JP6674604B2 - セルピン融合ポリペプチド及びその使用方法 - Google Patents

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関連出願
本出願は、２０１１年６月２８日に出願された米国特許仮出願第６１／５０２０５５号；２０１１年１２月１４日に出願された米国特許仮出願第６１／５７０３９４号；及び２０１１年１２月１９日に出願された米国特許仮出願第６１／５７７２０４号；並びに２０１２年４月２５日に出願された米国特許仮出願第６１／６３８１６８号の利益を主張する。これらの出願それぞれの内容全体を参照により本明細書中に援用する。
本発明の分野

本願発明は、分子、特にポリペプチド、より特にセルピンポリペプチド又はセルピンポリペプチドに由来するアミノ酸配列と第二のポリペプチドを含んでいる融合タンパク質に関する。さらに、本発明は、セルピンポリペプチド又はセルピンポリペプチドに由来するアミノ酸配列、第二のポリペプチド、及び第三のポリペプチドを含んでいる融合タンパク質に関する。特に、本願発明は、少なくとも１種類のセルピンポリペプチド及び第二のポリペプチドを含んでいる融合タンパク質、又は少なくとも１種類のセルピンポリペプチド、第二のポリペプチド、及び第三のポリペプチドを含んでいる融合タンパク質に関し、ここで、本発明の融合タンパク質の第二及び第三のポリペプチドが、以下の：Ｆｃポリペプチド又はＦｃポリペプチドに由来するアミノ酸配列；サイトカイン標的ポリペプチド又はサイトカイン標的ポリペプチドに由来する配列；ＷＡＰドメイン含有ポリペプチド又はＷＡＰ含有ポリペプチドに由来する配列；或いはアルブミンポリペプチド又は血清アルブミンポリペプチドに由来するアミノ酸配列の少なくとも１種類である。本願発明はまた、さまざまな治療及び診断指標にそのような分子の使用方法、及びそのような分子の製造方法に関する。

異常セリンプロテアーゼ活性又はプロテアーゼ対プロテアーゼ阻害物質の不均衡が、プロテアーゼ媒介性の組織破壊及び炎症反応に通じる。従って、異常セリンプロテアーゼ活性及び／又はプロテアーゼ対プロテアーゼ阻害物質の不均衡を標的とする治療薬と治療法の必要性が存在している。さらに、促進された治療効果は、異常サイトカインシグナル及びセリンプロテアーゼ活性の減少によって得ることができる。加えて、セルピンタンパク質が抗感染症薬活性を実証した一方で、標的炎症性サイトカインが感染症の危険を増強することが示された。本願発明の融合タンパク質には、炎症性サイトカイン活性を抑制し、且つ、感染症の危険を制限する可能性がある。

本明細書中に記載した融合タンパク質は、少なくともセルピンポリペプチド又はセルピンポリペプチドに由来するアミノ酸配列（ポリペプチド１）及び第二のポリペプチド（ポリペプチド２）を含んでいる。さらに、本明細書中に記載した融合タンパク質は、セルピンポリペプチド又はセルピンポリペプチドに由来するアミノ酸配列（ポリペプチド１）、第二のポリペプチド（ポリペプチド２）、及び第三のポリペプチド（ポリペプチド３）を含んでいる。本明細書中で互換的に使用される場合、「融合タンパク質」と「融合ポリペプチド」という用語は、少なくとも第二のポリペプチド又は少なくとも第二のポリペプチドに由来するアミノ酸配列に作動できるように連結されたセルピンポリペプチド又はセルピンポリペプチドに由来するアミノ酸配列を指す。融合タンパク質の個別化された要素は、例えば直接的な結合、中間体又はスペーサーペプチドの使用、リンカー領域の使用、ヒンジ領域の使用又はリンカーとヒンジ領域の両方の使用を含めたさまざまな方法のいずれでも連結できる。いくつかの実施形態において、リンカー領域は、ヒンジ領域の配列内に含まれていてもよいが、その代わりに、ヒンジ領域は、リンカー領域の配列内に含まれていてもよい。好ましくは、リンカー領域はペプチド配列である。例えば、リンカーペプチドは、０〜４０アミノ酸の範囲、例えば、０〜３５アミノ酸、０〜３０アミノ酸、０〜２５アミノ酸、又は０〜２０アミノ酸の範囲に含まれる。好ましくは、ヒンジ領域はペプチド配列である。例えば、ヒンジペプチドは、０〜７５アミノ酸の範囲、例えば０〜７０アミノ酸、０〜６５アミノ酸又は０〜６２アミノ酸の範囲に含まれる。融合タンパク質がリンカー領域及びヒンジ領域の両方を含む実施形態において、好ましくはリンカー領域及びヒンジ領域のそれぞれがペプチド配列である。これらの実施形態において、ヒンジペプチドとリンカーペプチドは一緒に、０〜９０アミノ酸の範囲、例えば、０〜８５アミノ酸又は０〜８２アミノ酸の範囲に含まれる。

いくつかの実施形態において、セルピンポリペプチド及び第二のポリペプチドは、中間結合タンパク質（intermediate binding protein）を通して連結される。いくつかの実施形態において、融合タンパク質のセルピンベースの部分と第二のポリペプチド部分は、非共有結合により連結されてもよい。

いくつかの実施形態において、本発明による融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端方向へ又はＣ末端からＮ末端方向へ、以下の式のうちの１つを有している：
ポリペプチド１_(a)−ヒンジ_m−ポリペプチド２_(b)
ポリペプチド１_(a)−リンカー_n−ポリペプチド２_(b)
ポリペプチド１_(a)−リンカー_n−ヒンジ_m−ポリペプチド２_(b)
ポリペプチド１_(a)−ヒンジ_m−リンカー_n−ポリペプチド２_(b)
ポリペプチド１_(a)−ポリペプチド２_(b)−ポリペプチド３_(c)
ポリペプチド１_(a)−ヒンジ_m−ポリペプチド２_(b)−ヒンジ_m−ポリペプチド３_(c)
ポリペプチド１_(a)−リンカー_n−ポリペプチド２_(b)−リンカー_n−ポリペプチド３_(c)
ポリペプチド１_(a)−ヒンジ_m−リンカー_n−ポリペプチド２_(b)−ヒンジ_m−リンカー_n−ポリペプチド３_(c)
ポリペプチド１_(a)−リンカー_n−ヒンジ_m−ポリペプチド２_(b)−リンカー_n−ヒンジ_m−ポリペプチド３_(c)
式中、ｎは０〜２０の整数であり、ｍは１〜６２までの整数であり、そして、ａ、ｂ、及びｃは少なくとも１の整数である。これらの実施形態には、上記の式、及びその変形又は組み合わせのいずれもが含まれる。例えば、前記式のポリペプチドの順序には、ポリペプチド３_(c)−ポリペプチド１_(a)−ポリペプチド２_(b)、ポリペプチド２_(b)−ポリペプチド３_(c)−ポリペプチド１_(a)、又はその変形や組み合わせもまた含まれる。

いくつかの実施形態において、ポリペプチド１配列としては、セルピンポリペプチドが挙げられる。セルピンは、プロテアーゼを阻害することができる１連のタンパク質として最初に同定された、類似構造を有するタンパク質の一群である。本明細書中に提供された融合タンパク質における使用に好適なセルピンタンパク質としては、制限されることのない例によると、α１アンチトリプシン（ＡＡＴ）、アンチトリプシン関連タンパク質（ＳＥＲＰＩＮＡ２）、α１抗キモトリプシン（ＳＥＲＰＩＮＡ３）、カリスタチン（ＳＥＲＰＩＮＡ４）、単球好中球エラスターゼ阻害剤（ＳＥＲＰＩＮＢ１）、ＰＩ−６（ＳＥＲＰＩＮＢ６）、アンチトロンビン（ＳＥＲＰＩＮＣ１）、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤１（ＳＥＲＰＩＮＥ１）、α２抗プラスミン（ＳＥＲＰＩＮＦ２）、補体１阻害物質（ＳＥＲＰＩＮＧ１）、及びニューロセルピン（ＳＥＲＰＩＮＩ１）が挙げられる。

いくつかの実施形態において、ポリペプチド１配列は、α１アンチトリプシン（ＡＡＴ）ポリペプチド配列又はＡＡＴに由来するアミノ酸配列を含んでいる。いくつかの実施形態において、ポリペプチド１配列は、ＡＡＴタンパク質の一部を含んでいる。いくつかの実施形態において、ポリペプチド１配列は、少なくともＡＡＴタンパク質の反応部位ループ部分を含んでいる。いくつかの実施形態において、ＡＡＴタンパク質の反応部位ループ部分は、少なくとも以下のアミノ酸配列を含んでいる：

好ましい実施形態において、ＡＡＴポリペプチド配列又はＡＡＴに由来するアミノ酸配列は、ヒトＡＡＴポリペプチド配列であるか又はヒトＡＡＴポリペプチド配列に由来する。

いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、以下のアミノ酸配列を有する完全長のヒトＡＡＴポリペプチド配列を含んでいる：

いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるヒトＡＡＴポリペプチド配列を含んでいる。

いくつかの実施形態において、ＡＡＴポリペプチド配列又はＡＡＴポリペプチドに由来するアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＡＢ５９４９５．１、ＣＡＪ１５１６１．１、Ｐ０１００９．３、ＡＡＢ５９３７５．１、ＡＡＡ５１５４６．１、ＣＡＡ２５８３８．１、ＮＰ＿００１００２２３５．１、ＣＡＡ３４９８２．１、ＮＰ＿００１００２２３６．１、ＮＰ＿０００２８６．３、ＮＰ＿００１１２１１７９．１、ＮＰ＿００１１２１１７８．１、ＮＰ＿００１１２１１７７．１、ＮＰ＿００１１２１１７６．１６、ＮＰ＿００１１２１１７５．１、ＮＰ＿００１１２１１７４．１、ＮＰ＿００１１２１１７２．１、及び／又はＡＡＡ５１５４７．１に示されているヒトＡＡＴポリペプチド配列の１若しくは複数に由来する。

いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、１若しくは複数の突然変異を含んでいる。例えば、融合タンパク質は、融合タンパク質のセルピン部分に少なくとも１つのメチオニン（Ｍｅｔ）残基における突然変異を含んでいる。これらのＭｅｔ突然変異において、Ｍｅｔ残基は任意のアミノ酸によって置換される。例えば、Ｍｅｔ残基は、例えば、ロイシン（Ｌｅｕ、Ｌ）などの疎水性側鎖を有するアミノ酸によって置換される。いかなる理論にも縛られることを望むものではないが、（単数若しくは複数の）Ｍｅｔ突然変異が、本発明の融合タンパク質の酸化とその後の阻害活性の不活性化を予防する。いくつかの実施形態において、Ｍｅｔ残基は、例えば、グルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ）などの荷電残基で置換できる。いくつかの実施形態において、Ｍｅｔ突然変異は、ＡＡＴポリペプチドの３５８位である。例えば、Ｍｅｔ突然変異は、Ｍｅｔ３５８Ｌｅｕ（Ｍ３５８Ｌ）である。いくつかの実施形態において、Ｍｅｔ突然変異は、ＡＡＴポリペプチドの３５１位である。例えば、Ｍｅｔ突然変異は、Ｍｅｔ３５１Ｇｌｕ（Ｍ３５１Ｅ）である。いくつかの実施形態において、例えば、Ｍｅｔ突然変異は、ＡＡＴポリペプチドの３５１位及び３５８位におけるものであって、例えば、Ｍｅｔ突然変異は、Ｍｅｔ３５１Ｇｌｕ（Ｍ３５１Ｅ）及びＭｅｔ３５８Ｌｅｕ（Ｍ３５８Ｌ）である。例えば、融合ＡＡＴポリペプチドの反応部位ループのこの変異型は、以下の配列を有する：
いくつかの実施形態において、Ｍｅｔ突然変異は、ＡＡＴポリペプチドの３５１位及び３５８位におけるものであって、例えば、Ｍｅｔ突然変異は、Ｍｅｔ３５１Ｌｅｕ（Ｍ３５１Ｌ）及びＭｅｔ３５８Ｌｅｕ（Ｍ３５８Ｌ）である。例えば、融合ＡＡＴポリペプチドの反応部位ループのこの変異型は、以下の配列を有する：

いくつかの実施形態において、セルピン融合タンパク質の第二のポリペプチド（ポリペプチド２）は、Ｆｃポリペプチドであるか、又はＦｃポリペプチドに由来する。これらの実施形態は、本明細書中ではまとめて「セルピン−Ｆｃ融合タンパク質」と呼ばれる。本明細書中に記載したセルピン−Ｆｃ融合タンパク質は、少なくともセルピンポリペプチド又はセルピンに由来するアミノ酸配列、及びＦｃポリペプチド又はＦｃポリペプチドに由来するアミノ酸配列を含んでいる。いくつかの実施形態において、セルピン−Ｆｃ融合タンパク質は、１つのセルピンポリペプチドを含んでいる。他の実施形態において、セルピン−Ｆｃ融合タンパク質は、２つ以上セルピンポリペプチドを含んでおり、そして、これらの実施形態は、本明細書中ではまとめて「セルピン_(a’)−Ｆｃ融合タンパク質」と呼ばれ、その中で、（ａ’）は少なくとも２の整数である。いくつかの実施形態において、セルピン_(a’)−Ｆｃ融合タンパク質内のそれぞれのセルピンポリペプチドは、同じアミノ酸配列を含んでいる。他の実施形態において、セルピン_(a’)−Ｆｃ融合タンパク質内のそれぞれのセルピンポリペプチドは、異なったアミノ酸配列を有するセルピンポリペプチドを含んでいる。セルピン_(a’)−Ｆｃ融合タンパク質のセルピンポリペプチドは、その融合タンパク質内のあらゆる位置に配置できる。

いくつかの実施形態において、セルピン−Ｆｃ融合タンパク質のセルピンポリペプチドは、少なくともＡＡＴタンパク質の反応部位ループ部分のアミノ酸配列を含んでいる。いくつかの実施形態において、ＡＡＴタンパク質の反応部位ループ部分は、少なくとも配列番号１のアミノ酸配列を含んでいる。いくつかの実施形態において、セルピン−Ｆｃ融合タンパク質のセルピンポリペプチドは、少なくともＡＡＴタンパク質の反応部位ループ部分の変異型のアミノ酸配列を含んでいる。いくつかの実施形態において、ＡＡＴタンパク質の反応部位ループ部分の変異型は、少なくとも配列番号３２又は配列番号３３のアミノ酸配列を含んでいる。いくつかの実施形態において、セルピン−Ｆｃ融合タンパク質のセルピンポリペプチドは、少なくとも、配列番号２のアミノ酸配列を有する完全長のヒトＡＡＴポリペプチド配列を含んでいる。いくつかの実施形態において、セルピン−Ｆｃ融合タンパク質のセルピンポリペプチドは、配列番号２又は３２若しくは３３のアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるヒトＡＡＴポリペプチド配列を含んでいる。

いくつかの実施形態において、セルピン−Ｆｃ融合タンパク質のセルピンポリペプチドは、ＡＡＴポリペプチド配列を含んでおり、そしてそれ又はＡＡＴポリペプチドに由来するアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＡＢ５９４９５．１、ＣＡＪ１５１６１．１、Ｐ０１００９．３、ＡＡＢ５９３７５．１、ＡＡＡ５１５４６．１、ＣＡＡ２５８３８．１、ＮＰ＿００１００２２３５．１、ＣＡＡ３４９８２．１、ＮＰ＿００１００２２３６．１、ＮＰ＿０００２８６．３、ＮＰ＿００１１２１１７９．１、ＮＰ＿００１１２１１７８．１、ＮＰ＿００１１２１１７７．１、ＮＰ＿００１１２１１７６．１６、ＮＰ＿００１１２１１７５．１、ＮＰ＿００１１２１１７４．１、ＮＰ＿００１１２１１７２．１、及び／又はＡＡＡ５１５４７．１に示されているヒトＡＡＴポリペプチド配列の１若しくは複数に由来する。

いくつかの実施形態において、融合タンパク質のＦｃポリペプチドは、ヒトＦｃポリペプチド、例えばヒトＩｇＧ Ｆｃポリペプチド配列又はヒトＩｇＧ Ｆｃポリペプチド配列に由来するアミノ酸配列である。例えば、いくつかの実施形態において、Ｆｃポリペプチドは、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃポリペプチド又はヒトＩｇＧ１ Ｆｃポリペプチド配列に由来するアミノ酸配列である。いくつかの実施形態において、Ｆｃポリペプチドは、ヒトＩｇＧ２ Ｆｃポリペプチド又はヒトＩｇＧ２ Ｆｃポリペプチド配列に由来するアミノ酸配列である。いくつかの実施形態において、Ｆｃポリペプチドは、ヒトＩｇＧ３ Ｆｃポリペプチド又はヒトＩｇＧ３ Ｆｃポリペプチド配列に由来するアミノ酸配列である。いくつかの実施形態において、Ｆｃポリペプチドは、ヒトＩｇＧ４ Ｆｃポリペプチド又はヒトＩｇＧ４ Ｆｃポリペプチド配列に由来するアミノ酸配列である。いくつかの実施形態において、Ｆｃポリペプチドは、ヒトＩｇＭ Ｆｃポリペプチド又はヒトＩｇＭ Ｆｃポリペプチド配列に由来するアミノ酸配列である。

本発明の融合タンパク質がＦｃポリペプチドを含んでいるいくつかの実施形態において、融合タンパク質のＦｃポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を有するヒトＩｇＧ１ Ｆｃポリペプチド配列を含んでいる：

本発明の融合タンパク質がＦｃポリペプチドを含んでいるいくつかの実施形態において、融合タンパク質のＦｃポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるヒトＩｇＧ１ Ｆｃポリペプチド配列を含んでいる。

本発明の融合タンパク質がＦｃポリペプチドを含んでいるいくつかの実施形態において、Ｆｃポリペプチドは、ＦｃＲｎ結合を強化するために突然変異又は修飾されている。これらの実施形態において、突然変異又は修飾されたＦｃポリペプチドは、以下の突然変異を含んでいる：Ｋａｂａｔ付番システムを使用すると、Ｍｅｔ２５２Ｔｙｒ、Ｓｅｒ２５４Ｔｈｒ、Ｔｈｒ２５６Ｇｌｕ（Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５６Ｔ、Ｔ２５６Ｅ）又はＭｅｔ４２８Ｌｅｕ、及びＡｓｎ４３４Ｓｅｒ（Ｍ４２８Ｌ、Ｎ４３４Ｓ）。いくつかの実施形態において、Ｆｃポリペプチド部分は、Ｆｃ媒介性二量体化を妨げるために、突然変異又は別の方法で修飾される。これらの実施形態において、融合タンパク質は、事実上、単量体である。

本発明の融合タンパク質がＦｃポリペプチドを含んでいるいくつかの実施形態において、融合タンパク質のＦｃポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を有するヒトＩｇＧ２ Ｆｃポリペプチド配列を含んでいる：

本発明の融合タンパク質がＦｃポリペプチドを含んでいるいくつかの実施形態において、
融合タンパク質のＦｃポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるヒトＩｇＧ２ Ｆｃポリペプチド配列を含んでいる。

本発明の融合タンパク質がＦｃポリペプチドを含んでいるいくつかの実施形態において、融合タンパク質のＦｃポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を有するヒトＩｇＧ３ Ｆｃポリペプチド配列を含んでいる：

本発明の融合タンパク質がＦｃポリペプチドを含んでいるいくつかの実施形態において、融合タンパク質のＦｃポリペプチドは、配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるヒトＩｇＧ３ Ｆｃポリペプチド配列を含んでいる。

本発明の融合タンパク質がＦｃポリペプチドを含んでいるいくつかの実施形態において、融合タンパク質のＦｃポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を有するヒトＩｇＧ４ Ｆｃポリペプチド配列を含んでいる：

本発明の融合タンパク質がＦｃポリペプチドを含んでいるいくつかの実施形態において、融合タンパク質のＦｃポリペプチドは、配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるヒトＩｇＧ４ Ｆｃポリペプチド配列を含んでいる。

本発明の融合タンパク質がＦｃポリペプチドを含んでいるいくつかの実施形態において、融合タンパク質のＦｃポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を有するヒトＩｇＭ Ｆｃポリペプチド配列を含んでいる：

本発明の融合タンパク質がＦｃポリペプチドを含んでいるいくつかの実施形態において、融合タンパク質のＦｃポリペプチドは、配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるヒトＩｇＭ Ｆｃポリペプチド配列を含んでいる。

本明細書中に提供された融合タンパク質のいくつかの実施形態において、セルピン融合タンパク質の第二のポリペプチド（ポリペプチド２）は、サイトカイン標的ポリペプチドであるか、又はサイトカイン標的ポリペプチドに由来する。これらの実施形態は、本明細書中でまとめて「セルピン−サイトカイン標的ポリペプチド融合タンパク質」と呼ばれる。本明細書中に記載したセルピン−サイトカイン標的ポリペプチド融合タンパク質は、少なくともセルピンポリペプチド又はセルピンポリペプチドに由来するアミノ酸配列、及びサイトカイン標的ポリペプチド、又はその誘導体を含んでいる。いくつかの実施形態において、セルピン−サイトカイン標的ポリペプチド融合タンパク質は、１つのセルピンポリペプチドを含んでいる。他の実施形態において、セルピン−サイトカイン標的ポリペプチド融合タンパク質は、２つ以上セルピンポリペプチドを含んでおり、そして、これらの実施形態は、本明細書中でまとめて「セルピン_(a’)−サイトカイン標的ポリペプチド融合タンパク質」と呼ばれ、その中で、（ａ’）は少なくとも２の整数である。いくつかの実施形態において、セルピン_(a’)−サイトカイン標的ポリペプチド融合タンパク質内のそれぞれのセルピンポリペプチドは、同じアミノ酸配列を含んでいる。他の実施形態において、セルピン_(a’)−サイトカイン標的ポリペプチド融合タンパク質内のそれぞれのセルピンポリペプチドは、異なったアミノ酸配列を有するセルピンポリペプチドを含んでいる。

いくつかの実施形態において、セルピン−サイトカイン標的ポリペプチド融合タンパク質のサイトカイン標的ポリペプチドは、サイトカイン受容体であるか、又はサイトカイン受容体に由来する。好ましい実施形態において、サイトカイン標的ポリペプチド又はサイトカイン受容体に由来するアミノ酸配列は、ヒトサイトカイン受容体配列であるか、又はヒトサイトカイン受容体配列に由来する。他の実施形態において、サイトカイン標的ポリペプチドは、抗体又は抗体断片、例えば、抗サイトカイン抗体又は抗サイトカイン抗体断片である。好ましい実施形態において、サイトカイン標的ポリペプチド又は抗体若しくは抗体断片に由来するアミノ酸配列は、キメラ抗体配列、ヒト化抗体配列、又は完全なヒト抗体配列に由来する。抗体断片という用語には、一本鎖、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）₂断片、ｓｃＦｖ、ｓｃＡｂ、ｄＡｂ、単一ドメイン重鎖抗体、及び単一ドメイン軽鎖抗体が含まれる。

他の実施形態において、サイトカイン標的ポリペプチドは、サイトカイン受容体に結合し、その受容体へのサイトカインの結合を妨げる。他の実施形態において、サイトカイン標的ポリペプチドは、抗体又は抗体断片、例えば、抗サイトカイン受容体抗体又は抗サイトカイン受容体抗体断片である。

いくつかの実施形態において、セルピン−サイトカイン標的ポリペプチド融合タンパク質のセルピンポリペプチドは、少なくともＡＡＴタンパク質の反応部位ループ部分のアミノ酸配列を含んでいる。いくつかの実施形態において、ＡＡＴタンパク質の反応部位ループ部分は、少なくとも配列番号１のアミノ酸配列を含んでいる。いくつかの実施形態において、セルピン−サイトカイン標的融合タンパク質のセルピンポリペプチドは、少なくとも、ＡＡＴタンパク質の反応部位ループ部分の変異型のアミノ酸配列を含んでいる。いくつかの実施形態において、ＡＡＴタンパク質の反応部位ループ部分の変異型は、少なくとも配列番号３２又は配列番号３３のアミノ酸配列を含んでいる。いくつかの実施形態において、セルピン−サイトカイン標的融合タンパク質のセルピンポリペプチドは、少なくとも、配列番号２のアミノ酸配列を有する完全長のヒトＡＡＴポリペプチド配列を含んでいるか、又は少なくとも、配列番号２のアミノ酸配列を有する完全長のヒトＡＡＴポリペプチド配列に由来する。いくつかの実施形態において、セルピン−サイトカイン標的融合タンパク質のセルピンポリペプチドは、配列番号２又は３２若しくは３３のアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるヒトＡＡＴポリペプチド配列を含んでいる。

いくつかの実施形態において、セルピン−サイトカイン標的融合タンパク質のセルピンポリペプチドは、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＡＢ５９４９５．１、ＣＡＪ１５１６１．１、Ｐ０１００９．３、ＡＡＢ５９３７５．１、ＡＡＡ５１５４６．１、ＣＡＡ２５８３８．１、ＮＰ＿００１００２２３５．１、ＣＡＡ３４９８２．１、ＮＰ＿００１００２２３６．１、ＮＰ＿０００２８６．３、ＮＰ＿００１１２１１７９．１、ＮＰ＿００１１２１１７８．１、ΝΡ＿００１１２１１７７．１、ＮＰ＿００１１２１１７６．１６、ＮＰ＿００１１２１１７５．１、ＮＰ＿００１１２１１７４．１、ＮＰ＿００１１２１１７２．１、及び／又はＡＡＡ５１５４７．１に示されたヒトＡＡＴポリペプチド配列であるか又はそれらのうちの１若しくは複数に由来する、ＡＡＴポリペプチド配列又はＡＡＴポリペプチドに由来するアミノ酸配列を含んでいる。

セルピン−サイトカイン標的ポリペプチド融合タンパク質には、セルピン−Ｆｃ融合タンパク質の一部を組み込むことができる。例えば、抗体はＦｃポリペプチドを含んでいる。そのため、サイトカイン標的ポリペプチドがサイトカイン標的抗体であるいくつかの実施形態において、セルピン−サイトカイン標的ポリペプチド融合タンパク質には、セルピン−Ｆｃ融合タンパク質の一部を組み込む。さらに、治療的に有用なものである受容体融合タンパク質のほとんどが、Ｆｃ融合タンパク質である。これにより、セルピン−サイトカイン標的ポリペプチド融合タンパク質がセルピン−サイトカイン受容体融合タンパク質であるいくつかの実施形態において、セルピン−サイトカイン標的ポリペプチド融合タンパク質には、セルピン部分及びサイトカイン受容体部分に加えて、Ｆｃポリペプチドを組み込むこともできる。

セルピン−サイトカイン標的ポリペプチド融合タンパク質がＦｃポリペプチド配列を含んでいるいくつかの実施形態において、該Ｆｃポリペプチド配列は、配列番号３、４、５、６、又は７のいずれか１つのアミノ酸配列を含んでいるか、又はそれに由来する。セルピン−サイトカイン標的融合タンパク質がＦｃポリペプチド配列を含んでいるいくつかの実施形態において、該Ｆｃポリペプチド配列は、配列番号３、４、５、６、又は７のアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有する。いくつかの実施形態において、セルピンポリペプチドとサイトカイン標的ポリペプチドは、リンカー領域、例えば、グリシン−セリンリンカー又はグリシン−セリンベースのリンカーを介して作動できるように連結されている。いくつかの実施形態において、セルピンポリペプチドとサイトカイン標的ポリペプチドは、ヒンジ領域を介して作動できるように連結されている。いくつかの実施形態において、セルピンポリペプチドとサイトカイン標的ポリペプチドは、リンカー領域及びヒンジ領域を介して作動できるように連結されている。他の実施形態において、セルピンポリペプチドとサイトカイン標的ポリペプチドは、直接結合されている。

本明細書中に提供された融合タンパク質のいくつかの実施形態において、セルピン融合タンパク質の第二のポリペプチド（ポリペプチド２）は、乳清酸性タンパク質（ＷＡＰ）ドメイン含有ポリペプチド、又はＷＡＰドメイン含有ポリペプチドに由来するアミノ酸配列である。これらの実施形態は、本明細書中でまとめて「セルピン−ＷＡＰドメイン融合タンパク質」と呼ばれる。セルピン−ＷＡＰドメイン融合タンパク質は、少なくともセルピンポリペプチド又は少なくともセルピンに由来するアミノ酸配列、ＷＡＰドメイン含有ポリペプチド又はＷＡＰドメイン含有ポリペプチドに由来するアミノ酸配列を含んでいる。いくつかの実施形態において、セルピン−ＷＡＰドメイン融合タンパク質は、１つのセルピンポリペプチドを含んでいる。他の実施形態において、セルピン−ＷＡＰ標的ポリペプチド融合タンパク質は、２つ以上のセルピンポリペプチドを含んでいる。これらの実施形態は、本明細書中でまとめて「セルピン_(a’)−ＷＡＰドメイン融合タンパク質」と呼ばれ、その中で、（ａ’）は少なくとも２の整数である。いくつかの実施形態において、セルピン_(a’)−ＷＡＰドメイン融合タンパク質のセルピンポリペプチドは、同じアミノ酸配列を含んでいる。他の実施形態において、セルピン_(a’)−サイトカイン標的ポリペプチド融合タンパク質のセルピンポリペプチドは、異なったアミノ酸配列を有するセルピンポリペプチドを含んでいる。

これらのセルピン−ＷＡＰドメイン融合タンパク質は、ＷＡＰドメイン含有ポリペプチド又はＷＡＰドメイン含有ポリペプチドであるポリペプチド配列若しくはＷＡＰドメイン含有ポリペプチドに由来するポリペプチド配列を含んでいる。ＷＡＰドメインは、特徴的な４−ジスルフィドコア配置（４−ジスルフィドコアモチーフとも呼ばれる）内に見られる８つのシステインを含めた５０アミノ酸から成る進化的に保存された配列モチーフである。ＷＡＰドメイン配列モチーフは、多くのタンパク質におけるセリンプロテアーゼ阻害活性によって特徴づけられる機能的モチーフである。

本明細書中で提供された融合タンパク質での使用に好適なＷＡＰドメイン含有ポリペプチドとしては、制限されることのない例によると、分泌型白血球プロテアーゼ阻害物質（ＳＬＰＩ）、Ｅｌａｆｉｎ、及びＥｐｐｉｎが挙げられる。

いくつかの実施形態において、融合タンパク質のＷＡＰドメイン含有ポリペプチド配列は、分泌型白血球プロテアーゼ阻害物質（ＳＬＰＩ）ポリペプチド配列又はＳＬＰＩに由来するアミノ酸配列を含んでいる。これらの実施形態は、本明細書中では「セルピン−ＳＬＰＩ由来融合タンパク質」と呼ばれる。いくつかの実施形態において、ＳＬＰＩポリペプチド配列は、例えば、ＷＡＰ２ドメイン又はその小部分などのＳＬＰＩタンパク質の一部を含む。好ましい実施形態において、ＳＬＰＩポリペプチド配列又はＳＬＰＩに由来するアミノ酸配列は、ヒトＳＬＰＩポリペプチド配列であるか又はヒトＳＬＰＩポリペプチド配列に由来する。

本発明のセルピン−ＳＬＰＩ融合タンパク質のいくつかの実施形態において、融合タンパク質のＳＬＰＩ配列又はＳＬＰＩ由来配列は、以下のアミノ酸配列を有する完全長のヒトＳＬＰＩポリペプチド配列を含んでいる：

本発明のセルピン−ＳＬＰＩ融合タンパク質のいくつかの実施形態において、融合タンパク質のＳＬＰＩ配列又はＳＬＰＩ由来配列は、配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるヒトＳＬＰＩポリペプチド配列を含んでいる。

本発明のセルピン−ＳＬＰＩ融合タンパク質のいくつかの実施形態において、融合タンパク質のＳＬＰＩ配列又はＳＬＰＩ由来配列は、完全長のヒトＳＬＰＩポリペプチド配列の一部を含んでおり、そこで、該一部が以下のアミノ酸配列を有する：

本発明のセルピン−ＳＬＰＩ融合タンパク質のいくつかの実施形態において、融合タンパク質のＳＬＰＩ配列又はＳＬＰＩ由来配列は、配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるヒトＳＬＰＩポリペプチド配列を含んでいる。

本発明のセルピン−ＳＬＰＩ融合タンパク質のいくつかの実施形態において、融合タンパク質のＳＬＰＩ配列又はＳＬＰＩ由来配列は、完全長のヒトＳＬＰＩポリペプチド配列のＷＡＰ２ドメインを含んでおり、そこで、該ＷＡＰ２ドメインは以下のアミノ酸配列を有する：

本発明のセルピン−ＳＬＰＩ融合タンパク質のいくつかの実施形態において、融合タンパク質のＳＬＰＩ配列又はＳＬＰＩ由来配列は、配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるヒトＳＬＰＩポリペプチド配列を含んでいる。

本発明のセルピン−ＳＬＰＩ融合タンパク質のいくつかの実施形態において、ＳＬＰＩポリペプチド配列又はＳＬＰＩポリペプチドに由来するアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＣＡＡ２８１８７．１、ＮＰ＿００３０５５．１、ＥＡＷ７５８６９．１、Ｐ０３９７３．２、ＡＡＨ２０７０８．１、ＣＡＢ６４２３５．１、ＣＡＡ２８１８８．１、ＡＡＤ１９６６１．１、及び／又はＢＡＧ３５１２５．１に示されているヒトＳＬＰＩポリペプチド配列の１若しくは複数であるか又はそれらに由来する。

本発明のセルピン−ＳＬＰＩ融合タンパク質のいくつかの実施形態において、ＳＬＰＩポリペプチド配列又は融合タンパク質のＳＬＰＩ由来配列は、メチオニン（Ｍｅｔ）残基にて修飾されるヒトＳＬＰＩポリペプチド配列を含んでいる。これらのＭｅｔ突然変異において、Ｍｅｔ残基は任意のアミノ酸によって置換できる。例えば、Ｍｅｔ残基は、例えば、ロイシン（Ｌｅｕ、Ｌ）又はバリン（Ｖａｌ、Ｖ）などの疎水性側鎖を有するアミノ酸によって置換できる。いかなる理論にも縛られることを望むものではないが、（単数若しくは複数の）Ｍｅｔ突然変異は、本発明の融合タンパク質の酸化と、その後の阻害活性の不活性化を防ぐ。いくつかの実施形態において、Ｍｅｔ突然変異は、ＳＬＰＩポリペプチドの９８位に存在する。例えば、セルピン−ＳＬＰＩの修飾ＳＬＰＩポリペプチド配列は、配列番号８に突然変異Ｍ９８Ｌ又はＭ９８Ｖを含んでいる。

他の実施形態において、融合タンパク質のＷＡＰドメイン含有ポリペプチド配列は、エラフィンポリペプチド配列又はエラフィンに由来するアミノ酸配列を含んでいる。これらの実施形態は、本明細書中に「セルピン−エラフィン融合タンパク質」と呼ばれる。いくつかの実施形態において、エラフィンポリペプチド配列は、例えば、ＷＡＰドメイン又はその小部分などのエラフィンタンパク質の一部を含んでいる。好ましい実施形態において、エラフィンポリペプチド配列又はエラフィンに由来するアミノ酸配列は、ヒトエラフィンポリペプチド配列であるか又はそれらに由来する。

セルピン−エラフィン融合タンパク質のいくつかの実施形態において、融合タンパク質は、以下のアミノ酸配列を有する完全長のヒトエラフィンポリペプチド配列を含んでいる：

セルピン−エラフィン融合タンパク質のいくつかの実施形態において、融合タンパク質は、配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるヒトエラフィンポリペプチド配列を含んでいる。

セルピン−エラフィン融合タンパク質のいくつかの実施形態において、融合タンパク質は、完全長のヒトエラフィンポリペプチド配列の一部を含んでおり、そこで、該一部が以下のアミノ酸配列を有する：

セルピン−エラフィン融合タンパク質のいくつかの実施形態において、融合タンパク質は、配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるヒトエラフィンポリペプチド配列を含んでいる。

セルピン−エラフィン融合タンパク質のいくつかの実施形態において、融合タンパク質は、完全長のヒトエラフィンポリペプチド配列のＷＡＰドメインを含んでおり、そこで、該ＷＡＰドメインは以下のアミノ酸配列を有する：

セルピン−エラフィン融合タンパク質のいくつかの実施形態において、融合タンパク質は、配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるヒトエラフィンポリペプチド配列を含んでいる。

セルピン−エラフィン融合タンパク質のいくつかの実施形態において、エラフィンポリペプチド配列又はエラフィンポリペプチドに由来するアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｐ１９９５７．３、ＮＰ＿００２６２９．１、ＢＡＡ０２４４１．１、ＥＡＷ７５８１４．１、ＥＡＷ７５８１３．１、Ｑ８ＩＵＢ２．１、及び／又はＮＰ＿５４２１８１．１に示されているヒトエラフィンポリペプチド配列の１若しくは複数に由来する。

他の実施形態において、融合タンパク質のＷＡＰドメイン含有ポリペプチド配列は、Ｅｐｐｉｎポリペプチド配列又はＥｐｐｉｎに由来するアミノ酸配列を含んでいる。これらの実施形態は、本明細書中に「セルピン_(a’)−Ｅｐｐｉｎ融合タンパク質」と呼ばれる。いくつかの実施形態において、セルピン−Ｅｐｐｉｎ融合タンパク質のＥｐｐｉｎポリペプチド配列は、例えば、ＷＡＰドメイン又はその小部分などのＥｐｐｉｎタンパク質の一部を含んでいる。好ましい実施形態において、Ｅｐｐｉｎポリペプチド配列又はＥｐｐｉｎに由来するアミノ酸配列は、ヒトＥｐｐｉｎポリペプチド配列であるか又はヒトＥｐｐｉｎポリペプチド配列に由来する。

セルピン−Ｅｐｐｉｎ融合タンパク質のいくつかの実施形態において、Ｅｐｐｉｎポリペプチド配列又はＥｐｐｉｎポリペプチドに由来するアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｏ９５９２５．１、ＮＰ＿０６５１３１．１、ＡＡＨ４４８２９．２、ＡＡＨ５３３６９．１、ＡＡＧ００５４８．１、ＡＡＧ００５４７．１、及び／又はＡＡＧ００５４６．１に示されているヒトＥｐｐｉｎポリペプチド配列の１若しくは複数であるか又はそれらに由来する。

いくつかの実施形態において、セルピン−ＷＡＰドメイン融合タンパク質のセルピンポリペプチドは、少なくともＡＡＴタンパク質の反応部位ループ部分のアミノ酸配列を含んでいる。いくつかの実施形態において、ＡＡＴタンパク質の反応部位ループ部分は、少なくとも配列番号１のアミノ酸配列を含んでいる。いくつかの実施形態において、セルピン−ＷＡＰ融合タンパク質のセルピンポリペプチドは、少なくともＡＡＴタンパク質の反応部位ループ部分の変異型のアミノ酸配列を含んでいる。いくつかの実施形態において、ＡＡＴタンパク質の反応部位ループ部分の変異型は、少なくとも配列番号３２又は配列番号３３のアミノ酸配列を含んでいる。いくつかの実施形態において、セルピン−ＷＡＰドメイン融合タンパク質のセルピンポリペプチドは、少なくとも配列番号２のアミノ酸配列を有する完全長のヒトＡＡＴポリペプチド配列を含んでいる。いくつかの実施形態において、セルピン−ＷＡＰドメイン融合タンパク質のセルピンポリペプチドは、配列番号２又は３２若しくは３３のアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるヒトＡＡＴポリペプチド配列を含んでいる。

いくつかの実施形態において、セルピン−ＷＡＰドメイン融合タンパク質のセルピンポリペプチドは、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＡＢ５９４９５．１、ＣＡＪ１５１６１．１、Ｐ０１００９．３、ＡＡＢ５９３７５．１、ＡＡＡ５１５４６．１、ＣＡＡ２５８３８．１、ＮＰ＿００１００２２３５．１、ＣＡＡ３４９８２．１、ＮＰ＿００１００２２３６．１、ＮＰ＿０００２８６．３、ＮＰ＿００１１２１１７９．１、ＮＰ＿００１１２１１７８．１、ΝΡ＿００１１２１１７７．１、ＮＰ＿００１１２１１７６．１６、ＮＰ＿００１１２１１７５．１、ＮＰ＿００１１２１１７４．１、ＮＰ＿００１１２１１７２．１、及び／又はＡＡＡ５１５４７．１に示されたヒトＡＡＴポリペプチド配列の１若しくは複数であるＡＡＴポリペプチド配列、又はそこに示されたヒトＡＡＴポリペプチド配列の１若しくは複数に由来するＡＡＴポリペプチドに由来するアミノ酸配列を含んでいる。

いくつかの実施形態において、セルピン−ＷＡＰドメイン融合タンパク質はまた、Ｆｃポリペプチド又はＦｃポリペプチドに由来するアミノ酸配列を含んでいる。これらの実施形態は、本明細書中ではまとめて「セルピン−Ｆｃ−ＷＡＰドメイン融合タンパク質」と呼ばれる。これらの実施形態において、この専門用語によっていずれか特定の順序と解釈されないものとする。例えば、融合タンパク質の順序は、セルピン−Ｆｃ−ＷＡＰドメイン、セルピン−ＷＡＰドメイン−Ｆｃ、又はそれらの組み合わせのあらゆる変形形態であることができる。本明細書中に記載したセルピン−Ｆｃ−ＷＡＰドメイン融合タンパク質は、少なくともセルピンポリペプチド又はセルピンに由来するアミノ酸配列、ＷＡＰドメイン含有ポリペプチド又はＷＡＰドメイン含有ポリペプチドに由来するアミノ酸配列、及びＦｃポリペプチド又はＦｃポリペプチドに由来するアミノ酸配列を含んでいる。

いくつかの実施形態において、セルピン−ＷＡＰドメイン融合タンパク質がＦｃポリペプチド配列を含んでいるとき、Ｆｃポリペプチド配列は、配列番号３〜７のアミノ酸配列を有することができる。他の実施形態において、セルピン−ＷＡＰドメイン融合タンパク質がＦｃポリペプチド配列を含んでいるとき、Ｆｃポリペプチド配列は、配列番号３〜７のアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であることができる。いくつかの実施形態において、セルピン−ＷＡＰドメイン融合タンパク質はまた、アルブミンポリペプチド又はアルブミンポリペプチドに由来するアミノ酸配列を含むこともできる。これらの実施形態は、本明細書中ではまとめて「セルピン−アルブミン−ＷＡＰドメイン融合タンパク質」と呼ばれる。これらの実施形態において、この専門用語によって特定の順序と解釈されないものとする。例えば、融合タンパク質の順序は、セルピン−アルブミン−ＷＡＰドメイン、セルピン−ＷＡＰドメイン−アルブミン、又はそれらの組み合わせのあらゆる変形形態であることができる。本明細書中に記載したセルピン−アルブミン−ＷＡＰドメイン融合タンパク質は、少なくともセルピンポリペプチド又はセルピンに由来するアミノ酸配列、ＷＡＰドメイン含有ポリペプチド又はＷＡＰドメイン含有ポリペプチドに由来するアミノ酸配列、及びアルブミンポリペプチド又はアルブミンポリペプチドに由来するアミノ酸配列を含んでいる。

セルピン−ＷＡＰドメイン融合タンパク質がアルブミンポリペプチド配列を含んでいるいくつかの実施形態において、アルブミンポリペプチド配列は、本明細書中に記載した配列番号１４〜１５のアミノ酸配列を含んでいる。セルピン−ＷＡＰドメイン融合タンパク質がアルブミンポリペプチド配列を含んでいる他の実施形態において、アルブミンポリペプチド配列は、配列番号１４又は１５を有するアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有する。

いくつかの実施形態において、セルピン融合タンパク質の第二のポリペプチド（ポリペプチド２）は、アルブミンポリペプチドであるか又はアルブミンポリペプチドに由来する。これらの実施形態は、本明細書中ではまとめて「セルピン_(a’)−アルブミン融合タンパク質」と呼ばれる。本明細書中に記載したセルピン−アルブミン融合タンパク質は、少なくともセルピンポリペプチド又はセルピンに由来するアミノ酸配列、及びアルブミンポリペプチド又はアルブミンポリペプチドに由来するアミノ酸配列を含んでいる。加えて、本願発明は、セルピン−アルブミン結合ポリペプチド融合タンパク質に関し、そこで、該アルブミンは中間結合分子を介してセルピンに作動できるように連結されている。本明細書中では、セルピンは、ヒト血清アルブミンに非共有結合しているか又は共有結合している。

本発明の融合タンパク質がアルブミンポリペプチド配列を含んでいる実施形態において、融合タンパク質のアルブミンポリペプチド配列は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）ポリペプチド又はＨＳＡに由来するアミノ酸配列である。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、以下のアミノ酸配列を有するＨＳＡポリペプチド配列を含んでいる：

本発明の融合タンパク質がアルブミンポリペプチド配列を含んでいる実施形態において、融合タンパク質のアルブミンポリペプチド配列は、配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％の＞、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるヒト血清アルブミンポリペプチド配列を含んでいる。

本発明の融合タンパク質がアルブミンポリペプチド配列を含んでいる実施形態において、融合タンパク質のアルブミンポリペプチド配列は、以下のアミノ酸配列を有するヒト血清アルブミンポリペプチド配列のドメイン３を含んでいる：

本発明の融合タンパク質がアルブミンポリペプチド配列を含んでいる実施形態において、融合タンパク質のアルブミンポリペプチド配列は、配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％の＞、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるヒト血清アルブミンポリペプチド配列を含んでいる。

本発明の融合タンパク質がアルブミンポリペプチド配列を含んでいるいくつかの実施形態において、融合タンパク質は、中間アルブミン結合ポリペプチドを介してヒト血清アルブミンに連結される。アルブミン結合ポリペプチドは、抗体若しくは抗体断片であるか、又は抗体若しくは抗体断片に由来し得る。好ましい実施形態において、アルブミン結合ポリペプチド又は抗体若しくは抗体断片に由来するアミノ酸配列は、キメラ抗体配列、ヒト化抗体配列、又は完全なヒト抗体配列に由来する。抗体断片という用語には、一本鎖、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）₂断片、ｓｃＦｖ、ｓｃＡｂ、ｄＡｂ、単一ドメイン重鎖抗体、及び単一ドメイン軽鎖抗体が含まれる。加えて、アルブミン結合ポリペプチドはアルブミン結合ペプチドであり得る。本発明の別の実施形態は、セルピン−アルブミン結合ポリペプチド融合物であり、そこで、該アルブミン結合ポリペプチドは、連鎖球菌（Streptococcal）Ｇタンパク質のドメイン３であるか、又は連鎖球菌Ｇタンパク質のドメイン３に由来する配列である。

いくつかの実施形態において、セルピン_(a’)−アルブミン融合タンパク質のセルピンポリペプチドは、少なくともＡＡＴタンパク質の反応部位ループ部分のアミノ酸配列を含んでいる。いくつかの実施形態において、ＡＡＴタンパク質の反応部位ループ部分は、少なくとも配列番号１のアミノ酸配列を含んでいる。いくつかの実施形態において、セルピン−アルブミン融合タンパク質のセルピンポリペプチドは、少なくともＡＡＴタンパク質の反応部位ループ部分の変異型のアミノ酸配列を含んでいる。いくつかの実施形態において、ＡＡＴタンパク質の反応部位ループ部分の変異型は、少なくとも配列番号３２又は配列番号３３のアミノ酸配列を含んでいる。いくつかの実施形態において、セルピン−アルブミン融合タンパク質のセルピンポリペプチドは、少なくとも配列番号２のアミノ酸配列を有する完全長のヒトＡＡＴポリペプチド配列を含んでいる。いくつかの実施形態において、セルピン−アルブミン融合タンパク質のセルピンポリペプチドは、配列番号２又は３２若しくは３３のアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるヒトＡＡＴポリペプチド配列を含んでいる。

いくつかの実施形態において、セルピン−アルブミン融合タンパク質のセルピンポリペプチドは、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＡＢ５９４９５．１、ＣＡＪ１５１６１．１、Ｐ０１００９．３、ＡＡＢ５９３７５．１、ＡＡＡ５１５４６．１、ＣＡＡ２５８３８．１、ＮＰ＿００１００２２３５．１、ＣＡＡ３４９８２．１、ＮＰ＿００１００２２３６．１、ＮＰ＿０００２８６．３、ＮＰ＿００１１２１１７９．１、ＮＰ＿００１１２１１７８．１、ΝΡ＿００１１２１１７７．１、ＮＰ＿００１１２１１７６．１６、ＮＰ＿００１１２１１７５．１、ＮＰ＿００１１２１１７４．１、ＮＰ＿００１１２１１７２．１、及び／又はＡＡＡ５１５４７．１に示されているヒトＡＡＴポリペプチド配列の１若しくは複数であるか、若しくはそれらに由来するＡＡＴポリペプチド配列又はＡＡＴポリペプチドに由来するアミノ酸配列を含んでいる。

いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、例えば、１若しくは複数のタンパク分解性切断部位を突然変異させることによって、タンパク質分解性切断を増やすか、そうでなければ、阻害するように修飾される。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、融合タンパク質のＦｃエフェクター機能を変更するか、そうでなければ、調節するように修飾されてはいるが、変更のない融合タンパク質と比較して結合及び阻害機能を同時に持ち続けている。Ｆｃエフェクター機能としては、制限されることのない例によると、Ｆｃ受容体結合性、Ｆｃ受容体結合時の炎症誘発性メディエータ放出の予防、食作用、修飾された抗体依存性細胞媒介細胞障害作用（ＡＤＣＣ）、修飾された補体依存性細胞障害作用（ＣＤＣ）、ＦｃポリペプチドのＡｓｎ２９７残基（Ｋａｂａｔ付番のＥＵインデックス、Kabat et al 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest）における修飾されたグリコシル化反応が挙げられる。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、Ｆｃ受容体結合性に影響を及ぼすように突然変異されるか、そうでなければ、修飾される。いくつかの実施形態において、Ｆｃポリペプチドは、ＦｃＲｎ結合を増強するように修飾される。ＦｃＲｎへの結合を増強するＦｃポリペプチド突然変異の例は、Ｍｅｔ２５２Ｔｙｒ、Ｓｅｒ２５４Ｔｈｒ、Ｔｈｒ２５６Ｇｌｕ（Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５６Ｔ、Ｔ２５６Ｅ）（Ｋａｂａｔ付番、Dall'Acqua et al 2006, J. Biol Chem Vol 281(33) 23514-23524）、又はＭｅｔ４２８Ｌｅｕ及びＡｓｎ４３４Ｓｅｒ（Ｍ４２８Ｌ、Ｎ４３４Ｓ）（Zalevsky et al 2010 Nature Biotech, Vol. 28(2) 157-159）（Kabat et al 1991 Sequences of Proteins of Immunological InterestのＥＵインデックス）である。いくつかの実施形態において、Ｆｃポリペプチド部分は、Ｆｃ媒介性二量体化を妨げるように突然変異されるか、そうでなければ、修飾される（Ying et al 2012 J. Biol Chem 287(23): 19399-19408）。これらの実施形態において、融合タンパク質は、事実上、単量体である。

本明細書中に提供される融合タンパク質及びその変異型は、例えば、ヒト好中球エラスターゼ（ＮＥ）、炎症反応中に好中球によって分泌されるケモトリプシン折り畳みセリンプロテアーゼなどのセリンプロテアーゼを阻害することによって、阻害活性を提供した。本明細書中に提供された融合タンパク質は、セリンプロテアーゼ発現、又はセリンプロテアーゼ、例えば、ヒトセリンプロテアーゼとの結合、そうでなければ、相互作用による活性を、完全に又は部分的に低減するか、そうでなければ、調節する。セリンプロテアーゼの生物学的機能の低減又は調節は、完全に又は部分的に、融合タンパク質と、ヒトセリンプロテアーゼタンパク質、ポリペプチド、及び／又はペプチドとの相互作用によるものである。融合タンパク質の存在下でセリンプロテアーゼ発現又は活性のレベルが、本明細書中に記載した融合タンパク質との相互作用、例えば、結合がない場合のセリンプロテアーゼ発現又は活性のレベルと比較して、少なくとも９５％、例えば、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％減少するとき、融合タンパク質がセリンプロテアーゼの発現又は活性を完全に阻害すると見なされる。融合タンパク質の存在下でセリンプロテアーゼの発現又は活性のレベルが、本明細書中に記載した融合タンパク質との相互作用、例えば、結合がない場合のセリンプロテアーゼの発現又は活性のレベルと比較して、９５％未満、例えば、１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７５％、８０％、８５％又は９０％減少するとき、融合タンパク質がセリンプロテアーゼの発現又は活性をに部分的に阻害したと見なされる。

本明細書中に記載した融合タンパク質は、さまざまな治療学的、診断的、及び予防的適応症で有用である。例えば、融合タンパク質は、対象のさまざまな疾患及び障害を治療するのに有用である。いくつかの実施形態において、本明細書中に記載した融合タンパク質を含めたセルピン融合タンパク質は、α１アンチトリプシン（ＡＡＴ）欠乏、肺気腫、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、アレルギー性喘息、嚢胞性繊維症、肺癌、例えば、心臓移植後の虚血／再潅流損傷を含めた虚血再灌流障害、心筋梗塞、関節リウマチ、敗血症性関節炎、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、クローン病、乾癬、Ｉ型及び／又はＩＩ型糖尿病、細菌感染症、真菌感染症、ウイルス感染症、肺炎、敗血症、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、創傷治癒、全身性エリテマトーデス、及び多発性硬化症から選択される疾患又は障害に罹患しているか又はその危険性が高いと判断された対象の疾患又は障害の症状を治療、緩和する、それらの進行を改善する及び／又は遅らせるのに有用である。

本発明による医薬組成物は、修飾された融合タンパク質や他の変異型を含めた本発明の融合タンパク質を、好適な担体と共に含んでいる。これらの医薬組成物は、例えば、診断キットなどのキットに含まれている。

本発明によるセルピン−Ｆｃ融合タンパク質のいくつかの実施形態の略図である。セルピンは、融合タンパク質内の任意の位置に配置できる。２つ以上のセルピンポリペプチドを組み込んだセルピン−Ｆｃ融合タンパク質もまた示されている。 血清由来ＡＡＴ（レーン１）、ＡＡＴ−Ｆｃ１（レーン２、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ）、及びＡＡＴ−ＥＬ−Ｆｃ１（レーン３、ＡＡＴ内のＭｅｔ３５１Ｇｌｕ、Ｍｅｔ３５８Ｌｅｕ突然変異、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ）を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの写真である。 ＡＡＴ−Ｆｃ融合タンパク質による好中球エラスターゼ活性の阻害を示すグラフである。 Ｆｃポリペプチドあたり２つのＡＡＴポリペプチドを有する４価のＡＡＴ−Ｆｃ−ＡＡＴを示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの写真である。 ４価のＡＡＴ−Ｆｃ−ＡＡＴ融合タンパク質による好中球エラスターゼ活性の阻害を示すグラフである。 プロテインＡ樹脂からの低ｐＨ溶出の効果を実証するグラフであり、その中で、低ｐＨで溶出されたＡＡＴ−Ｆｃ融合タンパク質のＮＥ阻害能力は、大幅に減少している。 二重突然変異体であるＡＡＴ−ＥＬ−Ｆｃ（Ｍｅｔ３５１Ｇｌｕ、Ｍｅｔ３５８Ｌｅｕ突然変異）が、野性型ＡＡＴ及び単独突然変異体ＡＡＴ−ＥＭ−Ｆｃ（Ｍｅｔ３５１Ｇｌｕ）と比較して、Η₂Ｏ₂不活性化（ｃｏｎｃ．）に対して耐性であることを示すグラフである。 １０ｍｇ／ｋｇタンパク質を投与したラット（３匹のラット／試験タンパク質）においてＡＡＴ−Ｆｃと比較した、血清由来ＡＡＴ（ｓｄＡＡＴ）の血清クリアランス速度を示すグラフである。ＡＡＴ−Ｆｃの半減期は、ｓｄＡＡＴの半減期より実質的に長い。

本発明のセルピン−サイトカイン標的融合タンパク質のいくつかの実施形態の略図である。セルピンは、抗体の重鎖、軽鎖、又は両方に融合されることができる。セルピン−サイトカイン受容体融合タンパク質もまた示されている。 Ｄ２Ｅ７抗体（レーン１）、及び重鎖に融合した−ＡＡＴを有するＤ２Ｅ７抗体（レーン２）を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの写真である。 ＡＡＴに融合したＤ２Ｅ７抗体による好中球エラスターゼ活性の阻害を示すグラフである。血清由来ＡＡＴが正の対照として示されている一方で、Ｄ２Ｅ７抗体単独はＮＥ阻害の負の対照として示されている。

セルピン−Ｆｃ−ＷＡＰ融合タンパク質のいくつかの実施形態の略図である。 ＡＡＴ−Ｆｃ−ＥＬＡＦＩＮ（レーン１）及びＡＡＴ−Ｆｃ−ＳＬＰＩ（レーン２）を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの写真である。 ＡＡＴ−Ｆｃ−ＥＬＡＦＩＮ融合タンパク質及びＡＡＴ−Ｆｃ−ＳＬＰＩ融合タンパク質による好中球エラスターゼ活性の阻害を示すグラフである。ＡＡＴ−Ｆｃ融合タンパク質及び血清由来ＡＡＴが比較のために含まれている。

ＡＡＴ−ＨＳＡ融合タンパク質のいくつかの実施形態の略図である。 ＡＡＴ−ＨＳＡ融合物を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの写真である。 血清由来ＡＡＴと比較したＡＡＴ−ＨＳＡによる好中球エラスターゼ活性の阻害を示すグラフである。 発明の詳細な説明

ヒト好中球エラスターゼ（ＮＥ）は、炎症中に好中球によって分泌されるキモトリプシン折り畳みセリンプロテアーゼである。ＮＥの異常活性は、肺気腫及び肺線維症につながるエラスチン組織の進行性の分解及び肺の胞状構造の緩やかな破壊をもたらす（Lungarella et al 2008 Int. J. Biochem Cell Biol 40: 1287）。多くの場合、誤ったＮＥ活性は、その天然の阻害物質であるα１アンチトリプシン（ＡＡＴ）によるプロテアーゼの不均衡のためである。この不均衡は、喫煙者及び嚢胞性線維症（ＣＦ）又は急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）を患っている患者の肺で観察されるような、肺内への高い好中球浸入をもたらし得る。逆に、通常ＡＴＴが肝臓内に凝集し、蓄積させる点突然変異の結果としてのＡＡＴの欠乏は、肺を歯止めが利いていないＮＥ活性に晒されたままにする。ＡＡＴ欠乏を患っている個体は、肺気腫、ＣＯＰＤ、肝臓疾患、及び他の多数の病状の危険性が高い。

ＡＡＴ欠乏は、（α１財団の概算によると）約１０万人のアメリカ人に影響を及ぼし、そして、罹患者の多くが３０代〜４０代で亡くなっている。現在、ＡＴＴ欠乏の治療のためにＦＤＡによって承認された薬物はほんの数種類しか存在していない（Ｐｒｏｌａｓｔｉｎ（登録商標）、Ａｒａｌａｓｔ（商標）、Ｚｅｍａｉｒａ（登録商標）、Ｇｌａｓｓｉａ（商標））。各薬物はプールされているヒト血漿に由来する天然のＡＡＴであるが、それは、予期された臨床的需要にこたえるには不十分であるように見える。さらに、これらの製品は、短い血清中半減期（約５日間のＴ_1/2）しかないので、高い投与量（６０ｍｇ／ｋｇ体重）での毎週の点滴を必要とする。これらの薬物の現在の市場は、約４００百万ドルと見られている。ＡＡＴ欠乏を患っている９５％もの個人が診断されないままであるという推定、並びにこれらの薬物には、ＡＡＴ欠乏ではない個人の高ＮＥ活性を特徴とする症状（例えば、嚢胞性繊維症（ＣＦ）、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、喫煙誘発性肺気腫、及び／又はＣＯＰＤ）の効果的な治療法になる可能性があるという事実に基づいて、ＡＡＴ様薬物の市場は、実質的により大きいはずである。

ＡＡＴは、広範囲抗炎症活性を有することが示唆された（Tilg et al 1993 J Exp Med 178: 1629 - 1636, Libert et al 1996 Immunol 157:5126 -5129, Pott et al, Journal of Leukocyte Biology 85 2009, Janciauskiene et al 2007 J. Biol Chem 282(12): 8573-8582, Nita et al 2007 Int J Biochem Cell Biol 39: 1 165 -1176）。最近、ＡＡＴには、一般的に推奨されている炎症性肺症状の他に、多くのヒトの病状の処置に有効である可能性があるとする証拠が増えてきた。ヒトＡＡＴが、実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）の臨床的及び組織病理学的徴候からマウスを保護することが示され、それが多発性硬化症又は全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）などの自己免疫疾患の治療候補であることが示唆された（Subramanian et al 201 1 Metab Brain Dis 26: 107-113）。血清ＡＡＴは、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の齧歯動物モデルにおいて活性を示し（Tawara et al 2011 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 109: 564-569, Marcondes et al 2011 Blood Nov 3; 118(18):5031-9）、そしてそれが、ステロイド無反応性急性ＧＶＨＤを患っている個人を処置するのにＡＡＴを使用するヒト臨床試験につながった（ＮＣＴ０１５２３８２１）。さらに、ＡＡＴは、Ｉ型及びＩＩ型糖尿病の動物モデルにおいて有効であって、そして、炎症を緩和し、小島細胞をアポトーシスから保護し、小島細胞同種移植片を長持ちさせることを可能にした（Zhang et al 2007 Diabetes 56: 1316-1323, Lewis et al 2005 Proc Natl Acad Sci USA 102: 12153-12158, Lewis et al 2008 Proc Natl Acad Sci USA 105: 16236 -16241, Kalis et al 2010 Islets 2:185 - 189）。現在、血清由来ＡＡＴ製品を使用したＩ型糖尿病の早期ヒト臨床試験が多数存在している（ＮＣＴ０１１８３４６８、ＮＣＴ０１３１９３３１、ＮＣＴ０１３０４５３７）。

現在の血清由来ＡＡＴ製品は、多くの精製を受け、且つ、病原性ウイルスの除去を確実にするために試験しているが、しかしながら、感染症性物質の伝播の危険性を完全に排除できていない。そのうえ、血清は限られており、そしてどれが、血清由来ＡＡＴの生産能力を制限する。血清由来製品の懸念事項及び生産の問題に対処する試みは、遺伝子組み換えＡＡＴの発現を目指していた。しかしながら、作業から２０年後であっても、治療的に実行可能な遺伝子組み換えＡＡＴの作出は上市に至っていない（Karnaukhova et al 2006 Amino Acids 30: 317）。血清由来製品のように、遺伝子組み換えバージョンのＡＡＴも短い血清中半減期、低い生産率、及び乏しい肺分布に悩まされている。

本発明の融合タンパク質は、未修飾のＡＡＴ分子と比較して、機能性が高くなった。ＡＡＴポリペプチドの、新生児Ｆｃレセプター（ＦｃＲｎ）と相互作用する第二のポリペプチドとの融合が、血清中半減期を延長する役割を果たし、多くの必要な投薬利益を患者に提供する。融合タンパク質のこれらのＦｃＲｎ相互作用ポリペプチドとしては、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、若しくはＩｇＭに由来する免疫グロブリン（Ｉｇ）Ｆｃポリペプチド、又はヒトアルブミンの誘導体が挙げられる。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、酸化による不活性化に対して分子をより耐性にする突然変異を有するＡＡＴ部分を組み込んでいる。例えば、Ｍｅｔ３５１Ｇｌｕ、Ｍｅｔ３５８Ｌｅｕ（ＡＡＴ−ＥＬ−Ｆｃ）は、Ｈ₂Ｏ₂酸化による不活性化に対する抵抗性が実証している（図１Ｇ）。ＡＡＴが天然の抗炎症性タンパク質である一方で、本発明のいくつかの実施形態は、ＡＡＴポリペプチドとサイトカイン標的ポリペプチドの融合によって高い炎症緩和能力を提供する。ＡＡＴ及び第二のポリペプチドからの二元的な抗炎症性機能のカップリングは、それら自体のいずれかのポリペプチドに比べて、強力な治療用タンパク質をより多く提供する。さらに、ＡＡＴが抗感染症活性をカップリングすることで、ほとんどのサイトカイン標的生物の感染症リスクが軽減する。いくつかの実施形態は、ＡＡＴポリペプチドとＷＡＰドメイン含有ポリペプチドの融合によって、より強力な抗炎症性タンパク質及び抗感染症タンパク質を提供する。
本発明の融合タンパク質は、すばらしい治療的有用性を有しており、且つ、現在の血清由来ＡＡＴ製品より優れていると予想される。

遺伝子組み換えＡＡＴの半減期を延長するために、予想されるタンパク質産物がＦｃドメインがあとに続いたＡＡＴ（ＡＡＴ−Ｆｃ（ＩｇＧ１）、ＡＡＴ−Ｆｃ（ＩｇＧ２）、ＡＡＴ−Ｆｃ（ＩｇＧ３）、ＡＡＴ−Ｆｃ（ＩｇＧ４）、ＡＡＴ−Ｆｃ（ＩｇＭ））、又はＨＳＡがあとに続いたＡＡＴとなるように、組換えＤＮＡ技術を、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、又はＨＳＡのＦｃドメインと融合したＡＡＴ遺伝子を作り出すのに使用した。いくつかのタンパク質、タンパク質領域又はペプチドへのＨＳＡのＦｃドメインの融合が、それらの半減期を延長する場合があることは知られていたが（例えば、Jazayeri et al. BioDrugs 22, 11-26, Huang et al. (2009) Curr Opin Biotechnol 20, 692-699, Kontermann et al. (2009) BioDrugs 23, 93-109, Schmidt et al. (2009) Curr Opin Drug Discov Devel 12, 284-295を参照のこと）、ＡＡＴに融合されたＦｃドメイン又はＨＳＡが、適切な折り畳みとＮＥ阻害活性の保持を可能にするか、又は遺伝子組み換えＡＡＴの半減期を延長する場合があるかは知られていなかった。本発明の融合タンパク質は、ＮＥの強力な阻害物質であり、延長された血清中半減期を有し、且つ、いくつかの実施形態において酸化に対して耐性であることが示されている。他の実施形態において、本明細書中に記載した融合タンパク質は、サイトカイン標的ポリペプチド、及びＷＡＰドメイン含有ポリペプチドを含めた他の機能性ポリペプチドの取り込みによって異なった特性を有している。

本明細書中に記載した融合タンパク質は、少なくともセルピンポリペプチド又はセルピンに由来するアミノ酸配列、及び第二のポリペプチドを含んでいる。いくつかの実施形態において、例えば、本発明は、ヒトＩｇＧ１−Ｆｃ、ＩｇＧ２−Ｆｃ、ＩｇＧ３−Ｆｃ、ＩｇＧ４−Ｆｃ、ＩｇＭ−Ｆｃ、又はＨＳＡ誘導体に融合したセルピンポリペプチドを提供する。本明細書中に記載したセルピン融合物は、制限されることのない例によると、α１アンチトリプシン（ＡＡＴ）欠乏、肺気腫、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、アレルギー性喘息、嚢胞性繊維症、肺癌、例えば、心臓移植後の虚血／再潅流損傷を含めた虚血再灌流障害、心筋梗塞、関節リウマチ、敗血症性関節炎、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、クローン病、乾癬、Ｉ型及び／又はＩＩ型糖尿病、細菌感染症、真菌感染症、ウイルス感染症、肺炎、敗血症、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、創傷治癒、全身性エリテマトーデス、及び多発性硬化症を含めたさまざまな適応症を処置するのに有用であると予想される。

いくつかの実施形態において、本明細書中に記載した融合タンパク質は、少なくともα１アンチトリプシン（ＡＡＴ）のポリペプチド又はＡＡＴに由来するアミノ酸配列、及び第二のポリペプチドを含んでいる。例えば、本発明は、ヒトＩｇＧ１−Ｆｃ、ＩｇＧ２−Ｆｃ、ＩｇＧ３−Ｆｃ、ＩｇＧ４−Ｆｃ、ＩｇＭ−Ｆｃ、又はＨＳＡ誘導体に融合させたα１アンチトリプシン（ＡＡＴ）を提供する。

いくつかの実施形態において、本明細書中に記載した融合タンパク質は、少なくともセルピンポリペプチド又はセルピンポリペプチドに由来するアミノ酸配列、及びサイトカイン標的ポリペプチド又はサイトカイン標的ポリペプチドに由来するアミノ酸配列を含んでいる。例えば、本発明は、ヒトサイトカイン受容体又はその誘導体に融合されたセルピンポリペプチド又はセルピンポリペプチドに由来する配列を提供する。本発明の別の実施形態は、サイトカイン標的抗体、例えば、抗サイトカイン抗体、又はサイトカイン標的抗体に由来する配列、例えば、抗サイトカイン抗体、又はサイトカイン標的抗体の断片に由来する配列、例えば、抗サイトカイン抗体の断片に融合されたセルピンポリペプチド又はセルピンポリペプチドに由来する配列を提供する。例えば、本発明は、サイトカイン標的ポリペプチドに融合されたセルピンポリペプチド又はセルピンポリペプチドに由来する配列を提供するが、そこで、該サイトカイン標的ポリペプチドが以下のヒトサイトカイン：ＴＮＦα、ＩｇＥ、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３、ＩＬ−６、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−１７、ＩＬ−１３、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−２、ＩＬ−１８、ＩＬ−２７、又はＩＬ−３２のいずれかに結合する。

例えば、いくつかの実施形態において、サイトカイン標的ポリペプチドは、ＴＮＦαを標的とし、以下のＴＮＦα標的ポリペプチドに由来する又は以下のＴＮＦα標的ポリペプチドに由来する配列のいずれかを含んでいる：Ｒｅｍｉｃａｄｅ（登録商標）、Ｈｕｍｉｒａ（登録商標）、Ｓｉｍｐｏｎｉ（登録商標）、Ｃｉｍｉｚａ（登録商標）、Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標）又はＡＴＮ−１０３及びＡＴＮ−１９２。

例えば、いくつかの実施形態において、サイトカイン標的ポリペプチドは、ＩｇＥを標的とし、以下のＩｇＥ標的ポリペプチド又は以下のＩｇＥ標的ポリペプチドに由来する配列のいずれかを含んでいる：Ｘｏｌａｉｒ又はＦｃεＲＩ。

例えば、いくつかの実施形態において、サイトカイン標的ポリペプチドは、ＩＬ−１２及びＩＬ−２３の共有されたｐ４０サブユニットを標的とし、Ｓｔｅｌａｒａ（登録商標）ポリペプチド又はＳｔｅｌａｒａ（登録商標）ポリペプチドに由来する配列を含んでいる。

例えば、サイトカイン標的ポリペプチドＳｔｅｌａｒａ（登録商標）は、ＩＬ−１３を標的とし、ＣＤＰ７７６６ポリペプチド又はＣＤＰ７７６６ポリペプチドに由来する配列を含んでいる。

いくつかの実施形態において、本明細書中に記載した融合タンパク質は、少なくともα１アンチトリプシン（ＡＡＴ）ポリペプチド又はＡＡＴに由来するアミノ酸配列、及びサイトカイン標的ポリペプチド又はサイトカイン標的ポリペプチドに由来するアミノ酸配列を含んでいる。例えば、本発明は、サイトカイン標的ポリペプチドと融合されたα１アンチトリプシン阻害物質（ＡＡＴ）を提供するが、そこで、該サイトカイン標的ポリペプチドが以下のヒトサイトカイン：ＴＮＦα、ＩｇＥ、ＩＬ−６、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−１２、ＩＬ−１７、ＩＬ−１３、ＩＬ−２３、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−２、ＩＬ−１８、ＩＬ−２７、又はＩＬ−３２、のいずれかに結合する。

いくつかの実施形態において、サイトカイン標的ポリペプチドは、サイトカイン受容体に結合し、サイトカインの結合を妨げる。例えば、本発明は、サイトカイン受容体標的抗体に融合されたセルピンを含んでいる。例えば、本発明は、サイトカイン標的ポリペプチドに融合されたα１アンチトリプシン阻害物質（ＡＡＴ）を提供しりが、そこで、該サイトカイン標的ポリペプチドは、以下のヒトサイトカイン：ＴＮＦα、ＩｇＥ、ＩＬ−６、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−１２、ＩＬ−１７、ＩＬ−１３、ＩＬ−２３、ＩＬ−１２及びＩＬ−２３のｐ４０サブユニット、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−２、ＩＬ−１８、ＩＬ−２７、又はＩＬ−３２、のいずれかの受容体に結合する。

例えば、いくつかの実施形態において、サイトカイン標的ポリペプチドは、ＩＬ−６受容体を標的とし、Ａｃｔｅｍｒａ（登録商標）ポリペプチド（特許公報ＥＰ０６２８６３９に記載）若しくはＡＬＸ−００６１ポリペプチド（ＷＯ２０１０／１１５９９８に記載）、又はＡｃｔｅｍｒａ（登録商標）ポリペプチド若しくはＡＬＸ−００６１ポリペプチドに由来する配列を含んでいる。

例えば、サイトカイン標的ポリペプチドＡｃｔｅｍｒａ（登録商標）は、ＩＬ−６受容体を標的とし、トシリズマブポリペプチド又はトシリズマブポリペプチドに由来する配列を含んでいる。

タンパク質治療による炎症性サイトカイン及び免疫刺激物質の標的化が、多数の炎症状における臨床的成功を実証した。サイトカイン標的作用物質に使用される最も一般的なタンパク質は、可溶性サイトカイン受容体、並びにモノクローナル抗体及びその断片である。ＴＮＦα標的生物製剤、Ｒｅｍｉｃａｄｅ（登録商標）、Ｈｕｍｉｒａ（登録商標）、Ｓｉｍｐｏｎｉ（登録商標）、Ｃｉｍｉｚａ（登録商標）及びＥｎｂｒｅｌ（登録商標）、並びにＩＬ−１２／２３ｐ４０標的抗体、Ｓｔｅｌａｒａ（登録商標）によって証明されるように、サイトカインを標的化する顕著な欠点は、これらの患者における感染症の危険性の増大である。これは、患者で免疫抑制にをもたらす炎症性サイトカインの標的化の共通した問題になる。ＡＡＴ及び他のセルピンタンパク質は、抗感染症活性及び消炎活性の両方が実証されているところが興味深い。これにより、本願発明のセルピン−サイトカイン標的ポリペプチド融合タンパク質は、異常なサイトカイン活性を抑制できる一方で、感染症の危険を緩和する。

いくつかの実施形態において、本明細書中に記載した融合タンパク質は、セルピンポリペプチド又はセルピンに由来するアミノ酸配列、ＷＡＰドメイン含有ポリペプチド又はＷＡＰドメイン含有ポリペプチドに由来するアミノ酸配列、及びＦｃポリペプチド又はＦｃポリペプチドに由来するアミノ酸配列を含んでいる。例えば、本発明は、任意の機能的な組み合わせで一緒に作動できるように連結されたセルピンポリペプチド、ＷＡＰドメイン含有ポリペプチド及びヒトＩｇＧ１−Ｆｃ、ＩｇＧ２−Ｆｃ、ＩｇＧ３−Ｆｃ、ＩｇＧ４−Ｆｃ又はＩｇＭ−Ｆｃ誘導体を提供する。いくつかの実施形態において、ＷＡＰドメイン含有タンパク質は、ヒトＳＬＰＩであるか又はヒトＳＬＰＩに由来する。他の実施形態において、ＷＡＰドメイン含有タンパク質は、ヒトＥＬＡＦＩＮであるか又はヒトＥＬＡＦＩＮに由来する。いくつかの実施形態において、本明細書中に記載した融合タンパク質は、少なくともα１アンチトリプシン（ＡＡＴ）ポリペプチド又はＡＡＴに由来するアミノ酸配列、及びＳＬＰＩポリペプチド又はＳＬＰＩに由来するアミノ酸配列を含んでいる。いくつかの実施形態において、本明細書中に記載した融合タンパク質は、少なくともＡＡＴポリペプチド又はＡＡＴに由来するアミノ酸配列、及びＥＬＡＦＩＮポリペプチド又はＥｌａｆｉｎに由来するアミノ酸配列を含んでいる。

ＳＰＬＩ及びＥｌａｆｉｎは、セリンプロテアーゼ阻害活性を示すＷＡＰドメイン含有タンパク質である。これらの両タンパク質は、機能が抗炎症性である。加えて、これらのタンパク質は、細菌、ウイルス、及び真菌の多くの株に対して広い抗感染症能力を有する。

いくつかの実施形態において、本明細書中に記載した融合タンパク質は、少なくともセルピンポリペプチド又はセルピンに由来するアミノ酸配列、及びヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）ポリペプチド又はＨＳＡポリペプチドに由来するアミノ酸配列を含んでいる。本発明の更なる実施形態は、セルピン−アルブミン結合ポリペプチド融合タンパク質を含んでいて、そこで、該アルブミン結合ポリペプチドはセルピンとＨＳＡの結合に関与する。その結果、本発明は、セルピンポリペプチド及びＨＳＡポリペプチド、又はセルピンポリペプチド若しくはＨＳＡポリペプチドに由来する配列の共有結合及び非共有結合の両方を含んでいる。例えば、本発明は、ヒトＨＳＡ、ＨＳＡ誘導体、又はＨＳＡ結合ペプチド又はポリペプチドに融合されたセルピンポリペプチドを提供する。

いくつかの実施形態において、本明細書中に記載した融合タンパク質は、少なくともα１アンチトリプシン（ＡＡＴ）ポリペプチド又はＡＡＴに由来するアミノ酸配列、及びＨＳＡポリペプチド又はＨＳＡポリペプチドに由来するアミノ酸配列を含んでいる。例えば、本発明は、ＨＳＡ、ＨＳＡに由来する断片、又はアルブミン結合ポリペプチドに融合されたα１アンチトリプシン（ＡＡＴ）を提供する。

いくつかの実施形態において、本明細書中に記載した融合タンパク質は、
セルピンポリペプチド又はセルピンに由来するアミノ酸配列、ＨＳＡポリペプチド又はＨＳＡポリペプチドに由来するアミノ酸配列、及びＷＡＰドメイン含有ポリペプチド又はＷＡＰドメイン含有ポリペプチドに由来するアミノ酸配列を含んでいる。いくつかの実施形態において、本明細書中に記載した融合タンパク質は、少なくともα１アンチトリプシン（ＡＡＴ）ポリペプチド又はＡＡＴに由来するアミノ酸配列、ＨＳＡポリペプチド又はＨＳＡポリペプチドに由来するアミノ酸配列、ＳＬＰＩポリペプチド又はＳＬＰＩに由来するアミノ酸配列を含んでいる。他の実施形態において、本明細書中に記載した融合タンパク質は、少なくともα１アンチトリプシン（ＡＡＴ）ポリペプチド又はＡＡＴに由来するアミノ酸配列、ＨＳＡポリペプチド又はＨＳＡポリペプチドに由来するアミノ酸配列、及びＥｌａｆｉｎポリペプチド又はＥｌａｆｉｎに由来するアミノ酸配列を含んでいる。

本発明の融合タンパク質は、哺乳動物細胞発現系において容易に製造できる。例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞、ＣＯＳ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０、ＹＢ２／０が、本明細書中に記載したセルピン融合タンパク質の発現のために容易に使用できる。重要なことには、哺乳動物細胞発現系は、一般に、治療用途にとってより最適なタンパク質を生じる。細菌、昆虫、又は酵母ベースの発現系とは対照的に、哺乳動物細胞発現系は、天然ヒトタンパク質に見られるものと類似した又は同様のグリコシル化パターンを有するタンパク質をもたらす。タンパク質の本来のグリコシル化は、血清安定性、薬物動態、生体分布、タンパク質の折り畳み、及び機能性に大いに影響を及ぼす。そのため、哺乳動物発現系で治療用タンパク質を作り出す能力には、他の系を上回る明らかな利点がある。さらに、哺乳動物細胞発現系の大部分（例えば、ＣＨＯ、ＮＳ０、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞）は、臨床的要求を満たすための治療用タンパク質を製造するために市販の製造設備で容易にスケーリングできる。本明細書中に記載した融合タンパク質は、天然型のＡＡＴを超える高い機能性を有し、且つ、臨床及び市販のために哺乳動物発現系で製造されることができる。本発明のいくつかの実施形態は、ＮＥを阻害するそれらの能力を維持しているセルピン融合タンパク質の単離を可能にする精製システムを含んでいる。重要なことに、本発明の精製工程は、今日の市販の哺乳動物細胞ベースの製造工程に容易に組み入れることができる。

別に明記しない限り、本発明に関連して使用される科学用語及び技術用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有する。さらに、文脈によって特に必要とされない限り、単数形の用語は、複数の存在を含み、そして複数形の用語は、単数の存在を含む。一般に、本明細書中に記載される細胞及び組織培養、分子生物学、並びにタンパク質化学及びオリゴヌクレオチド化学又はポリヌクレオチド化学、並びにハイブリダイゼーションに関して利用される用語、並びにそれらの技術は、当該分野において周知であり、そして当該分野において一般的に使用される。標準的な技術が、組換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、及び組織培養並びに形質転換（例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション）に使用される。酵素反応及び精製技術は、製造業者の指示書に従って行なわれるか、当該分野において一般的に実行されるように行なわれるか、又は本明細書中に記載されるように行われる。上述の技術及び手順は、一般に、当該分野で周知である従来の方法に従って行なわれ、そして本明細書全体を通して引用され、そして議論される種々の一般的、且つ、より具体的な参考文献に記載されるように行われる。例えば、Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual（2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)）を参照のこと。本明細書中に記載される分析化学、合成有機化学、並びに医化学及び薬化学に関して利用される用語、並びにそれらの実験室手順及び技術は、周知であり、そして当該分野において一般的に使用される。標準的な技術は、化学合成、化学分析、薬学的な調製、処方、及び送達、並びに患者の処置に使用される。

本発明に従う治療的実体の投与が、改善された輸送、送達、耐性などを提供するために処方物中に組み込まれる、適切な担体、賦形剤、及び他の薬剤と一緒に投与されることが、認識される。多くの適切な処方物が、全ての薬剤師において公知である処方集において見出され得る：Remington's Pharmaceutical Sciences（15th ed, Mack Publishing Company, Easton, PA (1975)）、特にその中のBlaug, Seymourによる第８７章。これらの処方物としては、例えば、粉末、ペースト、軟膏、ゼリー、ワックス、油、脂質、脂質（カチオン又はアニオン）含有小胞（例えば、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標））、ＤＮＡ結合体、無水物吸着ペースト、水中油型エマルション及び油中水型エマルション、エマルションカルボワックス（carbowax）（種々の分子量のポリエチレングリコール）、半固体ゲル、及びカルボワックスを含む半固体混合物が挙げられる。任意の前述の混合物は、本発明に従う処置及び治療において適切であり得るが、処方物中の活性成分は、処方によって不活化されず、そして生理学的に適合性であり、且つ投与経路に関して許容され得る。Baldrick P. "Pharmaceutical excipient development: the need for preclinical guidance." Regul. Toxicol Pharmacol. 32(2):210-8 (2000), Wang W. "Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals." Int. J. Pharm. 203(1-2): 1-60 (2000), Charman WN "Lipids, lipophilic drugs, and oral drug delivery-some emerging concepts." J Pharm Sci. 89(8):967-78 (2000), Powell et al. "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA J Pharm Sci Technol. 52:238-311 (1998)、並びに薬剤師に公知である処方物、賦形剤、及び担体に関連するさらなる情報に関する本明細書中の引用を参照のこと。

本発明の融合タンパク質を含む本発明の治療用製剤は、対象における異常セリンプロテアーゼ活性に関連している疾患又は障害に関する症状を処置するか、又は緩和するために使用される。本発明はまた、対象における異常セリンプロテアーゼ活性に関連している疾患又は障害に関する症状を処置する方法又は緩和する方法を提供する。治療レジメンは、対象における異常セリンプロテアーゼ活性に関連している疾患又は障害を罹患する（又は疾患又は障害を発症する危険性がある）対象（例えば、ヒト患者）を、さまざまな臨床的及び／又は実験的手順のいずれかを含めた標準的な方法を使用して同定することによって実施される。患者という用語は、ヒト及び動物の対象を含んでいる。対象という用語は、ヒトと他の哺乳動物を含んでいる。

処置の効力は、特定の対象における異常セリンプロテアーゼ活性に関連している疾患又は障害を診断するか、又は処置するための任意の公知の方法に関連して決定される。対象における異常セリンプロテアーゼ活性に関連している疾患又は障害の１つ以上の症状の緩和は、融合タンパク質が臨床上の利益を提供することを示す。

所望の特異性を有する融合タンパク質のスクリーニングのための方法としては、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）及び当該分野において公知である免疫学的に媒介される技術が挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書中に記載した融合タンパク質は、セリンプロテアーゼなどの標的の局在性及び／又は定量化に関連する分野において公知の方法において使用され得る（例えば、適切な生理学的サンプル内のそれらの標的のレベルの測定に使用するため、診断方法において使用するため、上記タンパク質の画像化に使用するためなど）。本明細書中に互換的に使用される「生理学的サンプル」及び「生物学的サンプル」という用語は、対象から分離された組織、細胞、及び生体液、並びに対象体内に存在していた組織、細胞、及び体液を含むことを意図する。そのため、「生理学的サンプル」及び「生物学的サンプル」という用語の語法の中に含まれるのは、血液、及び血清、血漿又はリンパを含めた血液の画分又は成分である。

所定の実施形態において、標的結合ドメインを含めた、所定の標的、又はその誘導体、断片、アナログ若しくはホモログに対して特異的な融合タンパク質が、薬理学的に活性な化合物（以下、本明細書中で「治療薬」と呼ばれる）として利用される。

本発明の融合タンパク質は、イムノアフィニティー、クロマトグラフィー又は免疫沈降などの標準的な技術を使用して特定の標的を単離するために使用され得る。検出は、その融合タンパク質を検出可能な物質にカップリングする（すなわち、物理的に結合する）ことによって促され得る。検出可能な物質の例としては、種々の酵素、補欠分子族、蛍光材料、発光材料、生体発光材料、及び放射性材料が挙げられる。適切な酵素の例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、又はアセチルコリンエステラーゼが挙げられ；適切な補欠分子族複合体の例としては、ストレプトアビジン／ビオチン及びアビジン／ビオチンが挙げられ；適切な蛍光材料の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド又はフィコエリスリンが挙げられ；発光材料の例としては、ルミノールが挙げられ；生体発光材料の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、及びエクオリンが挙げられ、そして適切な放射性材料の例としては、¹²⁵Ｉ、¹³¹Ｉ、³⁵Ｓ又は³Ｈが挙げられる。

本発明の融合タンパク質の治療有効量は、一般に、治療対象を達成するのに必要とされる量に関連する。上に記載されるように、これは、特定の場合において、上記標的の機能することを妨害する、融合タンパク質とその標的との間の結合相互作用であり得る。さらに、投与されるのに必要とされる量は、その特定の標的に対する上記融合タンパク質の結合親和性に依存し、そしてその量はまた、投与される融合タンパク質がその抗体が投与される他の対象の自由体積（ｆｒｅｅ ｖｏｌｕｍｅ）から枯渇する速度に依存する。本発明の融合タンパク質又はその断片の治療的に有効な投薬のための一般的な範囲は、約０．１ｍｇ／ｋｇ体重〜約２５０ｍｇ／ｋｇ体重であり得るが、これに限定されない。一般的な投薬頻度は、例えば、１日２回〜月に１回の範囲であり得る。

融合タンパク質断片が使用される場合、標的に特異的に結合する最も小さい阻害性断片が、好ましい。例えば、上記標的を結合する能力を保持するペプチド分子が、設計され得る。このようなペプチドは、化学的に合成され得るか、そして／又は組換えＤＮＡ技術によって産生され得る。（例えば、Marasco et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7889-7893 (1993)を参照のこと）。処方物はまた、処置される特定の適応に必要であるような１種より多い活性化合物（好ましくは、互いに不利に影響しない補完的な活性を有する化合物）を含み得る。代替的か、又はそれに加えて、上記組成物は、その機能を増強する薬剤（例えば、細胞傷害性薬剤、サイトカイン、化学療法剤、増殖阻害剤、抗炎症剤又は抗感染症剤など）を含み得る。このような分子は、意図される目的に対して有効である量で、組み合わせにおいて安定に存在する。

上記活性成分はまた、例えば、コアセルベーション技術、又は界面重合によって調製されるマイクロカプセル中に捕捉され得、そのマイクロカプセルは、例えば、コロイド状薬物送達システム（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルション、ナノ粒子、及びナノカプセル）又はマクロエマルションにおいて、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロース−マイクロカプセル又はゼラチン−マイクロカプセル、及びポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセル）である。

インビボ投与のために使用される処方物は、無菌でなければならない。これは、滅菌濾過膜を通した濾過によって容易に達成される。

持続放出調製物が、調製され得る。持続放出調製物の適切な例としては、上記融合タンパク質を含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが挙げられ、そのマトリックスは、成形された物品の形態（例えば、フィルム、又はマイクロカプセル）である。持続放出マトリックスの例としては、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、又はポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸とγエチル−Ｌ−グルタメートとのコポリマー、非分解性のエチレン−ビニルアセテート、分解性の乳酸−グリコール酸コポリマー（例えば、ＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴＴＭ（乳酸−グリコール酸コポリマー及び酢酸ロイプロリドから構成される注射可能なマイクロスフェア））、及びポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。エチレン−ビニルアセテート及び乳酸−グリコール酸などのポリマーが、１００日間以上にわたって分子の放出を可能にする一方で、特定のヒドロゲルは、より短い期間にわたってタンパク質を放出する。
医薬組成物

本発明の融合タンパク質又は可溶性キメラポリペプチド（本明細書中で「活性化合物」とも称される）、並びにその誘導体、フラグメント、アナログ及びホモログは、投与に適した医薬組成物中に組み込まれ得る。このような組成物は、代表的に、上記融合タンパク質及び医薬的に受容可能な担体を含む。本明細書中で使用される場合、用語「医薬的に受容可能な担体」は、医薬投与に適合性である、任意、且つ、全ての溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌剤及び抗真菌剤、等張化剤及び吸収遅延剤などを含むことが意図される。適切な担体は、Remington's Pharmaceutical Sciences（当該分野における標準的な参考の教科書）の最新版（本明細書中に参考として援用される）に記載される。このような担体又は希釈剤の好ましい例としては、水、食塩水、リンガー液、デキストロース溶液、及び５％ヒト血清アルブミンが挙げられるが、これらに限定されない。リポソーム及び非水性ビヒクル（例えば、固定油）もまた、使用され得る。医薬的に活性な物質のためのこのような媒体及び薬剤の使用は、当該分野において周知である。任意の従来の媒体又は薬剤が上記活性化合物と不適合である限りを除いて、上記組成物におけるその使用が企図される。補足の活性化合物もまた、上記組成物中に組み込まれ得る。

本発明の医薬組成物は、その意図された投与経路に適合するように処方され得る。投与経路の例としては、非経口投与（例えば、静脈内投与、皮内投与、皮下投与）、経口投与（例えば、吸入）、経皮投与（すなわち、局所投与）、経粘膜投与、及び直腸投与が挙げられる。非経口適用、皮内適用、又は皮下適用のために使用される溶液又は懸濁液は、以下の成分を含み得る：無菌の希釈剤（例えば、注射用水、食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール又は他の合成の溶液）；抗菌剤（例えば、ベンジルアルコール又はメチルパラベン）；抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸又は亜硫酸水素ナトリウム）；キレート剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ））；緩衝剤（例えば、酢酸塩、クエン酸塩又はリン酸塩）及び張度の調整のための薬剤（例えば、塩化ナトリウム又はデキストロース）。ｐＨは、酸又は塩基（例えば、塩酸又は水酸化ナトリウム）を用いて調整され得る。非経口調製物は、ガラス製若しくはプラスチック製のアンプル、使い捨て可能な注射器又は複数用量バイアルに入れられ得る。

注射可能な用途に適した医薬組成物としては、無菌の水溶液（水溶性である）又は分散物、及び無菌の注射可能な溶液又は分散物の即時調製のための無菌の粉末が挙げられる。静脈内投与について、適切な担体は、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ（商標）（BASF,Parsippany,N.J.）又はリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）を含む。全ての場合において、上記組成物は、無菌でなければならず、そしてその組成物は、容易な注射器通過性（syringeability）が存在する限りは流体であるはずである。それは、製造及び保管の条件下において安定でなければならず、そして微生物（例えば、細菌及び真菌）の汚染作用に対して保護されなければならない。上記担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、及びそれらの適切な混合物を含む溶媒又は分散媒であり得る。適切な流動率は、例えば、コーティング剤（例えば、レシチン）の使用、必要とされる粒径の維持（分散物の場合）、及び界面活性剤の使用によって維持され得る。微生物の作用の予防は、種々の抗菌剤及び抗真菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなど）によって達成され得る。多くの場合において、組成物中に等張化剤（例えば、糖類、ポリアルコール（例えば、マンニトール）、ソルビトール、塩化ナトリウム）を含むことが、好ましい。注射可能な組成物の延長した吸収は、その組成物中に吸収を遅延させる薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチン）を含めることによってもたらされ得る。

無菌の注射可能な溶液は、必要とされる量で活性化合物を、上に列挙される成分の１つ又はその組み合わせと一緒に適切な溶媒中に取り込み、必要とされる場合、次いで濾過滅菌することによって調製され得る。一般に、分散物は、基礎の分散媒及び上に列挙されるものからの必要とされる他の成分を含む無菌のビヒクル中に上記活性化合物を取り込むことによって調製される。無菌の注射可能な溶液を調製するための無菌の粉末の場合において、調製の方法は、活性成分に任意のさらなる所望の成分を加えた粉末を、その予め濾過滅菌した溶液から生じる、真空乾燥及び凍結乾燥である。

経口組成物は、一般に、不活性な希釈剤又は食用担体を含む。それらは、ゼラチンカプセル中に封入され得るか、又は錠剤へと圧縮され得る。経口の治療的投与の目的のために、上記活性化合物は、賦形剤と一緒に組み込まれ得、そして錠剤、トローチ剤、又はカプセル剤の形態で使用され得る。経口組成物はまた、含そう剤として使用するための流体担体を使用して調製され得、その流体担体中の化合物は、経口的に適用され、そしてスウィッシュ（swish）されて、吐き出されるか、又は嚥下される。医薬的に適合性の結合剤及び／又はアジュバント材料が、上記組成物の一部として含まれ得る。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤などは、任意の以下の成分、又は同様の性質の化合物を含み得る：バインダー（例えば、微結晶性セルロース、トラガカントゴム又はゼラチン）；賦形剤（例えば、デンプン又は乳糖）、崩壊剤（例えば、アルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ、又はトウモロコシデンプン）；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム又はＳｔｅｒｏｔｅｓ；流動促進剤（glidant）（例えば、コロイド状二酸化ケイ素）；甘味剤（例えば、スクロース又はサッカリン）；又は香味剤（例えば、ペパーミント、メチルサリチレート、又はオレンジ香味料）。

吸入による投与について、化合物は、適切な噴霧剤（例えば、二酸化炭素などの気体）を含む加圧された容器若しくはディスペンサー、又は噴霧器からエアロゾルスプレーの形態で送達される。

全身投与はまた、経粘膜手段又は経皮手段によるものであり得る。経粘膜投与又は経皮投与に関して、透過されるべき障壁に適切な浸透剤が、上記処方物において使用される。このような浸透剤は、一般に、当該分野において公知であり、そしてその浸透剤としては、例えば、経粘膜投与については、洗浄剤、胆汁酸塩、及びフシジン酸誘導体が挙げられる。経粘膜投与は、鼻腔用スプレー又は坐剤の使用によって達成され得る。経皮投与に関して、上記活性化合物は、一般に、当該分野において公知であるような、軟膏（ointment）、軟膏（salve）、ゲル、又はクリーム中に処方される。

上記化合物はまた、直腸送達のために坐剤（例えば、従来の坐剤の基剤（例えば、カカオ脂及び他のグリセリド）を用いる）又は保留浣腸の形態で調製され得る。

１つの実施形態において、上記活性化合物は、その化合物を、身体からの迅速な排泄に対して保護する担体を用いて調製される（例えば、インプラント及びマイクロカプセル化した送達システムを含む制御放出処方物）。生分解性の、生体適合性ポリマーが、使用され得る。このような処方物の調製のための方法は、当業者にとって明らかである。その材料はまた、Alza Corporation及びNova Pharmaceuticals,Incから市販され得る。リポソーム懸濁物（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体によって感染症細胞を標的化するリポソームが挙げられる）もまた、医薬的に受容可能な担体として使用され得る。これらは、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号に記載されるような、当業者に公知である方法に従って調製され得る。

経口組成物又は非経口組成物を投与の容易さ及び投薬の均一性のために投薬単位形態で処方するとこは、特に有益である。本明細書中で使用されるような投薬単位形態とは、処置される対象に対する統一された投薬として適した物理的に別個の単位をいう；必要とされる医薬担体と共同して所望の治療効果をもたらすために算出される所定の量の活性化合物を含む各単位。本発明の投薬単位形態についての明細は、上記活性化合物の独特な特徴及び達成されるべき特定の治療効果、並びに個体の処置のためにこのような活性化合物を調合する分野における固有の制限によって決定付けられる。

上記医薬組成物は、投与のための指示書と一緒に容器、パック、又はディスペンサー中に含まれ得る。

本発明は、以下の実施例においてさらに記載され、特許請求の範囲において記載される本発明の範囲を限定しない。

実施例１：ＡＡＴ−Ｆｃ融合タンパク質と変異型
代表的ではあるが、制限されることのない本発明によるＡＡＴ−Ｆｃ融合タンパク質の例には以下の配列が含まれる。これらの例はヒンジ配列及び／又はリンカー配列を含んでいるが、本発明の融合タンパク質は、長さ及び／又は柔軟性の点で好適な任意のヒンジ配列及び／又はリンカー配列を使用して作製できる。あるいは、融合タンパク質は、ヒンジ及び／又はリンカー配列を使用せずに作製できる。例えば、ポリペプチド成分を直接結合することができる。

代表的なＡＡＴ−Ｆｃ融合タンパク質は、本明細書中に記載したＡＡＴ−ｈＦｃ１（ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ）である。以下に示すように、融合タンパク質のＡＡＴポリペプチド部分に下線を引き（配列番号２）、そして、融合タンパク質のＩｇＧ−Ｆｃポリペプチド部分をイタリック体にした（配列番号３）。
ＡＡＴ−ｈＦｃ１（ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ）

代表的なＡＡＴ−Ｆｃ融合タンパク質は、本明細書中に記載したＡＡＴ−ｈＦｃ２（ヒトＩｇＧ２ Ｆｃ）である。以下に示すように、融合タンパク質のＡＡＴポリペプチド部分に下線を引き（配列番号２）、そして、融合タンパク質のＩｇＧ−Ｆｃポリペプチド部分をイタリック体にした（配列番号４）。
ＡＡＴ−ｈＦｃ２（ヒトＩｇＧ２ Ｆｃ）

代表的なＡＡＴ−Ｆｃ融合タンパク質は、本明細書中に記載したＡＡＴ−ＭＭ−ＥＬ−ｈＦｃ１（ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ、Ｍｅｔ３５１Ｇｌｕ／Ｍｅｔ３５８Ｌｅｕ）である。以下に示すように、融合タンパク質のＡＡＴポリペプチド部分に下線を引き（配列番号３４）、融合タンパク質のＩｇＧ−Ｆｃポリペプチド部分をイタリック体にし（配列番号３）、Ｍｅｔ３５１Ｇｌｕ突然変異を四角で囲み、そして、Ｍｅｔ３５８Ｌｅｕ突然変異に灰色で陰影をつけた。
ＡＡＴ−ＭＭ−ＥＬ−ｈＦｃ１（ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ、Ｍｅｔ３５１Ｇｌｕ／Ｍｅｔ３５８Ｌｅｕ）

代表的なＡＡＴ−Ｆｃ融合タンパク質は、本明細書中に記載したＡＡＴ−ＭＭ−ＥＬ−ｈＦｃ２（ヒトＩｇＧ２ Ｆｃ、Ｍｅｔ３５１Ｇｌｕ／Ｍｅｔ３５８Ｌｅｕ）である。以下に示すように、融合タンパク質のＡＡＴポリペプチド部分に下線を引き（配列番号３４）、融合タンパク質のＩｇＧ−Ｆｃポリペプチド部分をイタリック体にし（配列番号４）、Ｍｅｔ３５１Ｇｌｕ突然変異を四角で囲み、そして、Ｍｅｔ３５８Ｌｅｕ突然変異に灰色で陰影をつけた。
ＡＡＴ−ＭＭ−ＥＬ−ｈＦｃ２（ヒトＩｇＧ２ Ｆｃ、Ｍｅｔ３５１Ｇｌｕ／Ｍｅｔ３５８Ｌｅｕ）

代表的なＡＡＴ−Ｆｃ融合タンパク質は、本明細書中に記載したＡＡＴ−ＭＭ−ＬＬ−ｈＦｃ１（ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ、Ｍｅｔ３５１Ｌｅｕ／Ｍｅｔ３５８Ｌｅｕ）である。以下に示すように、融合タンパク質のＡＡＴポリペプチド部分に下線を引き（配列番号３５）、融合タンパク質のＩｇＧ−Ｆｃポリペプチド部分をイタリック体にし（配列番号３）、Ｍｅｔ３５１Ｌｅｕ突然変異に黒色で陰影をつけ、そして、Ｍｅｔ３５８Ｌｅｕ突然変異に灰色で陰影をつけた。
ＡＡＴ−ＭＭ−ＬＬ−ｈＦｃ１（ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ、Ｍｅｔ３５１Ｌｅｕ／Ｍｅｔ３５８Ｌｅｕ）

代表的なＡＡＴ−Ｆｃ融合タンパク質は、本明細書中に記載したＡＡＴ−ＭＭ：ＬＬ−ｈＦｃ２（ヒトＩｇＧ２ Ｆｃ、Ｍｅｔ３５１Ｌｅｕ／Ｍｅｔ３５８Ｌｅｕ）である。以下に示すように、融合タンパク質のＡＡＴポリペプチド部分に下線を引き（配列番号３５）、融合タンパク質のＩｇＧ−Ｆｃポリペプチド部分をイタリック体にし（配列番号４）、Ｍｅｔ３５１Ｌｅｕ突然変異に黒色で陰影をつけ、そして、Ｍｅｔ３５８Ｌｅｕ突然変異に灰色で陰影をつけた。
ＡＡＴ−ＭＭ：ＬＬ−ｈＦｃ２（ヒトＩｇＧ２ Ｆｃ、Ｍｅｔ３５１Ｌｅｕ／Ｍｅｔ３５８Ｌｅｕ）

代表的なＡＡＴ−Ｆｃ融合タンパク質は、本明細書中に記載したＡＡＴ−ｈＦｃ１−ＡＡＴ（ヒトＩｇＧ１）である。以下に示すように、融合タンパク質のＡＡＴポリペプチド部分に下線を引き（配列番号２）、融合タンパク質のＩｇＧ−Ｆｃポリペプチド部分をイタリック体にした（配列番号３）。
ＡＡＴ−ｈＦｃ１−ＡＡＴ（ヒトＩｇＧ１）

これらの代表的なＡＡＴ−Ｆｃ融合タンパク質を、以下の技術を使用して作製した。

ヒトＡＡＴをコードする遺伝子を、ヒト肝臓ｃＤＮＡ（Zyagen）からＰＣＲ増幅した。ＡＡＴ又はＦｃ領域をコードする遺伝子内の特異的点突然変異を、オーバーラップＰＣＲによって作り出した。ＡＡＴコード遺伝子を、ヒンジ領域をコードする遺伝子を有するフレーム内にクローニングし、それに続いて、ＡＡＴ遺伝子挿入部位の上流に哺乳動物分泌シグナル配列を含んでいる哺乳動物発現ベクター内にヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、又はＩｇＭのＣＨ２ドメイン、そして、ＣＨ３ドメインをクローニングした。これらの発現ベクターを、哺乳動物細胞（具体的には、ＨＥＫ２９３又はＣＨＯ細胞）内にトランスフェクトし、３７℃にて８％のＣＯ₂中で数日間培養した。遺伝子組み換えＡＡＴ−Ｆｃ融合タンパク質を、発現細胞上清からプロテインＡクロマトグラフィーによって精製した。重要なことに、中性ｐＨ付近のバッファーを、プロテインＡ樹脂からＡＡＴ−Ｆｃ融合タンパク質を溶出するのに使用した（Ｇｅｎｔｌｅ Ａｇ／Ａｂ Ｅｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ、Thermo Scientific）。おそらくＡＡＴの低ｐＨ媒介性オリゴマー化のため、ＮＥを阻害するＡＡＴの能力が低ｐＨ処理後に低下するので、ＡＡＴ−Ｆｃ融合タンパク質は、標準的な低ｐＨ溶出を使用してプロテインＡ樹脂から溶出できない。図１Ｆは、好中球エラスターゼを阻害するＡＡＴの能力に対する低ｐＨ溶出の影響を示している。ＡＡＴ−Ｆｃ融合タンパク質は、プロテインＡと中性ｐＨ付近の溶出バッファーによるか、又はＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（登録商標）Ａｌｐｈａ−１ Ａｎｔｉｔｒｙｐｓｉｎアフィニティーマトリックス（BAC BV）によって精製される。

精製したＡＡＴ−Ｆｃ融合タンパク質を、好中球エラスターゼ（ＮＥ）を阻害するそれらの能力を測定することによって活性について試験した。図１Ｂ及び１Ｄは、精製した血清由来ＡＡＴ（ｓｄＡＡＴ）及びＡＡＴ−Ｆｃ融合タンパク質（図１Ｂ−レーン１：ｓｄＡＡＴ、レーン２：ＡＡＴ−Ｆｃ（配列番号１６）、レーン３：ＡＡＴ−ＥＬ−Ｆｃ（配列番号１８）、図１Ｄ ＡＡＴ−Ｆｃ−ＡＡＴ（配列番号２０）の還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示している。タンパク質を、クマシーブルーで染色することによって可視化した。

ヒト好中球エラスターゼ（ＮＥ）活性を観察するために、蛍光ミクロプレートアッセイを使用した。阻害活性を、以下のアッセイを使用した残留ＮＥ活性の同時に起こる減少によって評価した。このアッセイバッファーは、１００ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ７．４、５００ｍＭのＮａＣｌ、及び０．０００５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で構成されている。ヒトＮＥを、５ｎＭ（しかし、１〜２０ｎＭでも使用できる）の終濃度で使用する。アッセイでは、蛍光ペプチド基質ＡＡＶＰ−ＡＭＣを１００μΜの終濃度で使用する。Molecular Devices製のＧｅｍｉｎｉ ＥＭプレートリーダを使用して、それぞれ３７０ｎｍ及び４４０ｎｍの励起及び発光波長、及び４２０ｎｍのカットオフを使用してアッセイ動態を読みとった。アッセイを、室温にて１０分間読みとり、そして、５〜１０秒毎にスキャンした。毎秒のＶｍａｘは残留ＮＥ活性に相当し、そしてそれを阻害物質の各濃度に対してプロットした。Ｘ軸との切片は、アッセイにおいて開始濃度のＮＥを完全に不活化するのに必要である阻害物質の濃度を示している。これらのアッセイにおいて、ヒト血清由来ＡＡＴ（ｓｄＡＡＴ）を、正の対照として使用した。ＡＡＴ−Ｆｃ融合タンパク質は、図１Ｃに示されるように、強力なＮＥ阻害活性を示す。１つのＦｃポリペプチドに２つのＡＡＴポリペプチドが存在する融合物（ＡＡＴ−Ｆｃ−ＡＡＴ）は、１つのＡＡＴポリペプチドを含むｓｄＡＡＴ及びＡＡＴ−Ｆｃ融合タンパク質の両方を超える高い効力を示す（図１Ｅ）。ここに提示したこれらの知見は、ＡＡＴがＦｃ領域に融合でき、且つ、ＮＥを阻害するその能力を維持できることを初めて実証する。特に興味深いことに、ＡＡＴ−Ｆｃ−ＡＡＴ融合タンパク質が、より強力なＮＥ阻害物質であることがわかった。

図１Ｆは、酸化による不活性化に対するＡＡＴ−ＥＬ−Ｆｃ（Ｍ３５１Ｅ、Ｍ３５８Ｌ）融合タンパク質の抵抗性を実証している。ＡＡＴ融合タンパク質、ＡＡＴ−Ｆｃ（ｗｔ）、ＡＡＴ−ＥＬ−Ｆｃ（Ｍ３５１Ｅ、Ｍ３５８Ｌ）、及びＡＡＴ−ＥＭ−Ｆｃ（Ｍ３５１Ｅ）を、３３ｍＭのＨ₂Ｏ₂で処理し、ＮＥ阻害アッセイにおいて未処理の融合タンパク質と比較した。ＡＡＴ−ＥＬ−ＦｃによるＮＥの阻害は、酸化によって構成されることなく、試験した他のタンパク質と逆であった。

さらに、血清由来ＡＡＴと比較して、ＡＡＴ−Ｆｃ融合タンパク質はラットにおいてより長い血清中半減期を示した（図１Ｈ）。これらの試験では、それぞれの試験タンパク質あたり３匹のラットに、１０ｍｇ／ｋｇのｓｄＡＡＴ又はＡＡＴ−ＦｃをＩ．Ｖ．に注射した。血清サンプルを４８時間の期間にわたって様々な時点で採取した。血清ＡＴＴ濃度にはＥＬＩＳＡを使用した。これらの知見は、本発明の融合タンパク質が、多くのヒト炎症状及び感染症を処置するための、薬物動力学的特性を改善し、且つ、血清由来ＡＡＴを超える優れた治療学的フォーマットであることを実証している。
実施例２：ＡＡＴ−ＴＮＦα標的分子融合タンパク質

本明細書中に示した試験は、抗ＴＮＦα抗体又はＴＮＦα受容体の誘導体に融合されたヒトＡＡＴを含めた遺伝子組み換えＡＡＴ誘導体のいくつもの制限されることのない例を記載している。これらの例を以下に提供して、本発明の様々な特徴を更に例示している。実施例はまた、本発明を実施するために有用な方法論も例示している。これらの実施例は、請求の範囲に記載した本発明を限定するものではなく、そして、限定することを意図したものでもない。

以下の融合タンパク質は、（ｉ）抗ＴＮＦα抗体Ｄ２Ｅ７（Ａｄａｌｉｍｕｍａｂ又はＨｕｍｉｒａ（登録商標）としても知られている）又は（ｉｉ）２型ＴＮＦα受容体（ＴＮＦＲ２−ＥＣＤ）の細胞外ドメイン、からの又はそれらに由来するサイトカイン標的ポリペプチド配列を含んでいる。融合タンパク質のＡＡＴポリペプチド部分には下線を引き、抗体定常領域（ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３、又はＣＬ）をイタリック体にし、そして、Ｄ２Ｅ７−ＶＨ、Ｄ２Ｅ７−ＶＫ、及びＴＮＦＲ２−ＥＣＤを太字で表示した。これらの実施例がヒンジ配列及び／又はリンカー配列を含んでいるのに対して、本発明の融合タンパク質は、長さ及び／又は柔軟性が好適な任意のヒンジ配列及び／又はリンカー配列を使用して作製できる。あるいは、融合タンパク質は、ヒンジ及び／又はリンカー配列を使用しなくても作製できる。

代表的なＡＡＴ−ＴＮＦα融合タンパク質は、本明細書中に記載したＤ２Ｅ７−軽鎖−ＡＡＴ（Ｇ₃Ｓ）₂リンカーである。以下に示すように、融合タンパク質のＡＡＴポリペプチド部分に下線を引き（配列番号２）、Ｄ２Ｅ７−ＶＫを太字で表示し（配列番号３７）、そして、抗体定常領域をイタリック体にした（配列番号３８）。
Ｄ２Ｅ７−軽鎖−ＡＡＴ（Ｇ₃Ｓ）₂リンカー

代表的なＡＡＴ−ＴＮＦα融合タンパク質は、本明細書中に記載したＤ２Ｅ７−軽鎖−ＡＡＴ ＡＳＴＧＳリンカーである。以下に示すように、融合タンパク質のＡＡＴポリペプチド部分に下線を引き（配列番号２）、Ｄ２Ｅ７−ＶＫを太字で表示し（配列番号３７）、そして、抗体定常領域をイタリック体にした（配列番号３８）。
Ｄ２Ｅ７−軽鎖−ＡＡＴ ＡＳＴＧＳリンカー

代表的なＡＡＴ−ＴＮＦα融合タンパク質は、本明細書中に記載したＤ２Ｅ７−重鎖−−ＡＡＴ（Ｇ₃Ｓ）₂リンカーである。以下に示すように、融合タンパク質のＡＡＴポリペプチド部分に下線を引き（配列番号２）、Ｄ２Ｅ７−ＶＨを太字で表示し（配列番号３９）、そして、抗体定常領域をイタリック体にした（配列番号４０）。
Ｄ２Ｅ７−重鎖−ＡＡＴ（Ｇ₃Ｓ）₂リンカー

代表的なＡＡＴ−ＴＮＦα融合タンパク質は、本明細書中に記載したＤ２Ｅ７−重鎖−−ＡＡＴ ＡＳＴＧＳリンカーである。以下に示すように、融合タンパク質のＡＡＴポリペプチド部分に下線を引き（配列番号２）、Ｄ２Ｅ７−ＶＨを太字で表示し（配列番号３９）、そして、抗体定常領域をイタリック体にした（配列番号４０）。
Ｄ２Ｅ７−重鎖−ＡＡＴ ＡＳＴＧＳリンカー

代表的なＡＡＴ−ＴＮＦα融合タンパク質は、本明細書中に記載したＴＮＦＲ２−ＥＣＤ−Ｆｃ１−ＡＡＴ（Ｇ₃Ｓ）₂リンカーである。以下に示すように、融合タンパク質のＡＡＴポリペプチド部分に下線を引き（配列番号２）、ＴＮＦＲ２−ＥＣＤを太字で表示し（配列番号４１）、そして、抗体定常領域をイタリック体にした（配列番号４２）。
ＴＮＦＲ２−ＥＣＤ−Ｆｃ１−ＡＡＴ（Ｇ₃Ｓ）₂リンカー

代表的なＡＡＴ−ＴＮＦα融合タンパク質は、本明細書中に記載したＴＮＦＲ２−ＥＣＤ−Ｆｃ１−ＡＡＴ ＡＳＴＧＳリンカーである。以下に示すように、融合タンパク質のＡＡＴポリペプチド部分に下線を引き（配列番号２）、ＴＮＦＲ２−ＥＣＤを太字で表示し（配列番号４１）、そして、抗体定常領域をイタリック体にした（配列番号４２）。
ＴＮＦＲ２−ＥＣＤ−Ｆｃ１−ＡＡＴ ＡＳＴＧＳリンカー

これらの代表的なＡＡＴ−ＴＮＦα標的分子融合タンパク質を、以下の技術を使用して作製した。

抗ＴＮＦα抗体（Ｄ２Ｅ７）の可変重（ＶＨ）領域及び可変κ（ＶＫ）領域をコードする遺伝子を、遺伝子合成で作り出した。Ｄ２Ｅ７−ＶＨ遺伝子を、ＶＨドメイン挿入部位の上流に哺乳動物分泌シグナル配列を含んでいる哺乳動物発現ベクター内にＣＨ１ドメイン、ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインから成るヒトＩｇＧ１抗体重鎖定常領域をコードする遺伝子を伴ったフレーム内にクローニングした（Ｄ２Ｅ７−ＨＣ）。Ｄ２Ｅ７−ＶＫ遺伝子を、ＶＫドメイン挿入部位の上流に哺乳動物分泌シグナル配列を含んでいる哺乳動物発現ベクター内のヒト抗体κ軽鎖定常（ＣＬ）ドメインを伴ったフレーム内にクローニングした（Ｄ２Ｅ７−ＬＣ）。ＡＡＴコード遺伝子及び隣接５’リンカー配列を、先に記載した哺乳動物発現ベクター内のＤ２Ｅ７重鎖遺伝子（Ｄ２Ｅ７−ＨＣ−ＡＡＴ）のＣＨ３ドメイン又はＤ２Ｅ７軽鎖遺伝子（Ｄ２Ｅ７−ＬＣ−ＡＡＴ）のＣＬドメインのいずれかのコード配列の３’末端のフレーム内にクローニングした。ＴＮＦα受容体２（ＴＮＦＲ２−ＥＣＤ）の細胞外ドメインを、遺伝子合成によって作り出し、そして、ＴＮＦＲ２−ＥＣＤ挿入部位の上流に哺乳動物分泌シグナル配列を含んでいる哺乳動物発現ベクター内のヒンジ領域をコードする遺伝子を伴ったフレーム内にクローニングし、それに続いて、ヒトＩｇＧ１（ｈＦｃ１）のＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインをクローニングした。ＡＡＴコード遺伝子及び隣接５’リンカー配列を、哺乳動物発現ベクター内のＴＮＦＲ２−ＥＣＤ−ｈＦｃ１をコードする遺伝子の３’末端のフレーム内にクローニングした（ＴＮＦＲ２−ＥＣＤ−ｈＦｃ１−ＡＡＴ）。

Ｄ２Ｅ７−ＨＣ−ＡＡＴ発現ベクターを、哺乳動物細胞（具体的には、ＨＥＫ２９３又はＣＨＯ細胞）内にＤ２Ｅ７−ＬＣ又はＤ２Ｅ７−ＬＣ−ＡＡＴ発現ベクターのいずれかと同時にトランスフェクトして、それぞれ重鎖のＣ末端又は重鎖と軽鎖の両方のＣ末端に融合したＡＡＴを有するＤ２Ｅ７抗体を作り出した。Ｄ２Ｅ７−ＬＣ−ＡＡＴを、哺乳動物細胞内にＤ２Ｅ７−ＨＣ発現ベクターと同時にトランスフェクトして、軽鎖のＣ末端に融合したＡＡＴを有するＤ２Ｅ７抗体を作り出した。ＴＮＦＲ２−ｈＦｃ１−ＡＡＴ発現ベクターを、哺乳動物細胞内にトランスフェクトした。トランスフェクト細胞を、３７℃にて８％のＣＯ₂中で数日間培養した。

遺伝子組み換えＡＡＴ−ＴＮＦα標的融合タンパク質を、発現細胞上清からプロテインＡクロマトグラフィーによって精製した。中性ｐＨ付近のバッファーを、プロテインＡ樹脂からＡＡＴ−ＴＮＦα標的融合タンパク質を溶出するのに使用した（Ｇｅｎｔｌｅ Ａｇ／Ａｂ Ｅｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ、Thermo Scientific）。

図２Ｂは、Ｄ２Ｅ７抗体単独（レーン１）、及びＡＡＴがＤ２Ｅ７の重鎖に融合されている変異型（レーン２）のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。タンパク質を、クマシーブルーで染色することによって可視化した。

精製したＡＡＴ−ＴＮＦα標的分子融合タンパク質を、好中球エラスターゼを阻害するそれらの能力を測定することによって、活性について試験した。これらのアッセイにおいて、ヒト血清由来ＡＡＴ（ｓｄＡＡＴ）を正の対照として使用した。ＮＥ阻害アッセイを、先に記載したように実施した。図２Ｃは、ｓｄＡＡＴと比較して、ＡＡＴ−ＴＮＦα標的分子融合タンパク質が同様の好中球エラスターゼ阻害を示すことを実証し、ＡＡＴの阻害能力は、抗体とそれが融合することによって支障をきたさないことを示唆している。
実施例３：ＡＡＴ−Ｆｃ−ＳＬＰＩ及びＡＡＴ−Ｆｃ−Ｅｌａｆｉｎ

本明細書中に示した試験は、ＷＡＰドメイン含有タンパク質を融合したヒトＡＡＴを含めた遺伝子組み換えＡＡＴ誘導体のいくつもの制限されることのない例を記載している。これらの例を以下に提供して、本発明の様々な特徴を更に例示している。実施例はまた、本発明を実施するために有用な方法論も例示している。融合タンパク質のＡＡＴポリペプチド部分に下線を引き、Ｆｃ部分をイタリック体にし、そして、ＷＡＰドメイン含有ポリペプチドを太字フォントにした。これらの実施例がヒンジ配列及び／又はリンカー配列を含んでいるのに対して、本発明の融合タンパク質は、長さ及び／又は柔軟性が好適な任意のヒンジ配列及び／又はリンカー配列を使用して作製できる。あるいは、融合タンパク質は、ヒンジ及び／又はリンカー配列を使用しなくても作製できる。例えば、ポリペプチド成分を、直接結合できる。

代表的なＡＡＴ−Ｆｃ−ＳＬＰＩ融合タンパク質は、本明細書中に記載したＡＡＴ−ｈＦｃ１ＳＬＰＩである（ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ）。以下に示すように、融合タンパク質のＡＡＴポリペプチド部分に下線を引き（配列番号２）、Ｆｃ部分をイタリック体にし（配列番号３）、そして、ＷＡＰドメイン含有ポリペプチドを太字フォントにした（配列番号９）。
ＡＡＴ−ｈＦｃ１−ＳＬＰＩ（ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ）

代表的なＡＡＴ−Ｆｃ−ＳＬＰＩ融合タンパク質は、本明細書中に記載したＡＡＴ−ｈＦｃ１ＳＬＰＩである（ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ）。以下に示すように、融合タンパク質のＡＡＴポリペプチド部分に下線を引き（配列番号２）、Ｆｃ部分をイタリック体にし（配列番号３）、そして、ＷＡＰドメイン含有ポリペプチドを太字フォントにした（配列番号１２）。
ＡＡＴ−ｈＦｃ１−エラフィン（ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ）

ＳＬＰＩとＥｌａｆｉｎをコードした遺伝子を、ヒト脾臓ｃＤＮＡ（Zyagen）からＰＣＲ増幅した。これらの遺伝子を、ＳＬＰＩ又はＥｌａｆｉｎの遺伝子をＡＡＴ−Ｆｃ遺伝子を有するフレーム内に挿入した実施例１の哺乳動物発現ベクター内にクローニングした。これらの発現ベクターを、哺乳動物細胞（具体的には、ＨＥＫ２９３又はＣＨＯ細胞）内にトランスフェクトし、３７℃にて８％のＣＯ₂中で数日間培養した。遺伝子組み換えＡＡＴ−Ｆｃ−ＷＡＰドメイン融合タンパク質を、発現細胞上清からプロテインＡクロマトグラフィーによって精製した。中性ｐＨ付近のバッファーを、プロテインＡ樹脂からＡＡＴ−Ｆｃ−ＷＡＰドメイン融合タンパク質を溶出するのに使用した（Ｇｅｎｔｌｅ Ａｇ／Ａｂ Ｅｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ、Thermo Scientific）。

図３Ｂは、ＡＡＴ−Ｆｃ−ＷＡＰ融合タンパク質（レーン１：ＡＡＴ−Ｆｃ−Ｅｌａｆｉｎ、レーン２：ＡＡＴ−Ｆｃ−ＳＬＰＩ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。タンパク質を、クマシーブルーで染色することによって可視化した。精製したＡＡＴ−Ｆｃ−ＷＡＰドメイン融合タンパク質を、好中球エラスターゼを阻害するそれらの能力を測定することによって活性について試験した。ＮＥ阻害アッセイを、先に記載したように実施した。これらのアッセイにおいて、ヒト血清由来ＡＡＴ（ｓｄＡＡＴ）及びＡＡＴ−Ｆｃ融合タンパク質を、正の対照として使用した。ｓｄＡＡＴと比較して、ＡＡＴ−Ｆｃ−ＷＡＰ標的分子融合タンパク質は、好中球エラスターゼのＮＥ阻害の高い能力を示した（図３Ｃ）。
実施例４：ＡＡＴ−アルブミン

本明細書中に示した試験は、アルブミンポリペプチドを融合したヒトＡＡＴを含めた遺伝子組み換えＡＡＴ誘導体のいくつもの制限されることのない例を記載している。これらの例を以下に提供して、本発明の様々な特徴を更に例示している。実施例はまた、本発明を実施するために有用な方法論も例示している。これらの実施例は、請求の範囲に記載した本発明を限定するものではなく、そして、限定することを意図したものでもない。ＡＡＴ部分に下線を引き、そして、アルブミン部分をイタリック体にした。例えば、ポリペプチド成分を、直接結合できる。

代表的なＡＡＴアルブミン融合タンパク質は、本明細書中に記載したＡＡＴ−ＨＳＡである。以下に示すように、融合タンパク質のＡＡＴポリペプチド部分に下線を引き（配列番号２）、そして、アルブミンポリペプチドをイタリック体にした（配列番号１４）。
ＡＡＴ−ＨＳＡ

代表的なＡＡＴアルブミン融合タンパク質は、本明細書中に記載したＡＡＴ−ＨＳＡドメイン３である。以下に示すように、融合タンパク質のＡＡＴポリペプチド部分に下線を引き（配列番号２）、そして、アルブミンポリペプチドをイタリック体にした（配列番号１５）。
ＡＡＴ−ＨＳＡドメイン３

ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）をコードする遺伝子を、ヒト肝臓ｃＤＮＡ（Zyagen）からＰＣＲ増幅した。ＨＳＡ又はＨＳＡのドメイン３をコードする遺伝子を、ＡＡＴの上流に哺乳動物分泌シグナル配列を含んでいる、ＡＡＴコード遺伝子の３’末端へとフレーム内にクローニングした哺乳動物発現ベクターを作製した。

これらの発現ベクターを、哺乳動物細胞（具体的には、ＨＥＫ２９３又はＣＨＯ細胞）内にトランスフェクトし、８％のＣＯ₂中で３７℃にて数日間培養した。遺伝子組み換えＡＡＴ−ＨＳＡ融合タンパク質を、結合バッファーが２０ｍＭのＴｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４から成り、そして、溶出バッファーが２０ｍＭのＴｒｉｓ、２ＭのＭｇＣｌ₂、ｐＨ７．４から成る、ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（登録商標）Ａｌｐｈａ−１ Ａｎｔｉｔｒｙｐｓｉｎアフィニティーマトリックス（BAC BV）を使用して発現細胞上清から精製した。

図４Ｂは、ＡＡＴ−ＨＳＡ融合タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。タンパク質を、クマシーブルーで染色することによって可視化した。精製したＡＡＴ−ＨＳＡ融合タンパク質を、好中球エラスターゼを阻害するそれらの能力を測定することによって活性について試験した。ＮＥ阻害アッセイを、先に記載したように実施した。これらのアッセイにおいて、ヒト血清に由来するＡＡＴ（ｓｄＡＡＴ）を、正の対照として使用した。ｓｄＡＡＴと比較して、ＡＡＴ−ＨＳ融合タンパク質が、同様のＮＥ阻害能力を示し、アルブミンへの融合がＮＥを阻害するＡＡＴの能力を抑制しないことを実証した（図４Ｃ）。
他の実施形態

本発明は、その詳細な説明に関連して記載されているが、上述の説明は、例示を目的とし、且つ添付の特許請求の範囲によって規定される本発明の範囲を限定するものではない。他の態様、利点、及び変更は、添付の特許請求の範囲の範囲内である。

Claims (15)

1. 融合タンパク質を精製する方法であって、前記方法が、以下の工程：
   （ａ）前記融合タンパク質の発現を許容する条件下で、前記融合タンパク質をコードする核酸構築物を含む細胞を培養する工程、ここで、前記融合タンパク質は、ヒト免疫グロブリンＦｃポリペプチドに作動できるように連結された、α１アンチトリプシン（ＡＡＴ）ポリペプチドを含む少なくとも１つのヒトセルピンポリペプチドを含み、ここで、前記ＡＡＴポリペプチドは、配列番号２、配列番号３４及び配列番号３５から成る群から選択されるアミノ酸配列を含むか、あるいは、配列番号１、配列番号３２及び配列番号３３から成る群から選択されるアミノ酸配列を含むＡＡＴの反応部位ループを含む；
   （ｂ）アフィニティー樹脂及び前記融合タンパク質の間の結合を許容する条件下で、前記培養した細胞由来の上清を前記アフィニティー樹脂と接触させる工程、ここで、前記アフィニティー樹脂はプロテインＡを含む；及び
   （ｃ）前記アフィニティー樹脂から前記融合タンパク質の分離を許容する条件下で、バッファーを用いて前記アフィニティー樹脂から前記融合タンパク質を溶出する工程、ここで、前記バッファーは中性ｐＨ付近におけるものである、
   を含み、
   前記精製した融合タンパク質は、好中球エラスターゼ（ＮＥ）活性を阻害することを特徴とする、方法。
2. 融合タンパク質を精製する方法であって、前記方法が、以下の工程：
   （ａ）前記融合タンパク質の発現を許容する条件下で、前記融合タンパク質をコードする核酸構築物を含む細胞を培養する工程、ここで、前記融合タンパク質は、ヒト免疫グロブリンＦｃポリペプチドに作動できるように連結された、α１アンチトリプシン（ＡＡＴ）ポリペプチドを含む少なくとも１つのヒトセルピンポリペプチドを含み、ここで、前記ＡＡＴポリペプチドは、配列番号２、配列番号３４及び配列番号３５から成る群から選択されるアミノ酸配列を含むか、あるいは、配列番号１、配列番号３２及び配列番号３３から成る群から選択されるアミノ酸配列を含むＡＡＴの反応部位ループを含む；
   （ｂ）アフィニティー樹脂及び前記融合タンパク質の間の結合を許容する条件下で、前記培養した細胞由来の上清を前記アフィニティー樹脂と接触させる工程、ここで、前記アフィニティー樹脂はプロテインＡ、プロテインＧ及びＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（登録商標）アルファ−１ アンチトリプシン アフィニティーマトリックスを含む；及び
   （ｃ）前記アフィニティー樹脂から前記融合タンパク質の分離を許容する条件下で、バッファーを用いて前記アフィニティー樹脂から前記融合タンパク質を溶出する工程、ここで、前記バッファーは中性ｐＨ付近におけるものである、
   を含み、
   前記精製した融合タンパク質は、好中球エラスターゼ（ＮＥ）活性を阻害することを特徴とする、方法。
3. 前記細胞が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞、ＣＯＳ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、又はＹＢ２／０細胞を含む、請求項１又は２に記載の方法。
4. 前記細胞が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、又はヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞を含む、請求項３に記載の方法。
5. 前記核酸構築物が分泌シグナル配列を含む、請求項１又は２に記載の方法。
6. 前記精製した融合タンパク質が、ヒト血清由来α１アンチトリプシン（ｓｄＡＡＴ）と比較して、同様又はそれ以上に好中球エラスターゼ（ＮＥ）活性を阻害する、請求項１又は２に記載の方法。
7. 前記ヒトＦｃポリペプチドが、ヒトＩｇＭポリペプチド又はヒトＩｇＧ Ｆｃポリペプチドを含む、請求項１又は２に記載の方法。
8. 前記ヒトＩｇＧ Ｆｃポリペプチドが、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃポリペプチド、ヒトＩｇＧ２ Ｆｃポリペプチド、ヒトＩｇＧ３ Ｆｃポリペプチド、又はヒトＩｇＧ４ Ｆｃポリペプチドを含む、請求項７に記載の方法。
9. 前記免疫グロブリンＦｃポリペプチドが、配列番号３、４、５、６、及び７から成る群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１又は２に記載の方法。
10. 前記ヒトセルピンポリペプチド及び免疫グロブリンＦｃポリペプチドが、ヒンジ領域、リンカー領域、又はヒンジ領域とリンカー領域の両方を介して作動できるように連結される、請求項１又は２に記載の方法。
11. 前記ヒンジ領域、リンカー領域、又はヒンジ領域とリンカー領域の両方が、ペプチド配列を含む、請求項１０に記載の方法。
12. 前記融合タンパク質が、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、及び配列番号３６から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１又は２に記載の方法。
13. 前記融合タンパク質が、少なくとも２つのα１アンチトリプシン（ＡＡＴ）ポリペプチド、及び免疫グロブリンＦｃポリペプチドを含む、請求項１又は２に記載の方法。
14. 前記融合タンパク質が、２つのα１アンチトリプシン（ＡＡＴ）ポリペプチドを含み、前記２つのＡＡＴポリペプチドのそれぞれが、融合タンパク質がＮ末端からＣ末端に向かって、ＡＡＴポリペプチド−免疫グロブリンＦｃポリペプチド−ＡＡＴポリペプチドの構造配置を有するように、ヒンジ領域、リンカー領域、又はヒンジ領域とリンカー領域の両方を介して免疫グロブリンＦｃポリペプチドに作動できるように連結されている、請求項１３に記載の方法。
15. 前記免疫グロブリンＦｃポリペプチドが、Ｍｅｔ２５２Ｔｙｒ、Ｓｅｒ２５４Ｔｈｒ、Ｔｈｒ２５６Ｇｌｕ、Ｍｅｔ４２８Ｌｅｕ又はＡｓｎ４３４Ｓｅｒのうちの少なくとも１つの突然変異を含む、請求項１又は２に記載の方法。