JP6748888B2 - 土壌病害防除の方法、植物栽培用土壌、および土壌病害防除剤 - Google Patents

Description

本発明は、土壌病害防除の方法、植物栽培用土壌、および土壌病害防除剤に関する。

土壌生息性糸状菌によって引き起こされる土壌病害は、果樹や野菜に大きな被害を与える重要病害であり、生産現場からは有効な防除方法の開発が望まれている。現在、土壌病害の防除方法は化学薬剤に頼っている状況であり、環境負荷に配慮した防除技術の開発が急務となっている。

土壌病害の一つである白紋羽病を防除する方法として、白紋羽病菌に対して拮抗性を示す微生物を土壌に投入する方法がある。土壌に投入する微生物として、特許文献１には、バチルス（Bacillus）属細菌、特許文献２、３、および４には、トリコデルマ（Trichoderma）属菌などの糸状菌類、さらに、特許文献５には、キノコ菌類が記載されている。

特許文献６および７には、トルクロホスメチル等化合物、特許文献８には、ヨウ素含有化合物、さらに特許文献９には、３−クロロ−Ｎ−(３−クロロ−５−トリフルオロメチル−２−ピリジル)−α,α,α−トリフルオロ-２,６-ジニトロ−ｐ−トルイジンをそれぞれ土壌に投入して白紋羽病を防除する方法が記載されている。これら化学化合物の品目としては、例えばフルアジナム水和剤（商品名：フロンサイドＳＣ）やイソプロチオラン粒剤（商品名：フジワン粒剤）など７種が農薬登録されている。

有機性廃棄物（大豆かす、ふすま、油かす、など）を土壌に投入する方法があり、非特許文献１により、土壌微生物相が変化し、白紋羽病菌の伸長を抑制することが報告されている。

特許文献１０および１１には、非病原性の白紋羽病菌を土壌に施用することが記載されている。

特開２００５−２０６４９６号公報 特許３２１３１１２号公報 特開２００６−１９９６０１号公報 特開平１０−０３６２１１号公報 特開２００９−２９２７４１号公報 特開平９−１７５９１７号公報 特開平９−１９４３１１号公報 特開２００５−２６３７３３号公報 特開２００２−１０４９０７号公報 特許４９３６４４４号公報 特開２０１４−１１１５５７号公報

羽田宏・松崎巖・三枝隆夫、「有機資材の施用が土壌病原菌に与える影響」、北日本病害虫研究会報、北日本病害虫研究会、第３６号（１９８５）、p.１５７−１５９

微生物の土壌への投入は、外部で得られたある特定の菌種を対象の土壌に施用して、白紋羽病菌に対する発病抑止効果を得るものであり、その対象の土壌に常在する微生物の存在を全く考慮していない。そのため、そのような常在する微生物の働きによって、施用した微生物の当該土壌への定着が妨げられ、発病抑止効果が早急に失われる場合があった。また、当該微生物を培養・増養する必要があると同時に、生菌であるため保存期間は冷所でも１年以下と短い。

トルクロホスメチル等化合物、ヨウ素含有化合物、および、３−クロロ−Ｎ−(３−クロロ−５−トリフルオロメチル−２−ピリジル)−α,α,α−トリフルオロ-２,６-ジニトロ−Ｐ−トルイジンの土壌への投入は、化学化合物や農薬登録されている薬剤が、直接的に病原菌に作用するものであるために環境に与える影響が危惧される。

有機性廃棄物の土壌への投入は、有機性廃棄物が保存中に変質しやすく、また、その作製条件も一定しないことから、均一な品質のものを準備することが困難である。

非病原性の白紋羽病菌を土壌に施用する場合、当該非病原性の白紋羽病菌を培養、増殖する必要があるが、当該非病原性の白紋羽病菌は耐久胞子などを形成しないため、工業的な生産が困難であると同時に、生菌であるため保存期間は短い。

以上のように、簡便な方法で土壌病原菌を抑制することができる防除方法は見出されていない。

本発明は、土壌病原菌を簡便に抑制することができる、土壌病原菌防除の方法を提供することを目的とする。

本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、下記式（１）で表される構造を有する少なくとも１種のポリヒドロキシアルカン酸を土壌に施用することを特徴とする、土壌病害防除の方法に関する。

［−ＣＨＲ−ＣＨ_２−ＣＯ−Ｏ−］ （１）
（式中、ＲはＣ_ｎＨ_２ｎ＋１で表されるアルキル基で、ｎは１以上１５以下の整数である。）

前記ポリヒドロキシアルカン酸を、前記ポリヒドロキシアルカン酸および前記土壌の合計体積に対し体積比１％以上の割合で施用することが好ましい。

前記施用が、前記式（１）で表される構造を有する少なくとも１種のポリヒドロキシアルカン酸と土壌との混合であることが好ましい。

前記土壌病害が、白紋羽病菌に由来する病害であることが好ましい。

下記式（１）で表される構造を有する少なくとも１種のポリヒドロキシアルカン酸を葉、枝、茎・幹、果実のうち何れか１か所或いは２か所以上に付着することを特徴とする、病害防除の方法に関する。
［−ＣＨＲ−ＣＨ_２−ＣＯ−Ｏ−］ （１）
（式中、ＲはＣ_ｎＨ_２ｎ＋１で表されるアルキル基で、ｎは１以上１５以下の整数である。）

前記病害が、うどんこ病であることが好ましい。

前記ポリヒドロキシアルカン酸がポリ（３−ヒドロキシ酪酸−コ−３−ヒドロキシヘキサン酸）であることが好ましい。

下記式（１）で表される構造を有する少なくとも１種のポリヒドロキシアルカン酸と土壌とを混合することにより得られた植物栽培用土壌に関する。
［−ＣＨＲ−ＣＨ_２−ＣＯ−Ｏ−］ （１）
（式中、ＲはＣ_ｎＨ_２ｎ＋１で表されるアルキル基で、ｎは１以上１５以下の整数である。）

前記ポリヒドロキシアルカン酸を、前記ポリヒドロキシアルカン酸および前記土壌の合計体積に対し体積比１％以上の割合で混合することにより得られたものであることが好ましい。

下記式（１）で表される構造を有する少なくとも１種のポリヒドロキシアルカン酸からなる土壌病害防除剤に関する。
［−ＣＨＲ−ＣＨ_２−ＣＯ−Ｏ−］ （１）
（式中、ＲはＣ_ｎＨ_２ｎ＋１で表されるアルキル基で、ｎは１以上１５以下の整数である。）

本発明によれば、土壌病原菌を簡便に抑制することができる。

実験例１に係る（ａ）ＰＨＢＨと土壌とを混合した直後、および（ｂ）ＰＨＢＨを混合していない果樹研究所内のナシ圃場土、をそれぞれ示す状態図である。 実験例１に係る（ａ）ＰＨＢＨ混合土壌（静置１ヶ月）における白紋羽病菌の生長、および（ｂ）ＰＨＢＨを混合していない土壌における白紋羽病菌の生長、をそれぞれ示す状態図である。 実験例１に係る（ａ）ＰＨＢＨ混合土壌における白紋羽病菌の生長、および（ｂ）ＰＨＢＨを混合していない土壌における白紋羽病菌の生長程度、を示す表である。 実験例２に係る（ａ）ポリマー懸濁水に沈めたペーパーディスクを載せた場合の白紋羽病菌の生長、および（ｂ）ポリマー懸濁水に沈めたペーパーディスクを載せなかった場合の白紋羽病菌の生長、をそれぞれ示す状態図である。 実験例３に係る（ａ）ＰＨＢＨ混合土壌における白紋羽病菌の生長程度、および（ｂ）ＰＨＢＨを混合していない土壌における白紋羽病菌の生長程度、を示す表である。 実験例４に係る（ａ）ＰＨＢＨ混合土壌における白紋羽病菌の生長程度、および（ｂ）ＰＨＢＨを混合していない土壌における白紋羽病菌の生長程度、を示す表である。 実験例５に係る（ａ）ＰＨＢＨ混合土壌（静置１ヶ月）における白紋羽病菌の生長、および（ｂ）ＰＨＢＨを混合していない土壌における白紋羽病菌の生長、（ｃ）白紋羽病が発病した根、をそれぞれ示す状態図である。 実験例５に係る、ＰＨＢＨ混合土壌、およびＰＨＢＨを混合していない土壌、における白紋羽病の発病率を示す表である。 実験例６に係る、（ａ）ＰＨＢＨ混合土壌における白紋羽病菌の生長、および（ｂ）ＰＨＢＨを混合していない土壌における白紋羽病菌の生長、をそれぞれ示す状態図である。 実験例６に係る、ＰＨＢＨ混合土壌、およびＰＨＢＨを混合していない土壌、における白紋羽病の発病率を示す表である。 実験例７に係る、ＰＨＢＨ混合土壌、およびＰＨＢＨを混合していない土壌における白紋羽病菌の生長程度を示す表である。 実験例８に係る、（ａ）長野県ブドウ圃場土、および（ｂ）市販黒土を使用した場合の白紋羽病菌の生長程度を示す表である。 実験例９に係る、土壌における各ＰＨＢＨ体積比、における白紋羽病菌の生長程度を示す表である。 実験例１０に係る、ＰＨＢＨ混合土壌、およびＰＨＢＨを混合していない土壌、におけるならたけ病の発病率を示す表である。 実験例１０に係る、ならたけ病の発病状況を示す状態図である。 実験例１１に係る、紫紋羽病の塊根全体における発病部位を示す状態図である。 実験例１１に係る、紫紋羽病の発病状況を示す状態図である。 実験例１１に係る、ＰＨＢＨ混合土壌、およびＰＨＢＨを混合していない土壌、における紫紋羽病の発病率を示す表である。 実験例１２に係る、ＰＨＢＨ混合土壌、およびＰＨＢＨを混合していない土壌、における疫病の発病率を示す表である。 実験例１２に係る、疫病の発病状況を示す状態図である。 実験例１２に係る、疫病菌の繁殖状況を示す状態図である。 実験例１３に係る、ＰＨＢＨを付着させたリンゴ葉、およびＰＨＢＨを付着させていないリンゴ葉、におけるうどんこ病の１葉あたりの平均病斑数を示す表である。 実験例１３に係る、うどんこ病の発病状況を示す状態図である。 実験例１４に係る、ＰＨＢＨ混合土壌、およびＰＨＢＨを混合していない土壌、における１枝あたりの平均瘤数を示す表である。 実験例１４に係る、根頭がんしゅ病の発病状況を示す状態図である。

以下、本発明の好ましい実施の形態の一例を詳細に説明する。

［ポリヒドロキシアルカン酸］
本発明において、ポリヒドロキシアルカン酸は、一般式：［−ＣＨＲ−ＣＨ_２−ＣＯ−Ｏ−］で示される繰り返し単位を含む脂肪族ポリエステル樹脂である。

ポリヒドロキシアルカン酸は、式（１） ：
［−ＣＨＲ−ＣＨ_２−ＣＯ−Ｏ−］
（式中、ＲはＣ_ｎＨ_２ｎ＋１で表されるアルキル基で、ｎは１以上１５以下の整数である。）
で示される表される構造を有することが好ましい。

式（１）で表される構造を有するポリヒドロキシアルカン酸を少なくとも１種用いればよく、２種以上併用してもよい。

ポリヒドロキシアルカン酸の具体例としては、ポリ（３−ヒドロキシ酪酸）、ポリ（３−ヒドロキシ酪酸−コ−３−ヒドロキシ吉草酸）、ポリ（３−ヒドロキシ酪酸−コ−３−ヒドロキシヘキサン酸）（以下、ＰＨＢＨと称する場合がある）、ポリ（３−ヒドロキシ酪酸−コ−４−ヒドロキシ酪酸）、ポリ（３−ヒドロキシ酪酸−コ−３−ヒドロキシオクタン酸）、およびポリ（３−ヒドロキシ酪酸−コ−３−ヒドロキシデカン酸）等が挙げられる。中でも、非晶部分が多く、生分解性に優れ、かつ、ポリマーの生産性が高いため、ポリ（３−ヒドロキシ酪酸−コ−３−ヒドロキシヘキサン酸）が好ましい。これらは、単独で使用してもよいし、２種以上併用してもよい。

式（１）で表される構造を有するポリヒドロキシアルカン酸（以下、ＰＨＡと称することがある。）は、３−ヒドロキシ酪酸が６０モル％以上からなる樹脂であることが好ましく、より好ましくは８０モル％以上からなる樹脂であり、微生物によって生産された物が好ましい。

３−ヒドロキシ酪酸（以下、３ＨＢと称する場合がある）と共重合している、３−ヒドロキシ吉草酸）や、３−ヒドロキシヘキサン酸（以下、３ＨＨと称する場合がある）や、４−ヒドロキシ酪酸等のコモノマーが４０％を超えると粘着性を有し、土壌中での分散が困難になることがある。

ＰＨＡの共重合樹脂中の各モノマー比率は、以下のようにガスクロマトグラフィーによって測定できる。乾燥ＰＨＡ約２０ｍｇに、２ｍｌの硫酸／メタノール混液（１５／８５（重量比））と２ｍｌのクロロホルムを添加して密栓し、１００℃で１４０分間加熱して、ＰＨＡ分解物のメチルエステルを得る。冷却後、これに１．５ｇの炭酸水素ナトリウムを少しずつ加えて中和し、炭酸ガスの発生が止まるまで放置する。４ｍｌのジイソプロピルエーテルを添加してよく混合した後、上清中のＰＨＡ分解物のモノマーユニット組成をキャピラリーガスクロマトグラフィーにより分析することにより、共重合樹脂中の各モノマー比率を求められる。

前記ガスクロマトグラフとしては、島津製作所社製「ＧＣ−１７Ａ」を用い、キャピラリーカラムにはＧＬサイエンス社製「ＮＥＵＴＲＡ ＢＯＮＤ−１」（カラム長：２５ｍ、カラム内径：０．２５ｍｍ、液膜厚：０．４μｍ）を用いる。キャリアガスとしてＨｅを用い、カラム入口圧を１００ｋＰａとし、サンプルは１μｌ注入する。温度条件は、８℃／分の速度で初発温度１００℃から２００℃まで昇温し、さらに２００〜２９０℃まで３０℃／分の速度で昇温する。

ＰＨＡの重量平均分子量は、３０００以上が好ましく、１０万以上がより好ましく、４０万以上がさらに好ましい。重量平均分子量が３０００未満では、粘着性を有し土壌中への分散が困難になる。

前記重量平均分子量の測定方法は、ゲル浸透クロマトグラフィー（昭和電工社製「Ｓｈｏｄｅｘ ＧＰＣ−１０１」）を用い、カラムにポリスチレンゲル（昭和電工社製「Ｓｈｏｄｅｘ Ｋ−８０４」）を用い、クロロホルムを移動相とし、ポリスチレン換算した場合の分子量として求めることができる。この際、検量線は重量平均分子量３１４００、１９７０００、６６８０００、１９２００００のポリスチレンを使用して作成する。

なお、前記ＰＨＡは、例えば、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓにＡｅｒｏｍｏｎａｓ ｃａｖｉａｅ由来のＰＨＡ合成酵素遺伝子を導入したＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ ＡＣ３２株（ブダペスト条約に基づく国際寄託、国際寄託当局：独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）、原寄託日：平成８年８月１２日、平成９年８月７日に移管、寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６０３８（原寄託ＦＥＲＭ Ｐ−１５７８６より移管））（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７９，４８２１（１９９７））等の微生物によって産生される。

ＰＨＡは、土壌病害防除剤として用いることができ、樹脂の劣化が起き難いことから、倉庫等の農家や一般家庭が通常使用する保管場所等で数年間保存することができる。

［土壌］
本発明において、土壌は、土壌微生物が生息している土壌（土壌微生物を含む土壌）であれば、任意の土壌を利用することができる。

土壌（ｓｏｉｌ, 通称：土）とは、地表の表面を覆っている生物活動の影響を受けた物質層のことを指す。

微生物の生育に適した通気性、保水性、排水性の全てに優れる土壌を用いることが好ましい。このような土壌としては、例えば、砂壌土、壌土、および植壌土に分類される土壌が挙げられる。また、有機物やミネラル分を適度に含み、土壌ｐＨが弱酸性〜中性付近の土壌であることも好ましい。

また、植物栽培に適するため、土壌粒子どうしが互いに凝集した団粒構造をとることが好ましい。

土壌としては、例えば、黒ボク土、褐色森林土、および低地土等、ならびに、これらの土壌に、腐葉土、バーク堆肥、および家畜糞尿堆肥等の有機物や土壌微生物の種類や量が豊富な資材を混合した作土を挙げることができる。

土壌微生物とは、土壌中に土着して生息し、微生物群集を構成している微生物の全体を指す。例えば、子嚢菌類および担子菌類の糸状菌類（カビ、キノコ等）および子嚢菌類の酵母類を含む真核菌類、細菌類、放線菌類等、様々な種類の微生物を挙げることができる。

また、土壌は、ＰＨＡに対する分解作用を示す微生物（以下、ＰＨＡ分解微生物と称することがある）を含むことで、土壌病害を防除することができる。

土壌は、土壌微生物が豊富に生息していることが好ましい。混合するＰＨＡ分解微生物の個体数や種類が多く、また、ＰＨＡ分解作用を示し、かつ、土壌病害を引き起こす原因となる菌に対して何らかの拮抗作用を示す微生物の個体数や種類も多くなり、土壌病害に対する防除効果を高いものとすることができるためである。

ＰＨＡ分解微生物は、ＰＨＡを低分子化する微生物をいい、ＰＨＡ分解微生物としては、例えば、Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ属、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ属、Ａｕｒｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｃｏｍａｍｏｎａｓ属、Ｍａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒ属、Ｐａｕｃｉｍｏｎａｓ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｓｔｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属、Ｉｌｙｏｂａｃｔｅｒ属、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｕｍ属、Ｐａｅｃｉｌｏｍａｙｃｅｓ属、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、およびＴｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ属等に属する微生物が挙げられる。ＰＨＡ分解微生物は、ＰＨＡが土壌中に存在すると、自己の増殖に有利に働く。

ＰＨＡ分解微生物は、土壌、河川、海水中などに広く分布することが知られている。ここで、特開２０００−１５７２５８号公報によれば、土壌が有する白紋羽病菌に対する生長抑制の程度は、土壌中に存在する細菌類の多様性の程度と相関していることから、多様なＰＨＡ分解微生物は、土壌環境中での白紋羽病菌の増殖を抑制するために、重要な働きをすると認められる。

ここで、「拮抗作用を示す微生物」とは、他の微生物に対して致死、増殖阻害、生育阻害等の抑制作用を示す微生物を指す。

土壌病害としては、例えば、白紋羽病菌（子嚢菌類の糸状菌類と同じ分類群に属する）等に由来する白紋羽病、ならたけ病、紫紋羽病、疫病および根頭がんしゅ病が挙げられる。

白紋羽病菌に対して拮抗作用を示す微生物としては、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属、Ｇｌｏｍｕｓ属、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属、Ｂｅａｕｖｅｒｉａ属、Ｃｌｏｎｏｓｔａｃｈｙｓ属、およびＳｏｒｄａｒｉａ属等の糸状菌類、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属やＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属等の細菌類、ならびにＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属等の放線菌類等の微生物を挙げることができる。

ならたけ病に対して拮抗に対して拮抗作用を示す微生物としては、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属、およびＣｈａｅｔｏｍｉｕｍ属等の糸状菌等の微生物を挙げることができる。

紫紋羽病に対して拮抗に対して拮抗作用を示す微生物としては、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属、およびＧｌｏｍｕｓ属等の糸状菌類等の微生物を挙げることができる。

疫病に対して拮抗に対して拮抗作用を示す微生物としては、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属等の糸状菌類、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属等の細菌類等の微生物を挙げることができる。

根頭がんしゅ病に対して拮抗に対して拮抗作用を示す微生物としては、植物に対して非病原性のＲｈｉｚｏｂｉｕｍ属等の細菌等の微生物を挙げることができる。

［防除方法１］
ＰＨＡを施用することによる土壌病害防除の方法を開発した。ここで、施用とは、ＰＨＡが病害を防除しようとする土壌に作用することができる態様であれば、特に限定されないものである。

ＰＨＡを土壌に施用することで、土壌中に普遍的に存在し、本ポリマーを分解可能な微生物の増殖をもたらすことによって、当該土壌に病害防除効果を付与することができる。

当該施用により、土壌中に元々生息していた土着のＰＨＡ分解微生物、および、ＰＨＡ分解作用を示し、かつ、土壌病害を引き起こす原因となる菌に対して拮抗作用を示す微生物の大量増殖が可能となる。これにより、ＰＨＡ混合土壌には土壌病害を引き起こす原因となる菌に対して何らかの拮抗作用を示す微生物が大量に含まれるものとなり、土壌病害、例えば、白紋羽病に対する防除効果を長期間にわたり付与することができる。

ＰＨＡの施用により生じる、土壌が有する白紋羽病菌に対する生長抑制程度の強さは、用いた土壌に存在していた土壌微生物の数と種類、当該土壌の特性、混合処理後の静置条件（温度、期間等）等によって決定される。

また、ＰＨＡの施用により、栽培植物が土壌病害に罹病する頻度（発病率）を大幅に低減させ、および罹病する程度（発病程度）を大幅に小さくすることが可能となる。そして、植物栽培における土壌病害防除が可能となる。

ＰＨＡの施用は、野外土壌に対して直接行うこと、および容器に入れた土壌に対して行うことのいずれも可能である。

ＰＨＡの施用による土壌病害を引き起こす原因となる菌の生長抑制作用の維持の程度は、用いるＰＨＡの形状、大きさ、量、また施用の方法等に依存する。

特に、ＰＨＡ分解微生物が効率的に増殖すると共にＰＨＡの分解が効率的に進めることができるため、ＰＨＡとＰＨＡ分解微生物との接触面積を大きくすることが好ましい。ＰＨＡとＰＨＡ分解微生物との接触面積を大きくするために、ＰＨＡの形状としては、表面積が大きくなる形状、例えば、粉状、球状、さらにエマルジョン、スラリー状にしてもよい。ＰＨＡの大きさとしては、即効性を求めるのであれば表面性が大きい、即ち粒径が小さい方が好ましく、徐放性を求めるのであれば大きい方が好ましい。また、粒径の異なるものを組み合わせることで、効果を出すタイミングを調整することも可能である。粒径は、例えば、エマルジョン、スラリー状の場合、平均粒径０．１μｍ〜１００μｍ、粉状、球状の場合、平均粒径１μｍ〜１０ｍｍであってもよい。平均粒径は、例えば、レーザー回折・散乱法（マイクロトラック法）により測定することができる。装置としては、日機装株式会社のMicrotrac MT3300EXIIを使用し、ラテックス、スラリー、または粉状体でレーザー回折・散乱法（マイクロトラック法）により測定することができる。

施用の方法としては、例えば、ＰＨＡを土壌に投入する方法、ＰＨＡと土壌とを混合する方法、ＰＨＡを土壌の上に散布する方法、ＰＨＡを土壌に含浸させる方法、ＰＨＡを生物（土壌小動物など）に付着させて土壌中に放す方法、土壌に穴を開けて注入する等によりＰＨＡと土壌とを接触させる方法を挙げることができる。これらの中でも、特に、ＰＨＡと土壌とを混合する方法が好ましい。ＰＨＡ分解微生物が効率的に増殖すると共にＰＨＡの分解が効率的に進めることができるためである。一方、スラリー状にして土壌に散布する方法は、根の遠く（根から離れた位置）まで浸透してしまうというロスが発生する恐れがあるが、作業効率に優れ、作業者への負担が最も少ない。スラリーを増粘させることで、狙った場所に投入してロスを減らすことも可能である。なお、ＰＨＡを混合することにより得られた土壌をＰＨＡ混合土壌と称する場合がある。

ＰＨＡの施用は、ＰＨＡが土壌中に均一且つ根の周辺に分散することが好適であり、均一に分散するため、例えば、噴霧器、散水器、肥料散布機、耕耘機を用いることができる。

ＰＨＡを土壌に施用する際のＰＨＡの体積比は、ＰＨＡおよび土壌の合計体積に対し１％以上の割合であることが好ましい。１％以上の割合であると、白羽病菌の生長抑制作用が強く示される。

さらに、ＰＨＡ混合土壌において、ＰＨＡの混合量は、土壌１００体積部に対し、１〜６０体積部であることが好ましく、５〜４０体積部であることがより好ましい。

ＰＨＡと土壌とを接触させた後、例えば、ＰＨＡと土壌とを混合した後、当該ＰＨＡ混合土壌を一定期間静置することが好ましい。土壌中に元々生息していた土着の土壌病害を引き起こす原因となる菌に対して何らかの拮抗作用を示す微生物を、特異的に大量に増殖させることができる。

静置は、ＰＨＡ分解微生物の生育に適した条件で行うことが好適である。好適な温度としては、例えば、１０〜３０℃であり、ＰＨＡ混合土壌中の含水量は、嫌気的にならない程度であることが望ましい。

また、静置の期間は特に限定されないが、ＰＨＡと土壌との混合の後、１週間以上６ヶ月以下であることが好ましい。１週間未満であると土壌病原菌を抑制できない場合があり、６ヶ月を超えると、土壌病原菌の抑制の程度が上昇しなくなるためである。ＰＨＡと土壌との混合の後、６ヶ月以下においては、静置の期間が経過するに従い、ＰＨＡ分解微生物が急激に増殖する。

ＰＨＡと土壌とを混合することにより得られた土壌など、ＰＨＡを含む土壌は、植物栽培用土壌として用いることがでる。例えば、ポットおよびプランター等を用いて植物を栽培する場合において、培土として使用してもよい。また、果樹園および圃場において、自然土壌に添加する培土として利用してもよい。植物としては、特に、果樹や花木、例えば、ナシ、リンゴ、ブドウ、モモ、ウメ、オウトウ、アンズ、スモモ、ビワ、イチジク、キウイフルーツ、カキ、クリ、チャ、サクラ、カエデ、ツバキ、ツツジ、およびバラ等の栽培に利用することができる。

［防除方法２］
ＰＨＡを施用することによる病害防除の方法として、ＰＨＡを土壌に施用する以外にも、ＰＨＡを葉、枝、茎・幹、果実等の植物の地上部のうち何れか１か所或いは２か所以上に付着する方法が挙げられる。

ＰＨＡを植物の地上部に施用することで、地上部に普遍的に存在し、本ポリマーを分解可能な微生物の増殖をもたらすことによって、当該地上部に病害防除効果を付与することができる。

当該施用により、元々生息していたＰＨＡ分解微生物、および、ＰＨＡ分解作用を示し、かつ、病害を引き起こす原因となる菌に対して拮抗作用を示す微生物の大量増殖が可能となる。これにより、例えば、うどんこ病に対する防除効果を付与することができる。

ＰＨＡの施用による病害を引き起こす原因となる菌の生長抑制作用の維持の程度は、用いるＰＨＡの形状、大きさ、量、また施用の方法等に依存する。

特に、ＰＨＡ分解微生物が効率的に増殖すると共にＰＨＡの分解が効率的に進めることができるため、ＰＨＡとＰＨＡ分解微生物との接触面積を大きくすることが好ましい。ＰＨＡとＰＨＡ分解微生物との接触面積を大きくするために、ＰＨＡの形状としては、表面積が大きくなる形状、例えば、粉状、球状、さらにエマルジョン、スラリー状にしてもよい。ＰＨＡの大きさとしては、即効性を求めるのであれば表面性が大きい、即ち粒径が小さい方が好ましく、徐放性を求めるのであれば大きい方が好ましい。また、粒径の異なるものを組み合わせることで、効果を出すタイミングを調整することも可能である。粒径は、例えば平均粒径０．１μｍ〜１００μｍであってもよい。平均粒径は、例えば、レーザー回折・散乱法（マイクロトラック法）により測定することができる。装置としては、日機装株式会社のMicrotrac MT3300EXIIを使用し、ラテックス、スラリー、または粉状体でレーザー回折・散乱法（マイクロトラック法）により測定することができる。

施用の方法としては、例えば、ＰＨＡを無人ヘリコプター等を用いて上空から散布する方法、ＰＨＡを地上から噴霧器等を用いて散布する方法、ＰＨＡを付着させた保持体（例えば、他の柔軟な素材からなる紐、布、網等の形状のもの）で被服する方法を挙げることができる。これらの中でも、特に、ＰＨＡを地上から散布する方法が好ましい。

ＰＨＡの施用は、ＰＨＡが植物の表面に均一且つまんべんなく分散することが好適であり、均一に分散するため、例えば、噴霧器、散水器、肥料散布機を用いることができる。また、ＰＨＡを効率良く植物に付着させるための添加剤を混合しても良い。

以下、実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明の範囲はこれらにより限定されるものではない。

（実験例１）
「ＰＨＡと土壌との混合が白紋羽病菌の生長に与える影響」
ＰＨＡと土壌との混合が白紋羽病菌の生長に与える影響を検討した。

（１）「ＰＨＡの一種であるＰＨＢＨの合成」
培養生産にはＫＮＫ−６３１株（国際公開第２００９／１４５１６４号）を用いた。

種母培地の組成は１ｗ／ｖ％ Ｍｅａｔ−ｅｘｔｒａｃｔ、１ｗ／ｖ％ Ｂａｃｔｏ−Ｔｒｙｐｔｏｎｅ、０．２ｗ／ｖ％ Ｙｅａｓｔ−ｅｘｔｒａｃｔ、０．９ｗ／ｖ％ Ｎａ_２ＨＰＯ_４・１２Ｈ_２Ｏ、０．１５ｗ／ｖ％ ＫＨ_２ＰＯ_４、（ｐＨ６．８）とした。

前培養培地の組成は１．１ｗ／ｖ％ Ｎａ_２ＨＰＯ_４・１２Ｈ_２Ｏ、０．１９ｗ／ｖ％ ＫＨ_２ＰＯ_４、１．２９ｗ／ｖ％ （ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、０．１ｗ／ｖ％ ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、０．５ｖ／ｖ％ 微量金属塩溶液（０．１Ｎ塩酸に１．６ｗ／ｖ％ ＦｅＣｌ_３・６Ｈ_２Ｏ、１ｗ／ｖ％ ＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ、０．０２ｗ／ｖ％ ＣｏＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ、０．０１６ｗ／ｖ％ ＣｕＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ、０．０１２ｗ／ｖ％ ＮｉＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏを溶かしたもの）、とした。炭素源はパーム核油を１０ｇ／Ｌの濃度で一括添加した。

ポリエステル樹脂生産培地の組成は０．３８５ｗ／ｖ％ Ｎａ_２ＨＰＯ_４・１２Ｈ_２Ｏ、０．０６７ｗ／ｖ％ ＫＨ_２ＰＯ_４、０．２９１ｗ／ｖ％ （ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、０．１ｗ／ｖ％ ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、０．５ｖ／ｖ％ 微量金属塩溶液（０．１Ｎ 塩酸に１．６ｗ／ｖ％ ＦｅＣｌ_３・６Ｈ_２Ｏ、１ｗ／ｖ％ ＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ、０．０２ｗ／ｖ％ ＣｏＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ、０．０１６ｗ／ｖ％ ＣｕＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ、０．０１２ｗ／ｖ％ ＮｉＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏを溶かしたもの）、０．０５ｗ／ｖ％ ＢＩＯＳＰＵＲＥＸ２００Ｋ（消泡剤：コグニスジャパン社製）とした。

まず、ＫＮＫ−６３１株のグリセロールストック（５０μｌ）を種母培地（１０ｍｌ）に接種して２４時間培養し種母培養を行なった。次に種母培養液を１．８Ｌの前培養培地を入れた３Ｌジャーファーメンター（丸菱バイオエンジ製ＭＤＬ−３００型）に１．０ｖ／ｖ％接種した。運転条件は、培養温度３３℃、攪拌速度５００ｒｐｍ、通気量１．８Ｌ／ｍｉｎとし、ｐＨは６．７〜６．８の間でコントロールしながら２８時間培養し、前培養を行なった。ｐＨコントロールには１４％水酸化アンモニウム水溶液を使用した。

次に、前培養液を６Ｌの生産培地を入れた１０Ｌジャーファーメンター（丸菱バイオエンジ製ＭＤＳ−１０００型）に１．０ｖ／ｖ％接種した。運転条件は、培養温度２８℃、攪拌速度４００ｒｐｍ、通気量６．０Ｌ／ｍｉｎとし、ｐＨは６．７から６．８の間でコントロールした。ｐＨコントロールには１４％水酸化アンモニウム水溶液を使用した。炭素源としてパーム油、を使用した。培養は６４時間行い、培養終了後、遠心分離によって菌体を回収、メタノールで洗浄、凍結乾燥し、乾燥菌体重量を測定した。

得られた乾燥菌体１ｇに１００ｍｌのクロロホルムを加え、室温で一昼夜攪拌して、菌体内のポリエステル樹脂を抽出した。菌体残渣をろ別後、エバポレーターで総容量が３０ｍｌになるまで濃縮後、９０ｍｌのヘキサンを徐々に加え、ゆっくり攪拌しながら、１時間放置した。析出したポリエステル樹脂をろ別後、５０℃で３時間真空乾燥し、ポリエステル樹脂を得た。

得られたポリエステル樹脂のモノマーユニット組成分析は以下のようにガスクロマトグラフィーによって測定した。

乾燥ポリエステル樹脂２０ｍｇに２ｍｌの硫酸−メタノール混液（１５：８５）と２ｍｌのクロロホルムを添加して密栓し、１００℃で１４０分間加熱して、ポリエステル樹脂分解物のメチルエステルを得た。冷却後、これに１．５ｇの炭酸水素ナトリウムを少しずつ加えて中和し、炭酸ガスの発生がとまるまで放置した。４ｍｌのジイソプロピルエーテルを添加してよく混合した後、遠心して、上清中のポリエステル分解物のモノマーユニット組成をキャピラリーガスクロマトグラフィーにより分析した。

ガスクロマトグラフは島津製作所ＧＣ−１７Ａ、キャピラリーカラムはＧＬサイエンス社製ＮＥＵＴＲＡ ＢＯＮＤ−１（カラム長２５ｍ、カラム内径０．２５ｍｍ、液膜厚０．４μｍ）を用いた。キャリアガスとしてＨｅを用い、カラム入口圧１００ｋＰａとし、サンプルは１μlを注入した。温度条件は、初発温度１００から２００℃まで８℃／分の速度で昇温、さらに２００から２９０℃まで３０℃／分の速度で昇温した。上記条件にて分析した結果、樹脂構造はＰＨＢＨであった。３−ヒドロキシ酪酸（３ＨＢ）の比率は、８９モル％、３−ヒドロキシヘキサン酸（３ＨＨ）の比率は、１１モル％であった。また、ＧＰＣ（ゲル浸透クロマトグラフィー（昭和電工社製「Ｓｈｏｄｅｘ ＧＰＣ−１０１」））で測定した重量平均分子量は６５万であった。

（２）「混合土壌の作製」
ステンレス製寸胴容器内に、土壌として圃場土（果樹研究所内のナシ圃場から採取した土）１．６Ｌと、ＰＨＢＨ（粉状：平均粒径２００μｍ）４００ｍＬ分を入れ、ＰＨＢＨと土壌とを混合することによりＰＨＢＨ混合土壌を作製し（図１（ａ））、２３℃暗所で所定期間静置した。その後、適宜、混合土壌を以下の試験に用いた。なお、静置期間中、土壌が乾燥することを回避するため、適宜、滅菌蒸留水を土壌表面に散水した。

（３）「混合土壌における白紋羽病菌の生長程度の調査」
白紋羽病菌の接種源として、径約５ｍｍのナシ枝を厚さ５ｍｍ程度に切ってオートクレブ滅菌したものに白紋羽病菌（Ｗ５６３株）を接種し、２週間培養したものを準備した。

ついで、滅菌したガラスシャーレにＰＨＢＨ混合土壌を約３０ｍｌ入れ、平坦になるようにならした。この時、ＰＨＢＨ混合土壌は静置１週間後および１ヶ月後のものをそれぞれ使用した。シャーレ中央部の土壌に径５ｍｍ程度の穴を掘り、接種源をシャーレ底面に接触するように、かつ、接種源上面に土が被らないように埋設した。

その後、２３℃暗所に静置し、９日後に土壌表面およびシャーレ底面において最も良好な生長を示した菌糸先端の接種源からの直線的な長さを計測した（図２（ｂ））。最も良好な生長を示した菌糸は、接種源から菌糸の先端までの距離が最も離れている菌糸である。試験は各４反復行い、白紋羽病菌の生長程度は１日あたりに生長した菌糸先端の接種源からの直線的な長さで示した。図３に示す結果は、４反復の各白紋羽病菌の生長程度の平均値である。

また、対照として、ＰＨＢＨ混合土壌の代わりに、ＰＨＢＨを混合していない果樹研究所内のナシ圃場土（ＰＨＢＨを混合していない土壌）を用いた以外は同様にして白紋羽病菌の生長程度を測定した。結果は、図３に示す。

（４）「結果」
計測の結果、上記作製したＰＨＢＨ混合土壌を供した場合、静置１週間後、１ヶ月後のいずれの土壌においても、ＰＨＢＨを混合していない土壌を用いた場合と比べて、白紋羽病菌の菌糸の生長が抑制された（図３）。特に、シャーレ底部における抑制が顕著であった。例えば、図２（ａ）からも分かるように、静置１ヶ月後のＰＨＢＨ混合土壌の場合、底面の菌糸生長がほとんどなかった。

このことから、ＰＨＢＨを混合する処理を行った土壌では、ＰＨＢＨを混合していない土壌に比べて、白紋羽病菌に対して高い生長抑制を示すことが明らかになった。

この高い生長抑制は、ＰＨＢＨ分解微生物のうち、白紋羽病菌に対して拮抗作用を有する微生物が、土壌中で増加したことによるためと推測された。

（実験例２）
「ＰＨＡによる白紋羽病菌への直接的な影響」
実験１により確認された、ＰＨＡ混合土壌が有する白紋羽病菌の生長抑制作用は、白紋羽病菌に対して拮抗作用を示す微生物が増加したために得られたものと推測された。しかし、使用したＰＨＡ自体に白紋羽病菌に対する生長抑制作用が存在する可能性があるため、ＰＨＡ分解微生物の存在しない環境下における、ＰＨＡによる白紋羽病菌に対する生長抑制作用の有無を調べた。

（１）「無菌条件下におけるＰＨＡによる白紋羽病菌に対する生長抑制作用の有無の調査」
ＰＨＢＨ（粉状：平均粒径２００μｍ）約５０ｍｌ分と蒸留水５０ｍｌをプラントボックスに入れて、１０５℃で１５分オートクレブし、室温に冷ました。以降、これをポリマー懸濁水と呼ぶ。

径６ｍｍのペーパーディスクをポリマー懸濁水に沈めてポリマーを付着させた後、栄養分を１／１０希釈したブドウ糖加用ジャガイモ煎汁寒天平板培地（１／１０ ＰＤＡ培地）にそのまま載せた。

同じ１／１０ ＰＤＡ培地に、白紋羽病菌（Ｗ５６３株）を培養したＰＤＡ培地から切り出した径４ｍｍのディスク状の含菌寒天を、上記ペーパーディスクから約３ｃｍ離して置いた（図４）。その後、２３℃暗所で培養した。試験は３反復行い、定期的に白紋羽病菌の生長程度の観察を１０日後まで続けた。

また、対照として、ポリマー懸濁水に沈めたペーパーディスクを載せなかった以外は同様にして白紋羽病菌を培養した。

（２）「結果」
その結果、ポリマー懸濁水に沈められ、ポリマーが付着したペーパーディスクが存在しても、当該ペーパーディスクを載せなかった培地と同様の生長程度を示した（図４）。

この白紋羽病菌の生長程度は、ＰＨＢＨの有無と関係なく同様に認められたことから、ＰＨＢＨ自体には白紋羽病菌に対する生長抑制作用は有していないと認められた。

（実験例３）
「ＰＨＡ混合土壌に含まれる微生物による白紋羽病菌への影響」
実験例１で作製したＰＨＢＨ混合土壌が有する白紋羽病菌の生長抑制作用は、白紋羽病菌に対して拮抗作用を示す微生物が増加したために得られたものと推測された。

そこで、当該土壌を滅菌処理し、白紋羽病菌に対する生長抑制作用が滅菌処理の有無によって変化するか否か調べた。

（１）「滅菌処理後のＰＨＡ混合土における白紋羽病菌の生長抑制の変化の調査」
実験例１に記載の混合土壌の作製方法に従って、ＰＨＢＨ混合土壌を作製し、静置１週間後の土壌を用い、実験例１に記載の調査手順に従って、白紋羽病菌の接種源を土壌が入ったシャーレ中央部の土壌に埋設した。

また、滅菌したガラスシャーレにＰＨＢＨ混合土壌を約３０ｍｌ入れた後、１１０℃で１０分、オートクレブし、その後、室温まで冷ました。その後、実験例１に記載の調査手順に従って、白紋羽病菌の接種源を当該オートクレブ後のＰＨＢＨ混合土壌が入ったシャーレ中央部の土壌に埋没した。

白紋羽病菌の接種源を埋没後、いずれのシャーレも２３℃暗所で静置９日後に、土壌表面およびシャーレ底面における菌糸の長さを計測した。試験は各４反復行い、白紋羽病菌の生長程度は１日あたりに生長した菌糸先端の接種源からの直線的な長さで示した。図５に示す結果は、４反復の各白紋羽病菌の生長程度の平均値である。

また、対照として、ＰＨＢＨ混合土壌の代わりに、ＰＨＢＨを混合していない果樹研究所内のナシ圃場土（ＰＨＢＨを混合していない土壌）を用いた以外は同様にして白紋羽病菌の生長程度について測定した。結果は、図５に示す。

（２）「結果」
オートクレブ処理をしたＰＨＢＨ混合土壌およびオートクレブ処理をしたＰＨＢＨを混合していない土壌を用いた場合のいずれも、オートクレブしなかった土壌を用いた場合よりも高い値が得られた（図５）。また、ポリマー混合土壌において、オートクレブ処理によってシャーレ底部における白紋羽病菌の生長が顕著に向上した。

このことから、白紋羽病菌に対する生長抑制には土壌微生物が関与しており、特に、ＰＨＢＨ混合土壌における白紋羽病菌の生長抑制には土壌微生物が大きく関与していることが明らかになった。特に、ＰＨＢＨ混合土壌においては、増加したＰＨＢＨ分解微生物の影響が大きいと推測された。

（実験例４）
「ＰＨＡ混合土壌の長期静置による白紋羽病菌生長抑制への影響」
ＰＨＢＨ混合土壌における白紋羽病菌の生長抑制作用が、長期静置した場合でも維持されるか否かを調査した。

（１）「混合土壌の作製」
実験例１に記載の混合土壌作製方法に従って、ＰＨＢＨ混合土壌を作製した。

（２）「長期保存後の混合土壌における白紋羽病菌の生長程度の調査」
上記で作製したＰＨＢＨ混合土壌について、実験例１に記載の計測方法と同様にして、当該土壌における白紋羽病菌の生長抑制程度を調査するため、菌糸の長さを計測した。この時、混合土壌は静置２ヶ月および６ヶ月のものを使用した。

また、対照として、ＰＨＢＨ混合土壌の代わりに、土壌としてＰＨＢＨを混合していない果樹研究所内のナシ圃場土（ＰＨＢＨを混合していない土壌）を用いた以外は同様にして白羽病菌の生長程度について調査した。結果は、図６に示す。
（３）「結果」
その結果、２ヶ月、６ヶ月の静置期間を設けた場合においては、実験例１で示した静置1週間後、１ヶ月後の土壌における生長抑制程度と比較して、同等以上の高い値が得られることが示された（図２、図３、図６）。

このことから、ＰＨＢＨ混合土壌は、ＰＨＢＨ混合後、静置１週間から生長抑制作用が認められ、その後、静置６ヶ月に至るまで、生長抑制作用は維持あるいは漸次上昇することが示された。

（実験例５）
「ＰＨＡ混合土壌による白紋羽病に対する防除効果（一部処理）」
実際に植物を栽培する場合に、白紋羽病の発病抑制が認められるか否かを検証した。本実験では、ＰＨＢＨ混合土に植物を一部接触させた場合の効果を調べた。

（１）「発病抑制試験」
ポット（径９ｃｍ）の底部に果樹研究所内のナシ圃場土を深さ約１ｃｍ分を入れた後に、白紋羽病菌の接種源を埋め込むように置いた。この時、接種源として、滅菌したナシ枝片（長さ３〜４ｃｍ、径０．８〜１ｃｍ）に白紋羽病菌（Ｗ５６３株）を接種し、約１ヶ月培養したものを使用した。

さらに、接種源の上にＰＨＢＨ混合土壌約３０ｍｌを入れ、平坦になるようにならした（図７）。ＰＨＢＨ混合土壌は、実験例１に記載の混合土壌の作製方法に従って、１ヶ月静置したもの、および６ヶ月静置したものをそれぞれ用いた。

対照として、ＰＨＢＨ混合土壌を用いる代わりに、ＰＨＢＨを混合していない果樹研究所内のナシ圃場土（ＰＨＢＨを混合していない土壌）を用いた以外は同様にして土壌を入れたポットを作製した。

根部を水道水で水洗した２年生リンゴ台木苗を圃場土を用いてＰＨＢＨ混合土壌およびＰＨＢＨを混合していない果樹研究所内のナシ圃場土（ＰＨＢＨを混合していない土壌）を入れたポットにそれぞれ移植した後（図７）、２５℃の環境制御ガラス室で育成した。ポット苗は、１ヶ月静置したＰＨＢＨ混合土壌、６ヶ月静置したＰＨＢＨ混合土壌、およびＰＨＢＨを混合していない土壌を入れたポットについて６個ずつ用いた。

２ヶ月後に、苗を掘り起こして地下部（根部）の腐敗状況を観察し、発病した個体の割合（発病率）を計算した。結果を図８に示した。発病したか否かは、根部が腐敗し、かつ、その樹皮下に白紋羽病菌の菌糸が観察されるか否かにより判断した。実験例６についても同様である。発病した苗の例を図７（ｃ）に示す。

（２）「結果」
その結果、ＰＨＢＨ混合土壌を用いた場合、１ヶ月静置したもの、６ヶ月静置したもの共に、白紋羽病の発病率は、対照と比較して１／２以下の低い値を示すことが確認された（図７、図８）。

また、ＰＨＢＨ混合土壌を用いた場合、１ヶ月静置したもの、６ヶ月静置したもの共に、根は健全であったが、ＰＨＢＨを混合していない土壌を用いたものは、根が腐敗した（図７）。

（実験例６）
「ＰＨＡ混合土壌による白紋羽病に対する防除効果（全体処理）」
実際に植物を栽培する場合に、白紋羽病の発病抑制が認められるか否かを検証した。本試験では、ＰＨＢＨ混合土で植物を育成した場合の効果を調べた。

（１）「発病抑制試験」
ポット（径９ｃｍ）に根部を水道水で水洗した2年生リンゴ台木苗をＰＨＢＨ混合土壌（混合直後）を用いて移植し（図９）、２５℃の環境制御ガラス室で１ヶ月および２ヶ月育成した。この時、ポットの最上部まで土壌を充填せず、上部１〜２ｃｍ分を残した。

新しいポット（径９ｃｍ）の底部に果樹研究所内のナシ圃場土を深さ約１ｃｍ分を入れた後に、白紋羽病菌の接種源を埋め込むように置いた。この時、接種源として、滅菌したナシ枝片（長さ３〜４ｃｍ、径０．８〜１ｃｍ）に白紋羽病菌（Ｗ５６３株）を接種し、約１ヶ月培養したものを使用した。

接種源の上に、ＰＨＢＨ混合土で１ヶ月および２ヶ月育成したリンゴ台木をポットから土壌ごと取り出して載せ（図９）、引き続き２５℃で育成した。ポット苗を６個ずつ用いた。

２ヶ月後に、苗を掘り起こして地下部（根部）の腐敗状況を観察し、発病した個体の割合（発病率）を計算した。

対照として、ＰＨＢＨ混合土壌の代わりに、果樹研究所内のナシ圃場土（ＰＨＢＨを混合していない土壌）を用いた以外は同様にしてリンゴ台木苗を育成し、苗を掘り起こして地下部（根部）の腐敗状況を観察し、発病した個体の割合（発病率）を計算した。結果は、図１０に示す。

（２）「結果」
その結果、ＰＨＢＨ混合土壌を用いた場合は、１ヶ月育成したもの、２ヶ月育成したもの共に、白紋羽病の発病率は、対照と比較して１／２の低い値を示すことが確認された（図９、図１０）。

また、ＰＨＢＨ混合土壌（混合直後）を用いた場合、根は健全であったが、ＰＨＢＨを混合していない土壌を用いたものは、根が腐敗した（図９）。

（実験例７）
「ＰＨＡ混合土壌の１年以上の長期静置による白紋羽病菌生長抑制への影響」
ＰＨＢＨを混合した土壌における白紋羽病菌の生長抑制作用が、１年以上長期静置した場合でも維持されるか否かを調査した。

（１）「混合土壌の作製」
実験例１に記載の混合土壌作製方法に従って、ＰＨＢＨ混合土壌を作製した。

（２）「長期保存後の混合土壌における白紋羽病菌の生長程度の調査」
上記で作製したＰＨＢＨ混合土壌について、シャーレ底面における白紋羽病菌の生長程度のみを計測した以外は実験例１と同様にして、当該土壌における白紋羽病菌の生長抑制程度を調査するため、菌糸の長さを計測した。この時、混合土壌は静置１５ヶ月のものを使用した。

また、対照として、ＰＨＢＨ混合土壌の代わりに、土壌としてＰＨＢＨを混合していない果樹研究所内のナシ圃場土（ＰＨＢＨを混合していない土壌）を用いた以外は同様にして白羽病菌の生長程度について調査した。結果は、図１１に示す。

（３）「結果」
その結果、１５ヶ月の静置期間を設けた場合においては、実験例１の静置１週間後、１ヵ月後、実験例４の静置２ヶ月後、６ヶ月後の土壌における生長抑制程度と比較して、同等の高い値が得られることが示された（図１１）。

このことから、ＰＨＢＨ混合土壌は、ＰＨＢＨ混合後、静置１週間から生長抑制作用が認められ、その後、静置１５ヶ月に至るまで、生長抑制作用は維持することが示された。

（実験例８）
「ＰＨＡを混合する土壌の違いによる白紋羽病菌生長抑制への影響」
ＰＨＢＨを混合する土壌の違いが白紋羽病菌の生長抑制作用に影響を与えるか否かを調査した。

（１）「使用土壌」
長野県須坂市の果樹試験場内のブドウ圃場土および市販黒土（栃木県産、刀川平和農園）を使用した。

（２）「混合土壌の作製」
実験例１の「混合土壌の作製」に記載の方法に従って、ＰＨＢＨ混合土壌を作製した。

（３）「保存後の混合土壌における白紋羽病菌の生長程度の調査」
上記で作製したＰＨＢＨ混合土壌について、シャーレ底面における白紋羽病菌の生長程度のみを計測した以外は実験例１と同様にして、当該土壌における白紋羽病菌の生長抑制程度を調査するため、菌糸の長さを計測した。この時、混合土壌は静置１ヶ月のものを使用した。

また、対照として、ＰＨＢＨ混合土壌の代わりに、土壌としてＰＨＢＨを混合していない長野県須坂市の果樹試験場内のブドウ圃場土および市販黒土（栃木県産、刀川平和農園）を用いた以外は同様にして白羽病菌の生長程度について調査した。結果は、図１２に示す。

（４）「結果」
その結果、長野県須坂市の果樹試験場内のブドウ圃場土および市販黒土（栃木県産、刀川平和農園）においては、実験例１の果樹研究所ナシ圃場土を使用した場合の生長抑制程度と同等の高い値が得られることが示された（図１２）。

このことから、ＰＨＢＨを混合する土壌の違いによる生長抑制作用に大きな違いはないことが示された。

（実験例９）
「土壌に混合するＰＨＡ量の違いによる白紋羽病菌生長抑制への影響」
土壌に混合するＰＨＢＨ量の違いが白紋羽病菌の生長抑制作用に影響を与えるか否かを調査した。

（１）「混合土壌の作製」
実験例１の「混合土壌の作製」に記載の方法に従って、ＰＨＢＨ混合土壌を作製した。この時、使用する材料の分量を変えて行い、ステンレス製寸胴容器内に、土壌として圃場土（果樹研究所内のナシ圃場から採取した土）８００ｍＬとＰＨＢＨ（粉状：平均粒径２００μｍ）２００ｍＬ分（体積比２０％）、圃場土９５０ｍＬとＰＨＢＨ５０ｍＬ（体積比５％）、圃場土９９０ｍＬとＰＨＢＨ１０ｍＬ（体積比１％）、圃場土９９９ｍＬとＰＨＢＨ１ｍＬ（体積比０．１％）、圃場土９９９．９ｍＬとＰＨＢＨ０．１ｍＬ（体積比０．０１％）を入れ、ＰＨＢＨと土壌とを混合することによりＰＨＢＨ混合土壌を作製し、２３℃暗所で所定期間静置した。その後、適宜、混合土壌を以下の試験に用いた。なお、静置期間中、土壌が乾燥することを回避するため、適宜、滅菌蒸留水を土壌表面に散水した。

（２）「保存後の混合土壌における白紋羽病菌の生長程度の調査」
上記で作製したＰＨＢＨ混合土壌について、シャーレ底面における白紋羽病菌の生長程度のみを計測した以外は実験例１と同様にして、当該土壌における白紋羽病菌の生長抑制程度を調査するため、菌糸の長さを計測した。この時、混合土壌は静置１ヶ月および２ヶ月のものを使用した。

また、対照として、ＰＨＢＨ混合土壌の代わりに、土壌としてＰＨＢＨを混合していない果樹研究所内のナシ圃場土（ＰＨＢＨを混合していない土壌）を用いた以外は同様にして白羽病菌の生長程度について調査した。結果は、図１３に示す。

（３）「結果」
その結果、体積比５％、１％で混合した土壌の場合においては、実験例１で示したものと同様に体積比２０％で混合した土壌における生長抑制程度と比較して、同等の高い値が得られることが示された（図１３）。

このことから、ＰＨＢＨ混合土壌は、ＰＨＢＨおよび土壌の合計体積に対し、体積比１％以上の割合であることにより白羽病菌の生長抑制作用が強く示されることが示された。

（実験例１０）
「ＰＨＡ混合土壌によるならたけ病に対する防除効果」
ならたけ病の発病抑制が認められるか否かを検証した。ならたけ病は土壌病害であり、ならたけ病の病原菌であるアルミラリア・メレア（Armillaria mellea；担子菌類の糸状菌類と同じ分類群に属する）は果樹を始めとする木本植物の根を腐敗させる。

（１）「発病抑制試験」
ポット（径９ｃｍ）の底部に果樹研究所内のナシ圃場土１０に対しバーミキュライト１の体積比で混合したものを深さ約１ｃｍ分を入れた後に、ならたけ病菌の接種源を埋め込むように置いた。この時、接種源として、滅菌したナシ枝片（長さ３〜４ｃｍ、径０．８〜１ｃｍ）にならたけ病菌（Ｐ−Ａ株）を接種し、約２ヶ月培養したものを使用した。

さらに、実験例５と同様に、接種源の上にＰＨＢＨ混合土壌約３０ｍｌを入れ、平坦になるようにならした。ＰＨＢＨ混合土壌は、実験例１に記載の混合土壌の作製方法に従って、４ヶ月半静置したものを用いた。

対照として、ＰＨＢＨ混合土壌を用いる代わりに、ＰＨＢＨを混合していない果樹研究所内のナシ圃場土（ＰＨＢＨを混合していない土壌）を用いた以外は同様にして土壌を入れたポットを作製した。

根部を水道水で水洗し、全ての根の先端を切断した２年生リンゴ台木（マルバカイドウ）苗を、ナシ圃場土を用いたＰＨＢＨ混合土壌およびＰＨＢＨを混合していないナシ圃場土（ＰＨＢＨを混合していない土壌）とバーミキュライトを、各土壌１０に対しバーミキュライト１の体積比で混合して入れたポットに、それぞれ移植した後、２５℃の環境制御ガラス室で育成した。ポット苗は、ＰＨＢＨ混合土壌、およびＰＨＢＨを混合していない土壌を入れたポットについて５個ずつ用いた。

２ヶ月後に、苗を掘り起こして地下部（根部）の腐敗状況を観察し、発病した個体の割合（発病率）を計算した。結果を図１４に示した。発病したか否かは、根部が腐敗し、かつ、その樹皮下にならたけ病菌の菌糸が観察されるか否かにより判断した。発病した苗の例を図１５に示す。

（２）「結果」
その結果、ＰＨＢＨ混合土壌を用いた場合、ならたけ病の発病率は、対照と比較して１／２の低い値を示すことが確認された（図１４）。また、ＰＨＢＨ混合土壌を用いた場合、根は健全であったが、ＰＨＢＨを混合していない土壌を用いたものは、根が腐敗した（図１５）。

（実験例１１）
「ＰＨＡ混合土壌による紫紋羽病に対する防除効果」
紫紋羽病の発病抑制が認められるか否かを検証した。紫紋羽病は土壌病害であり、紫紋羽病の病原菌であるヘリコバシディウム・モンパ（Helicobasidium mompa；担子菌類の糸状菌類と同じ分類群に属する）は果樹を始めとする木本植物および草本植物の根を腐敗させる。

（１）「発病抑制試験」
プラスチックバット（長さ３５ｃｍ、幅２５ｃｍ）の底部に果樹研究所内のナシ圃場土１０に対しバーミキュライト１の体積比で混合したものを深さ約２ｃｍ分を入れた後に、２ヶ所に紫紋羽病菌の接種源を埋め込むように置いた。この時、接種源として、滅菌したリンゴ枝片（長さ３〜４ｃｍ、径０．８〜１ｃｍ）に紫紋羽病菌（Ｖ６５０株）を接種し、約１ヶ月培養したものを使用した。

さらに、それぞれの接種源をまんべんなく覆うようにＰＨＢＨ混合土壌約３０ｍｌを載せた。ＰＨＢＨ混合土壌は、実験例１に記載の混合土壌の作製方法に従って、５ヶ月静置したものを用いた。

対照として、ＰＨＢＨ混合土壌を用いる代わりに、ＰＨＢＨを混合していない果樹研究所内のナシ圃場土（ＰＨＢＨを混合していない土壌）を用いた以外は同様にして土壌を入れたバットを作製した。

接種源を置いた場所１ヶ所につき水道水で水洗したサツマイモ塊根１個をＰＨＢＨ混合土壌およびＰＨＢＨを混合していない果樹研究所内のナシ圃場土（ＰＨＢＨを混合していない土壌）の上に載せ、果樹研究所内のナシ圃場土１０に対しバーミキュライト１の体積比で混合した土をサツマイモ塊根全体を覆うまで入れた後、２５℃の環境制御ガラス室で育成した。サツマイモ塊根は、ＰＨＢＨ混合土壌、およびＰＨＢＨを混合していない土壌を入れたバットについて２個ずつ用い、各土壌について２バット分計４個ずつ用いた。

１ヶ月半後に、塊根部を掘り起こして発病状況を観察し、塊根全体における発病部位の割合を１００分率で示した。結果を図１６に示した。ＰＨＢＨを混合していない土壌の場合は、全体的に発病し、その発病程度は９０％であり、ＰＨＢＨ混合土壌の場合は、一部のみに発病し、その発病程度は２０％であった。発病したか否かは、根部表面に紫紋羽病菌が植物体に侵入する際に形成する感染座といわれる構造体が観察されるか否かにより判断した。発病した塊根の例を図１７に示す。

（２）「結果」
その結果、ＰＨＢＨ混合土壌を用いた場合、紫紋羽病菌の発病程度は、対照と比較して２／３の低い値を示すことが確認された（図１８）。また、ＰＨＢＨ混合土壌を用いた場合、塊根は健全であったが、ＰＨＢＨを混合していない土壌を用いたものは、塊根が腐敗した（図１７）。

（実験例１２）
「ＰＨＡ混合土壌による疫病に対する防除効果」
疫病の発病抑制が認められるか否かを検証した。疫病は土壌病害および葉や果実の病害であり、疫病の病原菌であるフィトフトラ・カクトルム（Phytophthora cactorum；原生生物の卵菌類と同じ分類群に属する）は果樹を始めとする木本植物や草本植物の幹・茎および葉・果実を腐敗させる。

（１）「発病抑制試験」
プラントボックス（ＡＧＣテクノグラス製）の底部にＰＨＢＨ混合土壌約２０ｍｌを入れた。ＰＨＢＨ混合土壌は、実験例１の「混合土壌の作製方法」の記載に従って作製し、４ヶ月半静置したものを用いた。

接種源として、滅菌した小麦粒に疫病菌（５８−ａ−１株）を接種して約２ヶ月培養したものを使用した。接種源の培養小麦粒（乾燥重１ｇ分）をプラントボックス内の土壌に混ぜ込んだ後、滅菌蒸留水を土壌表面に水が浮くまで注いだ。

対照として、ＰＨＢＨ混合土壌を用いる代わりに、ＰＨＢＨを混合していない果樹研究所内のナシ圃場土（ＰＨＢＨを混合していない土壌）を用いた以外は同様にして土壌を入れたプラントボックスを作製した。

水道水で水洗したナシ幼果（径３〜３．５ｃｍ）１個を接種源を混ぜ込んだ土壌に載せた。ナシ幼果は、ＰＨＢＨ混合土壌、およびＰＨＢＨを混合していない土壌を入れたプラントボックスについて６個ずつ用いた。

２週間後に、幼果における発病状況を観察し、発病した幼果の割合（発病率）を計算した。結果を図１９に示した。発病したか否かは、幼果表面に疫病の特徴である黒変した病斑が観察されるか否かにより判断した。発病した幼果の例を図２０に示す。

（２）「結果」
その結果、ＰＨＢＨ混合土壌を用いた場合、疫病菌の発病率は、対照と比較して１／２以下の低い値を示すことが確認された（図１９）。また、ＰＨＢＨ混合土壌を用いた場合、対照と比較して疫病菌の繁殖が少なかった（図２１）。

（実験例１３）
「ＰＨＡによるうどんこ病に対する防除効果」
うどんこ病の発病抑制が認められるか否かを検証した。うどんこ病は葉や果実の病害であり、うどんこ病の病原菌であるポドスフェラ・レウコトリカ（Podosphaera leucotricha；子嚢菌類の糸状菌と同じ分類群に属する）はリンゴの葉・果実の表面に蔓延して光合成を阻害して衰弱させる。

（１）「発病抑制試験」
滅菌蒸留水で洗浄したリンゴの葉を滅菌蒸留水で湿らせたキムワイプを入れたシール容器内に置き、２３℃で５日間静置した。

ガラスビーカー内で滅菌蒸留水１００ｍｌとＰＨＢＨ（粉状：平均粒径２００μｍ）１０ｍｌを混合したものに、上記リンゴ葉を浸漬して葉の表面にＰＨＢＨを付着させた後、滅菌蒸留水で湿らせたキムワイプを入れたシール容器内に置き、２３℃で２日間静置した。

接種源として、果樹研究所構内に植栽されているリンゴ樹から採集したうどんこ病に罹病した葉１０枚を使用した。採集した罹病葉を篩い（４ｍｍ目）に載せ、ＰＨＢＨを付着させた葉の上で振とうさせてうどんこ病菌の分生子を落下させた。その後、２３℃で培養した。

対照として、ＰＨＢＨを混合した滅菌蒸留水を用いる代わりに、ＰＨＢＨを混合していない滅菌蒸留水を用いた以外は同様にしてリンゴ葉を入れたシール容器を作製した。ＰＨＢＨを付着させたリンゴ葉、およびＰＨＢＨを付着させていないリンゴ葉について５葉ずつ用いた。

１０日後に、リンゴ葉上における発病状況を観察し、１葉あたりの平均病斑数を計算した。結果を図２２に示した。病斑か否かは、葉表面に白色粉状のうどんこ病菌の菌叢が認められるか否かにより判断し、連続した一塊を１病斑とした。葉上に形成された病斑の例を図２３（ａ）に示す。

（２）「結果」
その結果、ＰＨＢＨを付着させた葉を用いた場合、うどんこ病菌の発病率は、対照と比較して１／３以下の低い値を示すことが確認された（図２２）。

（実験例１４）
「ＰＨＡ混合土壌による根頭がんしゅ病に対する防除効果」
根頭がんしゅ病の発病抑制が認められるか否かを検証した。根頭がんしゅ病は土壌病害であり、根頭がんしゅ病の病原菌であるリゾビウム・ラディオバクター（Rhizobium radiobacter；細菌類のグラム陰性菌と同じ分類群に属する）は果樹を始めとする木本植物や草本植物の根や地際部に瘤（がんしゅ）を形成して生育阻害や枯死を起こさせる。

（１）「発病抑制試験」
ポット（径３０ｃｍ）に果樹研究所ブドウ・カキ研究拠点のブドウ圃場から採取した土１１ＬにＰＨＢＨ１Ｌを混合したもの（ＰＨＢＨ混合土壌）を充填し、ガラス室内に約１ヶ月半放置した。

接種源として、培地で培養した根頭がんしゅ病菌（１株）を滅菌蒸留水で５×１０^９ｃｆｕ／ｍｌに濃度調整した菌液９５０ｍｌを土壌表面に潅注し、ガラス室内に１週間放置した。

リンゴ台木（マルバカイドウ）の枝（長さ約３０ｃｍ）の３ヶ所にナイフで傷をつけたもの１０本をポットのＰＨＢＨ混合土壌に挿し木（約１０ｃｍを土壌に挿入）した後、野外に約半年放置した。

対照として、ＰＨＢＨ混合土壌を用いる代わりに、ＰＨＢＨを混合していない果樹研究所ブドウ・カキ拠点内の圃場土（ＰＨＢＨを混合していない土壌）を用いた以外は同様にして土壌を入れたポットを準備し、接種源の培養菌液を潅注し、リンゴ台木枝をポットのＰＨＢＨ混合土壌に挿し木した後、野外に約半年放置した。

挿し枝を掘り上げて、挿し枝１本あたりに形成された瘤（がんしゅ）の最大径と数（傷口に形成されるので最大数は３）を計測した。結果を図２４に示した。

（２）「結果」
その結果、ＰＨＢＨ混合土壌を用いた場合、根頭がんしゅ病によって形成された瘤の数は、対照と比較して約１／２の低い値を示すことが確認された（図２４）。また、ＰＨＢＨ混合土壌を用いた場合、根頭がんしゅ病による瘤の大きさ（平均最大径１．３cｍ）は対照による瘤の大きさ（平均最大径２．８cm）と比較して小さかった（図２５）。

Claims (10)

1. 土壌病害防除の方法であって、
   下記式（１）で表される構造を有する少なくとも１種のポリヒドロキシアルカン酸を土壌に施用し、
   前記土壌病害が、白紋羽病、ならたけ病、紫紋羽病、疫病および根頭がんしゅ病から選択されるものであり、
   前記疫病の原因となる菌がフィトフトラ・カクトルム（Phytophthora cactorum）であることを特徴とする、土壌病害防除の方法。
   ［−ＣＨＲ−ＣＨ_２−ＣＯ−Ｏ−］ （１）
   （式中、ＲはＣ_ｎＨ_２ｎ＋１で表されるアルキル基で、ｎは１以上１５以下の整数である。）
2. 前記ポリヒドロキシアルカン酸を、前記ポリヒドロキシアルカン酸および前記土壌の合計体積に対し体積比１％以上の割合で施用する、請求項１に記載の土壌病害防除の方法。
3. 前記施用が、前記式（１）で表される構造を有する少なくとも１種のポリヒドロキシアルカン酸と土壌との混合である、請求項１または２に記載の土壌病害防除の方法。
4. 前記土壌病害が、白紋羽病菌に由来する病害である、請求項１から３の何れか１項に記載の土壌病害防除の方法。
5. 病害防除の方法であって、
   下記式（１）で表される構造を有する少なくとも１種のポリヒドロキシアルカン酸を葉、枝、茎・幹、果実のうち何れか１か所或いは２か所以上に付着し、
   前記病害が、うどんこ病であることを特徴とする、病害防除の方法。
   ［−ＣＨＲ−ＣＨ_２−ＣＯ−Ｏ−］ （１）
   （式中、ＲはＣ_ｎＨ_２ｎ＋１で表されるアルキル基で、ｎは１以上１５以下の整数である。）
6. 前記ポリヒドロキシアルカン酸がポリ（３−ヒドロキシ酪酸−コ−３−ヒドロキシヘキサン酸）である、請求項１から４の何れか１項に記載の土壌病害防除の方法。
7. 前記ポリヒドロキシアルカン酸がポリ（３−ヒドロキシ酪酸−コ−３−ヒドロキシヘキサン酸）である、請求項５に記載の病害防除の方法。
8. 植物栽培用土壌であって、
   下記式（１）で表される構造を有する少なくとも１種のポリヒドロキシアルカン酸と土壌とを混合することにより得られ、
   前記ポリヒドロキシアルカン酸がポリ（３−ヒドロキシ酪酸−コ−３−ヒドロキシヘキサン酸）であり、
   前記ポリヒドロキシアルカン酸が土壌病害防除剤であり、
   前記土壌病害が、白紋羽病、ならたけ病、紫紋羽病、疫病および根頭がんしゅ病から選択されるものであり、
   前記疫病の原因となる菌がフィトフトラ・カクトルム（Phytophthora cactorum）である、植物栽培用土壌。
   ［−ＣＨＲ−ＣＨ_２−ＣＯ−Ｏ−］ （１）
   （式中、ＲはＣ_ｎＨ_２ｎ＋１で表されるアルキル基で、ｎは１以上１５以下の整数である。）
9. 前記ポリヒドロキシアルカン酸を、前記ポリヒドロキシアルカン酸および前記土壌の合計体積に対し体積比１％以上の割合で混合することにより得られた、請求項８に記載の植物栽培用土壌。
10. 土壌病害防除剤であって、
    下記式（１）で表される構造を有する少なくとも１種のポリヒドロキシアルカン酸からなり、
    前記土壌病害が、白紋羽病、ならたけ病、紫紋羽病、疫病および根頭がんしゅ病から選択されるものであり、
    前記疫病の原因となる菌がフィトフトラ・カクトルム（Phytophthora cactorum）である、土壌病害防除剤。
    ［−ＣＨＲ−ＣＨ_２−ＣＯ−Ｏ−］ （１）
    （式中、ＲはＣ_ｎＨ_２ｎ＋１で表されるアルキル基で、ｎは１以上１５以下の整数である。）