하였다. 그 결과 Chloranthus henryi에서부터 분리된 세스퀴터핀 계열 화합물인 Shizukahenriol(SZH)가 우수한 Nrf2 활성화 효능을 나타내어, 이 화합물에 대한 항산화 및 항염증 효과, 그리고 시신경 척수염 치료제로서의 가능성을 검증하였다.

Nrf2 활성화를 통한 시신경 척수염 치료연구는 현재까지 전무하며, 대부분의 시신경 척수염 치료 연구는 항체의 결합을 저해하는 약물이 주를 이루고 있다. 미국공개특허 2014-0170140호에서는 아쿠아포린 4에 결합하는 항체를 이용하여 단일요법 또는 면역억제제 또는 혈장분리 반출술과 같은 기본 NMO 요법과 함께 시신경 척수염을 치료하는 방법에 관한 특징을 기재하고 있으며, 미국등록특허 7872032호에서는 과산화소체 증식체 활성화 수용체 델타 조절물질로서 1,3,4-옥사디아졸-2-온 유도체 또는 이의 입체 이성질체 호변이성체 또는 이의 용매화물 또는 약제학적으로 허용되는 염을 이용하여 다발성 경화증, 시신경척수염 등을 포함하는 질병을 치료하는 방법에 관한 특징을 개시하고 있다.

시신경 척수염과 증상이 비슷한 다발성 경화증의 상황과 비교해 보면, 다발성 경화증은 서양에서 비교적 높을 비율을 차지하는 반면, 시신경 척수염은 한국과 중국을 비롯한 아시아 지역에서 환자의 비율이 높게 나타났다고 보고되었다. 다발성 경화증은 치료제가 개발되어 이미 서양에서 큰 시장을 형성하고 있으므로 시신경 척수염 또한 치료제 개발이 되면 빠른 시일 내에 한국과 중국을 포함한 아시아에서 큰 시장을 형성할 것이라고 예상한다.

본 발명이 해결하고자 하는 과제는 천연물 유래의 세스퀴터핀 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 이의 용매화물을 유효성분으로 포함하여 시신경 척수염 또는 뇌염증 또는 데빅병, 다발성 경화증 및 루게릭 병과 같은 퇴행성 신경계 질환을 치료 또는 예방할 수 있는 약학조성물을 제공하는 것이다.

본 발명은 클로란투스 헨리(Chloranthus henryi)로부터 추출된 추출물이 NF-E2-related factor-2(이하, "Nrf2"라 한다)에 대해 우수한 활성효과를 나타내는 것을 확인하여 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명은 클로란투스 헨리 추출물을 유효성분으로 포함하는 시신경 척수염, 뇌염증 및 퇴행성 신경계 질환 중에서 선택되는 질병의 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 상기 "시신경 척수염"이란, 단안 또는 양안의 심안 시신경염(optic neuritis)과 척추 3분절 이상을 침범하는 긴 척수염(longitudinally extensive myelitis)이 특징적으로 발현하는 질환을 의미한다.

본 발명에 따른 상기 "퇴행성 신경계 질환"은 데빅병, 다발성경화증 및 루게릭병 중에서 선택되는 어느 하나 일 수 있다.

본 발명에 따른 상기 클로란투스 헨리 추출물은 클로란투스 헨리를 에틸아세테이트로 추출한 추출물; 또는 클로란투스 헨리를 메탄올/클로로포름 공용매 또는 메탄올로 조추출한 뒤, 상기 조추출물을 에틸아세테이트로 재추출한 추출물;일 수 있다.

구체적으로 상기 클로란투스 헨리 추출물의 유효성분은 하기 [화학식 1]로 표시되는 세스퀴터핀 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 이의 용매화물 일 수 있다.

[화학식 1]

본 발명에 있어서, 상기 약제학적으로 허용 가능한 염은 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 것이면 특별히 제한은 없으며, 구체적인 예로는 염산, 브롬산, 술폰산, 아미도황산, 인산 또는 질산과 같은 무기산이나 카르복시산 또는 술폰산과 같은 유기산을 이용하여 염을 형성할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 상기 카르복시산의 종류로는 아세트산, 말레산, 푸마르산, 말산, 시트르산, 타르타르산, 락트산, 벤조산, 숙신산, 프로피온산, 글리콜산, 스테아르산 및 젖산 등이 포함될 수 있으며, 술폰산의 종류로는 메탄술폰산, 에탄술폰산, 벤젠술폰산, 톨루엔 술폰산 및 나프탈렌디술폰산 등이 포함될 수 있으나, 상기 카르복시산 및 술폰산의 종류가 상기 화합물들로 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 클로란투스 헨리 추출물 또는 상기 [화학식 1]로 표시되는 화합물은 NF-E2-related factor-2 (Nrf2)를 우수한 효율로 활성화시키는데 특징이 있다. 구체적으로 종래의 Nrf2의 활성화 약물로 잘 알려진 디메틸푸마레이트(DMF)와 모노메틸푸마레이트(MMF)와 비교하여 유사한 활성 효능을 나타내고 있으므로, 상기 [화학식 1]로 표시되는 세스퀴터핀 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 이의 용매화물을 유효성분으로 포함하는 NF-E2-related factor-2 (Nrf2) 활성화제로 유용하게 사용될 수 있다.

아쿠아포린 4는 혈액 뇌 관문을 둘러싸고 있는 별아교세포 말단에 존재하며, 세포 막을 통해 수분을 수송하는 역할을 하는 통로로 작용한다. 시신경 척수염의 특이 항체인 NMO-IgG는 수분 통로 단백질인 아쿠아포린 4에 결합하여 면역 반응을 유발한다. 상기 시신경 척수염은 성상교세포 등에 존재하는 아쿠아포린 4에 항-아쿠아 자가항체가 결합하여 보체-의존성 세포독성을 유도함으로써, BBB(blood brain barrier)의 파괴 등이 유발되는 것을 주요 발병 및 진행 기전으로 한다.

또한, 본 발명은 생체 외 또는 인간을 제외한 포유동물의 생체 내에서 세포에 하기 [화학식 1]로 표시되는 세스퀴터핀 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 처리하여 해당 세포에서 NMO-IgG(Neuro myelitis Optica-IgG)와 아쿠아포린 4 단백질의 결합에 의해 유발되는 세포사멸을 억제하는 방법을 제공한다. 본 발명에 따르면, 상기 클로란투스 헨리 추출물 또는 상기 [화학식 1]로 표시되는 화합물을 세포에 처리하면, NMO-IgG(Neuro myelitis Optica-IgG)와 아쿠아포린 4 단백질의 결합에 의해 유발되는 세포사멸을 억제할 수 있다. 따라서 상기 클로란투스 헨리 추출물 또는 상기 [화학식 1]로 표시되는 화합물은 NMO-IgG(Neuro myelitis Optica-IgG)와 아쿠아포린 4 단백질의 결합에 의해 유발되는 세포사멸 억제제로도 유용하게 이용될 수 있다.

또한, 본 발명은 생체 외 또는 인간을 제외한 포유동물의 생체 내에서 세포에 하기 [화학식 1]로 표시되는 세스퀴터핀 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 처리하여 해당 세포에서 리포폴리사카라이드의 자극에 의해 생성되는 일산화질소의 양을 억제하는 방법을 제공한다. 본 발명에 따르면, 상기 클로란투스 헨리 추출물 또는 상기 [화학식 1]로 표시되는 화합물을 세포에 처리하면, 리포폴리사카라이드의 자극에 의해 생성되는 일산화질소의 양을 억제할 수 있다. 따라서 상기 클로란투스 헨리 추출물 또는 상기 [화학식 1]로 표시되는 화합물은 항염증 용도로 유용하게 이용될 수 있다.

본 발명에 의한 상기 [화학식 1]로 표시되는 세스퀴터핀 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 이의 용매화물은 통상적인 담체, 보조제 또는 희석제와 혼합하여 통상의 제제화 방법으로 제형화하여 경구투여 또는 비경구투여에 적합한 형태로 제조될 수 있다.

상기 담체, 보조제 또는 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

또한, 제제화할 경우에는 통상의 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등을 더 포함할 수도 있으며, 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제를 더 첨가할 수도 있다.

상기 경구투여의 경우에는 정제, 캡슐제, 용액, 시럽제, 현탁제 등의 형태로 제조될 수 있고, 비경구투여의 경우에는 복강, 피하, 근육, 경피에 대한 주사제의 형태로 제조될 수 있다.

본 발명에 따른 클로란투스 헨리로부터 분리된 세스퀴터핀 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 이의 용매화물은 Nrf2를 활성화시킴으로써 세포의 사멸을 방지할 수 있어, 세포사멸에 의해 유발되는 병, 특히, 시신경 척수염 특이항체인 NMO-IgG와 아쿠아포린 4 단백질의 결합에 의해 유발되는 세포사멸

도 1a는 클로란투스 헨리를 메탄올을 사용하여 상온에서 72 시간 동안 추출한 클로란투스 헨리 메탄올 조추출물의 HPLC 분석 결과이며, 도 1b는 클로란투스 헨리 메탄올 조추출물을 에틸아세테이트로 45 ℃에서 18시간 동안 재추출하여 얻은 클로란투스 헨리 추출물(이하, '시주카헨리올; SZH'이라 한다)의 HPLC 분석 결과이다.
도 2는 시주카헨리올의 Nrf2 활성화 여부 확인을 위하여 Keap1과 결합하고 있는 Nrf2가 시주카헨리올, 디메틸푸마레이트 및 모노메틸푸마레이트에 의해 분리되어 핵 안으로 이동하였는지를 확인한 그래프이다.
도 3은 본 발명에 따른 시주카헨리올의 Nrf2 활성화에 의해 항산화 효소(HO-1, GCLC 및 GCLM)의 발현을 유도하는지를 확인한 결과이다.
도 4는 본 발명에 따라 시주카헨리올의 항염증 효능을 확인한 것으로, 시주카헨리올의 농도에 따른 산화질소 및 TNF-α 생성량을 확인한 결과이다.
도 5는 본 발명에 따라 시주카헨리올의 농도에 따른 산화성 스트레스에 의한 세포사멸을 저해능을 확인한 결과이다.
도 6은 본 발명에 따라 젖산탈수소효소 분비검사 방법을 도식화하여 나타낸 도이다.
도 7은 본 발명에 따라 시주카헨리올이 NMO-IgG에 일어나는 세포사멸을 저해하는지 확인을 위한 Complement dependent cytotoxicity(CDC) assay 결과이다.

이하, 바람직한 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 성명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이에 의하여 제한되지 않는다는 것은 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 자명할 것이다.

실시예

실시예 1. 시주카헨리올(Shizukahenriol)의 분리

클로란투스 헨리(Chloranthus henryi)로부터 Nrf2 활성에 작용하는 물질의 분리 효율을 극대화하기 위해 다양한 용매(증류수, 알콜 수용액, 메탄올, 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트 등)를 이용하여 추출조건을 설계하였다.

추출 결과, 하기 도 1에 나타낸 HPLC 결과에서와 같이, 에틸아세테이트(Ethyl acetate)로 45 ℃에서 18시간 동안 추출한 다음 필터하여 추출하였을 때 Nrf2 활성에 작용하는 물질의 분리 효능이 가장 우수하였다.

구체적인 방법은 클로란투스 헨리의 줄기 및 뿌리 건조물 200 g을 에틸아세테이트(Ethyl acetate)로 45 ℃에서 18시간 동안 추출한 다음 필터하여 추출액을 얻었다. 상기 추출액에 물을 첨가하여 세척한 후, 유기층을 모아 농축한 뒤, 실리카겔컬럼크로마토그래피법(용리액; 헥산:에틸아세테이트=1:1)으로 정제하였다. 순도 향상을 위해 에틸아세테이트/헥산(=4:1)을 이용하여 재결정하였으며, 얻어진 결정을 분석하여 [화학식 1]의 구조를 가지는 것을 확인하였고,이를 시주카헨리올로 명명하였다.

white solid.

Rf = 0.35 (n-hexane/EtOAc 1/1);

mp: 173.8-174.2 ℃

¹H-NMR (400 MHz, DMSO) δ 0.20-0.67 (m, 2CHCH₂, 2H), 0.79 (s, CHCH₃, 3H), 0.91 (m, CHCH₂, 1H), 0.93 (s, CH₃, 3H), 1.12-1.16 (m, CHCH₂, 1H), 1.36-1.39 (m, CHCH₂, 1H), 1.55-1.56 (m, CHCH₂, 1H), 1.59-1.64 (m, CHCOH, 1H), 1.68 (d, J = 5.1 Hz, CHCH₂, 1H), 1.72 (s, CH₃C(O)OCH₃, 3H), 1.80 (s, 2CH₃, 6H), 1.88-1.91 (m, CHCH₂, 2H), 2.03 (s, C(O)OCH₃, 3H), 2.28-2.32 (m, CH₂CHCOH, 1H), 2.38-2.42 (m, CHCH₂, 1H), 2.66-2.71 (m, CH₂CHCOH, 1H), 2.76 (d, J = 17.0 Hz, CHCH₂, 1H), 3.60 (s, C(O)OCH₃, 3H), 3.67(d, J = 11.4 Hz, C(O)OCH₂COH, 1H), 3.72 (d, J = 5.0 Hz, C(O)CHCOH, 1H), 3.90 (d, C(O)CCH, 1H), 4.10 (d, J = 11.4 Hz, CHCH₂, 1H), 4.48 (s, C(O)OCH₂OH, 1H), 4.62, 4.82 (d, J = 12.8, 12.9 Hz, C(O)OCH₂, 2H), 5.77 (d, J = 5.1 Hz, C(O)COH, 1H), 6.80-6.82 (m, CH₃CCHCH₃, 1H);

¹³C-NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 12.0 (CCHCH₂), 12.2 (C(O)CCH₃), 14.6 (CCHCH₃), 15.3 (CCHCH₂), 16.0 (CCH₃), 20.4 (C(O)CCH₃), 20.5 (C(O)CH₃), 22.7 (CCH2), 24.8, 25.3 (2CHCH₂), 25.4 (CCH₂), 25.8 (CHCH₂), 26.4 (CCH₃), 28.4 (CHCOH), 41.0 (C(O)CCH), 44.8 (CCH₃), 51.2 (CH₃CCOH), 52.6 (C(O)OCH₃), 55.1 (C(O)OCH2), 55.8, 60.5 (2CH₃CCH), 70.9 (C(O)OCH₂COH), 77.5 (CHCOH), 80.2 (C(O)CHOH), 93.3(C(O)OCCH), 123.7 (CH₂CC(O)O), 128.1 (C(O)OCCH₃), 131.6 (CHCCCH₃), 132.0 (CH₃CC(O)OCH₃), 138.9 (CCHCH₃), 142.3 (CCHCH2), 147.6 (CC(O)COH), 168.4 (C(O)OCH₂), 170.4 (CH₃C(O)OCH₂), 170.5 (CC(O)OCH₃), 171.4 (CH₂CC(O)O), 172.2 (CCH₂CH), 200.5 (CHCC(O)COH);

HRMS [M+H]⁺ (ESI+) 677.2956; [M+H]⁺ (calcd for C₃₈H₄₄O₁₁H + 677.2962).

시험예

cell culture

BV-2 생쥐 미세아교세포는 황온유(울산대학교, 한국)로부터 제공받았다. BV-2 미세아교세포를 10% FBS(fetal bovine serum), 100 U/L penicillin 및 100 ㎍/ml streptomycin가 함유된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium)의 37 ℃, 5% CO₂ 조건하에서 배양하였다. LPS가 유도된 세포 배양은 BV-2 세포를 새로운 배지로 교환한 뒤, 3시간 후에 LPS로 처리하여 24시간 동안 배양하였다.

웨스턴블롯 분석

세포를 PBS 완충액으로 3회 세척하고, 프로테아제 저해제 칵테일 정제 (Roche Diagnostics Corp., Indianapolis, IN, USA)를 포함된 RIPA 용해 완충액에 용해시켰다. 핵 분획물은 제조업체의 지시에 따라 NE-PER nuclear extraction reagent (Pierce Biotechnology, Waltham, MA, USA)를 사용하여 제조하였다. 용해물을 4 ℃에서 20분 동안 13,000g으로 원심분리한 후, 상등액을 얻었다.

동량의 단백질을 SDS 폴리아크릴아마이드 겔에 로딩하여 전기영동시켜 분리하고, 이어, 니트로 셀룰로오스 막(BIO-RAD, Munich, Germany)에 전사한 후, 4% 탈지유(Neogen, Lexington, KY, USA)-TBST(Tris-buffered saline Tween; 10 mM Tris, pH 7.5, 150 mM NaCl and 0.1% Tween 20)으로 상온에서 1시간 동안 처리하였다. 막(membrain)은 4℃에서 하룻밤 동안 1차 항체(NRF2 , HO-1, GCLC , GCLM , iNOS, NF-κB p65, LAMIN-B1 및 β-ACTIN)를 사용하여 배양하였다. 이어, 상기 막을 ScanLater EU-표지된 2차항체와 함께 상온에서 1시간 동안 배양하였다. 단백질 밴드는 SpectraMax®i3 ScanLater™ Western blot (Molecular Devices)을 사용하여 시각화하였고, ImageJ software (version 1.49)를 사용하여 정량 분석하였다.

시험예 1. 시주카헨리올의 Nrf2 활성화 효능 검증

Keap1과 반응하고 있는 Nrf2가 시주카헨리올에 의해 분리되어 핵 안쪽으로 이동하는지 여부를 확인함으로써 본 발명에 따른 시주카헨리올의 Nrf2 활성여부를 측정하였다.

PathHunter® Assay Complete™ U2OS cell culture Keap1-Nrf2 assay Kit를 사용하여 화합물이 첨가된 U20S cell에 substrate를 처리하였다. 효소 fragment complementation(EFC) 원리를 이용하여 chemiluminescence signal 수치를 통해 활성을 측정하였다. 배양된 U2OS cell은 CP0 배지에 섞어주고 96-well plate에 1.5×10⁴세포/well로 80 μL씩 분주한 후 37 ℃ 배양기에서 하루 동안 배양하였다. 10% DMSO가 포함된 후보 물질들을 농도별로 20 μL씩 처리한 후 6시간 동안 상온에서 반응시켰다. 그 후, substrate를 50 μL씩 처리하여 빛이 들어가지 않게 호일로 감싼 뒤 1시간 동안 상온에서 반응시킨 후 microplate reader에서 luminescence를 측정하였다.

또한, 상기 시주카헨리올의 활성 능력을 평가하기 위하여 Nrf2 활성화 약물로서 다발성 경화증 치료제로 처방되어 있는 디메틸 푸마레이트(DMF)와 체내에서 실질적인 효능을 나타내는 물질로 알려진 디메틸푸마레이트의 대사물질인 모노메틸푸마레이트(MMF)를 비교 실험하였으며, 그 결과를 하기 도 2에 나타내었다.

하기 도 2를 참조하면, 시주카헨리올로(SZH) 처리된 군에서 농도 의존적으로 발광 강도(RLU)가 증가한 것을 확인할 수 있다. 이는 시주카헨리올에 의해 Nrf2가 Keap1으로부터 분리된 후 핵 내부로 이동하였음을 보여주는 결과이다. 또한, 시주카헨리올은 30 μM에서 DMF와 비슷한 효과를 나타냈으며, 10 μM에서는 DMF보다는 다소 낮은 활성을 나타내었지만 MMF 보다는 우수한 활성을 보였다.

시험예 2. 시주카헨리올의 항산화 효소 발현 유도 효능 검증

HO-1, GCLC 및 GCLM는 Nrf2에 의존하는 효소이다. 시주카헨리올의 Nrf2 활성화를 통해 항산화 효소인 HO-1, GCLC 및 GCLM의 발현을 유도하는지 확인하였다. 상기 효소들의 발현은 BV-2 미세아교세포(microglial cell)에 화합물을 처리한 후 각 효소들의 발현양을 상기 웨스턴블롯(western blot)을 통해 확인하였다.

BV-2 미세아교세포에 대한 시주카헨리올의 세포 독성 여부를 확인하였다. 세포 생존률은 살아있는 세포에서 미토콘드리아 탈수소효소 활성에 의해 무색의 WST-8로부터 오렌지색 포르마잔 대사물이 생성되는지를 측정하여 확인하였다.

96-well plate에 BV-2 미세아교세포를 15,000 cell/well로 접종하고, 24시간 동안 다양한 농도의 시주카헨리올로 처리하여 24시간 동안 배양한 뒤, CCK-8 reagent로 4시간 동안 처리하고, microplate reader(SpectraMax®i3; Molecular Devices)를 이용하여 450 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. CCK-8 테스트 결과, 세포생존능은 시주카헨리올의 농도에 의해 큰 영향을 받지 않는 것을 확인하였다.

도 3에 나타낸 바와 같이, 시주카헨리올의 농도를 각각 0, 3, 10 및 30 μM 농도로 처리한 결과, 상기 HO-1, GCLC 및 GCLM이 모두 농도의존적으로 발현양이 증가한 것을 확인할 수 있다. 상기한 결과들을 통해 시주카헨리올이 Nrf2를 활성화시킴으로써 세포 내의 항산화효소들의 발현양을 증가시키는 것을 검증하였다.

시험예 3. 시주카헨리올의 항염증 효능 검증

시주카헨리올의 항염증 효능을 알아보기 위해서 BV-2 미세아교세포(microglial cell)에 리포폴리사카라이드(Lipopolysaccharide, LPS)를 처리하여 염증을 유도한 후, 시주카헨리올의 처리농도에 따른 항염증 관련 인자 발현을 비교하였다.

먼저, LPS에 의한 염증 유도시에 가장 대표적으로 증가하는 산화질소(Nitric oxide, NO)를 정량하였다.

BV-2 미세아교세포를 96 well plate에 2x10⁴cells/well 씩 분주하여 배양한 후 lipopolysaccharide(0.2 ug/ml)로 처리하여 활성을 유도하였다. 이때 적절 농도의 시험대상 화합물을 공동처리하였다. 24 시간 후, 배양액에 존재하는 nitrite, 즉 NO 산화물질을 Griess reaction 방법으로 정량한다. Griess reaction 방법은 각 well에서 200 μl의 배양액을 취하여 새 96 well plate로 옮기고 100 μl의 Griess reagent(1% sulphanilamide, 0.1% naphthylethylenediamine dihydrochloride, 2.5% H₃PO₄)를 첨가한 후 상온에서 10분간 반응시킨 다음, SpectraMax Plus microplate spectrophotometer(Molecular Devices)를 사용하여 540 nm 파장에서 흡광도를 측정함으로써 수행하였다. NaNO₂에 대한 표준 곡선을 각 농도별로 작성하고, 이를 기준으로 Nitrite 를 정량하였다.

도 4를 참고로 하면, LPS 처리시 산화질소(NO)의 생성량이 LPS를 처리하지 않은 대조군 대비 3배 이상 증가하였다. 한편, 시주카헨리올을 각각 5, 10, 20, 30 μM으로 처리하였더니 농도의존적으로 산화질소의 생성량이 감소한 결과를 얻었는데, 이는 종래의 Nrf2 활성화 약물인 DMF 및 MMF를 30 μM으로 처리한 대조군에 비해서도 훨씬 더 우수한 저해율을 나타내는 것이다.

한편, LPS 처리는 TNF-α의 생성량도 함께 증가시킴으로 염증을 유발하는 문제가 있다. 이에 ELISA 키트를 이용하여 시주카헨리올 농도에 따른 TNF-α변화를 확인하였다. 산화질소와 마찬가지로 본 발명에 따른 시주카헨리올을 각각 5, 10, 20, 30 μM으로 처리하였더니 농도의존적으로 TNF-α의 생성량이 감소되는 결과를 얻었다. 상기한 결과를 바탕으로 본 발명에 따른 시주카헨리올이 염증시 발생하는 염증인자를 감소시킬 수 있음을 실험을 통해 확인하였고, 이에 항염증 효능을 증명하였다.

시험예 4. 시주카헨리올의 신경세포보호 효능 검증

상기 시험예 1 내지 2을 통해 시주카헨리올이 Nrf2를 활성화시키며, 상기 활성화를 통해 항산화 및 항염증 효능을 보임을 확인하였다. 이러한 활성 효능이 실질적으로 신경세포를 보호하는지 여부를 확인하였다. 과산화수소(Hydrogen peroxide; H₂O₂)는 산소의 환원 대사물로서 정상 세포 내 대사과정이나 세포질 내 효소들의 작용으로 형성되며 세포에 심각한 손상을 일으키는 원인이 된다. 이 세포들은 항산화 방어기전으로 H₂O₂의 축적에 대항하나 항산화 능력을 초과하는 경우 산화적 스트레스에 노출되어 결국에 세포사멸로 이어진다. 이에, 시주카헨리올의 신경세포보호 효능을 검증하기 위해 BV-2 미세아교세포에 과산화수소(Hydrogen peroxide; H₂O₂)를 처리하여 산화성 스트레스에 의한 세포사멸을 유도하였고, 시주카헨리올의 처리시 세포사멸을 저해하는지 여부를 확인하였다.

96-well 마이크로 플레이트에 BV-2 세포를 웰당 5000 cell의 밀도로 심어 24시간 동안 배양하였다. 측정 화합물은 DMSO에 용해시킨 뒤(DMSO, 최종농도<0.5%) 배양배지에서 희석하였다. Vehicle control은 동일한 농도의 DMSO를 사용하였다. 화합물은 다양한 농도에서 24시간 동안 전처리하여 이용하였다.

BV-2 세포에 250 μM의 H₂O₂를 과량으로 처리하고 2시간 동안 배양하여 산화적 스트레스를 유도하였다. 2시간 후, H₂O₂가 포함된 세포배양액을 새로운 배지로 교환한 후, 살아있는 세포와 죽은 세포를 2 ㎍/mL Propidium iodide(PI; Sigma-Aldrich, excitation/emission of 535/617 nm)와 2 ㎍/mL Hoechst33342를 사용하여 15분 동안 염색하였다. 구체적으로 전체 세포의 핵을 Hoechst33342(Thermo Scientific, Fisher, IL, USA, excitation/emission of 350 nm/461 nm)를 이용하여 염색한 다음, 그중에 사멸한 세포의 핵은 PI를 이용하여 염색함으로써 이중 염색을 통해 전체 세포 중에서 사멸한 세포의 양을 Harmony®software를 이용하여 정량하였다. 형광이미지는 Operetta high-content imaging system(Perkin Elmer, Waltham, MA, USA)을 사용하여 얻었다.

하기 도 5는 250 μM의 H₂O₂를 처리한 세포들을 Propidium iodide(PI)와 Hoechst33342로 염색한 형광이미지 및 세포사멸율을 계산한 그래프이다.

도 5의 형광이미지를 참조하면 PI에 의해 붉게 염색된 세포들을 관찰할 수 있는데, 이는 산화적 스트레스에 의해 사멸된 세포를 의미한다. 시주카헨리올의 처리 농도가 높아질수록 붉게 염색된 세포의 수가 감소한 결과를 얻었었는데, 이를 통해 시주카헨리올이 농도의존적으로 세포사멸을 저해하는 것을 입증하였다.

시험예 5. NMO-IgG에 의해 유발된 세포사멸 저해 효과 검증

본 발명에 따른 화합물이 NMO-IgG에 일어나는 세포사멸을 저해하는지 확인하였다. 젖산탈수소효소 분비(lactate dehydrogenase release assay; LDH assay)를 이용하여 NMO-IgG와 human complement에 의해 cytotoxicity가 일어난 군보다 본 발명에 따라 시주카헨리올이 처리된 군에서 더 낮은 LDH release 수치를 나타내는지 검증하였다.

시험예 5.1. 젖산탈수소효소 분비( lactate dehydrogenase release assay ; LDH assay ) 검사

하기 도 6에 나타낸 방법으로 젖산탈수소효소 분비검사(LDH assay)를 수행하였다. Complement dependent cytotoxicity 저해 정도는 CytoTox-ONE Homogeneous Membrane Integrity Assay Kit(Promega, Madison, USA)를 사용하여 NMO환자의 IgG와 인간 보체 human complement를 처리하여 보체에 의한 cell death(compelent dependent cytotoxicity)를 LDH-releasing 수치의 감소정도에 의하여 측정하였다.

U87MG-AQP4 over-expressed stable cell은 완전 배지[10% 우태아혈청(FBS, Thermo Scientific), 1% 페니실린/스트렙토마이신(Penstripe, Gibco), 400ng/mL G418-disulfate(Duchefa Biochemie)]이 첨가된 DMEM 배지에 섞어주고 96 well plate에 2.5×10⁴세포/well로 분주한 후 37 ℃ 배양기에서 이틀 동안 배양하였다. 그 후, 배지를 제거하고 HBSS(Sigma)로 1회 세척한 후 50 μL의 0.2% DMSO가 포함된 후보 물질들을 농도별로 처리한 후 50 μL의 NMO-IgG 100 μg/mL 와 5% human complement를 혼합하여 96 well에 반응시켰다.

1시간 후, 100 μL의 LDH detecting reagent를 넣어주고 10분 후 microplate reader에서 형광(fluorescence)을 excitation 560 nm, emission 590 nm에서 측정하였다.

시험예 5.2. Complement dependent cytotoxicity ( CDC ) assay 법 검증

CDC assay는 NMO-IgG의 AQP-4 결합과 함께 complement의 IgG 결합으로 인해 cell membrane이 손상됨으로 인한 cytotoxicity를 측정하는 방법으로 시험예 6.1의 방법에 따라 손상된 세포 밖으로 나오는 lactate dehydrogenase(LDH)를 이용해 cytotoxicity 정도를 측정하는 LDH assay를 진행하였다. 이 방법을 검증하기 위해 AQP-4가 trasfection된 U87-MG 세포주와 대조군 세포주 모두에서 CDC assay를 진행하였다. 또한 NMO 환자의 IgG와 건강한 사람의 IgG를 함께 비교 시험하여 효능 평가시스템을 검증하였다.

하기 도 7E에 나타낸 바와 같이, AQP-4가 발현되는 세포에 NMO 환자의 IgG를 처리했을 때 농도 의존적으로 CDC가 일어남을 확인할 수 있었다. 이에, 본 발명에서 사용한 CDC assay법을 통해 NMO-IgG가 AQP-4와의 결합에 의해 일어남을 검증하였다.

시험예 5.3. Complement dependent cytotoxicity ( CDC ) assay

시주카헨리올(이하, "실시예 1"라 한다)의 CDC assay에 대한 LDH release 수치를 대조군(100%) 대비 퍼센트 환율로 계산하여 하기 표 1에 나타내었다. 표 1 에 나타낸 바와 같이 본 발명에 따른 실시예1 화합물은 기존에 보고된 활성 화합물인 arbidol 보다 더 낮은 LDH release 수치를 나타내는 것을 확인하였다. 이에, 본 발명에 따른 화합물이 Nrf2 활성화를 통해 NMO-IgG에 일어나는 세포사멸을 저해하는 효과가 있음을 확인하였다.

구분	CDC assay(대조군대비 LDH release)
vehicle	100
실시예 1	72
arbidol	75

Claims

클로란투스 헨리(Chloranthus henryi) 에틸아세테이트 추출물을 유효성분으로 포함하는 시신경 척수염 또는 다발성경화증의 예방 또는 치료용 약학조성물.
제1항에 있어서,
상기 클로란투스 헨리 에틸아세테이트 추출물의 유효성분은 하기 [화학식 1]로 표시되는 세스퀴터핀 화합물인 것을 특징으로 하는 약학조성물.
[화학식 1]
제1항에 있어서,
상기 클로란투스 헨리 아세테이트 추출물은 NF-E2-related factor-2를 활성화시키는 것을 특징으로 하는 약학조성물.
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인간의 것을 제외한 세포에 하기 [화학식 1]로 표시되는 세스퀴터핀 화합물을 유효성분으로 포함하는 클로란투스 헨리 에틸아세테이트 추출물을 처리하여 NMO-IgG(Neuro myelitis Optica-IgG)와 아쿠아포린 4 단백질의 결합에 의해 유발되는 세포사멸을 억제하는 방법.
[화학식 1]
인간의 것을 제외한 세포에 하기 [화학식 1]로 표시되는 세스퀴터핀 화합물을 유효성분으로 포함하는 클로란투스 헨리 에틸아세테이트 추출물을 처리하여 해당 세포에서 리포폴리사카라이드의 자극에 의해 생성되는 일산화질소의 양을 억제하는 방법.
[화학식 1]