JP6864508B2

JP6864508B2 - キマーゼ阻害用組成物

Info

Publication number: JP6864508B2
Application number: JP2017053146A
Authority: JP
Inventors: 征次阿部; 櫻田　剛史; 剛史櫻田; 公太中川; 雅哉坪川; 秀則浦田
Original assignee: Fancl Corp
Current assignee: Fancl Corp
Priority date: 2016-03-29
Filing date: 2017-03-17
Publication date: 2021-04-28
Anticipated expiration: 2037-03-17
Also published as: JP2017178935A

Description

本発明は、アンペロプシンを有効成分として含有するキマーゼ阻害用組成物に関する。

キマーゼは、肥満細胞が産生分泌するキモトリプシン様の酵素である。ヒト血管に従来のレニン・アンジオテンシン（ＲＡ）系に属さない、アンジオテンシン（Ａｎｇ）ＩＩ産生機構が存在することが知られていた。この生成機構に係るセリンプロテアーゼがキマーゼであることが近年判明した。ＡｎｇＩＩは、循環系において、血圧調節のみならず、最近は、広く臓器障害と見なされる病的組織リモデリングにかかわる因子として注目されている。
レニンの作用によって、アンジオテンシノーゲンからアミノ酸１０残基から成るアンジオテンシンＩが作り出される。その後、これがアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）、キマーゼ、カテプシンＧの働きによってＣ末端の２残基が切り離され、アンジオテンシンＩＩ（ＡｎｇＩＩ）に変換される。ヒトキマーゼは、循環血中ではなく、ヒト組織で作用する特異的なＡｎｇＩＩ産生酵素であると考えられている。
ヒトキマーゼ阻害剤は、あらたな高血圧治療剤として注目されている。また、キマーゼ阻害剤を高血圧治療剤や心臓病、脳卒中、血管障害、動脈硬化、腎炎、又は腎不全の治療剤とする提案がある（特許文献１）。

また、上記のとおりキマーゼは主に肥満細胞内顆粒成分として、皮膚、心臓、血管壁、腸管等の組織に広く存在しており、キマーゼがラット腹腔マスト細胞に作用し脱顆粒を惹起し、キマーゼ阻害剤が、ＩｇＥを介したマスト細胞の脱顆粒を抑制するといった報告があり、マスト細胞の機能におけるキマーゼの関与が指摘されていた。また最近、ヒトキマーゼをマウスの腹腔内やモルモットの皮内に投与することにより好酸球等の白血球の浸潤が誘発されることや、ヒトキマーゼがＩＬ−１β（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１β）の前駆体に作用し、活性型のＩＬ−１βに変換すること、或いは、ヒトキマーゼがＳｔｅｍＣｅｌｌＦａｃｔｏｒ（ＳＣＦ）と呼ばれるサイトカインの膜結合型分子を部分分解し、膜非結合型分子に変換する作用を持つこと等が相次いで報告され、アトピー性皮膚炎などのアレルギー性疾患においてキマーゼが何らかの役割を持つ可能性が示唆されている。このような免疫関連の研究から、キマーゼ阻害性物質を気管支喘息、じん麻疹、アトピー性皮膚炎、アレルギー性結膜炎、鼻炎、関節リューマチ、マストサイトーシス、強皮症、心不全、心肥大、うっ血性心疾患、高血圧、アテローム動脈硬化、心筋虚血、心筋梗塞、経皮的冠動脈形成術後再狭窄、バイパスグラフト術後再狭窄、虚血性末梢循環障害、高アルドステロン症、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症、腎炎、糸球体硬化症、腎不全、乾癬、固形腫瘍、手術後癒着、緑内障および高眼圧症などの予防治療剤とする提案がある（特許文献２）。

これまで公知のキマーゼ阻害作用を有する化合物は、大半が化学合成された物質であるが、特許文献３には天然の地衣類に分類されるスルカリア・スルカタ又はロバリア・クロカワエ、又はスルカリア・スルカタの抽出物又はロバリア・クロカワエの抽出物を含有するキマーゼ阻害剤が記載されている。このような食品由来や、植物等の抽出物は、食経験が長く、その安全性も熟知されており、キマーゼ阻害剤として利用する場合、有用性が高
いと考えられる。特許文献３のキマーゼ阻害剤は、和名を「バンダイキノリ」とするスルカリア・スルカタが食品として中国や日本で広く利用されていることが記載されている。

このような背景にあって、本発明者らも天然物や天然抽出物についてキマーゼ阻害物の探索を行っている。その過程で、伝統的な食品である藤茶にキマーゼ阻害活性が存在することを発見した。藤茶には様々な薬効が存在することが知られている。その作用は、皮脂分泌抑制（特許文献４）、急性肝炎などの肝臓疾患治療効果（特許文献５）、抗菌効果（特許文献６）、色素退色防止作用（特許文献７）など多岐に渡っている。しかし藤茶にキマーゼ阻害作用が存在することは、食経験の長い食品でありながらこれまでまったく知られていなかった。

特開２００７−３１４５６８号公報国際公開第２００７／１３９２３０号特開２０１５−１４７７３６号公報特開２００３−２３８３７９号公報特開２００３−２６５８４号公報特開２００２−１５９５６６号公報特開２００２−６５２０１号公報

本発明者らは、上記のような背景技術をもとに研究を行い、藤茶抽出物が強いキマーゼ阻害作用を有していることを発見した。そして、さらに研究を進めたところ、キマーゼ阻害作用を示す物質が藤茶中に含まれるフラボノイドの一種であるアンペロプシンであることを発見し、本発明をなした。

すなわち、本発明の課題はアンペロプシンを有効成分とする、キマーゼ阻害作用を有する組成物及び藤茶抽出物を有効成分とするキマーゼ阻害用組成物を提供することにある。

本発明の主な構成は以下の通りである。
（１）アンペロプシンを有効成分として含有するキマーゼ阻害用組成物。
（２）アンペロプシンを１０質量％以上含有するキマーゼ阻害用組成物。
（３）アンペロプシンが藤茶抽出物由来である（１）又は（２）に記載のキマーゼ阻害用組成物。
（４）藤茶抽出物を含むキマーゼ阻害用組成物。
（５）アンペロプシン又は藤茶抽出物を有効成分とするキマーゼに由来する疾患の治療又は予防用組成物。
（６）キマーゼに由来する疾患が、気管支喘息、じん麻疹、アトピー性皮膚炎、アレルギー性結膜炎、鼻炎、関節リューマチ、マストサイトーシス、強皮症、心不全、心肥大、うっ血性心疾患、高血圧、食塩依存性高血圧、アテローム動脈硬化、心筋虚血、心筋梗塞、経皮的冠動脈形成術後再狭窄、バイパスグラフト術後再狭窄、虚血性末梢循環障害、高アルドステロン症、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症、腎炎、糸球体硬化症、腎不全、乾癬、固形腫瘍、手術後癒着、緑内障および高眼圧症から選択されるいずれかの疾患である（５）に記載の組成物。
（７）高血圧治療又は予防用の藤茶抽出物含有飲食品組成物。
（８）アンペロプシンを１０質量％以上含有する（７）に記載の飲食品組成物。

本発明によりあらたなキマーゼ阻害用組成物が提供される。本発明の組成物は、気管支喘息、じん麻疹、アトピー性皮膚炎、アレルギー性結膜炎、鼻炎、関節リューマチ、マストサイトーシス、強皮症、心不全、心肥大、うっ血性心疾患、高血圧、食塩依存性高血圧、アテローム動脈硬化、心筋虚血、心筋梗塞、経皮的冠動脈形成術後再狭窄、バイパスグラフト術後再狭窄、虚血性末梢循環障害、高アルドステロン症、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症、腎炎、糸球体硬化症、腎不全、乾癬、固形腫瘍、手術後癒着、緑内障および高眼圧症などの予防治療剤及びこれらの疾患の改善用飲食品組成物とすることができる。

本発明の組成物及び市販品の藤茶抽出物のキマーゼ活性阻害率を測定した結果を示すグラフである。本発明の組成物が、高血圧誘導時の心拍数（ＨＲ）に及ぼす効果を示すグラフである。本発明の組成物が、高血圧誘導時の収縮期血圧（ＳＢＰ）に及ぼす効果を試験した結果を示すグラフである。本発明の組成物が、高血圧誘導時の平均血圧（ＭＢＰ）に及ぼす効果を試験した結果を示すグラフである。本発明の組成物が、高血圧誘導時の拡張期血圧（ＤＢＰ）に及ぼす効果を試験した結果を示すグラフである。本発明の組成物が、高血圧誘導後の心拍数（ＨＲ）に及ぼす効果を試験した結果を示すグラフである。本発明の組成物が、高血圧誘導後の収縮期血圧（ＳＢＰ）改善作用を有することを試験した結果を示すグラフである。本発明の組成物が、高血圧誘導後の平均血圧（ＭＢＰ）改善作用を有することを試験した結果を示すグラフである。本発明の組成物が、高血圧誘導後の拡張期血圧（ＤＢＰ）改善作用を有することを試験した結果を示すグラフである。

本発明は、アンペロプシンを有効成分として含有するキマーゼ阻害用組成物に係る発明である。
藤茶は、ブドウ科蛇葡萄属の植物であり、中国名を顕歯蛇葡萄という。学名は、Ampelopsis grossedentataである。主には中国の広西、広東、雲南、貴州、湖南、湖北、江西、福建などの省並びに自治区に分布している。中国の広西、湖南などの省や自治区の壮族や瑶族の人々がこの茎および葉から作った飲料を常用しており、風邪、のどの痛みなどにも利用されている。アンペロプシンは、藤茶の示す肝臓疾患の治療作用や抗菌作用の活性本体として特定されている。

アンペロプシンは、下記の式で表される。

アンペロプシンは、例えば、藤茶（Ａｍｐｅｌｏｐｓｉｓｇｒｏｓｓｅｄｅｎｔａｔａ）、大叶蛇葡萄（Ａｍｐｅｌｏｐｓｉｓｍｅｇａｌｏｐｈｙｌｌａ）、広東蛇葡萄（Ａｍｐｅｌｏｐｓｉｓｃａｎｔｏｎｉｅｎｓｉｓ）、ケンポナシ（Ｈｏｖｅｎｉａｄｕｌｃｉｓ）、オノエヤナギ（Ｓａｌｉｘｓａｃｈａｌｉｎｅｎｓｉｓ）、ヨレハマツ（Ｐｉｎｕｓｃｏｎｔｏｒｔａ）、Ｅｒｙｔｈｒｏｐｈｌｅｕｍａｆｒｉｃａｎｕｍ及びカツラ（Ｃｅｒｃｉｄｉｐｈｙｌｌｕｍｊａｐｏｎｉｃｕｍ）から選ばれる植物の抽出物から単離精製することができる。これらの中でも、藤茶が好ましい。

具体的には、Ａｍｐｅｌｏｐｓｉｓ属植物である藤茶（Ａｍｐｅｌｏｐｓｉｓｇｒｏｓｓｅｄｅｎｔａｔａ）から、下記のようにしてアンペロプシンを得ることができる。
すなわち、乾燥させた藤茶の枝葉部を含水エタノールで抽出した抽出物を濃縮し、例えば多孔性樹脂（ＤＩＡＩＯＮＨＰ−２０）を用いたカラムクロマトグラフィーにかけ、８０容量％含水メタノールで溶出される分画にアンペロプシンが得られる。これを逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィーや再結晶により、更に精製することができる。精製されたアンペロプシンは、試薬としても販売されており、これを用いることもできる。

キマーゼ阻害組成物としては、上記のアンペロプシンを１０質量％以上含有するものであれば使用可能である。このような組成物を藤茶から得るためには以下のような操作を行う。
乾燥した藤茶の葉又は茎の粉砕物又は粉末を抽出原料とし、水若しくは親水性有機溶媒又はこれらの混合溶媒に投入し、室温乃至溶媒の沸点以下の温度で任意の装置を用いて抽出することにより得ることができる。

抽出に用いる有機溶媒としては、例えばメタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール等の炭素数１〜５の低級アルコール；アセトン、メチルエチルケトン等の低級脂肪族ケトン；１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、イソプロピレングリコール、グリセリン等の炭素数２〜５の多価アルコールなどが挙げられる。
また、これら親水性有機溶媒と水との混合溶媒などを用いることができる。なお、水と親水性有機溶媒との混合系溶媒を使用する場合には、低級アルコールの場合は水１０質量部に対して３０〜９０質量部、低級脂肪族ケトンの場合は水１０質量部に対して１０〜４０質量部、多価アルコールの場合は水１０質量部に対して１０〜９０質量部添加することが好ましい。

抽出溶媒を満たした処理槽に、藤茶の乾燥・粉砕物を投入し、必要に応じて時々撹拌しながら、３０分〜２時間静置して可溶性成分を溶出した後、ろ過して固形物を除去し、この抽出液から抽出溶媒を留去し、乾燥することにより抽出物が得られる。抽出溶媒量は、抽出原料の通常５〜１５倍量（質量比）であることが好ましく、抽出条件は、抽出溶媒として水を用いた場合には、通常５０〜９５℃で１〜４時間程度である。また、抽出溶媒として水とエタノールとの混合溶媒を用いる場合には、通常４０〜８０℃で３０分〜４時間程度である。

得られた抽出液から抽出溶媒を留去するとペースト状の濃縮物が得られる。更に乾燥すれば、固形の抽出物が得られる。本発明においては、アンペロプシンの含有量が１０質量％以上、好ましくは２０質量％以上であれば、上記抽出液又はその濃縮液の状態であっても良い。これらは、活性炭処理、吸着樹脂処理、イオン交換樹脂、液―液向流分配などの方法により精製してから用いても構わない。
したがって、上記の藤茶から抽出しアンペロプシンの濃度を高めた抽出物も本発明の組成物として使用可能である。

組成物中のアンペロプシンの含有量は、ＨＰＬＣなど公知の分析方法で分析することができる。定量方法の概略は次のとおりである。
・試料溶液の調製
試料（抽出物）約２０ｍｇを精秤し、蒸留水を加えて超音波処理して溶解し、正確に５０ｍＬとする。この溶液２ｍＬを５０ｍＬに正確に希釈し、試料溶液とする。
・標準溶液の調製と検量線作成
標準品（ＤｉｈｙｄｒｏｍｙｒｉｃｅｔｉｎＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社製）２．００ｍｇを精秤し、１００％アセトニトリルを適量加えて超音波処理して溶解し、さらにアセトニトリルを加えて正確に２５ｍＬとし、アンペロプシン標準原液８０μｇ／ｍＬを調製する。この標準原液を蒸留水にて正確に５倍希釈して、１６μｇ／ｍＬアンペロプシン標準溶液を調製する。ＨＰＬＣへの注入量を１０、２０、４０μＬとし、アンペロプシンのピークに基づいて検量線を作成する。
・ＨＰＬＣ測定条件
下記表１の条件に設定する。

本発明のキマーゼ阻害用組成物は、そのまま、あるいは各種賦形剤を添加して製剤化する。製剤としては顆粒剤、錠剤、カプセル剤を例示することができる。
また組成物をそのまま、あるいは製剤化したものを飲食品に添加して用いることもできる。
なお製剤化に当たっては、賦形剤やその他の有効成分を本発明の組成物の目的を阻害しない範囲で使用することができる。具体的には、シクロデキストリン、へミセルロース、リグニン、グアーガム、コンニャクマンナン、イサゴール、アルギン酸、寒天、カラギーナン、キチン、カルボキシルメチルセルロース、ポリデキストロースなどの食物繊維や増粘剤、食用油、カルシウム、鉄、ナトリウム、亜鉛、銅、カリウム、リン、マグネシウム、ヨウ素、マンガン、セレンなどのミネラル；ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＫ、ナイアシン、葉酸、パントテン酸などの脂溶性又は水溶性のビタミン群、グリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステル、リン脂質、アラビアガム、キサンタンガム、トラガカントガム、ローカストビーンガムなどの乳化剤や分散剤、増量剤、賦形剤、保存料・酸化防止剤、風味調整剤や香料、塩化ナトリウム、グルタミン酸ナトリウム、グリシン、コハク酸、乳酸ナトリウムなどの呈味料、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸、アジピン酸、フマル酸、リンゴ酸などの酸味料、マルチトール、アスパルテームなどの低カロリー甘味料、着色剤などである。
なお本発明のキマーゼ阻害組成物には、アンペロプシンを１０〜５００ｍｇ、好ましくは５０〜３００ｍｇ、特に好ましくは１００〜２００ｍｇを含有するように調製する。

以下に本発明の組成物の製造例及びこの組成物を用いた試験例を示し、本発明をさらに説明する。
＜藤茶抽出物の製造例１＞
乾燥藤茶１重量部（２００ｇ）に対して水を１５倍量加え９０℃に加熱し、１時間抽出しろ過を行い、１番抽出液を得た。次いでこの残渣に水を１２倍量加え、９０℃に加熱し、その後ろ過を行い、２番抽出液を得た。両抽出液を合算し、減圧濃縮し、濃縮液約３００ｍＬを−４０℃で凍結し、さらに凍結乾燥装置で乾燥し、乾燥物を得た。これを粉砕し、６０メッシュの篩で篩い分けし、通過物８５ｇをキマーゼ阻害用組成物とした。この組成物中のアンペロプシン含有量は６５．８質量％であった。

＜藤茶抽出物の製造例２＞
乾燥藤茶１重量部（２００ｇ）に対して５０％エタノール水溶液を１５倍量加え、還流冷却機を付して加熱し、１時間抽出しろ過を行い、１番抽出液を得た。次いでこの残渣に同様に５０％エタノール水溶液を１２倍量加え、９０℃に加熱し、３０分間抽出しろ過を行い、２番抽出液を得た。両抽出液を合算し、減圧濃縮し、濃縮液約３００ｍＬを−４０℃で凍結し、さらに凍結乾燥装置で乾燥し、乾燥物を得た。これを粉砕し、６０メッシュの篩で篩い分けし、通過物７８．１ｇをキマーゼ阻害用組成物とした。この組成物中のアンペロプシン含有量は５２．９質量％であった。

＜藤茶抽出物の製造例３＞
製造例１と同様に、乾燥藤茶１重量部に対して水を１５倍量加え９０℃に加熱し、１時間抽出しろ過を行い、１番抽出液を得た。次いでこの残渣に水を１２倍量加え、９０℃に加熱し、３０分間抽出しろ過を行い、２番抽出液を得た。両抽出液を合算し、減圧濃縮し、濃縮液約３００ｍＬを得た。さらにグアガム分解物を、濃縮液あたりを７８ｇ添加し、−４０℃で凍結し、さらに凍結乾燥装置で乾燥し、乾燥物を得た。これを粉砕し、６０メッシュの篩で篩い分けし、通過物１６３．１ｇをキマーゼ阻害用組成物とした。この組成物中のアンペロプシン含有量は２４．７質量％であった。

＜藤茶抽出物の製造例４＞
製造例１と同様に、乾燥藤茶１重量部に対して水１５倍量加え９０℃に加熱し、１時間抽出しろ過を行い、１番抽出液を得た。次いでこの残渣に水を１２倍量加え、９０℃に加熱し、３０分間抽出しろ過を行い、２番抽出液を得た。両抽出液を合算し、減圧濃縮し、濃縮液約３００ｍＬを得た。さらにγシクロデキストリンを、濃縮液中に７８ｇ添加し、−４０℃で凍結し、さらに凍結乾燥装置で乾燥し、乾燥物を得た。これを粉砕し、６０メッシュの篩で篩い分けし、通過物１５１．４ｇをキマーゼ阻害用組成物とした。この組成物中のアンペロプシン含有量は４５．２質量％であった。

・キマーゼ阻害試験
（１）試験試料
製造例１〜５の組成物、市販の藤茶抽出物（市販品１）、及びアンペロプシン精製物（シグマ・アルドリッチ社）を用いて試験をおこなった。

（２）試験方法
１）試験試料調製方法
各試料のアンペロプシン含有量がそれぞれ所定の濃度（ｍＭ）になるように、各試験試
料を水で溶解した。各試験試料濃度の詳細は以下の表２に示す。

２）キマーゼ活性阻害試験方法
キマーゼ活性阻害の評価（ｉｎｖｉｔｒｏ）は、ＥｕｒＪＢｉｏｃｈｅｍ２６８（２２），ｐｐ．５８８５−５８９３（２００１）に記載された方法に変更を加えた以下の方法で行った。
この評価方法では、ヒトキマーゼの基質となるアンジオテンシンＩをＤｎｐ／Ｎｍａ修飾した基質を用い、キマーゼがこの基質を切断し、アンジオテンシンＩＩを産生すると蛍光発色することを利用する簡易的な方法である。以下に当該評価方法の概要を記述する。
インキュベーションバッファーは１００ｍＭＮａＣｌ含有２０ｍＭリン酸緩衝液で総インキュベーション溶液量は１００μＬである。まず、サンプルを５μＬ加え、そこへ標準ヒトキマーゼ（シグマ・アルドリッチ社製）が０．００１２単位含まれるように調整し、室温で前インキュベーションを３０分間施行後、基質であるＤｎｐ／Ｎｍａ修飾アンジオテンシンＩを最終濃度が２００μＭになるように加え、３７℃で３０分インキュベーションする。０．５ＭＮａＯＨを２５μＬ加えてインキュベーションを終了した。産生されたＤｎｐアンジオテンシンＩＩの発光蛍光（４６０ｎｍ）を測定し、標準ＤｎｐアンジオテンシンＩＩによって作成した標準曲線から産生量を計算した。試験試料を加えないコントロールを対照として、検定サンプルのヒトキマーゼ活性阻害及び阻害率を求めた。ヒトキマーゼによるアンジオテンシン生産能の抑制率試験の試験操作手順は以下の通りである。

＜１＞試験試料を水で溶解および段階希釈により、テスト用ストック（アンジオテンシンＩ添加時に目的濃度となる濃度（２０倍濃い濃度にすることが好ましい）を作成する。
＜２＞９６ｗｅｌｌプレートに、キマーゼ標準品１．２ｍＵ／ｗｅｌｌ、ａｓｓａｙｂｕｆｆｅｒ、テストサンプルを混入し、２５℃下で３０分間振盪しながら、プレインキュベーションする。
＜３＞アンジオテンシンＩを反応濃度２００μＭで添加し、３７℃で３０分間振盪しつつ反応させる。
＜４＞３０分経過後ただちにＮａＯＨを添加し反応を止める（３０分のカウントはｗｅｌｌごとに管理）。
＜５＞蛍光プレートリーダーにて測定を行う。励起波長：３５５ｎｍ、測定波長：４６０ｎｍ。
試験後、以下の計算式を用いて、ヒトキマーゼによるアンジオテンシン生産能の抑制率を求める。
※試験試料を添加しないｗｅｌｌの結果を抑制率０％として、各サンプルの抑制率を算出する。
（計算方法）抑制率＝（１−Ａ／Ｂ）×１００
Ａ：各サンプル値
Ｂ：テスト品を使用しないｗｅｌｌの結果値

３）濃度設定試験方法
アンペロプシン及び製造例１〜４のそれぞれについてアンペロプシン量を基に、最終試験に用いる試料濃度を調整した。これを用いてヒトキマーゼによるアンジオテンシン生産能の抑制率試験を実施した。

（３）試験結果
ヒトキマーゼによるアンジオテンシン生産能抑制率試験の結果を下記表３及び図１に示す。また、各試験試料のヒトキマーゼ産生能の抑制から、各試料のヒトキマーゼ生産能の抑制率５０％を示す値（ＩＣ５０値）を表４に示す。ＩＣ５０は下記式による。

［式１］

Ａ：５０％を挟む高い濃度
Ｂ：５０％を挟む低い濃度
Ｃ：Ｂでの阻害率
Ｄ：Ａでの阻害率

以上の試験結果、アンペロプシンは、最終濃度２００μＭでヒトキマーゼを完全に抑制することができることがわかった。またＩＣ５０は、アンペロプシンの含有量と逆相関していた。

以上の製造例及び試験結果から、藤茶抽出物をキマーゼ阻害剤とするためには、アンペロプシン含有量を高めるような抽出濃縮操作を行う必要があることがわかる。よって、アンペロプシンは新規なキマーゼ阻害剤として有用である。

・動物試験
キマーゼの標的基質であるアンジオテンシンＩが分解されてアンジオテンシンＩＩが生成し、血圧を上昇させる。このため、血圧を指標として本発明のキマーゼ阻害用組成物の作用効果を動物試験によって確認した。
＜１．食塩による血圧上昇抑制試験＞
（１）試験動物及び試験方法
８週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスを１群７匹とした。

（２）検体
精製アンペロプシン及び試験試料として製造例１で得た藤茶抽出物をベースとして、デキストリンを混合しアンペロプシン３０質量％含有の組成物を調製した。

（３）試験方法
マウスに２％食塩水（ＮａＣｌ）を１２週間自由摂水の状態で与えて高血圧モデルを作製した。なおマウスに２％食塩水投与によってマウスキマーゼＭＭＣＰ４及びＭＭＣＰ５が活性化されて高血圧が発症する（Devarajan S他、Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2015 Dec 1;309(11):H1987-96.:参照）。
また水のみの投与群を対照として設定した。
試験開始日より連続６週間ゾンデにより１回／日の頻度で、表５に示す検体を強制投与した。６週間経過後は、検体の投与を中止し１２週間まで観察及び血圧を測定した。
血圧は、苦痛を与えない状況で、１回／週の頻度で尾を用いて測定した。なお心拍数（ＨＲ）、収縮期血圧（ＳＢＰ）、平均血圧（ＭＢＰ）、拡張期血圧（ＤＢＰ）を測定し、記録した。また、投与群は次の表５の群分けとした。

（４）結果
１２週間の心拍数（ＨＲ）、収縮期血圧（ＳＢＰ）、平均血圧（ＭＢＰ）、拡張期血圧（ＤＢＰ）の値をそれぞれ平均し、プロットした結果をそれぞれ図２〜５に示した。なお１−Ｉ、１−ＩＩ群は血圧上昇が起こらなかったため図には記載しなかった。また１−ＩＩＩ群（食塩水投与）に対する有意差を二元配置分散分析法で有意差検定した（有意水準Ｐ＜０．０１２５）。
血圧：
藤茶抽出物（試験試料）低用量の群（１−Ｖ）は殆ど降圧を認めなかった。一方高用量の群（１−ＶＩ，１−ＶＩＩ）は、ほぼ完璧に血圧上昇を抑制した。藤茶抽出物投与を中止後（７週以降）は、１−ＶＩ，１−ＶＩＩとも徐々に血圧は上昇し１２週経過すると、糖茶抽出物無投与の群とほぼ同じ血圧に上昇した。
一方、アンペロプシン投与群（１−ＩＶ）は、６週の投与期間血圧の上昇を完全に抑制した。投与中止後１２週まで血圧の上昇は抑制されておりレガシー効果を有していることが確認された。この血圧上昇抑制効果は、収縮期血圧、平均血圧、拡張期血圧について同様に観察された。

心拍数：
心拍数についても、血圧と同様の抑制効果が確認された。この抑制効果は、完全な抑制ではなく中等度の抑制効果であったが、有意差検定では所定の有意水準を満たしていた。
以上の試験結果から、アンペロプシン又は藤茶抽出物は、インビボにおいても強いキマーゼ阻害作用を有していることが確認できた。

＜２．食塩による血圧上昇からの改善試験＞
（１）試験動物及び試験方法
１と同様に８週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスを１群７匹とした。

（２）検体
公知のキマーゼ阻害薬（帝人ファーマ株式会社 TPC-806）及び１と同様に製造例１で得た藤茶抽出物（アンペロプシン３０質量％含有の組成物）の試験試料を検体とした。

（３）試験方法
マウスに２％食塩水（ＮａＣｌ）を１２週間自由摂水の状態で与えた。６週終了後より連続６週間ゾンデにより１回／日の頻度で、表６に示す検体を強制投与した。なお１２週間終了まで観察及び血圧を測定した。
血圧は、苦痛を与えない状況で、１回／週の頻度で尾を用いて測定した。なお１と同様に心拍数（ＨＲ）、収縮期血圧（ＳＢＰ）、平均血圧（ＭＢＰ）、拡張期血圧（ＤＢＰ）を測定し、記録した。
また、投与群は次の表６の群分けとした。
なお試験対照として２％食塩水投与群を置いた。

（４）結果
対照（食塩水投与群）は、塩分負荷によって６週目までに１４５ｍｍＨｇまで血圧が上昇した。そして１２週までに１５０ｍｍＨｇまでさらに上昇した。
１２週間の心拍数（ＨＲ）、収縮期血圧（ＳＢＰ）、平均血圧（ＭＢＰ）、拡張期血圧（ＤＢＰ）の値をそれぞれ平均した数値を求め、プロットした結果をそれぞれ図６〜９に示した。また食塩水投与群に対する有意差を二元配置分散分析法で有意差検定した（有意水準Ｐ＜０．０１２５）。
血圧：
藤茶抽出物（試験試料）低用量の群（２−ＩＩ）は殆ど降圧を認めなかった。一方中用量の群（２−ＩＩＩ）は、１４５ｍＨｇから１２週目に１３５ｍｍＨｇまで降圧した。また、高用量の群（２−ＩＶ）は、１４５ｍＨｇから１２週目に１３０ｍｍＨｇまで降圧した。藤茶の高用量群と中用量群には殆ど降圧作用に差はなかった。
キマーゼ阻害剤投与群（２−Ｉ）は、１４５ｍｍＨｇから１２５ｍｍＨｇまで降圧した。この血圧改善効果は、収縮期血圧、平均血圧、拡張期血圧についても同様に観察された。

心拍数：
心拍数についても、血圧と同様の改善効果が確認された。その改善は、中用量群、高用量群で７６０拍／分から７４０拍／分に低下したことから明らかである。
この抑制効果は、完全な抑制ではなく中等度の抑制効果であったが、有意差検定では所定の有意水準を満たしていた。
以上の試験結果から、藤茶抽出物は、高血圧の顕著な改善作用を有しており、その作用はインビボにおいてもキマーゼ阻害作用によることが確認できた。

＜３．ヒト臨床試験＞
ヒトにおけるキマーゼ阻害作用と血圧降下効果を試験した。
１．試験方法
（１）試験品（以下「被験食品」）
被験食品の原材料は藤茶エキス末（５００ｍｇ／日：アンペロプシン（１５０ｍｇ含有）で、プラセボの原材料はデンプン（５００ｍｇ／日）である。

（２）試験対象者
１）選択基準
（１）スクリーニング検査での血圧（収縮期）が１３０ｍｍＨｇ以上１６０ｍｍＨｇ未満である者
（２）同意取得時の年齢が２０歳以上８０歳未満の通院可能な者
（３）ＢＭＩが１８．５ｋｇ／ｍ^２以上３０．０ｋｇ／ｍ^２未満の者
（４）文書同意を取得した者

２）除外基準
（１）重度な消化器疾患、肝疾患、腎疾患、循環器疾患、血液疾患、内分泌系疾患、または悪性新生物が疑われる者、またはその既往がある者
（２）腎障害、左室肥大と診断された者
（３）二次性高血圧症の者
（４）ブドウ科の植物にアレルギーを引き起こす恐れのある者
（５）現在降圧薬服薬中、もしくは医師による降圧治療を受けている者
（６）試験期間中、医師による治療または投薬を受ける予定のある者
（７）試験期間中、特定保健用食品、機能性表示食品及びその他のサプリメントを摂取する予定のある者
（８）試験期間中、食生活（食事回数、食事内容、アルコール摂取量）が変化する可能性のある者
（９）試験期間中、生活習慣が変更する可能性のある者（夜間勤務、長期の旅行、転勤など）
（１０）現在喫煙中、もしくは過去１年以内に喫煙歴のある者
（１１）スクリーニング検査における随時尿検査で推定１日塩分摂取量が男性で８．０ｇ未満、女性で７．０ｇ未満の者
（１２）妊娠中あるいは妊娠の可能性のある女性または授乳中の女性
（１３）試験期間中に他の臨床試験に参加する予定のある者
（１４）その他、担当医師が不適当と判断した者

（３）評価項目
１）主要評価項目
藤茶摂取１２週間後の来院時血圧（収縮期）
２）副次的評価項目
摂取期間中の家庭血圧（収縮期）の経時変化
３）安全性評価項目
有害事象、臨床検査値

（４）投与試験
１）試験デザイン
二重盲検並行群間比較試験
２）試験期間（１４週間）
藤茶エキス末摂取前を初期観察期とする。その後、被験者を無作為に２群に振り分け、藤茶エキス末５００ｍｇもしくはプラセボを１２週間摂取させる。
来院はスクリーニング検査、摂取開始日、摂取４週後、摂取８週後、摂取１２週後の５回とする。
試験初期観察期・摂取期（全１４週間）
３）摂取方法
選択、除外基準に抵触しないことを確認した上で、１日１回朝食後に前記の被験食品（藤茶エキス末）摂取を開始する。
摂取期間１２週間
摂取方法１日１回３粒を朝食後に経口摂取
試験食品藤茶エキス末をカプセルに詰めたものを被験食品、デンプンをカプセルに詰めたものをプラセボとする。

４）併用薬剤・併用療法
併用薬剤の使用及び併用療法は原則禁止とする。但し、医師の判断により必要に応じて治療を開始することができる。薬剤などの使用状況について使用薬物・用量・期間等について調査する。

５）調査項目
（１）背景調査
スクリーニング検査で年齢、性別、現病歴、既往歴、生活歴（喫煙、飲酒、服薬状況、健康食品の使用状況）を調査する。
（２）家庭血圧（ＨＰＭ）
スクリーニング検査開始から摂取１２週後検査終了まで、起床後１時間以内（排尿後、朝食前）及び就寝前に１〜２分間の安静後２回、当院より貸出する本試験用の血圧計を用いて坐位血圧を測定する。
（３）来院時血圧、脈拍
試験実施医療施設で外来受診時、３分以上の安静後、坐位にて上腕血圧を測定し，安定した値（測定値の差が５ｍｍＨｇ未満）を示した２回の平均値を来院時血圧とする。試験期間中来院ごとに実施する。
（４）血液検査
一般血液検査（白血球、赤血球数、ヘモグロビン、ヘマトクリット、ＭＣＶ、ＭＣＨ、ＭＣＨＣ、血小板数）、一般生化学検査（ＴＧ、ＴＣ、ＨＤＬ−Ｃ、ＬＤＬ−Ｃ、血糖、ＨｂＡ１ｃ（ＮＧＳＰ）、γ−ＧＴＰ、ＡＳＴ、ＡＬＴ、総ビリルビン、総蛋白、アルブミン、Ａ／Ｇ比、ＡＬＰ、ＬＤＨ、ＣＰＫ、クレアチニン、尿酸、尿素窒素、Ｎａ、Ｋ、Ｃｌ、ＬＡＰ）、キマーゼ、レニン、アルドステロンを測定する。
血液検査については、空腹時採血とし、スクリーニング検査と摂取１２週後検査の計２回行う。
尿検査についてはスポット尿を用い、尿中Ｎａ及び尿中Ｃｒを測定する。推定１日食塩摂取量を算出し、塩分摂取量の経時的変化を観察するため、毎月検査する。また、スクリーニング検査のみ安全性確認のため尿中アルブミンを測定する。
（５）胸写・負荷心電図、ＡＢＩ、ＰＷＶ
スクリーニング検査で安全性確認のため実施する。心電図測定における負荷方法は階段の昇降とする。
（６）食事調査
来院日に検査前日の食事内容を調査する。
（７）日誌
飲酒内容、食生活の変化、体調の変化、試験食品の摂取状況を調査する。

６）中止基準
・被験者より中止の申し出があった場合
・有害事象で担当医師が試験を継続することが好ましくないと判断した場合
・その他、試験責任医師が中止を必要と判断した場合

７）有害事象
（１）有害事象の重症度
・軽度：日常的活動が妨げられない程度の有害事象
・中等度：日常的活動が妨げられる程度の有害事象
・重度：日常的活動が不能となる有害事象
（２）重篤な有害事象
・死亡に至るもの
・生命を脅かすもの
注：その事象の発現時点において患者が死の危険にさらされている場合をいい、仮にもっと重度であれば死を招いたかもしれないという意味ではない。
・治療のため入院または入院期間の延長が必要となるもの
・永続的または顕著な障害・機能不全に陥るもの
・先天異常を来すもの
・その他の医学的に重要な状態と判断される事象又は反応
（３）試験食品との関連性
・なし：試験食品との間に合理的な可能性がない場合
・あり：試験食品との間に少なくとも合理的な可能性があり、因果関係が否定できない場合
・不明：試験食品との因果関係が情報不足のため判定できない場合
（４）転帰
有害事象の転帰を以下の６段階で判定する。
・回復
・軽快
・未回復
・回復したが後遺症あり
・死亡
・不明
（５）重篤な有害事象が発生した際の報告
重篤である有害事象が発生し、試験責任者が当該有害事象を知った後、速やかに試験実施機関の長に報告し、試験担当者に連絡するとともに、重篤な有害事象に関する報告書を作成し、試験実施機関の長に提出する。

８）統計解析
主要評価項目の平均値及び摂取前からの変化量についてｔ検定を実施する。

９）試験実施症例数
藤茶エキス末摂取による降圧作用を探索的に評価するために、最終解析可能症例目標数を各群１５症例で両群合わせて３０症例とする。

（５）試験結果
藤茶エキス摂取群、プラセボ摂取群の比較の結果、藤茶摂取群は血圧が低下してお
り、ヒトにおけるキマーゼ阻害効果を確認することができた。

Claims

アンペロプシンを１０質量％以上含有するキマーゼ阻害用組成物。
請求項１に記載のキマーゼ阻害用組成物を含有するキマーゼに由来する疾患の治療又は予防用組成物。
キマーゼに由来する疾患が、気管支喘息、じん麻疹、アトピー性皮膚炎、アレルギー性結膜炎、鼻炎、関節リューマチ、マストサイトーシス、強皮症、心不全、心肥大、うっ血性心疾患、アテローム動脈硬化、心筋虚血、心筋梗塞、経皮的冠動脈形成術後再狭窄、バイパスグラフト術後再狭窄、虚血性末梢循環障害、高アルドステロン症、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症、腎炎、糸球体硬化症、腎不全、乾癬、固形腫瘍、手術後癒着、緑内障および高眼圧症から選択されるいずれかの疾患である請求項２に記載のキマーゼに由来する疾患の治療又は予防用組成物。