JP6782779B2 - トウモロコシふすまからフェルラ酸を高純度及び高収率で製造する方法 - Google Patents

Description

本出願は、穀物副産物であるトウモロコシふすまから高機能性物質であるフェルラ酸を製造する方法に関するもので、より詳しくは、穀物副産物であるトウモロコシふすまから新規な方法を通じてフェルラ酸を高収率で抽出し、抽出されたフェルラ酸を経済的な方法を用いて高収率及び高純度で分離精製して製品化する製造方法に関する。

現在、フェルラ酸は天然抗酸化及び紫外線吸収素材、美白素材として世界的に市場を開拓している中にあり、アルツハイマー病誘発物質であるベータアミロイド蓄積の抑制に対する臨床報告により抗アルツハイマー素材としても注目されている（非特許文献１）。また、バニラ香料（Vanillin）の原料として大きな需要があり、フェルラ酸の機能性と成長可能性は非常に高いと見らえる（非特許文献２）。

しかし、従来の商業的に生産されたフェルラ酸は、米糠油の製造過程で脱酸される副産物（原油脱酸のｓｏａｐ）を原料として、ＩＰＡ、ヘキサン（Hexane）、エタノール（Ethanol）のような溶媒を活用し、分解及び分離過程を行い、このような一連の過程を経て高純度に精製（９８％以上）して製品化されるものであった。前記技術は、１９９２年に日本の米加工会社である築野社で最初に特許化したもので（特許文献１）、これを用いてフェルラ酸が商業的に製造及び販売されている。

前記技術は、米糠油の副産物を活用する形態では合理的な工法を有しているが、フェルラ酸の工業的大量生産の面では限界があることは事実である。つまり、米糠油の生産及び販売は自由な市場構造がなく、米糠油の生産メーカーのみが原材料の確保が容易なので、本工法はフェルラ酸の商業的な底辺化を通じた市場の拡大に大きな欠点がある。

トウモロコシのでん粉製造過程で副産物として大量に得られるトウモロコシふすま（corn bran）は、非消化性多糖類と灰分を多く含有しており、高付加価値産業に活用されず、現在はほとんど飼料に添加して用いられている。一方、フェルラ酸は、穀物の中でリグニン内のポリフェノール成分として存在し、穀物中、トウモロコシふすまでの含量が２．６〜３．３％であり、米糠内の０．９％水準より多く含まれている。したがって、未活用トウモロコシふすまから高価な生理活性物質の素材であるフェルラ酸を抽出及び精製する技術は、機能性新素材の開発の面で非常に有用であり、必ず必要であるといえる。

フェルラ酸は、穀物の中で抽出が容易なフリー型として存在するものではなく、前述した内容のように細胞壁の構成成分であるアラビノキシランとエステル結合（ester linkage）によって強く結合された形態として存在している。これらの理由から、一般的に穀物類からフェルラ酸を分離するためには、非常に複雑な過程が必要であり、その収率がわずかなために経済的生産が困難である。また、フェルラ酸は、トウモロコシふすまの乾燥重量に微量含まれており低純度で抽出され、これを高純度（９８％以上）のフェルラ酸に分離及び精製することは非常に難しい。

韓国登録特許第００９５５３９号

Nutrients, 2015, 7 (7): 5764-5782 Appl Biochem Biotechnol, 2013, 169 （４）: 1353-1372

本発明者らは、前記の欠点を克服しようと経済的穀物原料であるトウモロコシふすまからフェルラ酸を高収率及び高純度で製造するために鋭意努力した結果、新規な方法を通じた抽出及び分離精製過程を行って、最も効果的かつ経済的な方法でフェルラ酸を高純度で製造しうることを確認することで、本出願を完成した。

本出願の目的は、（ａ）トウモロコシふすまをアルカリ溶液と反応させてフェルラ酸（ferulic acid）を含む粗抽出物を収得する段階；（ｂ）前記収得した粗抽出物からでん粉を除去する段階；及び（ｃ）トウモロコシふすまの抽出残渣を洗浄する段階を含む、フェルラ酸の製造方法を提供することにある。

本出願の他の目的は、前記方法で製造されたフェルラ酸を提供することにある。

本出願のフェルラ酸の製造方法は、トウモロコシふすまを原料として用いて、高付加価値素材であるフェルラ酸を経済的に製造することができ、特に、高純度のフェルラ酸を高収率で製造することができ、フェルラ酸の大量生産に有用に使用されうる。

温度によるフェルラ酸抽出収率の変化を示したものである。 酵素を用いたフェルラ酸抽出収率の向上を示したものである。 糖化酵素の濃度による抽出収率を示したものである。 残渣洗浄による抽出収率を示したものである。 糖化酵素の処理時期による抽出収率を示したものである。 及び ＨＰＬＣ分析を通じたフェルラ酸の純度評価を示したものである。図６ａはフェルラ酸標準品の純度評価、図６ｂはトウモロコシふすまからのフェルラ酸製造品の純度評価を示したものである。

前記目的を達成するための本出願の一つの態様は、（ａ）トウモロコシふすまをアルカリ溶液と反応させてフェルラ酸（ferulic acid）を含む粗抽出物を収得する段階；（ｂ）前記収得した粗抽出物からでん粉を除去する段階；及び（ｃ）トウモロコシふすまの抽出残渣を洗浄する段階を含む、フェルラ酸の製造方法である。

本出願では、経済的な穀物原料であるトウモロコシふすまからフェルラ酸を製造するための最適の工程を確立するために、様々な条件でフェルラ酸を抽出、分離精製し、これを比較及び評価して最適化された高純度及び高収率のフェルラ酸の製造方法を開発した。

本出願で用語、「フェルラ酸（ferulic acid）」は、１８６６年に植物の樹脂から最初に抽出された物質であって、ヒドロキシケイ皮酸（hydroxycinnamic acid）または３−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）−２−プロペン酸（3-（4-hydroxy-3-methoxyphenyl）-2-propenoic acid）などと命名され、下記化学式（１）の構造を有する。

[化１]

フェルラ酸は、抗酸化、紫外線吸収、抗アルツハイマー病などの効果が報告されて様々な分野で用いられうる高付加価値の化合物であるか、これを経済的に高純度で製造しうる製造方法が必要な実情である。そこで、本発明者らは、従来フェルラ酸を生産する原料である米糠油の代わりに、これよりフェルラ酸の含量がより高く、原料確保が容易な穀類副産物であるトウモロコシふすまからフェルラ酸を高純度及び高効率で製造した。以下、本出願のフェルラ酸の製造方法を詳細に説明する。

（ａ）段階は、トウモロコシふすまをアルカリ溶液と反応させてフェルラ酸（ferulic acid）を含む粗抽出物を収得する段階である。

本出願で用語、「トウモロコシふすま（corn bran）」は、トウモロコシの外皮の部分を意味する。トウモロコシふすまは、トウモロコシのでん粉製造過程で副産物として収得でき、フェルラ酸を製造するための原材料として安く、確保が容易であるという長所がある。本出願で、前記トウモロコシふすまはトウモロコシを加工する工程で副産物として収得したものであってもよく、フェルラ酸の製造のために直接トウモロコシから分離されるものであってもよいが、本出願の製造方法を介してフェルラ酸を生産しうるものであれば、特に制限されない。

本出願のフェルラ酸の製造方法では、まず、トウモロコシふすまからフェルラ酸を含む粗抽出物を収得する段階を経る。特に、本出願では、アルカリ抽出を用いて粗抽出物を収得することを特徴とし、これはトウモロコシふすまをアルカリ溶液と反応させることによって行うことができる。本出願の一実施形態によれば、アルカリ抽出は熱水抽出、酸抽出及び酵素抽出に比べて著しく高い水準のフェルラ酸抽出収率を示すことができる。

アルカリ抽出のための溶媒は、特にその種類は制限されるものではなく塩基性条件でフェルラ酸を抽出するのに適当なアルカリ溶媒を用いてもよい。具体的に、前記アルカリ溶媒は、水酸化ナトリウムまたは水酸化カリウムであってもよいが、これに限定されるものではなく、当業者は、フェルラ酸抽出収率及び溶媒価格などを考慮して、適切な溶媒を選択してもよい。また、前記アルカリ溶液は、０．５％〜１．５％（ｗ/ｗ）、具体的には０．７５％〜１．２５％、より具体的には１％の濃度で用いられてもよいが、これに限定されるものではない。

アルカリ抽出は、トウモロコシふすまとアルカリ溶液をよく混合した後に反応させる方法で行なわれてもよい。具体的に、前記トウモロコシふすま及びアルカリ溶液を１：３〜１：１５の固液比で混合した後、６０℃〜１００℃で１時間〜２４時間反応させて粗抽出物を収得することができ、より具体的に、トウモロコシふすま及びアルカリ溶液を１：５〜１：１０の固液比で混合した後、６５℃〜９５℃で１．５時間〜２４時間反応させて粗抽出物を収得することができ、最も具体的に、トウモロコシふすま及びアルカリ溶液を１：７の固液比で混合した後、７５℃で２時間反応させて粗抽出物を収得することができるが、これに限定されるものではない。

また、これに限定されるものではないが、（ａ）段階は前記反応で収得された粗抽出物をろ過して固形物を除去する段階をさらに含んでもよい。

（ｂ）段階は、前記収得した粗抽出物からでん粉を除去する段階である。

本出願でトウモロコシふすまは、トウモロコシのでん粉除去工程の後に発生する副産物であってもよいため、残りのでん粉が存在しうる。でん粉によって工程中の粘性が発生することになると抽出液の回収工程及びその後の分離精製工程で効率阻害を引き起こすことがある。ここで、抽出収率を最大化するためにはでん粉の除去工程を行ってもよい。

前記でん粉を除去する段階は、これに限定されるものではないが、特に酵素反応を介して行われるものであってもよく、具体的に、（ａ）段階から収得した粗抽出物と液化酵素（α-amylase）、糖化酵素（glucoamylase）、または液化酵素及び糖化酵素をすべて反応させる酵素反応を介して行われるものであってもよい。

前記液化酵素及び糖化酵素はでん粉を糖に加水分解する反応を触媒する酵素をいい、このような酵素反応を介して粗抽出物に存在する残りのでん粉が除去されうる。

前記糖化酵素及び液化酵素は、具体的に、０．１〜１．０％（ｗ/ｗ）の濃度、より具体的に０．５〜１．０％の濃度で用いられてもよいが、これに限定されるものではなく、酵素濃度、反応温度及び反応時間は前記粗抽出物からでん粉を効果的に除去することができれば、当業者によって適切に選択されてもよい。

前記でん粉除去段階を介して粗抽出物の粘度が改善されて、これにより、抽出物の回収率を向上させることができ、抽出後の工程である分離精製工程での効率性を向上されることができる。

（ｃ）段階は、トウモロコシふすまの抽出残渣を洗浄する段階であって、固体原料の抽出特徴上、残渣洗浄によってより高い抽出収率を得るためのものである。

前記残渣洗浄は、これに限定されるものではないが、トウモロコシふすま残渣の１〜１０倍数、具体的には５倍数の水を用いて行われるものであってもよい。

前記製造方法は、フェルラ酸を分離精製する段階をさらに含んでもよい。

つまり、トウモロコシふすまからアルカリ抽出、でん粉の除去及び残渣洗浄の工程を行い、高い収率でフェルラ酸を抽出した後、これを分離精製することにより製品化が可能な水準の高純度のフェルラ酸を収得しうる。

本出願で、前記分離精製段階は当業界に公知された多様な分離精製工程を介して行われてもよく、特に制限されるものではないが、特に活性炭を用いた１次精製工程、及び吸着樹脂を用いた２次精製工程を介して行なわれるものであってもよい。

トウモロコシふすまにはフェルラ酸３％未満で、非常に少ない水準で存在するため、フェルラ酸の製品化のためには精製工程で純度の向上が重要である。そこで、本発明者らは、様々な精製方法を比較し確認した結果、活性炭を用いた１次精製工程、及び吸着樹脂を用いた２次精製工程を介して最も効率的にフェルラ酸を高純度化しうることを確認した。

前記活性炭を用いた１次精製工程において、活性炭は粒状活性炭または粉末活性炭を用いてもよいが、これに限定されるものではない。前記活性炭は、抽出液に比べて０．１％〜２％（ｗ/ｖ）の濃度、具体的に１％の濃度で用いてもよいが、これに限定されるものではない。

活性炭を用いた精製工程は、（１）フェルラ酸の活性炭吸着現象を用いた活性炭吸着段階、（２）フェルラ酸以外の有機物を除去するための熱水洗浄段階、（３）フェルラ酸を回収するためのフェルラ酸脱着段階、及び（４）ｐＨに応じて沈殿される固形物を除去するためのｐＨ調整段階で行われてもよい。

前記脱着段階は、アルカリ溶媒を用いて行われるものであってもよく、アルカリ溶媒は、具体的に水酸化ナトリウムまたは水酸化カリウムであってもよいが、これに限定されない。また、前記アルカリ溶媒は０．０１〜０．５％（ｗ/ｗ）の濃度、具体的に０．０５〜０．１％（ｗ/ｗ）の濃度で用いられてもよいが、これに限定されない。

前記１次精製工程中のｐＨ調整段階は、前記フェルラ酸の脱着段階を介して脱離された工程液のｐＨを３〜４に補正して不純物を沈殿させて除去するものであってもよい。

前記吸着樹脂を用いた２次精製工程は、１次精製工程から収得した工程液を吸着樹脂に吸着させる段階及びこれからフェルラ酸を脱着させる段階を含むものであってもよい。

前記吸着樹脂の種類は、特に制限されるものではないが、例えばＰＡＤ９００、Ｍｎ１００、ＨＰ２０及びＰＡＤ６００などを用いてもよい。

前記吸着樹脂に吸着されたフェルラ酸を脱着させる段階は、１５〜３５％（ｗ/ｗ）、具体的に２０〜３０％（ｗ/ｗ）、より具体的に３０％（ｗ/ｗ）のエタノール溶媒を用いて行われるものであってもよいが、これに限定されるものではない。

さらに、本出願のフェルラ酸の製造方法は、フェルラ酸を製品化しうる水準の純度で確保するために、分離精製されたフェルラ酸を結晶化する段階をさらに含んでもよい。前記結晶化段階は、当業界で一般的に公知の方法を介して当業者が適切に行ってもよい。例えば、これに限定されるものではないが、前記結晶化段階は、（１）脱離分画分の濃縮、（２）沈殿物の熱水溶解、（３）温度下降による結晶化の進行、及び（４）フェルラ酸結晶の回収段階で行われてもよい。

本出願の他の一つの様態は、前記の方法で製造されたフェルラ酸を提供する。

（実施例）
以下、実施例を挙げて本出願をさらに詳細に説明する。これらの実施例は、単に本出願を例示するためのもので、本出願の範囲がこれらの実施例により制限されるものと解釈されない。

実施例１．トウモロコシふすまからフェルラ酸の抽出法スクリーニング
トウモロコシ加工工程中に発生される副産物であるトウモロコシふすまを原料として高付加価値素材であるフェルラ酸の最も効果的な抽出方法を選定するために、熱水抽出、酸抽出、アルカリ抽出、及び酵素抽出を行い、これらを比較し、この過程を通じて最も優れた結果を確保した抽出方法に基づいて以後の工程の最適化を行った。

抽出後、フェルラ酸の含量及び収率評価のために標準分析法を確立し、これにより抽出された各溶液内のフェルラ酸分析を行った。フェルラ酸の標準分析法は、以下の通りである。
（１）原料を３つのキャップチューブに１００ｍｇ秤量した。
：原料の水分含量を同時に測定し、フェルラ酸純正品（Ｓｉｇｍａ、 ＞ ９９％）を対照群として一緒に比較する。
（２）２Ｍ ＮａＯＨ ５ｍｌを加えた後、栓で密閉した。
（３）４５℃の恒温水槽で反応を行い、間欠的に振って攪拌した。
：３つのキャップチューブをそれぞれ１０/２０/４０時間加水分解を行うことを勧めるが、原料に応じて加水分解の時間は流動的である。
（４）加水分解が完了したサンプルは強く攪拌した後に定置し、上澄液約２〜３ｍｌを採取して遠心分離を行った。
（５）遠心分離後の上澄液を採取して、０．４５μmのフィルターを行った。
（６）フィルター液１ｍｌを採取して、溶媒分離/回収のためのチューブに移した。
（７）回収された１ｍｌに３５％ＨＣｌ ０．２ｍｌを加えて、中和した。
（８）中和された１ｍｌに酢酸エチル（Ethyl Acetate）を３ｍｌ投入して撹拌/定置、上澄液を回収した。このような過程を合計５回繰り返して、フェルラ酸を回収した。
（９）約１５ｍｌの回収された酢酸エチルは６０℃の真空遠心乾燥機で乾燥して溶媒を完全に除去した。
（１０）溶媒が除去された固形物に５ｍｌの５０％ＭｅＯＨを投入して完全に溶解させた（標準品は２５０ｍｌで定容）。
（１１）ＨＰＬＣ（カラム：Ｃａｐｃｅｌｌｐａｋ １８）分析を希釈せずに行った。

また、最適な抽出法選択のための各抽出条件は、次のように行った。
（１）酸抽出
トウモロコシふすま（１００ｇ）と１％Ｈ_２ＳＯ_４（１Ｌ）を入れ、１２０℃で１．５時間反応させた。以後ＣａＣＯ_３で中和した後、ろ過を行った。ＨＰＬＣ （Ｃａｐｃｅｌｌｐａｋ １８カラム）を介してろ過液からフェルラ酸を分析した。酸によって破壊されるフェルラ酸の含量を確認するために、フェルラ酸標準品（ｓｉｇｍａ、 ＞ ９９％）を同様の酸抽出条件（１％ Ｈ_２ＳＯ_４、１２０℃、１．５時間）で反応させた。また、温度によって破壊される含量を把握するために、フェルラ酸標準品を純粋な滅菌水で１２０℃、１．５時間反応させてフェルラ酸の破壊率を確認した。
（２）酵素抽出
トウモロコシふすま（６０ｇ）と滅菌水３００ｇを混合してよく混ぜた。この後、各酵素の５％になるように入れて混合した後、４５℃のシェイキングインキュベーター（shaking incubator）で１５時間攪拌して反応させた。反応後、ろ過過程を経て固形物を除去した後、ＨＰＬＣを介してろ過液からフェルラ酸を分析した。
（３）アルカリ抽出
トウモロコシふすま（１００ｇ）に１％ＮａＯＨ または１％ＫＯＨをそれぞれ５００ｍｌ入れてよく混合した後、それぞれ７５℃または９５℃の温度で２時間反応させた。反応後にろ過過程を経て固形物を除去した後、ＨＰＬＣを介してろ過液からフェルラ酸を分析した。
（４）熱水抽出
トウモロコシふすま（１００ｇ）に滅菌水１Ｌを混合した後、攪拌を介して混合した。この後、１２０℃、１４０℃、１６０℃のそれぞれの温度で１時間反応を行い、その後、ろ過過程を経て固形物を除去した。ＨＰＬＣを介してろ過液からフェルラ酸を分析した。

前述した抽出法及び分析法でトウモロコシふすま内の抽出されたフェルラ酸の収率を分析した（表１）。

その結果、熱水抽出の場合、最大収率は１６０℃で３９％の水準であることが確認された。酸抽出の場合、収率が約５．８％と現れたが、酸による破壊率の分析時９４．１７％の破壊率が示された。このことから、フェルラ酸の場合、酸抽出時の物質の加水分解が起こり、適切な抽出方法でないことが確認できた。酵素抽出は、構造タンパク質分解能を有する商業酵素を購入して行った。バイオマス（Biomass）内のフェルラ酸アラビノキシランの形態でリグニンとの複合体構造を形成している。このようなリグニンとアラビノキシランのエステル結合を酵素的に分解できるメカニズムはフェルロイルエステラーゼ（feruloylesterase）を介して可能である。本フェルロイルエステラーゼの活性を有する商業酵素を優先的に選択し、前述した酵素抽出方法を用いて抽出を行った。抽出結果、ほとんどの酵素で１０％未満の低い抽出収率を示すことが分かった。酵素による単独抽出は、選択的抽出の利点があり得るが、リグニンとアラビノキシランのエステル結合のすべてを分解するほどのエネルギーは不足であることを確認した。アルカリ抽出は１％ＮａＯＨ または１％ＫＯＨを用いて行った。各触媒剤を活用する抽出率は５５．６％、６１．６％の水準で、他の抽出方法に比べて優れた抽出率を示した。

したがって、本発明者らは、さまざまな抽出方法を検討した結果、トウモロコシふすまでフェルラ酸の抽出は、アルカリ抽出によるのが最も効率的であることを確認した。また、ＮａＯＨ とＫＯＨとの比較は、価格がより安いＮａＯＨ がより効果的なものと判断し、今後の抽出条件を最適化するテストはＮａＯＨ を活用した。

実施例２．フェルラ酸の高収率抽出のための最適条件の確立
本発明者らは、より高収率のフェルラ酸確保及び抽出後の精製工程の効率性を考慮して抽出条件の最適化を行った。まずアルカリ触媒剤の最適濃度と反応時間を確保するために、原料（トウモロコシふすま）１００ｇにＮａＯＨ を濃度別（０％、０．５％、０．７５％、１％）で添加した。ＮａＯＨ 溶液添加時の原料と溶液との固液比は１：５を維持し、抽出温度は９５℃に固定して行った。また、最適な抽出時間を確認するために、各時間ごとにサンプリングしてフェルラ酸の抽出収率を確認した。記述した方法で確認した結果、最大抽出収率のためのＮａＯＨ の濃度は、１％が適切であることを確認した。抽出時間は、抽出した後１．５時間〜３時間以内であればほとんどの抽出が行われることを確認した（表２）。

抽出収率に影響を与えることができる条件として原料とアルカリ溶液との固液比が挙げられる。それで、本研究者は原料とアルカリ溶液との固液比の最適比を知るためにテストを行った。原料とアルカリ溶液との固液比は商業的利用性を考慮して、１：５、１：７、１：１０の割合で行った。固液比実験の結果、１：７の固液比と１：１０固液比で非常に類似の収率を示した（表３）。

ここで、商業的適用を考慮すると、用水使用量と廃水発生量を減らすことができる１：７の固液比が効率的といえる。

また、抽出時の温度の影響性を確認しようと、６５℃〜９５℃の温度領域で抽出収率の効果を確認した（図１）。抽出温度の影響性確認の結果、６５℃〜９５℃分布の抽出率が同様に現れ、前記結果と同様に１．５時間後の抽出率は非常に類似した分布であった。これは、１％ＮａＯＨが、抽出に必要な触媒的効果をほとんど示していると判断される。

実施例３．酵素適用の技術による抽出収率の向上
トウモロコシ加工工程の副産物であるトウモロコシふすまはトウモロコシのでん粉除去工程の後に発生する副産物であるため、原料（トウモロコシふすま）内の除去されなかったでん粉が存在する。でん粉は工程中に粘性を発生させて抽出した後に抽出液回収工程及び抽出後の工程に大きな阻害を起こす。そこで、本発明者らはアルカリ抽出とでん粉を除去する酵素技術を混合して抽出収率を最大化することができる方法を研究した。本方法は、抽出収率の向上及び抽出後の精製工程の進行をよりスムーズにする効果がある。

原料内のでん粉構造が抽出収率に及ぼす影響を確認するために、トウモロコシ加工工程で活用される液化酵素（α-amylase）及び糖化酵素（glucoamylase）を活用した。液化酵素は、反応温度９５℃、糖化酵素は、反応温度６５℃を適用し、酵素濃度は１％で固定して抽出効果を把握した。

酵素適用性の効果分析のために、実験群は以下のように構成した：（１）アルカリ抽出進行、（２）糖化酵素１時間適用した後に抽出進行、（３）液化酵素３時間適用した後に糖化酵素３時間反応して抽出進行、（４）液化酵素１時間適用した後に糖化酵素１時間反応して抽出進行。このように４つの実験群を構成して抽出収率の変化を確認した（図２）。

実験結果、抽出単独の進行に比べて糖化酵素及び液化酵素を活用した実験群ではるかに高い抽出収率が示されることを確認した。また、糖化酵素の単独使用よりは液化酵素との併用使用が抽出収率及び物性の改善に優れることが分かった。これは前述した内容のようにでん粉成分の除去を介して粘度が改善されて、これにより、抽出物の回収率が向上するためであると把握される。この過程を介して抽出した後の工程である精製工程での効率を向上させることができる。そこで、本発明者らは、トウモロコシふすまでフェルラ酸の抽出工程は本酵素技術との複合活用が最も重要な部分であると評価する。

また、酵素濃度の最適化のために糖化酵素の濃度別抽出収率の変化を評価した。糖化酵素（glucoamylase）を０．１％、０．５％、１．０％で反応をさせ、反応温度は６５℃、反応時間は２時間で行った。また、糖化後の抽出は、１％ＮａＯＨ （７５℃）で行った。

フェルラ酸抽出収率向上時の糖化酵素濃度の影響性は０．５％の濃度の後、同じ効果を示した。そこで、本研究者は、フェルラ酸抽出収率向上のための糖化酵素濃度を０．５％に最適化することができた。

前記酵素処理の工程により収率を向上させて、さらに、固体原料の抽出特徴上、残渣洗浄によってより高い抽出収率を得ることができる。そこで、本発明者らは、抽出後の抽出残渣の洗浄を介して抽出収率の変化を確認した。抽出後の残渣洗浄の影響性を確認するために、次の４つの実験群を構成した。（１）アルカリ抽出、（２）アルカリ抽出後に残渣洗浄、（３）糖化酵素処理及びアルカリ抽出、（４）糖化酵素処理及びアルカリ抽出後に残渣洗浄。

このように４つの実験群を構成してテストした結果、残渣洗浄時の約１０％水準のフェルラ酸を追加確保することができた。また、前記結果のように糖化酵素を反応させた場合、糖化酵素と反応しない実験群に比べて約１３％以上収率が向上することを確認した（図４）。

トウモロコシふすまからフェルラ酸を抽出時の収率を最大化するために、酵素技術が活用できることは前記で確認した。そこで、本発明者らは、トウモロコシふすまからフェルラ酸のアルカリ抽出の前後に糖化酵素の効果を確認した。また、抽出後の回収率を向上させるために抽出残渣の洗浄を介して追加の収率が増加すると期待した。この実験のために、以下のように２つの実験群を準備した：（１）アルカリ抽出後の糖化酵素（０．５％ グルコアミラーゼ、６５℃、２時間）を処理して抽出残渣の洗浄（原料比５倍数のＤＷを使用）の進行、（２）トウモロコシふすまに糖化酵素を優先処理した後、アルカリ抽出を進行して抽出残渣の洗浄の進行。このように２つの実験群を用意して抽出収率に対する評価を行った（図５）。

実験結果、アルカリ抽出前の段階の糖化酵素処理群よりもアルカリ抽出した後の段階で、糖化酵素を処理する実験群でより高い抽出収率を示した。そこで、本研究者は、抽出収率を最大化するための糖化酵素の適用は、アルカリ抽出以後の段階で最適化することができた。

前述したように、トウモロコシ加工工程中の副産物であるトウモロコシふすまから効率的にフェルラ酸を高収率で抽出する工程の最適化を行った。その後、本発明者らは記述した内容をもとにフェルラ酸抽出を進め、抽出工程液を用いて高純度の分離精製技術の開発を行った。また、フェルラ酸の高純度分離精製法の開発のためのその後の研究は、記述した最適化された抽出方法で行った。最適化された抽出方法は、以下の通りである。トウモロコシふすまと水との固液比１：７（表３）、１％ＮａＯＨ（表２）、７５℃、２時間（図１）の条件で抽出した後、糖化酵素（glucoamylase）０．５％（ｗ/ｗ）を投入（図３及び図５）して６５℃で１時間反応させた。酵素反応後の抽出液をろ過して固形分を分離した後、次の工程である高純度の分離精製工程液として使用した。

実施例４．抽出されたフェルラ酸の高純度の分離精製技術の開発
フェルラ酸はトウモロコシふすまにその含量が３％未満で存在するので、抽出後の精製工程で純度の向上が非常に困難な過程である。それで、本発明者らは、食品型工程に適したフェルラ酸精剤のために非常にさまざまな方法を進行し、最も効率的で高純度化しうる精製法の研究を行った。

抽出されたフェルラ酸の精製過程を要約すると、まず、［１］活性炭吸着：フェルラ酸の活性炭吸着現象を利用、［２］活性炭の熱水洗浄：フェルラ酸以外の有機物を除去、［３］活性炭内のフェルラ酸脱着：純度が向上されたフェルラ酸の確保、［４］ｐＨ調整：ｐＨに応じて沈殿される固形物の除去、［５］吸着樹脂に吸着及び脱着：精製純度を最大化、［６］粉末結晶化：９８％以上の製品を確保、このように合計６段階を介して最終純度９８％以上の製品のための精製工程が行われた。

（１）活性炭を通じたフェルラ酸の精製工程
フェルラ酸はリグニン系の有機物として活性炭に吸着される構造的な特徴を有する。そこで、本発明者らは精製の容易性のために活性炭（粒状活性炭、粉末活性炭）別に吸着及び脱離される収率と、脱離後の純度向上が最も優れた条件で活性炭を選定し、これを工程に適用した。

フェルラ酸の効率的な高純度化の分離精製のために、前記実施例で記述したように最適化された抽出条件を介して抽出されたフェルラ酸液を活用した。

トウモロコシふすま内のフェルラ酸抽出液を活性炭（粉末活性炭または粒状活性炭）内に投入させると、フェルラ酸の吸着率は９５％以上になった。具体的に、吸着効率を高めるために、活性炭は粉末活性炭及び粒状活性炭を用いてテストを行い、前記２種の活性炭の両方で９５％〜９９％ｍｐ水準で吸着された。

ただし、脱離の過程で粉末活性炭が粒状活性炭に比べて優れた結果が導出され、その後の活性炭精製は粉末活性炭を用いて行った。吸着条件は、様々な温度ですべて可能であり、本発明者らは、最終的に常温で吸着を行った。また、適正な活性炭の使用量に対する最適化のために０．１％〜２％（ｗ/ｖ）の水準で活性炭の使用量を確認した結果、適正活性炭は抽出液に比べて１％（ｗ/ｖ）の水準が最も適切であると評価された。活性炭内に吸着されたフェルラ酸の脱離のための脱離溶媒の評価はアルカリ溶媒であるＮａＯＨ を濃度（０．０５％〜０．５％）別に確認し、その結果、脱離された溶液内フェルラ酸の純度と脱離収率が０．０５％と０．１％ ＮａＯＨで同様に表れた（表４）。

活性炭精製工程中のフェルラ酸の純度を向上させるために、活性炭吸着後の温度による活性炭内の有機物の脱離が発生する原理を利用しようと熱水（９０℃）を使用した活性炭の洗浄を行い、熱水洗浄後の不純物（impurity）が約１１．６％程度で追加削除される効果を示した（表５）。

本熱水洗浄の工程は、フェルラ酸以外の有機物を除去することにより、活性炭に吸着されているフェルラ酸の脱離を容易にし、脱離後の純度を向上させる効果が得られる。

以後、本発明者らは、追加のフェルラ酸の精製純度を向上させるためにｐＨによる抽出液内の残存有機物の沈降される効果を利用した。活性炭で脱離された工程液を酸性溶液（ＨＣｌ）を用いてｐＨ３〜４の水準に補正した結果、多くの不純物が沈殿されることを確認し、これにより、追加の１０％以上の純度向上をもたらすことができた（表５）。本ｐＨ降下による有機物沈殿の効果によって、粘質性物質の除去及び以降の吸着樹脂工程の投入が可能な物性を確保することができ、前記記述した活性炭及び純度向上の方法で抽出した後の約２％水準のフェルラ酸純度を革新的に約３０％の水準に向上させた。

これらの結果をもとに、フェルラ酸高純度化の１次精製条件は、抽出ろ過液に粉末活性炭１％（ｗ/ｗ）、常温で1時間反応を行い、活性炭に吸着させた後に抽出液と同じ体積に相当する９０℃熱水を用いて洗浄し（表５）、この後、０．０５％ＮａＯＨを抽出液と同じ体積に相当するように活用して脱離した（表４）。脱離された液は６Ｎ ＨＣｌを用いて中和（ｐＨ３〜４）させた後、ろ過を介して１次精製液を確保した（表５）。確保された１次精製液は、その後の工程である吸着樹脂の工程液として使用した。

（２）吸着樹脂工程によるフェルラ酸の高純度化工程
抽出工程により確保されるフェルラ酸の抽出純度は約１．５％〜２．５％水準であり、活性炭の精製工程を介して確保されたフェルラ酸の純度は約３０％の水準である（表５）。フェルラ酸の製品化が可能な純度は９８％以上であり、そのために、本発明者らは樹脂工程及び結晶化工程を介して高純度化を行った。樹脂工程に活用した工程液は、活性炭を用いて抽出液から１次精製を行った純度３０％水準の工程液を使用した（表５）。

樹脂工程は陰イオン樹脂による効果も確認されたが、フェルラ酸の純度及び収率の面で吸着樹脂が優れていると判断され、吸着樹脂の種類別テストにより確保されたＰＡＤ９００（purolite）樹脂による高純度化を行った。吸着樹脂工程のテストは、室温で行い、吸着時のＳＶは３〜６、脱着時のＳＶは１０を維持しながら行った。また、テストに用いた吸着樹脂の総量は１４ｍｌで行った。活性炭で１次精製されたフェルラ酸の濃度は、０．６６ｇ/Ｌの水準で投入され、吸着容量は４１．５ｇ−ＦＡ/Ｌ−樹脂で確認された。脱離溶媒（エタノール）の濃度別（２０％〜８０％）テストの結果、低濃度エタノールの脱離溶媒で高い純度（７９％〜８５％）のフェルラ酸分離パターンが確認され、各分画別フェルラ酸の結晶性を確認した結果、２０％と３０％エタノールの濃度で脱離されたフェルラ酸で結晶性が確認された（表６）。

これは、他のエタノール濃度で脱離された同じ純度のフェルラ酸であっても結晶性に阻害不純物が存在することを間接的に確認できる結果である。それで、本発明者らは吸着樹脂の工程上で脱離溶媒であるエタノールの濃度を３０％に最適化することができた。

前記記述した内容のように、吸着樹脂の工程はＰＡＤ９００吸着樹脂に吸着した後、エタノール３０％で脱離させることにより、８０％水準のフェルラ酸の高純度化が可能であった。その後の結晶化工程は、トウモロコシふすまの抽出過程と１次活性炭の精製、及び吸着樹脂の精製工程を経た純度８０％水準の工程液を対象に行った。

（３）結晶化方法によるフェルラ酸の製品化純度の確保
前記脱離分画分（エタノール２０％及び３０％）を用いて製品化純度である９８％以上の純度を確保するためにフェルラ酸結晶化を行った。結晶化は、［１］脱離分画分の濃縮（１０倍）、［２］沈殿物の熱水溶解（１００ｍｌ）、［３］温度コントロール（温度降下）による結晶化進行、及び［４］フェルラ酸結晶の回収段階を経て行った。

本過程の実行結果、濃縮沈殿によって投入液に比べた非結晶回収率は８１．８％であり、熱水溶解後の結晶化過程は回収率８８％水準で評価した。最終フェルラ酸の純度は９８．７％で製品化品質として回収され、結晶化工程の最終収率は７２％を示した（表７、図６）。

前記記述した工程により確保されたフェルラ酸の最終純度は９８．７％で、標準品９９％水準と同様の水準であり、現在商用化されているフェルラ酸の純度である９８％水準に適した製品として生産された。

このような結果から、本発明者らは、従来米糠油の製造工程上の副産物である原油脱産物を原料にして、様々な溶媒（ＩＰＡ、ヘキサン、エタノール）により生産されたフェルラ酸を経済的で、大量化可能な原料であるトウモロコシふすまを用いて単純化されて高収率化が可能な抽出、精製、結晶化方法を介して高付加価値素材であるフェルラ酸を効率的に量産化可能な工程を発明した。

以上の説明から、本出願が属する技術分野の当業者は本出願がその技術的思想や必須の特徴を変更せず、他の具体的な形態で実施できることを理解できるだろう。これに関連し、以上で記述した実施例は、すべての面で例示的なものであり、限定的なものではないと理解するべきである。本出願の範囲は、前記の詳細な説明ではなく、後述する特許請求の範囲の意味及び範囲、そしてその等価概念から導出されるすべての変更または変形された形態が本出願の範囲に含まれるものと解釈されるべきである。

Claims (22)

1. （ａ）トウモロコシふすまをアルカリ溶液と反応させてフェルラ酸（ferulic acid）を含む粗抽出物を収得する段階；
   （ｂ）該粗抽出物と液化酵素（α-amylase）、糖化酵素（glucoamylase）、または液化酵素及び糖化酵素の両方を反応させる酵素反応を介して、前記収得した粗抽出物からでん粉を除去する段階；及び
   （ｃ）トウモロコシふすまの抽出残渣を洗浄する段階
   を含む、フェルラ酸の製造方法。
2. 前記アルカリ溶液が、水酸化ナトリウムまたは水酸化カリウムである、請求項１に記載のフェルラ酸の製造方法。
3. 前記アルカリ溶液が、０．５％〜１．５％（ｗ/ｗ）の濃度である、請求項２に記載のフェルラ酸の製造方法。
4. 前記反応が、１時間〜２４時間行われるものである、請求項１に記載のフェルラ酸の製造方法。
5. 前記トウモロコシふすま及びアルカリ溶液の固液比が、１：３〜１：１５である、 請求項１に記載のフェルラ酸の製造方法。
6. 前記反応が、６０℃〜１００℃で行われるものである、請求項１に記載のフェルラ酸の製造方法。
7. 前記（ａ）段階が、収得した粗抽出物をろ過して固形物を除去する段階をさらに含むものである、請求項１に記載のフェルラ酸の製造方法。
8. 前記糖化酵素及び液化酵素の濃度が、各々０．１％〜１．０％（ｗ/ｗ）である、請求項１に記載のフェルラ酸の製造方法。
9. 前記残渣の洗浄が、トウモロコシふすまの残渣の１〜１０倍数の水を用いて行われるものである、請求項１に記載のフェルラ酸の製造方法。
10. （ｄ）フェルラ酸を分離精製する段階をさらに含む、請求項１に記載のフェルラ酸の製造方法。
11. 前記分離精製段階が、活性炭を用いた１次精製工程、及び吸着樹脂を用いた２次精製工程を含むものである、請求項１０に記載のフェルラ酸の製造方法。
12. 前記活性炭が、粒状活性炭または粉末活性炭である、請求項１１に記載のフェルラ酸の製造方法。
13. 前記活性炭が、抽出液に比べて０．１％〜２％（ｗ/ｖ）の濃度である、請求項１１に記載のフェルラ酸の製造方法。
14. 前記１次精製工程が、（ｉ）活性炭吸着、（ｉｉ）活性炭の熱水洗浄、及び（ｉｉｉ）活性炭内のフェルラ酸の脱着段階を含むものである、請求項１１に記載のフェルラ酸の製造方法。
15. 前記脱着段階が、アルカリ溶媒を用いて行われるものである、請求項１４に記載のフェルラ酸の製造方法。
16. 前記アルカリ溶媒が、水酸化ナトリウムまたは水酸化カリウムである、請求項１５に記載のフェルラ酸の製造方法。
17. 前記アルカリ溶媒が、０．０１％〜０．５％（ｗ/ｗ）の濃度である、請求項１５に記載のフェルラ酸の製造方法。
18. 前記１次精製工程が、前記フェルラ酸の脱着段階を介して脱離された工程液のｐＨを３〜４に補正して不純物を除去する段階をさらに含むものである、請求項１４に記載のフェルラ酸の製造方法。
19. 前記吸着樹脂が、ポリスチレン樹脂である、請求項１１に記載のフェルラ酸の製造方法。
20. 前記２次精製工程が、１次精製工程から収得した工程液を吸着樹脂に吸着させる段階及びこれから脱着させる段階を含むものである、請求項１１に記載のフェルラ酸の製造方法。
21. 前記脱着させる段階が、１５％〜３５％（ｗ/ｗ）のエタノール溶媒を用いて行われるものである、請求項２０に記載のフェルラ酸の製造方法。
22. 分離精製されたフェルラ酸を結晶化する段階をさらに含むものである、請求項１０に記載のフェルラ酸の製造方法。