JP6845548B2 - 粘膜免疫調節剤 - Google Patents

Description

本発明は、粘膜免疫調節剤に関する。

外界と接する腸管及び呼吸器等の粘膜組織は初発感染部位となる場合が多いため、粘膜免疫機能を強化することは、予防医学的観点からみて、重要である。感染防御機構の第一線バリアとして、パイエル板及び鼻咽頭関連リンパ組織（ＮＡＬＴ）は、粘膜免疫応答の誘導及び制御に関して中心的な役割を担っている。小襞細胞（Ｍｉｃｒｏｆｏｌｄ細胞又はＭ細胞）は、パイエル板等の腸管関連リンパ組織、及びＮＡＬＴ等のリンパ濾胞を覆う濾胞関連上皮（ＦＡＥ）に見出される。Ｍ細胞は、腸管内の抗原の取り込み及びトランスサイトーシスを介して粘膜免疫応答の開始に関わっている（非特許文献１）。糖タンパク質２（ＧＰ２）は、Ｍ細胞特異的マーカーとして知られている（非特許文献２）。

粘膜免疫賦活剤として、特許文献１には、ローヤルゼリー、プロポリス、花粉荷から選ばれる少なくともいずれか１つのミツバチ産品を有効成分として含有する粘膜免疫賦活剤が開示されている。

特開２０１１−８４５２５号公報

Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ，Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｈｅａｌｔｈ，２０１４年，３３巻（３号），ｐｐ．９１−９７ Ｍｕｃｏｓａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２０１３年，６巻（４号），ｐｐ．６６６−６７７

特許文献１に開示される粘膜免疫賦活剤などの粘膜免疫調節剤はいくつか知られてはいるものの、需要者の多様なニーズを満たすためには、未だ充分な選択肢が存在するとは言えない。そこで、本発明は、新規な粘膜免疫調節剤を提供することを目的とする。

本発明は、下記一般式（１）で表される化合物
［一般式（１）中、Ｒ^１は、水素原子又は炭素原子数１〜３のアルキル基を示し、Ｒ^２及びＲ^３は、それぞれ独立に、水素原子、ヒドロキシル基又は炭素原子数２〜４のアルキルカルボニルオキシ基を示し、ｎは１〜６の自然数を示す。］、
下記一般式（２）で表される化合物
［一般式（２）中、Ｒ^１は、水素原子又は炭素原子数１〜３のアルキル基を示し、Ｒ^４は、水素原子又はヒドロキシル基を示し、Ｒ^５は、ヒドロキシル基、カルボキシル基又は炭素原子数２〜４のアルキルオキシカルボニル基を示し、ｎは１〜９の自然数を示す。但し、Ｒ^４が水素原子のときは、Ｒ^５は、ヒドロキシル基ではない。］、及び
下記一般式（３）で表される化合物
［一般式（３）中、Ｒ^１は、水素原子又は炭素原子数１〜３のアルキル基を示し、Ｒ^６及びＲ^７は、それぞれ独立にヒドロキシル基で置換されていてもよい炭素原子数１〜１０の直鎖アルキレン基を示す。］、
並びにこれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種を有効成分として含有する、粘膜免疫調節剤に関する。

本発明の粘膜免疫調節剤は、一般式（１）、一般式（２）、一般式（３）で表される化合物、及びこれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種を有効成分として含有しているため、粘膜免疫を調節（活性化、又は抑制）することができる。

上記粘膜免疫調節剤は、下記式（４）、（５）、（６）、（７）、（８）、（９）、（１０）、（１１）、（１２）、（１３）、（１４）で表される化合物、及びこれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種を有効成分として含有するものであることが好ましい。これにより、より一層効果的に粘膜免疫を調節（活性化、又は抑制）することができる。

本発明の粘膜免疫調節剤は、上記式（４）、式（５）、式（６）、式（７）、式（８）で表される化合物、及びこれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種を有効成分として含有する粘膜免疫賦活剤であってもよい。これらの化合物は、粘膜免疫を活性化するため、粘膜免疫賦活用途に好適に使用できる。

本発明の粘膜免疫調節剤は、上記式（９）、式（１０）、式（１１）、式（１２）、式（１３）、式（１４）で表される化合物、及びこれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種を有効成分として含有する粘膜免疫抑制剤であってもよい。これらの化合物は、粘膜免疫を抑制するため、粘膜免疫抑制用途に好適に使用できる。

本発明はまた、上述した本発明の粘膜免疫調節剤を含む、粘膜免疫調節用食品組成物にも関する。当該食品組成物には、食品、健康食品、機能性表示食品、栄養補助食品、サプリメント及び特定保健用食品が含まれる。

上記食品組成物は、本発明の粘膜免疫調節剤を含んでいることから、粘膜免疫を調節（活性化又は抑制）する機能を有しており、粘膜免疫調節用途に好適に使用できる。

本発明は更に、上記粘膜免疫賦活剤を含むアジュバントにも関する。上記粘膜免疫賦活剤は、粘膜免疫応答の開始に関わるＭ細胞の分化を誘導することができるため、アジュバントとして好適に使用することができる。

本発明は更にまた、上記アジュバントを含むワクチン製剤にも関する。

本発明は、粘膜免疫調節に使用するための、一般式（１）、一般式（２）若しくは一般式（３）で表される化合物、又はこれらの塩と捉えることもできる。本発明はまた、粘膜免疫調節に使用するための、一般式（１）、一般式（２）、一般式（３）で表される化合物、及びこれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種を有効成分として含有する剤と捉えることもできる。

本発明は、粘膜免疫調節剤の製造における、一般式（１）、一般式（２）若しくは一般式（３）で表される化合物、又はこれらの塩の応用と捉えることもできる。

本発明は、一般式（１）、一般式（２）、一般式（３）で表される化合物、及びこれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種を有効成分として含有する粘膜免疫調節剤の有効量を、それを必要とする対象に投与するステップを含む、粘膜免疫を調節する方法と捉えることもできる。

本発明により、新規な粘膜免疫調節剤が提供される。本発明の粘膜免疫調節剤は、粘膜免疫を賦活する粘膜免疫賦活剤と、粘膜免疫を抑制する粘膜免疫抑制剤とを含む。本発明の粘膜免疫賦活剤は、Ｍ細胞の分化を誘導することができるため、アジュバントとしても有用である。本発明の粘膜免疫抑制剤は、免疫寛容を促すことに有用である。

Ｍ細胞分化誘導試験の結果を示す電子顕微鏡写真である。 Ｍ細胞分化誘導試験の結果を示す蛍光免疫組織染色写真である。 免疫賦活試験の結果を示す蛍光免疫組織染色写真である。 抗体価の測定結果を示すグラフである。

以下、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。

本発明の粘膜免疫調節剤は、一般式（１）で表される化合物、一般式（２）で表される化合物、及び一般式（３）で表される化合物、並びにこれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種を有効成分として含有する。以下、一般式（１）で表される化合物、一般式（２）で表される化合物、及び一般式（３）で表される化合物をまとめて「本件化合物」ということもある。

一般式（１）中、Ｒ^１は、水素原子又は炭素原子数１〜３のアルキル基を示し、Ｒ^２及びＲ^３は、それぞれ独立に、水素原子、ヒドロキシル基又は炭素原子数２〜４のアルキルカルボニルオキシ基を示し、ｎは１〜６の自然数を示す。

Ｒ^１における炭素原子数１〜３のアルキル基としては、メチル基、エチル基、１−プロピル基、１−メチルエチル基が挙げられる。

Ｒ^２における炭素原子数２〜４のアルキルカルボニルオキシ基としては、メチルカルボニルオキシ基（ＣＨ_３−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−）、エチルカルボニルオキシ基（ＣＨ_３−ＣＨ_２−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−）、１−プロピルカルボニルオキシ基（ＣＨ_３−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−）、１−メチルエチルカルボニルオキシ基（ＣＨ_３−ＣＨ（−ＣＨ_３）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−）が挙げられる。

一般式（２）中、Ｒ^１は、一般式（１）中のＲ^１と同義であり、Ｒ^４は、水素原子又はヒドロキシル基を示し、Ｒ^５は、ヒドロキシル基、カルボキシル基又は炭素原子数２〜４のアルキルオキシカルボニル基を示し、ｎは１〜９の自然数を示す。但し、Ｒ^４が水素原子のときは、Ｒ^５は、ヒドロキシル基ではない。

Ｒ^５における炭素原子数２〜４のアルキルオキシカルボニル基としては、メチルオキシカルボニル基（ＣＨ_３−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−）、エチルオキシカルボニル基（ＣＨ_３−ＣＨ_２−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−）、１−プロピルオキシカルボニル基（ＣＨ_３−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−）、１−メチルエチルオキシカルボニル基（ＣＨ_３−ＣＨ（−ＣＨ_３）−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−）が挙げられる。

一般式（２）におけるｎは、３〜９の自然数であることが好ましく、４〜８の自然数であることがより好ましい。

一般式（３）中、Ｒ^１は、一般式（１）中のＲ^１と同義であり、Ｒ^６及びＲ^７は、それぞれ独立にヒドロキシル基で置換されていてもよい炭素原子数１〜１０の直鎖アルキレン基を示す。

Ｒ^６及びＲ^７における炭素原子数１〜１０の直鎖アルキレン基としては、メチレン基、エチレン基、ｎ−プロピレン基、ｎ−ブチレン基、ｎ−ペンチレン基、ｎ−ヘキシレン基、ｎ−ヘプチレン基、ｎ−オクチレン基、ｎ−ノニレン基、ｎ−デシレン基が挙げられる。Ｒ^６及びＲ^７における炭素原子数１〜１０の直鎖アルキレン基は、ヒドロキシル基で置換されていてもよい。

Ｒ^６及びＲ^７におけるヒドロキシル基で置換されていてもよい炭素原子数１〜１０の直鎖アルキレン基は、ヒドロキシル基で置換された炭素原子数１〜１０の直鎖アルキレン基であることが好ましく、ヒドロキシル基で置換された炭素原子数３〜９の直鎖アルキレン基であることがより好ましく、ヒドロキシル基で置換された炭素原子数５〜８の直鎖アルキレン基であることが更に好ましく、ヒドロキシル基で置換された炭素原子数６〜８の直鎖アルキレン基であることが更に好ましく、１〜３個のヒドロキシル基で置換された炭素原子数６〜８の直鎖アルキレン基であることがより好ましい。

本件化合物は、光学異性体が存在する場合、Ｒ体及びＳ体のいずれであってもよい。本件化合物はまた、幾何異性体が存在する場合、シス体及びトランス体のいずれであってもよい。

本件化合物のより具体的な例として、下記式（４）、（５）、（６）、（７）、（８）、（９）、（１０）、（１１）、（１２）、（１３）又は（１４）で表される化合物が挙げられる。

本件化合物は、食品用途又は医薬用途に許容される塩であってもよい。本件化合物の塩としては、例えば、アルカリ金属、アルカリ土類金属、その他の金属、アンモニウム等との塩が挙げられる。本件化合物の塩のより具体的な例として、カリウム塩、ナトリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩が挙げられる。

本件化合物及びその塩は、例えば、後述する実施例における、式（４）、（５）、（６）、（７）、（８）、（９）、（１０）、（１１）、（１２）、（１３）又は（１４）で表される化合物の合成方法に準じて、製造することができる。また、本件化合物及びその塩は、例えば、ローヤルゼリー等の天然物から、精製して得てもよい。さらにまた、本件化合物及びその塩は、市販されているものを購入して使用してもよい。

本発明の粘膜免疫調節剤は、上述した本件化合物及びその塩を１種単独で含有していてもよく、２種以上を組み合わせて含有していてもよい。

上記式（４）、式（５）、式（６）、式（７）又は式（８）で表される化合物は、粘膜免疫を活性化する。したがって、本発明の粘膜免疫調節剤の一実施形態として、式（４）、式（５）、式（６）、式（７）、式（８）で表される化合物、及びこれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種を有効成分として含有する粘膜免疫賦活剤が提供される。

上記式（９）、式（１０）、式（１１）、式（１２）、式（１３）又は式（１４）で表される化合物は、粘膜免疫を抑制する。したがって、本発明の粘膜免疫調節剤の一実施形態として、式（９）、式（１０）、式（１１）、式（１２）、式（１３）、式（１４）で表される化合物、及びこれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種を有効成分として含有する粘膜免疫抑制剤が提供される。

本発明の粘膜免疫調節剤は、上記有効成分のみを含有するものであってもよく、本発明による効果を妨げない限り、他の成分を更に含有していてもよい。他の成分としては、例えば、薬学的に許容される成分（例えば、賦形剤、結合材、滑沢剤、崩壊剤、乳化剤、界面活性剤、基剤、溶解補助剤、懸濁化剤）、食品として許容される成分（例えば、ミネラル類、ビタミン類、フラボノイド類、キノン類、ポリフェノール類、アミノ酸、核酸、必須脂肪酸、清涼剤、結合剤、甘味料、崩壊剤、滑沢剤、着色料、香料、安定化剤、防腐剤、徐放調整剤、界面活性剤、溶解剤、湿潤剤）を挙げることができる。

本発明の粘膜免疫調節剤は、有効成分量換算で、体重６０ｋｇの成人に一日当たり１ｍｇ以上１０ｇ以下の用量で用いることができ、５ｍｇ以上８ｇ以下の用量で用いることが好ましく、１０ｍｇ以上３ｇ以下の用量で用いることがより好ましく、１５ｍｇ以上１．５ｇ以下の用量で用いることが更に好ましく、２０ｍｇ以上１ｇ以下の用量で用いることが更により好ましく、２２ｍｇ以上５００ｍｇ以下の用量で用いることが更によりまた好ましく、２４ｍｇ以上２５０ｍｇ以下の用量で用いることが特に好ましい。本発明の粘膜免疫調節剤を小児に用いる場合の用量は、例えば、６歳から１３歳未満では成人の３／５用量、１歳から６歳未満では成人の２／５用量、１歳未満では１／５用量としてもよい。当該用量は、摂取する人の健康状態、投与方法及び他の剤との組み合わせ等の因子に応じて、上記範囲内で適宜設定することができる。

本発明の粘膜免疫調節剤は、経口投与（摂取）されてもよく、非経口投与（例えば、鼻腔内投与）されてもよい。本発明の粘膜免疫調節剤は、一日当たりの有効成分量が上述した範囲内にあれば、一日一回投与されてもよいし、一日二回、一日三回等、複数回に分けて投与されてもよい。また、本発明の粘膜免疫調節剤は、継続的に投与されるのが好ましい。継続的に投与されることにより、粘膜免疫調節剤効果（例えば、粘膜免疫賦活効果）がより一層顕著に発揮される。

本発明の粘膜免疫調節剤は、固体、液体、ペースト等のいずれの形状であってもよい。本発明の粘膜免疫調節剤の形態は、例えば、素錠、糖衣錠、顆粒、粉末、タブレット、カプセル（ハードカプセル、ソフトカプセル、シームレスカプセル）であってもよい。本発明の粘膜免疫調節剤は、例えば、有効成分である本発明に係る化合物又はその塩と、必要に応じて他の成分とを混合して上記剤形に成形することによって調製することができる。

本発明の粘膜免疫調節剤は、医薬品、医薬部外品及び食品組成物そのものとして、並びに医薬品、医薬部外品及び食品組成物に添加して使用することができる。食品組成物としては、食品の３次機能（体調調節機能）が強調された食品であることが好ましい。食品の３次機能が強調された食品としては、例えば、健康食品、機能性表示食品、栄養補助食品、サプリメント及び特定保健用食品を挙げることができる。

本発明の粘膜免疫調節剤からなる医薬品、医薬部外品若しくは食品組成物、又は本発明の粘膜免疫調節剤を含む医薬品、医薬部外品若しくは食品組成物は、粘膜免疫調節用であってよく、粘膜免疫賦活用であってもよく、「免疫力をアップする旨」、「ウイルスに負けない体を作る旨」、「免疫機能をサポートする旨」、「Ｍ細胞の増加に役立つ旨」、「免疫力を保つ旨」、「免疫力を維持する旨」、「風邪をひきやすい方に適する旨」、「免疫機能を良好にする旨」「弱った免疫系が衰弱するのを防ぐのに役立つ旨」「食中毒菌に負けない体をつくる旨」「粘膜の健康をサポートする旨」、「粘膜免疫をサポートする旨」、「鼻やのどの健康をサポートする旨」、「冬の健康維持に役立つ旨」、「寒い時期の健康維持に役立つ旨」、「寒い季節に負けない旨」、「免疫機能を調節する旨」、「過剰なＭ細胞を抑制する旨」、「過剰な免疫反応を抑制する旨」、「気管支喘息を予防又は改善する旨」、「アレルギー性鼻炎を予防又は改善する旨」、「花粉症を予防又は改善する旨」、「クローン病を予防又は改善する旨」等の表示が付されていてもよい。

医薬品、医薬部外品及び食品組成物における本発明の粘膜免疫調節剤の含有量は、一日当たり摂取する有効成分量が上述した範囲内となるように、医薬品、医薬部外品及び食品組成物の種類等に応じて適宜設定すればよい。

本発明の粘膜免疫調節剤を食品組成物そのものとして、又は食品組成物に添加して使用する場合、食品組成物の形態は特に限定されず、例えば、飲料類（コーヒー、ジュース、茶飲料等の清涼飲料、乳飲料、乳酸菌飲料、ヨーグルト飲料、炭酸飲料等）；スプレッド類（カスタードクリーム等）；ペースト類（フルーツペースト等）；洋菓子類（チョコレート、ドーナツ、パイ、シュークリーム、ガム、ゼリー、キャンデー、クッキー、ケーキ、プリン等）；和菓子類（大福、餅、饅頭、カステラ、あんみつ、羊羹等）；氷菓類（アイスクリーム、アイスキャンデー、シャーベット等）；食品類（カレー、牛丼、雑炊、味噌汁、スープ、ミートソース、パスタ、漬物、ジャム等）；調味料類（ドレッシング、ふりかけ、旨味調味料、スープの素等）であってもよい。

本発明の粘膜免疫調節剤を食品の３次機能が強調された食品（例えば、健康食品、機能性表示食品、栄養補助食品、サプリメント又は特定保健用食品）そのものとして、又は食品の３次機能が強調された食品に添加して使用する場合、食品の３次機能が強調された食品の形態は、上述した食品の形態に加えて、例えば、素錠、糖衣錠、顆粒、粉末、タブレット、カプセル（ハードカプセル、ソフトカプセル、シームレスカプセル）であってもよい。

本発明の粘膜免疫調節剤を医薬品若しくは医薬部外品そのものとして、又は医薬品若しくは医薬部外品に添加して使用する場合、医薬品又は医薬部外品の形態は特に限定されず、例えば、素錠、糖衣錠、顆粒、粉末、タブレット、カプセル（ハードカプセル、ソフトカプセル、シームレスカプセル）であってもよい。

本発明の粘膜免疫調節剤を添加した医薬品、医薬部外品又は食品組成物の製法は特に限定されず、適宜公知の方法に従うことができる。例えば、医薬品、医薬部外品又は食品組成物の製造工程における中間製品又は最終製品に、本発明の粘膜免疫調節剤を混合等して、上記の用途に用いられる医薬品、医薬部外品又は食品組成物を得ることができる。

上述した本発明は、粘膜免疫調節に使用するための、上記一般式（１）、一般式（２）若しくは一般式（３）で表される化合物、又はこれらの塩と捉えることもできる。本発明はまた、粘膜免疫調節に使用するための、上記一般式（１）、一般式（２）、一般式（３）で表される化合物、及びこれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種を有効成分として含有する剤と捉えることもできる。本発明は更に、粘膜免疫調節剤の製造における、上記一般式（１）、一般式（２）、一般式（３）で表される化合物、及びこれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種の応用と捉えることもできる。

上述した本発明はまた、上記一般式（１）、一般式（２）、一般式（３）で表される化合物、及びこれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種を有効成分として含有する粘膜免疫調節剤の有効量を、それを必要とする対象に投与するステップを含む、粘膜免疫を調節（賦活又は抑制）する方法と捉えることもできる。対象は、齧歯類、有蹄類、食肉類、有袋類、及び霊長類であってよい。対象は、カニクイザル及びヒト等の哺乳動物であることが好ましく、ヒトであることがより好ましい。

〔ワクチン製剤〕
本発明の粘膜免疫調節剤のうち、粘膜免疫賦活作用を有するもの（粘膜免疫賦活剤）は、アジュバントとしても使用できる。本発明のアジュバントによる作用メカニズムの少なくとも一部は、粘膜免疫応答の開始に関わるＭ細胞の分化を誘導することに基づくものである。本実施形態に係るアジュバントは、上記粘膜免疫賦活剤を含むものであってもよく、上記粘膜免疫賦活剤からなるものであってもよい。

本発明のワクチン製剤は、上記アジュバントを含むものである。本発明のアジュバントは、種々の免疫原と組み合わせてワクチン製剤とすることができる。本発明のワクチン製剤は、アジュバントと免疫原が混合されたものであってもよく、またアジュバントと免疫原がそれぞれ分離されており、投与時に混合されるか又は別々に投与されてもよい。本発明のワクチン製剤は、治療用であってもよく、予防用であってもよい。

本発明のアジュバントと組み合わせる免疫原としては、ヒト等の哺乳動物に対して免疫応答を惹起する抗原であれば特に制限されない。免疫原の具体例としては、インフルエンザウイルス、ロタウイルス、アデノウイルス、ノロウイルス、麻しんウイルス、風しんウイルス、おたふくかぜウイルス、エイズウイルス、肝炎ウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、百日せき菌、ジフテリア菌、ヘリコバクター・ピロリ菌、出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）、クラミジア原虫、マイコプラズマ原虫、マラリア原虫、コクシジウム原虫、及び住血吸虫からなる群より選択される一種又は二種以上の病原微生物及びこれら由来の抗原、プリオンタンパク質等を挙げることができる。これらの免疫原は、不活化されたものであってもよく、不活化されていないものであってもよい。

本発明のワクチン製剤における免疫原とアジュバントの量比は、使用する免疫原の種類、ワクチン製剤の目的等に応じて適宜設定することができるが、例えば、１：０．０００１〜１：１０，０００（重量比）とすることができ、１：０．１〜１：１０（重量比）とすることが好ましい。

本発明のワクチン製剤の形状は、液状であってもよく、粉末状であってもよい。本発明のワクチン製剤の形態は特に限定されず、例えば、素錠、糖衣錠、顆粒、粉末、タブレット、カプセル（ハードカプセル、ソフトカプセル、シームレスカプセル）であってもよい。

本発明のワクチン製剤には、公知の安定剤及び防腐剤等を含ませてもよい。本発明のワクチン製剤は、公知の方法により製造することができる。本発明のワクチン製剤は、経口接種されてもよく、経鼻摂取されてもよい。

本発明のワクチン製剤は、対象にアジュバントを投与するステップと、当該対象に免疫原を投与するステップとを含む方法により投与することができる。アジュバントの投与と免疫原の投与は、同時に行ってもよいし、別々に行ってもよい。また、例えば、アジュバントの投与を先行して行い、次いで免疫原の投与を行うこともできる。さらに、アジュバントを継続的に投与しつつ、適時に免疫原の投与を行うこともできる。本発明のワクチン製剤は、例えば、アジュバントを継続的に投与した後、免疫原を投与するように用いられることが好ましい。これにより、免疫応答の誘導をより一層増強することができる。アジュバントを継続的に投与する態様の具体例としては、例えば、１日１回の有効量の投与を３日以上、好ましくは７日以上、より好ましくは１４日以上、更に好ましくは２１日以上、継続することが挙げられる。また、一日あたりの有効量の範囲内で、一日二回、一日三回等、複数回に分けて投与されてもよい。

アジュバントの有効量は、有効成分量換算で、体重６０ｋｇの成人に一日当たり１ｍｇ以上１０ｇ以下の用量であり、５ｍｇ以上８ｇ以下の用量であることが好ましく、１０ｍｇ以上３ｇ以下の用量であることがより好ましく、１５ｍｇ以上１．５ｇ以下の用量であることが更に好ましく、２０ｍｇ以上１ｇ以下の用量であることが更により好ましく、２２ｍｇ以上５００ｍｇ以下の用量であることが更によりまた好ましく、２４ｍｇ以上２５０ｍｇ以下の用量であることが特に好ましい。また、小児に用いる場合の有効量は、例えば、６歳から１３歳未満では成人の３／５用量、１歳から６歳未満では成人の２／５用量、１歳未満では１／５用量としてもよい。当該用量は、摂取する人の健康状態、投与方法及び他の剤との組み合わせ等の因子に応じて、上記範囲内で適宜設定することができる。

以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明する。ただし、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

［試験例１：Ｍ細胞分化誘導試験−インビトロ試験］
〔試験化合物の準備〕
式（４）、（５）、（６）、（７）、（８）、（９）、（１０）、（１１）、（１２）、（１３）又は（１４）で表される化合物を試験化合物として準備した。

（式（４）で表される化合物の合成）
式（４）で表される化合物（（２Ｅ，９Ｒ）−９−ヒドロキシ−２−デセン酸）は、特開２０１０−１６８２９０号公報の調製例１４に記載された方法に従って、合成した。

（式（５）で表される化合物の合成）
式（５）で表される化合物（（２Ｅ，９Ｒ）−メチル−９，１０−ジヒドロキシ−２−デセノエート）は、特開２０１０−１６８２９０号公報の調製例１１に記載された方法に従って、合成した。

（式（６）で表される化合物の合成）
式（６）で表される化合物（（２Ｅ，１１Ｒ）−１１，１２−ジヒドロキシ−２−ドデセン酸）は、特開２０１０−１６８２９０号公報の調製例６に記載された方法に従って、合成した。

（式（７）で表される化合物の単離）
式（７）で表される化合物（（２Ｅ）−３，１０−ジヒドロキシ−デカン酸）は、以下の方法に従い、ローヤルゼリーから単離した。

乾燥粉末ローヤルゼリー（浙江省浙江平湖産）２００ｇに１５００ｍＬのメタノールを加え、室温で攪拌しながら１２時間抽出した。溶出液を減圧濾過し、ろ液の溶媒を減圧下留去した。得られた残渣（１０８．９ｇ）をＯＤＳ カラムクロマトグラフィー（カラム：Ｃｏｓｍｏｓｉｌ ７５Ｃ１８−ＰＲＥＰ、カラムサイズ：φ８０×２０５ｍｍ、溶離液：１０％、５０％メタノール水溶液、各２５００ｍＬ（１２５０ｍＬ×２フラクション）で精製し、フラクション１（１０％メタノール溶出区の前半）、２（１０％メタノール溶出区の後半）、３（５０％メタノール溶出区の前半）、４（５０％メタノール溶出区の後半）にわけた。フラクション４をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（カラム：Ｄａｉｓｏ ｇｅｌ ＩＲ−６０，カラムサイズ：φ２６×１５０ｍｍ、溶離液：５％、１０％メタノールを含むクロロホルム、５００ｍＬ（５０ｍＬ×１０フラクション）で精製し、１０％の４番目に溶出されたフラクションを濃縮した。これを再度シリカゲルカラムクロマトグラフィー（カラム：Ｄａｉｓｏ ｇｅｌ ＩＲ−６０、カラムサイズ：φ２６×１００ｍｍ、溶離液：１０、１５％メタノールを含むクロロホルム、３００ｍＬ（２０ｍＬ×１５フラクション）で精製し、１３−１９番目に溶出されたフラクションを集め、式（７）で表される化合物を２３．７ｍｇ得た。

（式（８）で表される化合物の準備）
式（８）で表される化合物（セバシン酸）は、Ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ社から購入した。

（式（９）で表される化合物の合成）
式（９）で表される化合物（（２Ｅ，７Ｒ）−７，８−ジヒドロキシ−２−オクテン酸）は、特開２０１０−１６８２９０号公報の調製例５に記載された方法に従って、合成した。

（式（１０）で表される化合物の合成）
式（１０）で表される化合物（（２Ｚ，９Ｒ）−９，１０−ジヒドロキシ−２−デセン酸）は、特開２０１０−１６８２９０号公報の調製例８に記載された方法に従って、合成した。

（式（１１）で表される化合物の合成）
式（１１）で表される化合物（（２Ｅ）−７−アセトキシ−２−ヘプテン酸）は、特開２０１０−１６８２９０号公報の調製例１５に記載された方法に従って、合成した。

（式（１２）で表される化合物の合成）
式（１２）で表される化合物（（２Ｅ，９Ｒ）−９，１０−ジアセトキシ−２−デセン酸）は、特開２０１０−１６８２９０号公報の調製例１２に記載された方法に従って、合成した。

（式（１３）で表される化合物の合成）
式（１３）で表される化合物（（２Ｅ，９Ｓ）−９，１０−ジヒドロキシ−２−デセン酸）は、特開２０１０−１６８２９０号公報の調製例２に記載された方法に従って、合成した。

（式（１４）で表される化合物の準備）
式（１４）で表される化合物（９（Ｓ），１２（Ｓ），１３（Ｓ）−トリヒドロキシ−１０（Ｅ）−オクタデセン酸）は、Ｌａｒｏｄａｎ社から購入した。

〔細胞培養〕
インビトロＭ細胞モデルとして、ヒト腸管上皮細胞由来のＣａｃｏ−２細胞を使用した。Ｃａｃｏ−２細胞は、ＭＥＭ培地（日水製薬株式会社製）に２０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ：ＣＡＮＳＥＲＡ ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ社製）、２ｍＭグルタミン（和光純薬株式会社製）、及び０．１ｍＭ非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ社製）を補充した培地を使用して、３７℃、５％ＣＯ_２存在下で培養した。細胞は、対数増殖の範囲内（２．０×１０^５〜１．０×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）で継代培養を行った。なお、細胞濃度はトリパンブルー染色法により、生細胞数と死細胞数とを力ウントして求めた。

〔蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）解析〕
各試験化合物によるＭ細胞の分化誘導を、ＧＰ２を指標としてＦＡＣＳにより解析した。各試験化合物は、ＤＭＳＯ溶液として調製した（１０ｍＭ）。６ウェルプレートにＣａｃｏ−２細胞を播種し、単層膜を形成させた後、上記各試験化合物を終濃度が１００μＭとなるよう添加した。また、対照として、同量のＤＭＳＯを添加した。培地は上述のとおりである。添加後、３７℃、５％ＣＯ_２存在下で３日間培養した。培養後、１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ／ＰＢＳ（−）（ｐＨ７．２）で細胞を回収し、ウサギ抗ＧＰ２抗体（ＩＭＧＥＮＥＸ社製）及びＡｌｅｘａ４８８標識抗ウサギ抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｂ１１ｅｓ社製）で染色した。染色した細胞をＦＡＣＳ（ＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ社製）で解析し、ＧＰ２発現量を定量した。

ＦＡＣＳのヒストグラムからＧＰ２発現量の定量値を解析ソフトＦｌｏｗｊｏにより求め、対照（ＤＭＳＯのみ）の定量値を１としたときの相対値として算出した。結果を下記表１に示す。

式（４）、（５）、（６）、（７）又は（８）で表される化合物は、ＧＰ２の発現を誘導した。特に式（５）又は（６）で表される化合物は、ＧＰ２の発現を強く誘導した。一方、式（９）、（１０）、（１１）、（１２）、（１３）又は（１４）で表される化合物は、ＧＰ２の発現を抑制した。特に式（１１）、（１２）又は（１３）で表される化合物は、ＧＰ２の発現を強く抑制した。参考例の結果を踏まえると、ＧＰ２は、Ｍ細胞特異的マーカーであり、ＧＰ２の発現誘導は、Ｍ細胞の分化誘導を反映したものと考えられる。

〔参考例：１０−ヒドロキシデカン酸におけるＧＰ２発現誘導による粘膜免疫の賦活効果の検証〕
［参考例１：１０−ヒドロキシデカン酸におけるＭ細胞分化誘導試験−インビトロ試験］
〔細胞培養〕
試験例１と同様に行った。

〔１０−ヒドロキシデカン酸における蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）解析〕
試験化合物として１０−ヒドロキシデカン酸（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社製）を用いたこと以外は、試験例１と同様にしてＦＡＣＳ解析を行った。ＦＡＣＳのヒストグラムからＧＰ２発現量の定量値を解析ソフトＦｌｏｗｊｏにより求め、対照（ＤＭＳＯのみ）の定量値を１としたときの相対値として算出した。結果を下記表２に示す。１０−ヒドロキシデカン酸は、ＧＰ２の発現を誘導した。

〔形態解析〕
トランズウェルインサート（６．５ｍｍ Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ，コーニング社製）にＣａｃｏ−２細胞を２×１０^５ｃｅｌｌｓ播種し、単層膜を形成させた後、単層膜の頂端側から１０−ヒドロキシデカン酸（終濃度１００μＭ）を作用させ、３７℃、５％ＣＯ_２存在下で３日間培養した。培養後、トランズウェルインサートの膜ごと切断し、電子顕微鏡（ＪＥＯＬ社製）で細胞形態を観察した。

電子顕微鏡写真を図１に示す。一般的に、Ｍ細胞は形態学的に頂端側の微絨毛（ｍｉｃｒｏｖｉｌｌｉ）が近傍の上皮細胞よりも短くなるという特徴を有する。図１中矢印で示したとおり、１０−ヒドロキシデカン酸を作用させることにより、微絨毛が短い細胞が観察された。この結果から、１０−ヒドロキシデカン酸の作用により、Ｃａｃｏ−２細胞が形態的にＭ細胞様細胞に変化したことを示すと考えられる。

［参考例２：１０−ヒドロキシデカン酸におけるＭ細胞分化誘導試験−インビボ試験］
〔試験方法〕
１０−ヒドロキシデカン酸のＤＭＳＯ溶液（１０ｍＭ）を、ＰＢＳ（−）で１００倍希釈して試験液を調製した。カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）の雄３匹（試験開始時３〜４歳、試験開始時の体重３．５３〜４．３６ｋｇ）を被験動物とした。ファインアトマイザー（ネイザル）（商品番号：ＦＡＮ０２０，製造販売元：吉川化成株式会社）を用いて、上記試験液をカニクイザルの左右鼻腔に約０．１ｍＬずつ噴霧した。対照として、ＰＢＳ（−）を用いて同様の操作を行った。この操作を１日１回、３日間繰り返した後、４日目にカニクイザルを解剖し、咽頭扁桃部位の鼻咽頭粘膜を採取した。採取した鼻咽頭粘膜をＡｌｅｘａ５５５標識抗ＧＰ２抗体（ＩＭＧＥＮＥＸ社製）又はＡｌｅｘａ５５５標識抗ＧＰ２抗体（Ａｂｃａｍ社製）で蛍光免疫組織染色し、オールインワン蛍光顕微鏡ＢＺ−９０００（キーエンス社製）で蛍光像を観察した。なお、蛍光像の観察にあたり、ＤＡＰＩ染色を併用している。

蛍光免疫組織染色写真を図２に示す。なお、図２は視認性を高めるため、明暗を反転させている。図２に示すように、１０−ヒドロキシデカン酸を鼻腔内に３日間暴露させることで、ＧＰ２陽性細胞（図２中、矢印で例示した黒色の箇所）が鼻咽頭粘膜状に観察された。一方、対照では、このようなＧＰ２陽性細胞の増加は観察されなかった。

［参考例３：１０−ヒドロキシデカン酸における免疫賦活試験−インビボ試験］
〔試験方法〕
（カプセル剤の調製）
１０−ヒドロキシデカン酸２．４ｍｇのみを腸溶カプセルに充填し、１０−ヒドロキシデカン酸入りカプセル剤（カプセルＡ錠）を調製した。１０−ヒドロキシデカン酸２．４ｍｇに加え、抗原としてＦｅｔｕｉｎ（３ｍｇ）、不活化ポリオウイルス抗原（１０^６ ＴＣＩＤ_５０）及び不活化インフルエンザウイルス抗原（２２０＿ＨＡ Ｕｎｉｔｓ）を腸溶カプセルに充填し、１０−ヒドロキシデカン酸と上記３種の抗原を含有するカプセル剤（カプセルＢ錠）を調製した。また、抗原としてＦｅｔｕｉｎ（３ｍｇ）、不活化ポリオウイルス抗原（１０^６ ＴＣＩＤ_５０）及び不活化インフルエンザウイルス抗原（２２０＿ＨＡ Ｕｎｉｔｓ）を腸溶カプセルに充填し、上記３種の抗原を含有するカプセル剤（カプセルＣ錠）を調製した。

（カプセル剤の投与）
カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）の雄３頭（試験開始時３〜６歳、試験開始時の体重３．０〜６．０ｋｇ）を被験動物とし、上記カプセルＡ錠及びカプセルＢ錠を下記表３に示すスケジュールに従って経口投与した（１日１回１錠）（以下、試験群）。対照として、カニクイザルの雄３頭（試験開始時３〜６歳、試験開始時の体重３．０〜６．０ｋｇ）にカプセルＣ錠のみを下記表３に示スケジュールに従って経口投与した（カプセルＡ錠及びカプセルＢ錠は投与せず）（以下、対象群）。２２日目にカニクイザルを解剖し、腸管粘膜を採取した。採取した腸管粘膜をＡｌｅｘａ５５５標識抗ＧＰ２抗体（ＩＭＧＥＮＥＸ社製）又はＡｌｅｘａ５５５標識抗ＧＰ２抗体（Ａｂｃａｍ社製）で蛍光免疫組織染色し、オールインワン蛍光顕微鏡ＢＺ−９０００（キーエンス社製）で蛍光像を観察した。なお、蛍光像の観察に当たり、ＤＡＰＩ染色を併用している。

蛍光免疫組織染色写真の一例を図３に示す。なお、図３は視認性を高めるため、明暗を反転させている。図３に示すように、１０−ヒドロキシデカン酸を１日１回継続的に摂取しながら約３日おきに抗原で感作した試験群は、ＧＰ２陽性細胞（図３中、矢印で例示した黒色の箇所）が腸管粘膜上に観察された。一方、約３日おきに抗原のみで感作した対照群では、このようなＧＰ２陽性細胞の増加は観察されなかった。

［参考例４：１０−ヒドロキシデカン酸における抗体価の測定］
〔試験方法〕
参考例３で飼育したカニクイザルの糞便を採取し、糞便中の抗Ｆｅｔｕｉｎ ＩｇＡ抗体価、抗ポリオウイルスＩｇＡ抗体価、抗インフルエンザウイルスＩｇＡ抗体価を、ＥＬＩＳＡにより測定した。

Ｆｅｔｕｉｎ抗原（シグマ社製）は、ａｎｔｉｇｅｎ ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），１０ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ_２，０．１％ Ｔｗｅｅｎ８０）で１００μｇ／ｍＬになるように溶解した。この抗原をＮｕｎｃ ＭａｘｉＳｏｒｐ（登録商標） ｆｌａｔ−ｂｏｔｔｏｍ ９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに加え、抗原プレートを作製した。インフルエンザウイルスＨ１Ｎ１抗原（１１，０００ ＨＡ Ｕｎｉｔ）及びポリオウイルス抗原ＩＩＩ型（０．６７×１０^８ ＴＣＩＤ_５０）は、２５ｍＬのａｎｔｉｇｅｎ ｂｕｆｆｅｒで希釈し、同様に抗原プレートを作製した。なお、マスキングは２００μｌ／ｗｅｌｌ，４℃でｏｖｅｒ ｎｉｇｈｔ反応させた。

糞便試料に対し、重量比で１：４になるようにｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒ（０．１％ ｓｏｄｉｕｍ ａｚｉｄｅ，１ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ・２Ｎａ，０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０，５％ ｎｏｎｆａｔ ｓｋｉｍ ｍｉｌｋ，１ｍｍｏｌ／Ｌ ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ ｆｌｕｏｒｉｄｅ（ＰＭＳＦ）のＰＢＳ（−）（ｐＨ７．２）溶液）を添加した。これを１３，０００×ｇ、５分間、４℃で遠心分離した後、上清を回収し、ＥＬＩＳＡ用サンプルとした。ＥＬＩＳＡ用サンプルは、氷感フリーザーにて保存した。測定時にＥＬＩＳＡ用サンプルをＰＢＳ（−）で１０倍及び１００倍に希釈した。

抗原プレートの各ｗｅｌｌに調製したサンプルを５０μｌずつ添加し、１．５時間、低温室で振盪させた。その後、ｗａｓｈｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（０．１％ Ｔｗｅｅｎ８０ ｉｎ ＭｉｌｌｉＱ：２００μｌ／ｗｅｌｌ）で４回洗浄した。

二次抗体は、二次抗体Ｂｕｆｆｅｒ（０．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１．７５％ ＮａＣｌ）に１％になるようにＢＳＡを溶解し、このｂｕｆｆｅｒで以下の（ａ）及び（ｂ）の抗体を５０００倍に希釈して調製した。
（ａ）Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−Ｌａｂｅｌｅｄ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｐｕｒｉｆｉｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｏ Ｍｏｎｋｅｙ ＩｇＡ（ａｌｐｈａ）（Ｃａｔ．Ｎｏ．０７４−１１−０１１，ＫＰＬ）
（ｂ）Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ−ｍｏｎｋｅｙ ＩｇＡ（ａｌｐｈａ−ｃｈａｉｎ ｓｐｅｃｉｆｃ）−ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（Ａｆｆｉｎｉｔｙ ｐｕｒｉｆｉｅｄ）（Ｃａｔ．Ｎｏ．７００４１，Ａｌｐｈａ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）

二次抗体の溶液を各ｗｅｌｌに５０μｌずつ添加し、０．７５時間反応させた。反応後、ｗａｓｈｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（０．１％ Ｔｗｅｅｎ８０ｉｎ ＭｉｌｌｉＱ：２００μｌ／ｗｅｌｌ）で４回洗浄した。

各ｗｅｌｌにｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（２．６８ｍｇ ＴＭＢＺ，１．０５μｌ ３５％過酸化水素水、７ｍＬ ＥＤＴＡ・２Ｎａ（２ｍＭ））を５０μｌずつ添加した。最後に各ｗｅｌｌに０．３Ｎ Ｈ_２ＳＯ_４を５０μｌずつ添加して反応を停止した。その後、吸光度（４５０ｎｍ／６３０ｎｍ）を測定した。

糞便中の抗Ｆｅｔｕｉｎ ＩｇＡ抗体価、抗ポリオウイルスＩｇＡ抗体価、及び抗インフルエンザウイルスＩｇＡ抗体価を図４に示す。図４に示すように、１０−ヒドロキシデカン酸を１日１回継続的に摂取しながら約３日おきに抗原で感作した試験群では、抗Ｆｅｔｕｉｎ ＩｇＡ抗体価、抗ポリオウイルスＩｇＡ抗体価、及び抗インフルエンザウイルスＩｇＡ抗体価の上昇が観察された。一方、約３日おきに抗原のみで感作した対照群ではこのような抗体価の増加は観察されなかった。

これらの結果は、インビトロ試験でのＧＰ２発現誘導とインビボでの粘膜免疫の賦活効果が相関していることを示している。

Claims (4)

1. 下記式（４）、（５）、（６）で表される化合物、及びこれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種を有効成分として含有する、粘膜免疫賦活剤。
   
   
   
2. 請求項１に記載の粘膜免疫賦活剤を含む、粘膜免疫賦活用食品組成物。
3. 請求項１に記載の粘膜免疫賦活剤を含む、アジュバント。
4. 請求項３に記載のアジュバントを含む、ワクチン製剤。