KR102084944B1 - 세르핀 융합 폴리펩타이드 및 이의 이용 방법 - Google Patents

세르핀 융합 폴리펩타이드 및 이의 이용 방법 Download PDF

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존 씨. 타이머
피터 엘. 응우이
그랜트 비. 건터
퀸 데브루
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인히브릭스, 인크.
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Abstract

본 발명은 분자, 구체적으로 폴리펩타이드, 더욱 구체적으로 세르핀 폴리펩타이드 또는 세르핀 유래 아미노산 서열 및 적어도 하나 이상의 Fc 폴리펩타이드 또는 Fc 폴리펩타이드 유래 아미노산 서열; 사이토카인 표적 폴리펩타이드 또는 사이토카인 표적 폴리펩타이드 유래 서열; WAP 도메인 포함 폴리펩타이드 또는 WAP 도메인 포함 폴리펩타이드 유래 서열; 및 알부민 폴리펩타이드 또는 혈청 알부민 유래 아미노산 서열을 포함하는 두 번째 폴리펩타이드를 포함하는 융합 단백질에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 이러한 분자들을 다양한 치료 및 진단 지표로 이용하는 방법뿐만 아니라, 이러한 분자를 생산하는 방법에 관한 것이다.

Description

세르핀 융합 폴리펩타이드 및 이의 이용 방법{SERPIN FUSION POLYPEPTIDES AND METHODS OF USE THEREOF}
관련 특허들
본 발명은 2011년 6월 26일 출원된 U.S. 가출원 번호 61/502055; 2011년 12월 14일 출원된 U.S. 가출원 번호 61/570394; 및 2011년 12월 19일에 출원된 U.S. 가출원 번호 61/577204; 및 2012년 4월 25일에 출원된 U.S. 가출원 번호 61/638168에 기초한다. 상기 각각의 특허들의 내용은 본 발명의 참조 문서로 여기에 포함된다.
발명의 분야
본 발명은 분자, 구체적으로는 폴리펩타이드, 더욱 구체적으로는 세르핀(serpin) 폴리펩타이드 또는 세르핀 폴리펩타이드 유래의 아미노산 서열과 두 번째 폴리펩타이드(second polypeptide)의 융합 단백질(fusion proteins)에 대한 것이다. 또한, 본 발명은 세르핀 폴리펩타이드 또는 세르핀 폴리펩타이드 유래의 아미노산 서열, 두 번째 폴리펩타이드, 및 세 번째 펩타이드를 포함하는 융합 단백질에 대한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 적어도 하나의 세르핀 폴리펩타이드 및 두 번째 폴리펩타이드, 또는 적어도 하나의 세르핀 폴리펩타이드, 두 번째 폴리펩타이드 및 세 번째 폴리펩타이드를 포함하는 융합 단백질에 관한 것이며, 여기에서 본 발명의 융합 단백질의 두 번째 및 세 번째 폴리펩타이드는 적어도 하나의 Fc 폴리펩타이드 또는 Fc 폴리펩타이드 유래의 아미노산 서열; 사이토카인 표적 폴리펩타이드 또는 사이토카인 표적 폴리펩타이드 유래의 서열; 폴레펩타이드 또는 WAP 포함 폴리펩타이드 유래 서열을 포함하는 WAP 도메인; 또는 알부민 폴리펩타이드 또는 혈청 알부민(serum albumin) 폴리펩타이드 유래 아미노산 서열일 수 있다. 본 발명은 이런 분자를 다양한 치료 및 진단 지표로 이용한 방법과 이러한 분자의 생산 방법에 대한 것이다.
비정상적인 세린 프로테아제(protease) 활성 또는 프로테아제-대-프로테아제 억제제(protease-to-protease inhibitor)의 불균형은 프로테아제-매개 조직 파괴 및 염증성 반응을 유발할 수 있다. 따라서, 비정상적인 세린 프로테아제 활성 및/또는 프로테아제-대-프로테아제 억제제의 불균형을 표적으로 한 치료법(therapeutics) 및 치료 요법(therapies)이 필요하다. 또한, 비정상적 사이토카인 시그널링 및 세린 프로테아제 활성의 감쇠(attenuation)를 통해 향상된 치료 효과를 얻을 수 있다. 또한, 세르핀 단백질이 감염의 위험을 증가시키는 것으로 밝혀진 염증성 사이토카인을 표적하여 항-감염 활성을 가지는 것이 밝혀졌다.
본 발명에 기재된 융합 단백질은 적어도 세르핀 폴리펩타이드 또는 세르핀 폴리펩타이드로부터 유래한 아미노산 서열 (폴리펩타이드 1), 및 두 번째 폴리펩타이드 (폴리펩타이드 2)를 포함한다. 또한, 본 발명에 기재된 융합 단백질은 세르핀 폴리펩타이드 또는 세르핀 폴리펩타이드로부터 유래한 아미노산 서열 (폴리펩타이드 1), 두 번째 폴리펩타이드 (폴리펩타이드 2), 및 세 번째 폴리펩타이드 (폴리펩타이드 3)를 포함한다. 본 발명에서 교체 가능하게 사용된, 용어 “융합 단백질(fusion protein)” 및 “융합 폴리펩타이드”는 두 번째 폴리펩타이드 또는 적어도 두 번째 폴리펩타이드 유래의 아미노산 서열과 작동 가능하게 연결된 세르핀 폴리펩타이드 또는 세르핀 폴리펩타이드 유래의 아미노산 서열을 말한다. 융합 단백질의 각각의 구성 요소는, 예를 들어, 직접 부착, 매개자(intermediate) 또는 스페이서 펩타이드(spacer peptide)의 이용, 링커 부위의 이용(linker region), 경첩 부위(hinge region)의 이용 또는 두 링커 및 경첩 부위의 이용을 포함한 다양한 방법으로 연결될 수 있다. 일부 실시태양에서, 링커 부위는 경첩 부위의 서열 범위에 포함될 수 있으며, 또는, 경첩 부위가 링커 부위의 서열 내로 포함될 수 있다. 바람직하게는, 링커 부위는 펩타이드 서열이다. 예를 들어, 링커 펩타이드는 0 내지 40 아미노산 사이의 아미노산을 포함한다, 예를 들어, 0 내지 35 아미노산, 0 내지 30 아미노산, 0 내지 25 아미노산, 또는 0 내지 20 아미노산. 바람직하게는, 경첩 부위는 펩타이드 서열이다. 예를 들어, 경첩 펩타이드는 0 내지 75 아미노산 사이의 아미노산을 포함한다. 예를 들어, 0 내지 70 아미노산, 0 내지 65 아미노산 또는 0 내지 62 아미노산. 링커 부위 및 경첩 부위를 모두 포함한 융합 단백질이 기재된 실시태양들에서, 바람직하게는 링커 부위 및 경첩 부위의 각각이 펩타이드 서열이다. 상기 실시태양들에서, 경첩 펩타이드 및 링커 펩타이드는 0 내지 90 아미노산 사이의 아미노산, 예를 들어, 0 내지 85 아미노산 또는 0 내지 82 아미노산을 함께 포함한다.
일부 실시태양에서, 세르핀 폴리펩타이드 및 두 번째 폴리펩타이드는 매개 결합 단백질(intermediate binding protein)을 통해 연결될 수 있다. 일부 실시태양에서, 융합 단백질의 세르핀-기반 부분(serpin-based portion) 및 두 번째 폴리펩타이드 부분은 비-공유적(non-covalently)으로 연결될 수 있다.
일부 실시태양에서, 본 발명에 따른 융합 단백질은 N-말단에서 C-말단의 방향으로 또는 C-말단에서 N-말단의 방향으로, 하기의 화학식 중 하나의 화학식을 가질 수 있다:
폴리펩타이드 1(a) - 경첩 m - 폴리펩타이드 2(b)
폴리펩타이드 1(a) - 링커 n - 폴리펩타이드 2(b)
폴리펩타이드 1(a) - 링커 n - 경첩 m - 폴리펩타이드 2(b)
폴리펩타이드 1(a) - 경첩 m - 링커 n - 폴리펩타이드 2(b)
폴리펩타이드 1(a) - 폴리펩타이드 2(b)- 폴리펩타이드 3(c)
폴리펩타이드 1(a) - 경첩 m - 폴리펩타이드 2(b)- 경첩 m - 폴리펩타이드 3(c)
폴리펩타이드 1(a) - 링커 n - 폴리펩타이드 2(b)- 링커 n - 폴리펩타이드 3(c)
폴리펩타이드 1(a) - 경첩 m - 링커 n - 폴리펩타이드 2(b)-경첩 m - 링커 n - 폴리펩타이드 3(c) 폴리펩타이드 1(a) - 링커 n - 경첩 m - 폴리펩타이드 2(b)- 링커 n - 경첩 m - 폴리펩타이드 3(c)
상기 n은 0 내지 20의 정수이고, m은 1 내지 62의 정수이며 a,b, 및 c는 적어도 1인 정수이다. 본 발명의 실시태양들은 상기 식들 및 이의 변형 또는 이들의 조합을 포함한다. 예를 들어, 화학식에서의 폴리펩타이드의 순서는 폴리펩타이드 3(c) - 폴리펩타이드 1(a)- 폴리펩타이드 2(b), 폴리펩타이드 2(b) - 폴리펩타이드 3(c)- 폴리펩타이드 1(a), 또는 이의 어떠한 변형 또는 이들의 조합도 포함한다.
일부 실시태양에서, 폴리펩타이드 1 서열은 세르핀 폴리펩타이드를 포함한다. 세르핀은 프로테아제를 억제할 수 있는 것으로 처음 밝혀진 단백질과 유사한 구조를 가진 그룹이다. 본 발명에서 제공된 융합 단백질로 이용하기 적합한 세르핀 단백질은 알파-1 안티트립신(alpha-1 antitrypsin) (AAT), 안티트립신-관련 단백질(antitrypsin-related protein) (SERPINA2), 알파 1-안티키모트립신(alpha 1-antichymotrypsin) (SERPINA3), 칼리스타틴(kallistatin) (SERPINA4), 모노사이트 뉴트로필 엘라스타아제 억제제(monocyte neutrophil elastase inhibitor) (SERPINB1), PI-6 (SERPINB6), 안티트롬빈(antithrombin) (SERPINC1), 플라스미노겐 활성화인자 억제제 1(plasminogen activator inhibitor 1) (SERPINE1), 알파 2- 안티플라스민(alpha 2-antiplasmin) (SERPINF2), 보체 1-억제제(complement 1-inhibitor) (SERPING1) 및 뉴로세르핀(neuroserpin) (SERPINI1)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
일부 실시태양에서, 폴리펩타이드 1 서열은 알파-1 안티트립신(alpha-1 antitrypsin) (AAT) 폴리펩타이드 서열 또는 ATT 유래 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시태양에서, 폴리펩타이드 1 서열은 AAT 단백질의 부분을 포함한다. 일부 실시태양에서, 폴리펩타이드 1 서열은 적어도 AAT 단백질의 반응 위치 루프(reactive site loop) 부분을 포함한다. 일부 실시태양에서, AAT 단백질의 반응 위치 루프 부분은 적어도 아미노산 서열: GTEAAGAMFLEAIPMSIPPEVKFNK (서열번호 1)을 포함한다.
바람직한 실시태양에서, AAT 폴리펩타이드 서열 또는 AAT 유래 아미노산 서열은 인간 AAT 폴리펩타이드 서열이거나 이로부터 유래한다.
일부 실시태양에서, 융합 단백질은 하기의 전장의 인간 AAT 폴리펩타이드 서열을 포함한다:
1 EDPQGDAAQK TDTSHHDQDH PTFNKITPNL AEFAFSLYRQ LAHQSNSTNI FFSPVSIATA
61 FAMLSLGTKA DTHDEILEGL NFNLTEIPEA QIHEGFQELL RTLNQPDSQL QLTTGNGLFL
121 SEGLKLVDKF LEDVKKLYHS EAFTVNFGDT EEAKKQINDY VEKGTQGKIV DLVKELDRDT
181 VFALVNYIFF KGKWERPFEV KDTEEEDFHV DQVTTVKVPM MKRLGMFNIQ HCKKLSSWVL
241 LMKYLGNATA IFFLPDEGKL QHLENELTHD IITKFLENED RRSASLHLPK LSITGTYDLK
301 SVLGQLGITK VFSNGADLSG VTEEAPLKLS KAVHKAVLTI DEKGTEAAGA MFLEAIPMSI
361 PPEVKFNKPF VFLMIEQNTK SPLFMGKVVN PTQK (서열번호 2).
일부 실시태양에서, 융합 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열과 적어도 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 일치하는인간 AAT 폴리펩타이드 서열을 포함한다.
일부 실시태양에서, AAT 폴리펩타이드 서열은, 또는 AAT 폴리펩타이드 유래 아미노산 서열은 GenBank Accession Nos. AAB59495.1, CAJ15161.1, P01009.3, AAB59375.1, AAA51546.1, CAA25838.1, NP_001002235.1, CAA34982.1, NP_001002236.1, NP_000286.3, NP_001121179.1, NP_001121178.1, NP_001121177.1, NP_001121176.16, NP_001121175.1, NP_001121174.1, NP_001121172.1 및/또는 AAA51547.1로 나타내어지는 하나 또는 그 이상의 인간 AAT 폴리펩타이드 서열에서 유래한다.
일부 실시태양에서, 융합 단백질은 하나 또는 그 이상의 돌연변이를 포함한다. 예를 들어, 융합 단백질은 융합 단백질의 세르핀 부분의 메티오닌 (Met) 잔기에 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다. 상기 Met 돌연변이들에서, Met 잔기가 다른 아미노산으로 치환될 수 있다. 예를 들어, Met 잔기는 소수성 측쇄를 가진 아미노산, 예를 들어, 류신(Leu, L)와 같은 아미노산으로 치환될 수 있다. 가설에 억매이지 않고, Met 돌연변이(들)은 산화 및 그 이후의 본 발명의 융합 단백질의 억제 활성의 불활성화를 방지한다. 일부 실시태양에서, Met 잔기는 예를 들어, 글루타메이트(Glu, E)와 같은 극성 잔기(charged residue)로 치환될 수 있다. 일부 실시태양에서, Met 돌연변이는 AAT 폴리펩타이드의 358 부위에 존재한다. 예를 들어, Met 돌연변이는 Met358Leu (M358L)이다. 일부 실시태양에서, Met 돌연변이는 AAT 폴리펩타이드의 351 부위에 존재한다. 예를 들어, Met 돌연변이는 Met351Glu (M351E)이다. 일부 실시태양에서, Met 돌연변이는 AAT 폴리펩타이드의 351 부위 및 358 부위에 존재하며, Met 돌연변이는 Met351Glu (M351E) 및 Met358Leu (M358L)이다. 예를 들어, 융합 AAT 폴리펩타이드의 이 변이체의 반응 위치 루프는 하기의 서열을 가진다: GTEAAGAEFLEAIPLSIPPEVKFNK (서열번호 32). 일부 실시태양에서, Met 돌연변이는 AAT 폴리펩타이드의 351 부분 및 358 부분에 존재하며, 예를 들어, Met 돌연변이는 Met351Leu (M351L) 및 Met358Leu (M358L)이다. 예를 들어, 융합 AAT 폴리펩타이드의 이 변이체의 반응 위치 루프는 하기의 서열을 가진다: GTEAAGALFLEAIPLSIPPEVKFNK (서열번호 33).
일부 실시태양에서, 세르핀 융합 단백질의 두 번째 폴리펩타이드 (폴리펩타이드 2)는 Fc 폴리펩타이드이거나 Fc 폴리펩타이드로부터 유래한다. 상기 실시태양들은 본 발명에서 총괄적으로 “세르핀-Fc 융합 단백질(serpin-Fc fusion proteins)”이라고 나타낸다. 본 발명에서 기재한 세르핀-Fc 융합 단백질은 적어도 세르핀 폴리펩타이드 또는 세르핀에서 유래한 아미노산 서열 및 Fc 폴리펩타이드 또는 Fc 폴리펩타이드 유래 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시태양에서, 세르핀-Fc 융합 단백질은 단일 세르핀 폴리펩타이드를 포함한다. 다른 실시태양에서, 세르핀-Fc 융합 단백질은 하나 이상의 세르핀 폴리펩타이드를 포함하며, 상기 실시태양들은 본 발명에서 총괄적으로 “세르핀(a’)-Fc 융합 단백질(serpin(a’)-Fc fusion protein)”라고 나타내며, 상기 (a’)는 적어도 2인 정수이다. 일부 실시태양에서, 세르핀(a’)-Fc 융합 단백질에서의 각각의 세르핀 폴리펩타이드는 일부 아미노산 서열을 포함한다. 다른 실시태양에서, 세르핀(a’)-Fc 융합 단백질에서의 각각의 세르핀 폴리펩타이드는 독특한 아미노산 서열을 가지는 세르핀 폴리펩타이드들을 포함한다. 세르핀(a’)-Fc 융합 단백질에서의 세르핀 폴리펩타이드들은 융합 단백질 내의 어느 위치에라도 존재할 수 있다.
일부 실시태양에서, 세르핀-Fc 융합 단백질의 세르핀 폴리펩타이드는 적어도 AAT 단백질의 반응 위치 루프 부분의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시태양에서, AAT 단백질의 반응 위치 루프 부분은 적어도 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시태양에서, 세르핀-Fc 융합 단백질의 세르핀 폴리펩타이드는 적어도 AAT 단백질의 반응 위치 루프의 변이체의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시태양에서, AAT 단백질의 반응 위치 루프 부분의 변이체는 적어도 서열번호 32 또는 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시태양에서, 세르핀-Fc 융합 단백질의 세르핀 폴리펩타이드는 적어도 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 전장의 인간 AAT 폴리펩타이드 서열을 포함한다. 일부 실시태양에서, 세르핀-Fc 융합 단백질의 세르핀 폴리펩타이드는 서열번호 2 또는 32 또는 33의 아미노산 서열과 적어도 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 일치하는 인간 AAT 폴리펩타이드 서열을 포함한다.
일부 실시태양에서, 세르핀-Fc 융합 단백질의 세르핀 폴리펩타이드는 GenBank Accession Nos. AAB59495.1, CAJ15161.1, P01009.3, AAB59375.1, AAA51546.1, CAA25838.1, NP_001002235.1, CAA34982.1, NP_001002236.1, NP_000286.3, NP_001121179.1, NP_001121178.1, NP_001121177.1, NP_001121176.16, NP_001121175.1, NP_001121174.1, NP_001121172.1, 및/또는 AAA51547.1로 나타내어지는 하나 또는 그 이상의 인간 AAT 폴리펩타이드 서열이거나 이로부터 유래한 AAT 폴리펩타이드 서열을 또는 AAT 폴리펩타이드로부터 유래한 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시태양에서, 융합 단백질의 Fc 폴리펩타이드는 인간 Fc 폴리펩타이드, 예를들어, 인간 IgG Fc 폴리펩타이드 서열 또는 인간 IgG Fc 폴리펩타이드 서열로부터 유래된 아미노산 서열이다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, Fc 폴리펩타이드는 인간 IgG1 Fc 폴리펩타이드 또는 인간 IgG1 Fc 폴리펩타이드로부터 유래된 아미노산 서열이다. 일부 실시태양에서, Fc 폴리펩타이드는 인간 IgG2 Fc 폴리펩타이드 또는 IgG2 Fc 폴리펩타이드 서열로부터 유래한 아미노산 서열이다. 일부 실시태양에서, Fc 폴리펩타이드는 인간 IgG3 Fc 폴리펩타이드 또는 인간 IgG3 Fc 폴리펩타이드로부터 유래한 아미노산 서열이다. 일부 실시태양에서, Fc 폴리펩타이드는 인간 IgG4 Fc 폴리펩타이드 또는 인간 IgG4 Fc 폴리펩타이드로부터 유래한 아미노산 서열이다. 일부 실시태양에서, Fc 폴리펩타이드는 인간 IgM Fc 폴리펩타이드 또는 인간 IgM Fc 폴리펩타이드 서열로부터 유래한 아미노산 서열이다.
본 발명의 융합 단백질의 일부 실시태양은 Fc 폴리펩타이드을 포함하며, 융합 단백질의 Fc 폴리펩타이드는 하기의 아미노산 서열을 가지는 인간 IgG1 Fc 폴리펩타이드 서열을 포함한다:
1 APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK
61 PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT
121 LPPSRDELTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL
181 TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGK (서열번호 3).
본 발명의 융합 단백질의 일부 실시태양은 Fc 폴리펩타이드를 포함하며, 융합 단백질의 Fc 폴리펩타이드는서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 인간 IgG1 Fc 폴리펩타이드 서열을 포함한다.
본 발명의 융합 단백질의 일부 실시태양은 Fc 폴리펩타이드를 포함하며, Fc 폴리펩타이드는 돌연변이되거나 FcRn 결합을 촉진하도록 변형된다. 상기 실시태양에서 돌연변이되거나 변형된 Fc 폴리펩타이드는 Kabat 넘버링 시스템(numbering system)을 이용한 하기의 돌연변이들을 포함한다: Met252Tyr, Ser254Thr, Thr256Glu (M252Y, S256T, T256E) or Met428Leu and Asn434Ser (M428L, N434S). 일부 실시태양에서 Fc 폴리펩타이드 부분은 Fc-매개 이합체화(dimerization)를 방해하기 위해 돌연변이되거나 그렇지 않으면 변형된다. 상기 실시태양에서, 융합 단백질은 자연 상태에서 단량체(monomeric)이다.
본 발명의 융합 단백질의 일부 실시태양은 Fc 폴리펩타이드를 포함하며, 융합 단백질의 Fc 폴리펩타이드는 하기의 아미노산 서열을 가지는 인간 IgG2 Fc 폴리펩타이드 서열을 포함한다:
1 APPVAGPSVF LFPPKPKDTL MISRTPEVTC VVVDVSHEDP EVQFNWYVDG VEVHNAKTKP
61 REEQFNSTFR VVSVLTVVHQ DWLNGKEYKC KVSNKGLPAP IEKTISKTKG QPREPQVYTL
121 PPSREEMTKN QVSLTCLVKG FYPSDIAVEW ESNGQPENNY KTTPPMLDSD GSFFLYSKLT
181 VDKSRWQQGN VFSCSVMHEA LHNHYTQKSL SLSPGK (서열번호 4).
본 발명의 융합 단백질의 일부 실시태양은 Fc 폴리펩타이드를 포함하며, 융합 단백질의 Fc 폴리펩타이드는 서열번호 4의 아미노산 서열과 적어도 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 일치하는 인간 IgG2 Fc 폴리펩타이드 서열을 포함한다. 본 발명의 융합 단백질의 일부 실시태양은 Fc 폴리펩타이드를 포함하며, 융합 단백질의 Fc 폴리펩타이드는 하기의 아미노산 서열을 가지는 인간 IgG3 Fc 폴리펩타이드를 포함한다:
1 APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVQFKWYVD GVEVHNAKTK
61 PREEQYNSTF RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKTK GQPREPQVYT
121 LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESSGQPENN YNTTPPMLDS DGSFFLYSKL
181 TVDKSRWQQG NIFSCSVMHE ALHNRFTQKS LSLSPGK (서열번호 5).
본 발명의 융합 단백질의 일부 실시태양은 Fc 폴리펩타이드를 포함하며, 융합 단백질의 Fc 폴리펩타이드는 서열번호 5의 아미노산 서열과 적어도 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 일치하는 인간 IgG3 Fc 폴리펩타이드 서열을 포함한다.
본 발명의 융합 단백질의 일부 실시태양은 Fc 폴리펩타이드를 포함하며, 융합 단백질의 Fc 폴리펩타이드는 하기의 아미노산 서열을 가지는 인간 IgG4 Fc 폴리펩타이드 서열을 포함한다:
1 APEFLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK
61 PREEQFNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS SIEKTISKAK GQPREPQVYT
121 LPPSQEEMTK NQVSLTCLVK GFYPDIAVEW ESNGQPENNY KTTPPVLDSD GSFFLYSRLT
181 VDKSRWQEGN VFSCSVMHEA LHNHYTQKSL SLSLGK (서열번호 6).
본 발명의 융합 단백질의 일부 실시태양은 Fc 폴리펩타이드를 포함하며, 융합 단백질의 Fc 폴리펩타이드는 서열번호 6의 아미노산 서열과 적어도 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 일치하는 인간 IgG4 Fc 폴리펩타이드를 포함한다.
본 발명의 융합 단백질의 일부 실시태양은 Fc 폴리펩타이드를 포함하며, 융합 단백질의 Fc 폴리펩타이드는 하기의 아미노산 서열을 가지는 인간 IgM Fc 폴리펩타이드를 포함한다:
1 IAELPPKVSV FVPPRDGFFG NPRKSKLICQ ATGFSPRQIQ VSWLREGKQV GSGVTTDQVQ
61 AEAKESGPTT YKVTSTLTIK ESDWLGQSMF TCRVDHRGLT FQQNASSMCV PDQDTAIRVF
121 AIPPSFASIF LTKSTKLTCL VTDLTTYDSV TISWTRQNGE AVKTHTNISE SHPNATFSAV
181 GEASICEDDW NSGERFTCTV THTDLPSPLK QTISRPKG (서열번호 7).
본 발명의 융합 단백질의 일부 실시태양은 Fc 폴리펩타이드를 포함하며, 융합 단백질의 Fc 폴리펩타이드는 서열번호 7의 아미노산 서열과 적어도 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 일치하는 인간 IgM Fc 폴리펩타이드를 포함한다.
본 발명에서 제공하는 융합 단백질의 일부 실시태양에서, 세르핀 융합 단백질의 두 번째 폴리펩타이드 (폴리펩타이드 2)는 사이토카인 표적(cytokine targeting) 폴리펩타이드이거나 사이토카인 표적 폴리펩타이드로부터 유래한다. 상기 실시태양들은 본 발명에서 총괄적으로 “세르핀-사이토카인 표적 폴리펩타이드 융합 단백질(serpin-cytokine targeting polypeptide fusion proteins)”이라고 나타낸다. 본 발명에서 기재한 세르핀-사이토카인 표적 폴리펩타이드 융합 단백질은 적어도 세르핀 폴리펩타이드 또는 세르핀 폴리펩타이드로부터 유래한 아미노산 서열 및 사이토카인 표적 폴리펩타이드 또는 이의 유도체를 포함한다. 일부 실시태양에서, 세르핀-사이토카인 표적 폴리펩타이드는 단일 세르핀 폴리펩타이드를 포함한다. 다른 실시태양에서, 세르핀-사이토카인 표적 폴리펩타이드 융합 단백질은 하나 이상의 세르핀 폴리펩타이드를 포함하며, 상기 실시태양들은 본 발명에서 총괄적으로 “세르핀(a’)-사이토카인 표적 폴리펩타이드 융합 단백질”로 나타내고, 상기 (a’) 는 적어도 2인 정수이다. 일부 실시태양에서, 세르핀(a’)-사이토카인 표적 폴리펩타이드 융합 단백질 내의 각각의 세르핀 폴리펩타이드는 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 다른 실시태양에서, 세르핀(a’)-사이토카인 표적 폴리펩타이드 융합 단백질 내의 각각의 세르핀 폴리펩타이드는 독특한 아미노산 서열을 가진 세르핀 폴리펩타이드를 포함한다.
일부 실시태양에서, 세르핀-사이토카인 표적 폴리펩타이드 융합 단백질의 사이토카인 표적 폴리펩타이드는 사이토카인 수용체(cytokine receptor)이거나 사이토카인 수용체에서 유래한다. 바람직한 실시태양에서, 사이토카인 표적 폴리펩타이드 또는 사이토카인 수용체는 인간 사이토카인 수용체 서열이거나 인간 사이토카인 수용체 서열로부터 유래한다. 다른 실시태양에서, 사이토카인 표적 폴리펩타이드는 항체 또는 항체 단편, 예를 들어, 항-사이토카인 항체 또는 항-사이토카인 항체 단편이다. 바람직한 실시태양에서, 사이토카인 표적 폴리펩타이드 또는 항체 또는 항체 단편으로부터 유래한 아미노산 서열은 키메릭(chimeric) 항체, 인간화된(humanized) 항체 또는 인간(fully human) 항체 서열로부터 유래한다. 용어 항체 단편은 단쇄(single chain), Fab 단편, F(ab')2 단편, scFv, scAb, dAb, 항체 중쇄 단일 도메인(single domain heavy chain antibody) 및 항체 경쇄 단일 도메인(single domain light chain antibody)를 포함한다.
다른 실시태양에서, 사이토카인 표적 폴리펩타이드는 사이토카인 수용체와 결합하여 사이토카인과 수용체의 결합을 방해한다. 다른 실시태양에서, 사이토카인 표적 폴리펩타이드는 항체이거나 항체 단편, 예를 들어, 항-사이토카인 수용체 항체 또는 항-사이토카인 수용체 항체 단편이다.
일부 실시태양에서, 세르핀-사이토카인 표적 폴리펩타이드 융합 단백질의 세르핀 폴리펩타이드는 적어도 AAT 단백질의 반응 위치 루프 부분의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시태양에서, AAT 단백질의 반응 위치 루프 부분은 적어도 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시태양에서, 세르핀-사이토카인 표적 융합 단백질의 세르핀 폴리펩타이드는 적어도 AAT 단백질의 반응 위치 루프 부분이 변형된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시태양에서, AAT 단백질의 반응 위치 루프의 변형은 적어도 서열번호 32 또는 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시태양에서, 세르핀-사이토카인 표적 융합 단백질의 세르핀 폴리펩타이드는 적어도 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 전장의 인간 AAT 폴리펩타이드를 포함하거나 이로부터 유래된다. 일부 실시태양에서 세르핀-사이토카인 표적 융합 단백질의 세르핀 폴리펩타이드는 서열번호 2 또는 32 또는 33의 아미노산 서열과 적어도 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 일치하는 인간 AAT 폴리펩타이드 서열을 포함한다.
일부 실시태양에서, 세르핀-사이토카인 표적 융합 단백질의 세르핀 폴리펩타이드는 GenBank Accession Nos. AAB59495.1, CAJ15161.1, P01009.3, AAB59375.1, AAA51546.1, CAA25838.1, NP_001002235.1, CAA34982.1, NP_001002236.1, NP_000286.3, NP_001121179.1, NP_001121178.1, NP_001121177.1, NP_001121176.16, NP_001121175.1, NP_001121174.1, NP_001121172.1 및/또는 AAA51547.1로 나타내어지는 하나 또는 그 이상의 인간 AAT 폴리펩타이드 서열이거나 이로부터 유래한 AAT 폴리펩타이드 서열 또는 AAT 폴리펩타이드로부터 유래한 아미노산 서열을 포함한다.
세르핀-사이토카인 표적 융합 단백질은 세르핀-Fc 융합 단백질의 부분을 포함할 수 있다. 예를 들어, 항체는 Fc 폴리펩타이드를 포함한다. 따라서, 사이토카인 표적 폴리펩타이드가 사이토카인-표적 항체인 일부 실시태양에서, 세르핀-사이토카인 표적 융합 단백질은 세르핀-Fc 융합 단백질의 부분을 포함할 수 있다. 또한, 치료적으로 이용되는 대부분의 수용체 융합 단백질은 Fc 융합 단백질이다. 따라서, 세르핀-사이토카인 표적 융합 단백질이 세르핀-사이토카인 수용체 융합 단백질인 일부 실시태양에서, 세르핀-사이토카인 표적 융합 단백질은 세르핀 부분 및 사이토카인 수용체 부분 이외에 Fc 폴리펩타이드를 포함할 수 있다.
세르핀-사이토카인 표적 융합 단백질이 Fc 폴리펩타이드 서열을 포함하는 일부 실시태양에서, Fc 폴리펩타이드 서열은 서열번호 3, 4, 5, 6 또는 7 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하거나 이로부터 유래한다. 세르핀-사이토카인 표적 융합 단백질이 Fc 폴리펩타이드 서열을 포함하는 일부 실시태양에서, Fc 폴리펩타이드 서열은 서열번호 3, 4, 5, 6 또는 7의 아미노산 서열 중 어느 하나와 적어도 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 일치한다. 일부 실시태양에서, 세르핀 폴리펩타이드 및 사이토카인 표적 폴리펩타이드는 링커 부위, 예를 들어, 글라이신-세린 링커 또는 글라이신-세린에 기반한 링커(glycine-serine based linker)를 통해 작동 가능하게 연결된다(operably linked). 일부 실시태양에서, 세르핀 폴리펩타이드 및 사이토카인 표적 폴리펩타이드는 경첩 부위를 통해 작동 가능하게 연결된다. 일부 실시태양에서, 세르핀 폴리펩타이드 및 사이토카인 표적 폴리펩타이드는 링커 부위 및 경첩 부위를 통해 작동 가능하게 연결된다. 다른 실시태양에서, 세르핀 폴리펩타이드 및 사이토카인 표적 폴리펩타이드는 직접적으로 부착된다.
본 발명에서 제공하는 융합 단백질의 일부 실시태양에서, 세르핀 융합 단백질의 두 번째 폴리펩타이드 (폴리펩타이드 2)는 WAP(whey acidic protein) 도메인을 포함하는 폴리펩타이드, 또는 WAP 도메인을 포함하는 폴리펩타이드 유래 아미노산 서열이다. 상기 실시태양들은 본 발명에서 총괄적으로 “세르핀-WAP 도메인 융합 단백질(serpin-WAP domain fusion proteins)”로 나타낸다. 세르핀-WAP 도메인 융합 단백질은 적어도 세르핀 폴리펩타이드 또는 적어도 세르핀 유래의 아미노산 서열, WAP 도메인-포함 폴리펩타이드 또는 WAP 도메인-포함 폴리펩타이드 유래 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시태양에서, 세르핀-WAP 도메인 융합 단백질은 단일 세르핀 폴리펩타이드를 포함한다. 다른 실시태양에서, 세르핀-WAP 표적 폴리펩타이드 융합 단백질은 하나 이상의 세르핀 폴리펩타이드를 포함한다. 상기 실시태양들은 본 발명에서 총괄적으로 “세르핀(a’)-WAP 도메인 융합 단백질(serpin(a’)-WAP domain fusion proteins)”로 나타내며, 상기 (a’)는 적어도 2인 정수이다. 일부 실시태양에서, 세르핀(a’)-WAP 도메인 융합 단백질의 세르핀 폴리펩타이드는 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 다른 실시태양에서, 세르핀(a’)-사이토카인 표적 폴리펩타이드 융합 단백질의 세르핀 폴리펩타이드는 독특한 아미노산 서열가지는 세르핀 폴리펩타이드를 포함한다.
세르핀-WAP 도메인 융합 단백질은 WAP 도메인을 포함하는 폴리펩타이드 또는 WAP 도메인을 포함하는 폴리펩타이드인 폴리펩타이드 서열 또는 이로부터 유래한 폴리펩타이드 서열을 포함한다. WAP 도메인은 4-이황화물 코어 배치(4-disulfide core arrangement) (4-이황화물 코어 모티브(four-disulfide core motif)로도 불린다) 특성을 보이는8개의 시스테인을 포함하는 50 아미노산의 진화적으로 보존된 서열 모티브이다. WAP 도메인 서열 모티브는 여러 단백질에서 세린 프로테아제 억제 활성으로 특징지어지는 기능적인 모티브이다.
본 발명에서 제공된 융합 단백질에 이용하기 적합한 WAP 도메인-포함 폴리펩타이드는 분비백혈구단백프로테아제 억제제(secretory leukocyte protease inhibitor, SLPI), 엘라핀(Elafin) 및 에핀(Eppin)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
일부 실시태양에서, 융합 단백질의 WAP 도메인-포함 폴리펩타이드 서열은 분비백혈구단백프로테아제 억제제(secretory leukocyte protease inhibitor, SLPI) 폴리펩타이드 서열 또는 SLPI 유래된 아미노산 서열을 포함한다. 상기 실시태양들은 총괄적으로 “세르핀-SLPI-유래 융합 단백질(serpin-SLPI-derived fusion proteins)”로 나타낸다. 일부 실시태양에서, SLPI 폴리펩타이드 서열은 SLPI 단백질의 부분, 예를 들어, WAP2 도메인 또는 이의 서브-부분(sub-portion)과 같은 부분을 포함한다. 바람직한 실시태양에서, SLPI 폴리펩타이드 서열 또는 SLPI 유래 아미노산 서열은 인간 SLPI 폴리펩타이드 서열이거나 이로부터 유래한 서열이다.
본 발명의 세르핀-SLPI 융합 단백질의 일부 실시태양에서, SLPI 서열 또는 융합 단백질의 SLPI-유래 서열은 하기의 아미노산 서열을 가지는 전장의 인간 SLPI 폴리펩타이드 서열을 포함한다:
1 MKSSGLFPFL VLLALGTLAP WAVEGSGKSF KAGVCPPKKS AQCLRYKKPE CQSDWQCPGK
61 KRCCPDTCGI KCLDPVDTPN PTRRKPGKCP VTYGQCLMLN PPNFCEMDGQ CKRDLKCCMG
121 MCGKSCVSPV KA (서열번호 8).
본 발명의 세르핀-SLPI 융합 단백질의 일부 실시태양에서, SLPI 서열 또는 융합 단백질의 SLPI-유래 서열은 서열번호 8의 아미노산 서열과 적어도 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 일치하는 인간 SLPI 폴리펩타이드 서열을 포함한다.
본 발명의 세르핀-SLPI 융합 단백질의 일부 실시태양에서, SLPI 서열 또는 융합 단백질의 SLPI-유래 서열은 전장의 인간 SLPI 폴리펩타이드 서열의 일부분을 포함하며, 상기 서열의 일부분은 하기의 아미노산 서열을 가진다:
1 SGKSFKAGVC PPKKSAQCLR YKKPECQSDW QCPGKKRCCP DTCGIKCLDP VDTPNPTRRK
61 PGKCPVTYGQ CLMLNPPNFC EMDGQCKRDL KCCMGMCGKS CVSPVKA (서열번호 9).
본 발명의 세르핀-SLPI 융합 단백질의 일부 실시태양에서, SLPI 서열 또는 융합 단백질의 SLPI-유래 서열은 서열번호 9의 아미노산 서열과 적어도 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 일치하는 인간 SLPI 폴리펩타이드 서열을 포함한다.
본 발명의 세르핀-SLPI 융합 단백질의 일부 실시태양에서, the SLPI 서열 또는 융합 단백질의 SLPI-유래 서열은 전장의 인간 SLPI 폴리펩타이드 서열의 WAP2 도메인을 포함하며, 상기 WAP2 도메인은 하기의 아미노산 서열을 가진다:
1 TRRKPGKCPV TYGQCLMLNP PNFCEMDGQC KRDLKCCMGM CGKSCVSPVK A (서열번호 10).
본 발명의 세르핀-SLPI 융합 단백질의 일부 실시태양에서, the SLPI 서열 또는 융합 단백질의 SLPI-유래 서열은 서열번호 10의 아미노산 서열과 적어도 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 일치하는 인간 SLPI 폴리펩타이드 서열을 포함한다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 세르핀-SLPI 융합 단백질의 일부 실시태양에서, SLPI 폴리펩타이드 또는 SLPI 폴리펩타이드 유래 아미노산 서열은 하나 또는 그 이상의 GenBank Accession Nos. CAA28187.1, NP_003055.1, EAW75869.1, P03973.2, AAH20708.1, CAB64235.1, CAA28188.1, AAD19661.1 및/또는 BAG35125.1로 나타내어지는 인간 SLPI 폴리펩타이드 서열이거나 이로부터 유래한다.
본 발명의 세르핀-SLPI 융합 단백질의 일부 실시태양에서, SLPI 폴리펩타이드 서열 또는 융합 단백질의 SLPI-유래 서열은 메티오닌(Methoine) (Met) 잔기가 변형된 인간 SLPI 폴리펩타이드 서열을 포함한다. Met 돌연변이에서, Met 잔기는 아미노산으로 치환될 수 있다. 예를 들어, Met 잔기는 소수성 측쇄를 가진 아미노산, 예를 들어, 류신(Leu, L) 또는 발린(Val, V)과 같은 아미노산으로 치환될 수 있다. 가설에 억매이지 않고, Met 돌연변이(들)은 산화 및 그 이후의 본 발명의 융합 단백질의 억제 활성의 불활성화를 방지한다. 일부 실시태양에서, Met 돌연변이는SLPI 폴리펩타이드의 98 부위이다. 예를 들어, 세르핀-SLPI의 변형된 SLPI 폴리펩타이드 서열은 서열번호 8에서 M98L 또는 M98V 돌연변이들을 포함한다.
다른 실시태양에서, 융합 단백질의 WAP 도메인-포함 폴리펩타이드 서열은 엘라핀 폴리펩타이드 서열 또는 엘라핀 유래 아미노산 서열을 포함한다. 상기 실시태양들은 본 발명에서 “세르핀-엘라핀 융합 단백질(serpin-elafin fusion proteins)”로 나타낸다. 일부 실시태양에서, 엘라핀 폴리펩타이드 서열은 엘라핀 단백질의 일부분, 예를 들어, WAP 도메인 또는 이의 서브-부분과 같은 부분을 포함한다. 바람직한 실시태양에서, 엘라핀 폴리펩타이드 서열 또는 엘라핀 유래 아미노산 서열은 인간 엘라핀 폴리펩타이드 서열이거나 이로부터 유래한다.
세르핀-엘라핀 융합 단백질의 일부 실시태양에서, 융합 단백질은 하기의 아미노산 서열을 가지는 전장의 인간 엘라핀 폴리펩타이드 서열을 포함한다:
1 MRASSFLIVV VFLIAGTLVL EAAVTGVPVK GQDTVKGRVP FNGQDPVKGQ VSVKGQDKVK
61 AQEPVKGPVS TKPGSCPIIL IRCAMLNPPN RCLKDTDCPG IKKCCEGSCG MACFVPQ
(서열번호 11).
세르핀-엘라핀 융합 단백질의 일부 실시태양에서, 융합 단백질은 서열번호 11의 아미노산 서열과 적어도 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 일치하는 인간 엘라핀 폴리펩타이드 서열을 포함한다.
세르핀-엘라핀 융합 단백질의 일부 실시태양에서, 융합 단백질은 전장의 인간 엘라핀 폴리펩타이드 서열의 일부분을 포함하며, 상기 일부분은 하기의 아미노산 서열을 가진다:
1 AVTGVPVKGQ DTVKGRVPFN GQDPVKGQVS VKGQDKVKAQ EPVKGPVSTK PGSCPIILIR
61 CAMLNPPNRC LKDTDCPGIK KCCEGSCGMA CFVPQ
(서열번호 12).
세르핀-엘라핀 융합 단백질의 일부 실시태양에서, 융합 단백질은 the fusion protein 의 아미노산 서열과 적어도 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 일치하는 인간 엘라핀 폴리펩타이드 서열을 포함한다 서열번호 12.
세르핀-엘라핀 융합 단백질의 일부 실시태양에서, 융합 단백질은 전장의 인간 엘라핀 폴리펩타이드 서열의 WAP 도메인을 포함하며, 상기 WAP 도메인은 하기의 아미노산 서열을 가진다:
1 VSTKPGSCPI ILIRCAMLNP PNRCLKDTDC PGIKKCCEGS CGMACFVPQ
(서열번호 13).
세르핀-엘라핀 융합 단백질의 일부 실시태양에서, 융합 단백질은 서열번호 13의 아미노산 서열과 적어도 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 일치하는 인간 엘라핀 폴리펩타이드 서열을 포함한다.
세르핀-엘라핀 융합 단백질의 일부 실시태양에서, 엘라핀 폴리펩타이드 서열 또는 엘라핀 폴리펩타이드 유래 아미노산 서열은 하나 또는 그 이상의 GenBank Accession Nos. P19957.3, NP_002629.1, BAA02441.1, EAW75814.1, EAW75813.1, Q8IUB2.1 및/또는 NP_542181.1로 나타내어지는 인간 SLPI 폴리펩타이드 서열로부터 유래한다.
다른 실시태양에서, 융합 단백질의 WAP 도메인-포함 폴리펩타이드 서열은 에핀 폴리펩타이드 서열 또는 에핀 유래 아미노산 서열을 포함한다. 상기 실시태양들은 본 발명에서 “세르핀(a’)-에핀 융합 단백질(serpin(a’)-Eppin fusion proteins)”나타낸다. 일부 실시태양에서, 세르핀-에핀 융합 단백질의 에핀 폴리펩타이드 서열은 에핀 단백질의 일부분, 예를 들어, WAP 도메인 또는 이의 서브-부분과 같은 부분을 포함한다. 바람직한 실시태양에서, 에핀 폴리펩타이드 서열 또는 에핀 유래 아미노산 서열은 인간 에핀 폴리펩타이드 서열이거나 이로부터 유래한 서열이다.
세르핀-에핀 융합 단백질의 실시태양에서, 에핀 폴리펩타이드 서열 또는 에핀 폴리펩타이드 유래의 아미노산 서열은 하나 또는 그 이상의 GenBank Accession Nos. O95925.1, NP_065131.1, AAH44829.2, AAH53369.1, AAG00548.1, AAG00547.1 및/또는 AAG00546.1로 나타내어지는 인간 에핀 폴리펩타이드 서열이거나 이로부터 유래한다.
일부 실시태양에서, 세르핀-WAP 도메인 융합 단백질의 세르핀 폴리펩타이드는 적어도 AAT 단백질의 반응 위치 루프 부분의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시태양에서, AAT 단백질의 반응 위치 루프 부분은 적어도 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시태양에서, 세르핀-WAP 융합단백질의 세르핀 폴리펩타이드는 적어도 AAT 단백질의 반응 위치 루프 부분이 변형된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시태양에서, AAT 단백질의 반응 위치 루프 부분의 변형은 적어도 서열번호 32 또는 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시태양에서, 세르핀-WAP 도메인 융합 단백질의 세르핀 폴리펩타이드는 적어도 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 인간 AAT 폴리펩타이드 서열을 포함한다. 세르핀-WAP 도메인 융합 단백질의 세르핀 폴리펩타이드의 일부 실시태양은 서열번호 2 또는 32 또는 33의 아미노산 서열과 적어도 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 일치하는 인간 AAT 폴리펩타이드 서열을 포함한다.
일부 실시태양에서, 세르핀-WAP 도메인 융합 단백질의 세르핀 폴리펩타이드는 GenBank Accession Nos. AAB59495.1, CAJ15161.1, P01009.3, AAB59375.1, AAA51546.1, CAA25838.1, NP_001002235.1, CAA34982.1, NP_001002236.1, NP_000286.3, NP_001121179.1, NP_001121178.1, NP_001121177.1, NP_001121176.16, NP_001121175.1, NP_001121174.1, NP_001121172.1 및/또는 AAA51547.1로 나타내어지는 하나 또는 그 이상의 인간 AAT 폴리펩타이드 서열인, 또는 이로부터 유래한 AAT 폴리펩타이드로부터 유래한 아미노산 서열인, AAT 폴리펩타이드 서열을 포함한다.
또한, 일부 실시태양에서, 세르핀-WAP 도메인 융합 단백질은 Fc 폴리펩타이드 또는 Fc 폴리펩타이드로부터 유래한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 상기 실시태양들은 본 발명에서 총괄적으로 “세르핀-Fc-WAP 도메인 융합 단백질(serpin-Fc-WAP domain fusion proteins)”로 나타낸다. 상기 실시태양들에서, 상기 용어에 의해 특정 순서가 정해지지 않는다. 예를 들어, 융합 단백질의 순서는 세르핀-Fc-WAP 도메인, 세르핀-WAP 도메인-Fc, 또는 이의 어떠한 조합의 변형일 수 있다. 본 발명에 기재된 세르핀-Fc-WAP 도메인 융합 단백질은 적어도 세르핀 폴리펩타이드 또는 세르핀 유래의 아미노산 서열, WAP 도메인-포함 폴리펩타이드 또는 WAP 도메인-포함 폴리펩타이드 유래 아미노산 서열, 및 Fc 폴리펩타이드 또는 Fc 폴리펩타이드 유래의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
일부 실시태양에서, 세르핀-WAP 도메인 융합 단백질이 Fc 폴리펩타이드 서열을 포함할 때, Fc 폴리펩타이드 서열은 서열번호 3 내지 7의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 다른 실시태양에서, 세르핀-WAP 도메인 융합 단백질이 Fc폴리펩타이드 서열을 포함할 때, Fc 폴리펩타이드 서열은 서열번호 3 내지 7의 아미노산 서열과 적어도 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 일치할 수 있다. 또한, 일부 실시태양에서, 세르핀-WAP 도메인 융합 단백질은 알부민(albumin) 폴리펩타이드, 또는 알부민 폴리펩타이드 유래 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 상기 실시태양들은 본 발명에서 총괄적으로 “세르핀-알부민-WAP 도메인 융합 단백질(serpin-albumin-WAP domain fusion proteins)”로 나타낸다. 상기 실시태양들에서, 상기 용어에 의해 특정 순서가 정해지지 않는다. 예를 들어, 융합 단백질의 순서는 세르핀-알부민-WAP 도메인, 세르핀-WAP 도메인-알부민, 또는 이의 조합의 변형이 될 수 있다. 본 발명에서 기재하는 세르핀-알부민-WAP 도메인 융합 단백질은 적어도 세르핀 폴리펩타이드 또는 세르핀 유래 아미노산 서열, WAP 도메인-포함 폴리펩타이드, 또는 WAP 도메인-포함 폴리펩타이드 유래 아미노산 서열, 및 알부민 폴리펩타이드, 또는 알부민 폴리펩타이드 유래 아미노산 서열을 포함한다.
세르핀-WAP 도메인 융합 단백질이 알부민 폴리펩타이드 서열을 포함한 일부 실시태양에서, 알부민 폴리펩타이드 서열은 본 발명에 기재된 서열번호 14 내지 15의 아미노산 서열을 포함한다. 세르핀-WAP 도메인 융합 단백질이 알부민 폴리펩타이드 서열을 포함하는 다른 실시태양에서, 알부민 폴리펩타이드 서열은 서열번호 14 또는 15의 아미노산 서열 중 어느 하나와 적어도 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 일치하는 서열을 갖는다.
일부 실시태양에서, 세르핀 융합 단백질의 두 번째 폴리펩타이드 (폴리펩타이드 2)는 알부민 폴리펩타이드 또는 알부민 폴리펩타이드로부터 유래한 폴리펩타이드이다. 상기 실시태양들은 본 발명에서 총괄적으로 “세르핀(a’)-알부민 융합 단백질(serpin(a’)-albumin fusion proteins)”으로 나타낸다. 본 발명에서 기재한 세르핀-알부민 융합 단백질은 적어도 세르핀 폴리펩타이드 또는 세르핀으로부터 유래한 아미노산 서열 및 알부민 폴리펩타이드 또는 알부민 폴리펩타이드로부터 유래한 아미노산 서열을 포함한다. 또한 본 발명은 세르핀 알부민 결합 폴리펩타이드 융합 단백질에 대한 것이며, 상기 알부민은 매개 결합 분자를 통해 세르핀과 작동 가능하게 연결된다. 본 발명에서 세르핀은 인간 혈청 알부민과 비-공유 또는 공유결합된다.
본 발명의 융합 단백질이 알부민 폴리펩타이드를 포함하는 실시태양에서, 융합 단백질의 알부민 폴리펩타이드 서열은 인간 혈청 알부민(human serum albumin, HSA) 폴리펩타이드 또는 HSA 유래 아미노산 서열이다. 일부 실시태양에서, 융합 단백질은 하기의 아미노산 서열을 가지는 HSA 폴리펩타이드 서열을 포함한다:
DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL (서열번호 14).
본 발명의 융합 단백질이 알부민 폴리펩타이드 서열을 포함하는 실시태양에서, 융합 단백질의 알부민 폴리펩타이드 서열은 서열번호 14의 아미노산 서열과 적어도 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 일치하는 인간 형청 알부민 폴리펩타이드 서열을 포함한다.
본 발명의 융합 단백질이 알부민 폴리펩타이드 서열을 포함하는 실시태양에서, 융합 단백질의 알부민 폴리펩타이드 서열은 하기의 아미노산 서열을 가지는 인간 혈청 알부민 폴리펩타이드의 도메인 3를 포함한다:
EEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCK
HPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVP
KEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCC
KADDKETCFAEEGKKLVA (서열번호 15).
본 발명의 융합 단백질이 알부민 폴리펩타이드 서열을 포함하는 실시태양에서, 융합 단백질의 알부민 폴리펩타이드 서열은 서열번호 15의 아미노산 서열과 적어도 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 일치하는 인간 혈청 알부민 폴리펩티드를 포함한다.
본 발명의 융합 단백질의 일부 실시태양은 알부민 폴리펩타이드 서열을 포함하며, 융합 단백질은 알부민 결합 폴리펩타이드 매개체(intermediate albumin binding polypeptide)를 통해 인간 혈청 알부민에 연결된다. 알부민 결합 폴리펩타이드는 항체 또는 항체 단편일 수 있고, 또는 항체 또는 항체 단편으로부터 유래할 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 알부민 결합 폴리펩타이드 또는 항체 또는 항체 단편으로부터 유래한 아미노산 서열은 키메릭 항체, 인간화 항체 또는 인간 항체 서열로부터 유래한다. 용어 항체 단편은 단쇄, Fab 단편, F(ab')2 단편, scFv, scAb, dAb, 단일 도메인 중쇄 항체 및 단일 도메인 경쇄 항체를 포함한다. 또한, 알부민 결합 폴리펩타이드는 알부민 결합 펩타이드일 수 있다. 본 발명의 또 다른 실시태양은 세르핀 알부민 결합 폴리펩타이드 융합이며, 상기 알부민 결합 폴리펩타이드는 Streptococcal 단백질 G의 도메인 3 또는 Streptococcal 단백질 G의 도메인 3 유래 서열이다.
일부 실시태양에서, 세르핀(a’)-알부민 융합 단백질의 세르핀 폴리펩타이드는 적어도 AAT 단백질의 반응 위치 루프 부분의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시태양에서, AAT 단백질의 반응 위치 루프 부분은 적어도 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시태양에서, 세르핀-알부민 융합 단백질의 세르핀 폴리펩타이드는 AAT 단백질의 반응 위치 루프 부분의 아미노산 서열 변형을 포함한다. 일부 실시태양에서, AAT 단백질의 반응 위치 루프 부분의 변형은 적어도 서열번호 32 또는 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시태양에서, 세르핀-알부민 융합 단백질의 세르핀 폴리펩타이드는 적어도 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 전장의 인간 AAT 폴리펩타이드 서열을 포함한다. 일부 실시태양에서 세르핀-알부민 융합 단백질의 세르핀 폴리펩타이드는 서열번호 2 또는 32 또는 33의 아미노산 서열과 적어도 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 일치하는 인간 AAT 폴리펩타이드 서열을 포함한다.
일부 실시태양에서, 세르핀-알부민 융합 단백질의 세르핀 폴리펩타이드는 GenBank Accession Nos. AAB59495.1, CAJ15161.1, P01009.3, AAB59375.1, AAA51546.1, CAA25838.1, NP_001002235.1, CAA34982.1, NP_001002236.1, NP_000286.3, NP_001121179.1, NP_001121178.1, NP_001121177.1, NP_001121176.16, NP_001121175.1, NP_001121174.1, NP_001121172.1 및/또는 AAA51547.1로 나타내어지는 하나 또는 그 이상의 인간 AAT 폴리펩타이드 서열이거나 이로부터 유래한, AAT 폴리펩타이드 서열 또는 이로부터 유래한 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시태양에서, 융합 단백질은 단백질 분해성 절단(proteolytic cleavage)을 증가시키거나 억제하기 위해, 예를 들어, 하나 또는 그 이상의 단백질 분해성 절단 부위의 돌연변이에 의해 변형된다. 일부 실시태양에서, 융합 단백질은 융합 단백질의 Fc 효과기 기능(Fc effector function)을 바꾸거나 조절하기 위해 변형되며, 동시에 변화되지 않은 융합 단백질에 비해 결합 및 억제 기능이 유지된다. Fc 효과기 기능은 Fc 폴리펩타이드의, Fc 수용체 결합, Fc 수용체와의 결합에 의한 염증전 매개인자(proinflammatory mediator)의 방출 방지, 식세포작용(phagocytosis), 항체-의존적 세포-매개 세포독성(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC) 변형, 보체-의존적 세포 독성 변형(complement-dependent cytotoxicity, CDC), Asn297 잔기의 당화(glycosylation) 변형 (EU index of Kabat numbering, Kabat et al 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 일부 실시태양에서, 융합 단백질은 돌연변이되거나 Fc 수용체 결합에 영향을 주도록 변형된다. 일부 실시태양에서, Fc 폴리펩타이드는 FcRn 결합을 향상시키기 위해 변형된다. FcRn과의 결합을 향상시키는 Fc 폴리펩타이드 돌연변이의 예시는 Met252Tyr, Ser254Thr, Thr256Glu (M252Y, S256T, T256E) (Kabat numbering, Dall’Acqua et al 2006, J. Biol ChemVol 281(33) 23514-23524), 또는 Met428Leu and Asn434Ser (M428L, N434S) (Zalevsky et al 2010 Nature Biotech, Vol. 28(2) 157-159)이다 (EU index of Kabat et al 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest). 일부 실시태양에서 Fc 폴리펩타이드 부분은 돌연변이되거나 Fc-매개 이합체화를 방해하기 위하여 변형된다 (Ying et al 2012 J. Biol Chem 287(23): 19399-19408). 상기 실시태양에서, 융합 단백질은 자연 상태에서 단합체(monomeric)이다.
융합 단백질 및 본 발명에서 제공하는 이의 변이체들은 예를 들어, 염증 반응 동안 호중구로부터 분비되는 인간 호중구 엘라스타제(neutrophil elastase, NE), 키모트립신-폴드 세린 프로테아제(chemotrypsin-fold serine protease)와 같은 세린 프로테아제를 억제하는 억제 활성을 나타낸다. 본 발명에서 제공하는 융합 단백질은 세린 프로테아제, 예를 들어, 인간 세린 프로테아제와 결합 또는 상호작용하여 완전히 또는 부분적으로 세린 프로테아제 발현 또는 활성을 감소 또는 조절한다. 세린 프로테아제의 생물학적 기능의 감소 또는 조절은 융합 단백질과 인간 세린 프로테아제 단백질, 폴리펩타이드 및/또는 펩타이드의 상호작용에 의해 완전히 또는 부분적이다. 융합 단백질은 세린 프로테아제 발현 또는 활성을 완전히 억제하는 것으로 여겨진다. 융합 단백질의 존재시의 세린 프로테아제 발현 또는 활성의 정도가 본 발명의 융합 단백질과의, 예를 들어, 결합과 같은 상호 작용이 없을 때의 세린 프로테아제 발현 또는 활성의 정도에 비해 적어도 95%, 예를 들어, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 감소했을 때, 세린 프로테아제 발현 또는 활성을 완전히 억제하는 것으로 여겨진다. 융합 단백질의 존재시의 세린 프로테아제 발현 또는 활성의 정도가 본 발명의 융합 단백질과의, 예를 들어, 결합과 같은 상호 작용이 없을 때의 세린 프로테아제 발현 또는 활성의 정도에 비해 적어도 95%, 예를 들어, 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 75%, 80%, 85% 또는 90% 감소했을 때, 세린 프로테아제 발현 또는 활성을 부분적으로 억제하는 것으로 여겨진다.
본 발명에 기재된 융합 단백질은 다양한 치료, 진단 및 예방 지표(prophylactic indications)로 유용하다. 예를 들어, 융합 단백질은 개체의 다양한 질병 및 장애를 치료하기에 유용하다. 일부 실시태양에서, 본 발명에 기재된 단백질을 포함하는 세르핀 융합 단백질은 알파-1-안티트립신 (AAT) 결핍, 기종(emphysema), 만성 폐쇄성 폐질환(chronic obstructive pulmonary disease, COPD), 급성 심근경색(acute respiratory distress syndrome, ARDS), 알러지성 천식(allergic asthma), 낭포성 섬유증(cystic fibrosis), 폐암(cancers of the lung), 예를 들어, 심장 이식(cardiac transplantation) 이후의 허혈성/재관류 손상을 포함하는 허혈성-재관류 손상(ischemia-reperfusion injury), 심근경색증(myocardial infarction), 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 화농성 관절염(septic arthritis), 건선성 관절염(psoriatic arthritis), 강직성 척추염(ankylosing spondylitis), 크론병(Crohn's disease), 건선(psoriasis), 타입 Ⅰ 및/또는 타입 Ⅱ 당뇨병, 박테리아 감염, 진균류 감염, 바이러스 감염, 폐렴(pneumonia), 패혈증(sepsis), 이식편대 숙주병(graft versus host disease, GVHD), 상처 치료, 전신성 홍반성 낭창(Systemic lupus erythematosis) 및 다발성 경화증(Multiple sclerosis)으로부터 선택되는 질병 또는 장애로 고통받고 있거나 상기 질병에 걸린 것으로 밝혀진 개체의 질병 또는 장애의 치료, 증상의 완화, 개선 및/또는 진행 지연에 유용하다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 현형된 융합 단백질 및 다른 변이체들을 포함한 본 발명의 융합 단백질 및 허용 가능한 담체를 포함한다. 본 발명의 약학적 조성물은 예를 들어, 진단 키트와 같은 키트를 포함할 수 있다.
도 1A는 본 발명에 따른 세르핀-Fc 융합 단백질의 일부 실시태양을 나타내는 도식이다. 세르핀은 융합 단백질 내의 어느 위치에도 위치할 수 있다. 하나 이상의 세르핀 폴리펩타이드를 포함하는 세르핀-Fc 융합 단백질 또한 나타낸다. 도 1B는 혈청 유래 AAT (레인 1), AAT-Fc1 (레인 2, DLSRKS IgG1 Fc) 및 AAT-EL-Fc1 (레인 3, AAT 내의 Met351Glu, Met358Leu 돌연변이들, 인간 IgG1 Fc)를 보여주는 SDS-PAGE 젤 사진이다. 도 1C는 AAT-Fc 융합 단백질에 의한 호중구 엘라스타제 활성 억제를 보여주는 그래프이다. 도 1D는 Fc폴리펩타이드 당 두 개의 AAT 폴리펩타이드를 가지는 4가(tetravalent) AAT-Fc-AAT를 나타내는 SDS-PAGE 젤 사진이다. 도 1E는 4가 AAT-Fc-AAAT 융합 단백질에 의한 호중구 엘라스타제 활성 억제를 보여주는 그래프이다. 도 1F는 단백질 A 레진(resin)으로부터의 낮은 Ph 용리(elution) 효과를 보여주는 도식이며, 낮은 pH에서 용리된 AAT-Fc 융합 단백질의 NE 억제 용량이 급격하게 감소하였다. 도 1G는 더블 돌연변이(double mutant)인 AAT-EL-Fc (Met351Glu, Met358Leu 돌연변이들)의 H2O2 불활성 (conc.)에 대한 저항성을 야생형 AAT 및 단일 돌연변이 AAT-EM-Fc (Met351Glu)와 비교하여 보여주는 그래프이다. 도 1H는 10mg/kg 단백질을 투여한 래트 (3 래트/시험 단백질)에서의 AAT-Fc와 비교한 혈청 유래 AAT(sdAAT) 의 혈청 간극(serum clearance)을 묘사하는 그래프이다. AAT-Fc의 반감기는 sdAAT의 반감기보다 대체로 길다.
도 2A는 본 발명의 세르핀-사이토카인 표적 융합 단백질의 일부 실시태양을 나타내는 도식이다. 세르핀은 중쇄, 경쇄 또는 항체의 중쇄 및 경쇄 모두와 융합될 수 있다. 세르핀-사이토카인 수용체 융합 단백질 또한 묘사된다. 도 2B는 D2E7 항체 (레인 1) 및 AAT-결합된 중쇄와 D2E7 항체 (레인 2)를 보여주는 SDS-PAGE 젤 사진이다. 도 2C는 AAT와 융합된 D2E7 항체에 의한 호중구 엘라스타제 활성 억제를 보여주는 그래프이다. 혈청 유래 AAT는 대조군으로 보여지는 반면, D2E7 항체 단독은 NE 억제에 대한 음성 대조군으로 나타낸다.
도 3A는 세르핀-Fc-WAP 융합 단백질의 일부 실시태양을 나타내는 도식이다. 도 3B는 AAT-Fc-ELAFIN (레인 1) 및 AAT-Fc-SLPI (레인 2)를 보여주는 SDS-PAGE 젤 사진이다. 도 3C는 AAT-Fc-ELAFIN 융합 단백질 및 AAT-Fc-SLPI 융합 단백질에 의한 호중구 엘라스타제 활성 억제를 보여주는 그래프이다. AAT-FC 융합 단백질 및 혈청 유래 AAT는 비교를 위해 포함된다.
도 4A는 AAT-HAS 융합 단백질의 일부 실시태양을 나타내는 도식이다. 도 4B는 AAT-HAS 융합을 보여주는 SDS-PAGE 젤 사진이다. 도 4C는 혈청 유래 AAT에 비한 AAT-HAS에 의한 호중구 엘라스타제 활성 억제를 보여주는 그래프이다.
인간 호중구 엘라스타제 (NE)는 염증 동안 호중구에서 분비되는 키모트립신-폴드 세린 프로테아제이다. NE의 비정상적 활성은 엘라스틴 조직의 점진적 열화(progressive degradation) 및 폐의 봉소상 구조를 천천히 파괴하여 폐기종 및 폐 섬유증을 유발한다 (Lungarella et al 2008 Int . J. Biochem Cell Biol 40:1287). 종종, 잘못 이해한 NE 활성은 이의 자연 억제제인 알파-안티트립신 (AAT)과 프로테아제의 불균형 때문이다. 상기 불균형은 흡연자들 및 낭포성 섬유증(Cystic Fibrosis, CF) 또는 급성호흡곤란증후군(Acute Respiratory Distress Syndrome, ARDS) 환자의 폐에서 관찰되는 것과 같이, 폐로 호중구 침투(neutrophil infiltration)가 증가하여 생긴 결과일 수 있다. 반대로, 대개 간에서 AAT의 뭉침(aggregate) 및 축적(accumulate)을 야기하는 점 돌연변이의 결과로 생긴 AAT의 결핍은 폐가 억제되지 않은 NE 활성에 노출되게 둔다. AAT 결손 장애인은 폐기종, COPD, 간 질병, 및 많은 다른 질환(conditions)의 위험이 증가한다.
AAT 결핍은 약 100,000 미국인들에게 영향을 미치며 (Alpha-1 Foundation의 추정에 따라서), 많은 고통받는 사람들이 30’대 및 40’대에 죽는다. 현재 AAT 결핍을 치료하기 위한 매우 적은 수의 FDA-승인된 약물들만이 존재한다 (Prolastin®, Aralast™, Zemaira®, Glassia™). 각각의 약물은 예상되는 임상적 요구를 충족시키기에 불충분한 것으로 보이는, 인간 혈장에서 유래한 자연 AAT이다. 또한, 상기 약물들은 짧은 혈청 반감기 (약 5일의 T1 /2)를 가지며 매주 고용량 (60 mg/체중kg)의 투여가 요구된다. 이와 같은 약물들에 대한 현재 시장은 약 $ 400 백만으로 추정된다. AAT-유사 약물에 대한 시장은, 무려 95%의 AAT-결핍을 가진 개인이 미확진인 예측, 및 이런 약물들이 개인에서 AAT-결핍이 아닌 향상된 NE 활성으로 특징지어진 병리현상 (예를 들어, 낭포성 섬유증 (CF), 급성호흡곤란증후군 (ARDS), 흡연-유발 폐기종 및/또는 COPD)에 대한 치료에 효과적일 가능성을 가진다는 사실에 기반하여 대체로 더 커질 것으로 예상된다.
AAT는 넓은 범위의 항-염증 활성을 가지는 것으로 여겨져왔다 (Tilg et al 1993 J Exp Med 178:1629-1636, Libert et al 1996 Immunol 157:5126-5129, Pott et al, Journal of Leukocyte Biology85 2009, Janciauskiene et al 2007 J. Biol Chem282(12): 8573-8582, Nita et al 2007 Int J Biochem Cell Biol 39:1165-1176). 최근, AAT가 흔히 권장되는 폐 염증성 질환들 이외에, 다양한 인간 병리현상 치료에 유용할 것이라는 증거가 제시되었다. 인간 AAT는 실험적 자가면역 뇌수막염(experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE)의 임상학적 및 조직병리학적 사인으로부터 마우스를 보호하는 것으로 나타나, 다발성 경화증 또는 전신 홍반성 낭창(systemic lupus erythematosus, SLE)와 같은 자가면역 질환을 치료할 수 있는 가능성이 있는 것으로 보인다 (Subramanian et al 2011 Metab Brain Dis 26:107-113). 혈청 AAT는 이식편대숙주병(Graft Versus Host Disease, GVHD)의 설치류 모델에서 활성을 보였고 (Tawara et al 2011 Proc . Natl . Acad . Sci. USA 109: 564-569, Marcondes et al 2011 Blood Nov 3;118(18):5031-9), 이는 AAT를 스테로이드 비-반응성 급성 GVHD(Steroid Non-responsive Acute GVHD)에 걸린 개체를 치료하기 위해 사용한 인간 임상 실험으로 이어졌다 (NCT01523821). 또한, AAT 는 타입 Ⅰ 및 타입 Ⅱ 당뇨병 동물 모델, 염증 감퇴(dampening inflammation), 섬세포 사포사멸 방지(islet cells) 및 섬세포 동종이식(allograft) 내구성 부여에 효과적이었다 (Zhang et al 2007 Diabetes 56:1316-1323, Lewis et al 2005 Proc Natl Acad SciUSA 102:12153-12158, Lewis et al 2008 Proc Natl Acad Sci USA 105:16236-16241, Kalis et al 2010 Islets 2:185-189). 현재, 혈청 유래 AAT 물질을 이용한 타입 Ⅰ 당뇨병에 대한 많은 초기임상(early human clinical trials)이 시도되고 있다 (NCT01183468, NCT01319331, NCT01304537).
현재 혈청-유래 AAT 물질들에서 병원성 바이러스를 제거하기 위해 광대하게 정제되고 있으며 실험이 진행되고 있으나, 감염성 인자의 전염을 완전히 제외할 수 없다. 또한, 혈청이 제한되어 있어, 혈청 유래 AAT의 생산 능력이 제한된다. 혈청 유래 물질의 걱정을 다루려는 시도 및 생산 쟁점은 재조합 AAT의 발현을 목표로 하였다. 그러나, 20년 후, 치료적으로 실현 가능한 재조합 AAT가 시장에 나왔으나 (Karnaukhova et al 2006 Amino Acids 30: 317). 혈장-유래 산물들처럼, AAT 재조합 버전은 짧은 혈청 반감기, 낮은 수율, 및 낮은 폐 기여도를 보이고 있다.
본 발명의 융합 단백질은 변형되지 않은 AAT 분자에 비해 향상된 기능성을 가진다. AAT 폴리펩타이드 및 신생아 Fc 수용체 (FcRN)과 상호작용하는 두 번째 폴리펩타이드의 융합은 혈청 반감기를 증가시켜, 환자에게 매우 필요한 투약량 혜택을 제공한다. 융합 단백질의 상기 FcRn 상호작용 폴리펩타이드는 인간 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 또는 IgM 유래 면역 글로불린 (Ig) Fc 폴리펩타이드 및 인간 알부민 유도체들을 포함한다. 일부 실시태양에서, 융합 단백질은 AAT 부분에 분자가 산화에 의한 불활성화에 더욱 저항성을 가지게 만드는 돌연변이를 포함한다. 예를 들어, Met351Glu, Met358Leu (AAT-EL-Fc)는 H2O2 산화에 의한 불활성에 저항성을 나타낸다 (도 1G). AAT 가 천연 항-염증성 단백질이나, 본 발명의 일부 실시태양은 AAT 폴리펩타이드 및 사이토카인 표적 폴리펩타이드의 융합을 통해 향상된 염증 감퇴 능력을 제공한다. AAT 및 두 번째 폴리펩타이드의 두 항-염증 기능의 결합은 폴리펩타이드 각각 자체에 비해 더욱 강력한 치료 단백질을 제공할 것이다. 또한, AAT의 항-감염 활성은 대부분의 생물학적 사이토카인 표적의 감염 위험을 경감시킬 것이다. 일부 실시태양은 AAT-폴리펩타이드 및 WAP 도메인을 포함하는 폴리펩타이드의 융합을 통해 더욱 강력한 항-염증 및 항-감염 단백질을 제공한다. 본 발명의 융합 단백질은 강력한 치료 유용성을 가질 것으로 기대되며 종래의 혈청 유래 AAT 산물보다 뛰어날 것으로 기대된다.
재조합 AAT의 반감기를 늘리기 위해, 재조합 DNA 기술을 이용하여 인간 gG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM 또는 HSA의 Fc 도메인과 융합한 AAT 유전자를 만들었고, 단백질 산물은 AAT 뒤에 Fc 도메인이 오거나 ((AAT-Fc (IgG1), AAT-Fc (IgG2), AAT-Fc (IgG3), AAT-Fc (IgG4), AAT-Fc (IgM)), HSA가 올 것으로 예상된다. HSA의 Fc 도메인과 다른 단백질, 단백질 도메인 또는 펩타이드과의 융합이 반감기를 증가시킬 수 있다고 알려져 있으나 (see e.g., Jazayeri et al . BioDrugs 22, 11-26, Huang et al . (2009) Curr Opin Biotechnol 20, 692-699, Kontermann et al . (2009) BioDrugs 23, 93-109, Schmidt et al . (2009) Curr Opin Drug Discov Devel 12, 284-295), Fc 도메인 또는 HSA 융합된 AAT가 적절한 폴딩 및 NE 억제 활성의 유지하거나, 재조합 AAT의 반감기를 늘릴 것이라는 건 알려져 있지 않다. 본 발명의 융합 단백질이 NE의 강력한 억제제이고, 혈청 발감기를 늘리며, 일부 실시태양에서 산화에 저항성을 가짐을 밝혔다. 다른 실시태양에서, 본 발명에 기재된 융합 단백질은 사이토카인 표적 폴리펩타이드 및 WAP 도메인 포함 폴리펩타이드를 포함하는 다른 기능성 폴리펩타이드와의 융합에 의해 구별되는 특성을 가진다.
본 발명에서 기재하는 융합 단백질은 적어도 세르핀 폴리펩타이드 또는 세르핀 유래 아미노산 서열 및 두 번째 펩타이드를 포함한다. 일부 실시태양에서, 예를 들어, 본 발명은 인간 IgG1-Fc, IgG2-Fc, IgG3-Fc, IgG4-Fc, IgM-Fc 또는HSA 유도체와 융합된 세르핀 폴리펩타이드를 제공한다. 본 발명의 세르핀-융합 단백질은 알파-1-안티트립신 (AAT) 결핍, 기종(emphysema), 만성 폐쇄성 폐질환(chronic obstructive pulmonary disease, COPD), 급성 심근경색(acute respiratory distress syndrome, ARDS), 알러지성 천식(allergic asthma), 낭포성 섬유증(cystic fibrosis), 폐암(cancers of the lung), 예를 들어, 심장 이식(cardiac transplantation) 이후의 허혈성/재관류 손상을 포함하는 허혈성-재관류 손상(ischemia-reperfusion injury), 심근경색증(myocardial infarction), 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 화농성 관절염(septic arthritis), 건선성 관절염(psoriatic arthritis), 강직성 척추염(ankylosing spondylitis), 크론병(Crohn's disease), 건선(psoriasis), 타입 Ⅰ 및/또는 타입 Ⅱ 당뇨병, 박테리아 감염, 진균류 감염, 바이러스 감염, 폐렴(pneumonia), 패혈증(sepsis), 이식편대 숙주병(graft versus host disease, GVHD), 상처 치료, 전신성 홍반성 낭창(Systemic lupus erythematosis) 및 다발성 경화증(Multiple sclerosis)를 포함한 다양한 징후들(indications)의 치료에 유용할 것으로 예상되나, 이에 한정되지 않는다.
일부 실시태양에서, 본 발명에 기재된 융합 단백질은 적어도 알파-1-안티트립신 (AAT) 폴리펩타이드 또는 AAT 유래 아미노산 서열 및 두 번째 폴리펩타이드를 포함한다. 예를 들어, 본 발명은 알파-1-안티트립신 (AAT) 융합된 인간 IgG1-Fc, IgG2-Fc, IgG3-Fc, IgG4-Fc, IgM-Fc 또는 HSA 유도체를 제공한다.
일부 실시태양에서,
일부 실시태양에서, 본 발명에 기재된 융합 단백질은 적어도 세르핀 폴리펩타이드 또는 세르핀 폴리펩타이드로부터 유래한 아미노산 서열 및 사이토카인 표적 폴리펩타이드 또는 사이토카인 표적 폴리펩타이드 또는 사이토카인 표적 폴리펩타이드 유래 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 본 발명은 인간 사이토카인 수용체 또는 이의 유도체와 융합된 세르핀 폴리펩타이드 또는 세르핀 폴리펩타이드 유래 서열을 제공한다. 본 발명의 또 다른 실시태양은 사이토카인 표적 항체 예를 들어, 항-사이토카인 항체, 또는 사이토카인 표적 항체 유래 서열, 예를 들어, 항-사이토카인 항체, 또는 사이토카인 표적 항체의 단편으로부터 유래한 서열, 예를 들어, 항-사이토카인 항체의 단편과 융합된 세르핀 폴리펩타이드 또는 세르핀 폴리펩타이드 유래 서열을 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 사이토카인 폴리펩타이드와 융합된 세르핀 폴리펩타이드 또는 세르핀 폴리펩타이드 유래 서열을 제공하며, 상기 사이토카인 표적 폴리펩타이드는 하기의 인간 사이토카인과 결합한다: TNFα, IgE, IL-12, IL-23, IL-6, IL-1α, ILβ1β, IL-17, IL-13, IL-4, IL-10, IL-2, IL-18, IL-27 또는 IL-32.
예를 들어, 일부 실시태양에서, 사이토카인 표적 폴리펩타이드는 TNFα를 표적화하고 하기의 TNFα-표적 폴리펩타이드 또는 TNFα-표적 폴리펩타이드 유래 서열을 포함한다: Remicade®, Humira®, Simponi®, Cimiza®, Enbrel® 또는 ATN-103 및 ATN-192.
예를 들어, 일부 실시태양에서, 사이토카인 표적 폴리펩타이드는 IgE를 표적으로 하고, 하기의 IgE-표적 폴리펩타이드 또는 IgE-표적 폴리펩타이드 유래 서열을 포함한다: Xolair 또는 FcεRI.
예를 들어, 사이토카인 표적 폴리펩타이드는 IL-12 및 IL-23의 공유된 서브유닛 p40을 표적으로하고 Stelara® 폴리펩타이드 또는 Stelara® 폴리펩타이드 유래 서열을 포함한다
예를 들어, 사이토카인 표적 폴리펩타이드 Stelara®는 IL-13을 표적으로 하고 CDP7766 폴리펩타이드 또는 CDP7766 폴리펩타이드 유래 서열을 포함한다.
일부 실시태양에서, 본 발명에 기재된 융합 단백질은 적어도 알파-1-안티트립신 (AAT) 폴리펩타이드 또는 AAT 유래 아미노산 서열 및 사이토카인 표적 폴리펩타이드 또는 사이토카인 표적 폴리펩타이드 유래 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 본 발명은 사이토카인 표적 폴리펩타이드와 융합된 알파-1-안티트립신 억제제 (AAT)를 제공하고, 상기 사이토카인 표적 폴리펩타이드는 하기의 인간 사이토카인과 결합한다: TNFα, IgE, IL-6, IL-1α, IL-1β, IL-12, IL-17, IL-13, IL-23, IL-4, IL-10, IL-2, IL-18, IL-27 또는 IL-32.
일부 실시태양에서 사이토카인 표적 폴리펩타이드는 사이토카인 수용체와 결합하고 사이토카인의 결합을 방지한다. 예를 들어, 본 발명은 사이토카인 수용체 표적 항체와 융합된 세르핀을 포함한다. 예를 들어, 본 발명은 사이토카인 표적 폴리펩타이드와 융합된 알파-1-안티트립신 억제제 (AAT)를 제공하며, 상기 사이토카인 표적 폴리펩타이드는 하기의 인간 사이토카인의 수용체와 결합한다: TNFα, IgE, IL-6, IL-1α, ILβ1β, IL-12, IL-17, IL-13, IL-23, IL-12 및 IL-23의 서브 유닛 p40, IL-4, IL-10, IL-2, IL-18, IL-27 또는 IL-32.
예를 들어, 일부 실시태양에서, 사이토카인 표적 폴리펩타이드는 IL-6 수용체를 표적으로 하며, Actemra® 폴리펩타이드 (특허 공개 번호 EP0628639에 기재된), 또는 ALX-0061 폴리펩타이드 (WO2010/115998에 기재된), 또는 Actemra® 폴리펩타이드 또는 ALX-0061 폴리펩타이드 로부터 유래된 서열을 포함한다.
예를 들어, 사이토카인 표적 폴리펩타이드인 Actemra®는 IL-6 수용체를 표적으로 하고 토실리주맙(tocilizumab) 폴리펩타이드 또는 토실리주맙 폴리펩타이드 유래 서열을 포함한다.
단백질 치료에 의한 염즘 사이토카인 및 면역-증진 약제의 표적화는 많은 염증 질환에서 임상적 성공을 보여줬다. 사이토카인 표적 약제로 이용되는 가장 일반적인 단백질은 수용성 사이토카인 수용체(soluble cytokine receptors) 및 단일클론 항체 및 이의 단편이다. 사이토카인 표적화의 중요한 문제점은, TNF 생물학적 표적화, Remicade®, Humira®, Simponi®, Cimiza®, and Enbrel®, 및 IL-12/23 p40 표적 항체, Stelara®에 의해 증명된 것처럼, 환자들에서의 감염 위험 증가이다. AAT 및 다른 세르핀 단백질은 항-감염 및 항-염증 활성이 있는 것으로 입증되었다. 따라서, 본 발명의 세르핀-사이토카인 표적 융합 단백질은 감염의 위험을 완화하면서 동시에 비정상적 사이토카인 활성을 감퇴시킬 수 있다.
일부 실시태양에서, 본 발명에 기재된 융합 단백질은 세르핀 폴리펩타이드 또는 세르핀 유래의 아미노산 서열, WAP 도메인 포함 폴리펩타이드 또는 WAP 도메인-포함 폴리펩타이드 유래의 아미노산 서열, 및 Fc 폴리펩타이드 또는 Fc 폴리펩타이드 유래의 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 본 발명은 작동 가능하게 기능적 조합으로 함께 연결된 세르핀 폴리펩타이드, WAP 도메인-포함 폴리펩타이드 및 인간 IgG1-Fc, IgG2-Fc, IgG3-Fc, IgG4-Fc 또는 IgM-Fc 유도체를 제공한다. 일부 실시태양에서, WAP 도메인 포함 단백질은 인간 SLPI이거나 인간 SLPI으로 부터 유래된다. 다른 실시태양에서, WAP 도메인 포함 단백질은 인간 ELAFIN이거나 인간 ELAFIN으로부터 유래된다. 일부 실시태양에서, 본 발명에 기재된 융합 단백질은 적어도 알파-1-안티트립신 (AAT) 폴리펩타이드 또는 AAT 유래 아미노산 서열 및 SLPI 폴리펩타이드 또는 SLPI 유래 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시태양에서, 본 발명에 기재된 융합 단백질은 적어도 AAT 폴리펩타이드 또는 AAT 유래 아미노산 서열 및 ELAFIN 폴리펩타이드 또는 ELAFIN 유래 아미노산 서열을 포함한다.
SPLI 및 Elafin은 세닐 프로테아제 억제 활성을 나타내는 WAP 도메인 포함 단백질이다. 상기 두 단백질은 항-염증 기능을 가진다. 또한, 상기 단백질들은 많은 종의 박테리아, 바이러스 및 진균류에 대해 광범위한 항-감염 능력을 가진다.
일부 실시태양에서, 본 발명에 기재된 융합 단백질은 적어도 세르핀 폴리펩타이드 또는 세르핀 유래 아미노산 서열 및 인간 혈청 알부민 (HSA) 폴리펩타이드 또는 HSA 유래 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명의 추가적인 실시태양은 세르핀-알부민 결합 폴리펩타이드 융합 단백질을 포함하며, 상기 알부민 결합 폴리펩타이드 융합 단백질을 포함하며, 상기 알부민 결합 폴리펩타이드는 세르핀 및 HSA의 연결(association)을 담당한다. 따라서, 본 발명은 세르핀 폴리펩타이드 및 HSA 폴리펩타이드 또는 세르핀 또는 HSA 폴리펩타이드 유래 서열의 공유 및 비-공유 결합을 모두 포함한다. 예를 들어, 본 발명은 인간 HSA 또는 HSA 유도체, 또는 HSA 결합 펩타이드 또는 폴리펩타이드와 융합된 세르핀 폴리펩타이드를 제공한다.
일부 실시태양에서, 본 발명에 기재된 융합 단백질은 적어도 알파-1-안티트립신 (AAT) 폴리펩타이드 또는 AAT 유래 아미노산 서열 및 HSA 폴리펩타이드 또는 HSA 폴리펩타이드 유래 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 본 발명은 HSA 또는 HSA 유래 단편, 또는 알부민 결합 폴리펩타이드와 융합된 알파-1-안티트립신 (AAT) 폴리펩타이드를 제공한다.
일부 실시태양에서, 본 발명에 기재된 융합 단백질은 세르핀 폴리펩타이드 또는 세르핀 유래 아미노산 서열, HSA 폴리펩타이드 또는 HSA 유래 아미노산 서열, 및 WAP 도메인-포함 폴리펩타이드 또는 WAP 도메인-포함 폴리펩타이드 유래 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시태양에서, 본 발명에 기재된 융합 단백질은 적어도 알파-1-안티트립신 (AAT) 폴리펩타이드 또는 AAT 유래 아미노산 서열 및 HSA 폴리펩타이드 또는 HSA 폴피펩타이드 유래 아미노산 서열, 및 SLPI 폴리펩타이드 또는 SLPI 유래 아미노산 서열을 포함한다. 다른 실시태양에서, 본 발명에 기재된 융합 단백질은 적어도 알파-1-안티트립신 (AAT) 폴리펩타이드 또는 AAT 유래 아미노산 서열 및 HSA 폴리펩타이드 또는 HSA 폴피펩타이드 유래 아미노산 서열, 및 Elafin 폴리펩타이드 또는 Elafin 유래 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 융합 단백질은 포유동물 세포 발현 시스템에서 쉽게 생산될 수 있다. 예를 들어, 중국햄스터난소(Chinese Hamster Ovary, CHO) 세포, 인간배아신장(Human Embryonic Kidney, HEK) 세포, COS 세포, PER.C6®, NS0 세포, SP2/0, YB2/0는 본 발명에 기재된 세르핀 융합 단백질의 발현을 위해 쉽게 이용될 수 있다. 중요한 것은, 치료적으로 이용하기에 일반적으로 가장 최선인 포유동물 세포 발현 시스템으로 단백질을 생산하는 것이다. 박테리아, 곤충, 또는 효모-기반한 발현 시스템과 달리, 포유동물 세포 발현 시스템은 인간 천연 단백질에서 발견되는 것과 유사하거나 동일한 글리코실화(glycosylation)된 형태의 단백질을 산출한다. 단백질의 적절한 글리코실화는 혈청 안정성(serum stability), 약리역학(pharmacokinetics), 생물학적 분배(biodistribution), 단백질 접힘(protein folding), 및 기능성(functionality)에 크게 영향을 줄 수 있다. 따라서, 치료 단백질을 포유동물 발현 시스템에서 생산할 수 있는 능력은 다른 시스템에 비해 분명히 유용하다. 또한, 대부분의 포유동물 세포 발현 시스템 (예를 들어, CHO, NS0, PER.C6® 세포)은 임상적인 요구에 대응해 치료 단백질을 생산하기 위해 손쉽게 상업적인 제조 설비 스케일로 제조될 수 있다. 본 발명에 기재된 융합 단백질은 자연형 AAT에 비해 기능성이 향상되었으며 임상적 및 상업적 공급을 위해 포유동물 발현 시스템으로 생산될 수 있다. 본 발명의 일부 실시태양은 NE 억제 능력을 보유하는 세르핀 융합 단백질의 분리를 가능하게 하는 정제 시스템을 포함한다. 중요한 것은, 본 발명의 정제 과정은 현재의 상업적 포유동물 세포-기반 생산 과정에 손쉽게 포함될 수 있다.
따로 명시되지 않는 한, 본 발명과 관련되어 사용된 과학적 및 기술적 용어들은 통상의 기술 분야의 통상의 기술자들에게 자명한 의미를 가질 것이다. 또한, 문맥에서 요구되지 않는 한, 단수형 용어는 다수를 포함할 것이며 복수 용어들은 단수를 포함할 것이다. 일반적으로, 본 발명에 기재된 세포 및 조직 배양, 분자 생물학, 및 단백질 및 올리고-또는 폴리뉴클레오티드 화학 및 하이브리다이제이션(hybridization) 관련되어 활용된 명명법, 및 이의 기술들은 통상의 기술 분야에서 일반적이고 자명하다. 재조합 DNA, 올리고뉴클레오타이드 합성 및 조직 배양 및 트랜스포메이션(transformation) (예들 들어, 전기 천공법(electroporation), 리포펙션(lipofection))에 대한 표준 기술들이 이용되었다. 제조 업체의 설명서 또는 통상의 기술 분야에서 일반적으로 수행되는 방법 또는 본 발명에 기재된 방법에 따라 효소 반응 및 정제 기술들이 수행되었다. 앞서 말한 기술들 및 방법들은 일반적으로 통상의 기술 분야에 자명한 종래의 방법에 따라서, 본 명세서에서 인용되고 논의된 다양한 일반적이고 더욱 구체적인 참조 문헌들에 기재된 바와 같이 수행된다. Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)) 참조. 본 발명에 기재된 분석 화학(analytical chemistry), 합성 유기화학(synthetic organic chemistry), 및 의학 및 약학 화학과 관련하여 사용된 명명법 및 실험 과정 및 기술은 통상의 기술 분야에서 일반적으로 잘 알려져 있다. 화학 합성, 화학 분석, 약제학 제제(pharmaceutical preparation), 제형, 및 운반, 및 환자 치료에 표준 기술이 사용된다. 상기 용어 환자는 인간 및 가축을 포함한다.
본 발명에 따른 신개념 치료제는 허용 가능한 담체, 완충제, 첨가제, 및 다른 약제들과 함께 투여될 수 있으며, 전달, 운반, 관용(tolerance) 등등이 향상된 제형에 포함된다. 다수의 적절한 제형은 모든 약사들이 알고 있는 처방전에서 찾아볼 수 있다: Remington's Pharmaceutical Sciences (15th ed, Mack Publishing Company, Easton, PA (1975)), 특히, Chapter 87 by Blaug, Seymour, 안에. 상기 제형들은 예를 들어, 분말, 페이스트(pastes), 연고, 젤리, 왁스, 오일, 지질(lipids), 지질(양이온 또는 음이온) 함유 비히클(vesicles) (Lipofectin™와 같은), DNA 결합체(conjugates), 무수 흡습성 페이스트(anhydrous absorption pastes), 수중유적형(oil-in-water) 및 유중수적형(water-in-oil) 에멀전, 카바왁스 에멀전(water-in-oil) (다양한 분자량의 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycols)), 반-고체 젤, 카바왁스(carbowax)를 함유하는 반-고체 혼합물을 포함한다. 앞서 말한 혼합물은 본 발명에 따른 처리 및 치료에 적합할 것이며, 제형에 포함된 유효 성분(active ingredient)은 제형에 의해 불활성화되지 않고 제형은 생리학적으로 호환가능하고 투여 경로에 적절하다. 또한, Baldrick P. “Pharmaceutical excipient development: the need for preclinical guidance.” Regul. Toxicol Pharmacol. 32(2):210-8 (2000), Wang W. “Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals.” Int. J. Pharm. 203(1-2):1-60 (2000), Charman WN “Lipids, lipophilic drugs, and oral drug delivery-some emerging concepts.” J Pharm Sci. 89(8):967-78 (2000), Powell et al. “Compendium of excipients for parenteral formulations” PDA J Pharm Sci Technol. 52:238-311 (1998) 및 이에 인용된 문헌에 제형, 첨가제 및 담체에 대해 약사들에게 자명한 것으로 추가된 정보를 참조하라.
본 발명의 융합 단백질을 포함하는 본 발명의 약학적 제형(formulations)은 개체에게서 비정상적 세린 프로테아제 활성과 관련된 질병 또는 질환과 관련된 증상을 치료 또는 완화시키기 위해 사용된다. 또한, 본 발명은 개체에게서 비정상적 세린 프로테아제 활성과 관련된 질병 또는 질환과 관련된 증상을 치료 또는 완화하는 방법을 제공한다. 치료 요법은 환자, 예를 들어, 비정상적 세린 프로테아제 활성과 관련된 질병 또는 장애로 고통받는 인간 환자를, 다양한 임상적 및/또는 실험 과정을 포함하는 방법을 이용하여 식별하여 수행한다. 용어 환자는 인간 및 가축을 포함한다. 용어 개체는 인간 및 다른 포유동물을 포함한다.
치료의 유효성은 비정상적 세린 프로테아제 활성과 관련된 특정 질병 또는 장애를 진단 또는 치료하는 알려진 방법으로 결정된다. 비정상적인 세린 프로테아제 활성과 관련된 질병 또는 장애의 하나 또는 그 이상의 증상의 완화는 융합 단백질이 임상적으로 유용한 것을 나타낸다.
원하는 특이성을 가지는 융합 단백질의 스크리닝 방법은 효소결합면역흡착측정법(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA), 효소 분석, 유세포 분석법, 및 통상의 기술 분야에 자명한 다른 면역학적 기술들을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 기재된 용합 단백질은 통상의 기술 분야에서 세린 프로테아제와 같은 표적의 위치(localization) 및/또는 정량과 관련된 것으로 알려진 방법, 예를 들어, 적절한 생리학적 시료에서의 상기 표적의 수준 측정, 진단 방법, 단백질의 이미징, 등등에 이용될 수 있다.
본 발명에서 교환 가능하게 사용된 용어 “생리학적 시료(physiological sample)” 및 “생물학적 시료(biological sample)”는 개체에게서 분리된 조직, 세포 및 생물학적 체액(biological fluids), 또한, 개체 내에 존재하는 조직, 세포 및 체액을 포함한다. 따라서, 용어 “생리학적 시료”및 “생물학적 시료”의 용법에 혈액 및 혈청, 혈장 또는 림프액을 포함한 혈액의 분획 또는 성분을 포함한다.
제공된 실시태양에서, 표적, 표적-결합 도메인을 함유하는 이의 유도체, 단편, 유사체 또는 동족체(homolog)에 대해 특이적인 융합 단백질은 약물학적 활성 화합물 (아래에 “치료(Therapeutics)”로 나타내는)로 이용된다.
본 발명의 융합 단백질은 면역친화(immunoaffinity), 크로마토그래피(chromatography) 또는 면역 침강(immunoprecipitation)과 같은 표준 기술을 이용하여 특정 표적을 분리하기 위해 사용될 수 있다. 검출은 융합 단백질과 검출 가능한 물질과의 결합 (즉, 물리적인 연결)에 의해 촉진될 수 있다. 검출 가능한 물질은 다양한 효소, 보결분자단(prosthetic group), 형광 물질(fluorescent materials), 발광 물질(luminescent materials), 생물발광 물질(bioluminescent materials) 및 방사능 물질을 포함한다. 적합한 효소들은 겨자무과산화효소(horseradish peroxidase), 알칼라인 포스파타아제(alkaline phosphatase),ββ-갈락토시다아제ββ-galactosidase) 또는 아세틸콜린에스터라아제(acetylcholinesterase)를 포함하며; 적합한 보결분자단 집합체의 예시는 스트렙타비딘/비오틴(streptavidin/biotin) 및 아비딘/비오틴(avidin/biotin)을 포함하고; 적합한 형광 물질은 움벨리페론(umbelliferone), 플루오레세인(fluorescein), 플루오레세인 이소티오사이아네이트(fluorescein isothiocyanate), 로다민(rhodamine), 디클로로트리아지닐아민 플루오로세인(dichlorotriazinylamine fluorescein), 단실 클로라이드(dansyl chloride) 또는 피로에리트린(phycoerythrin)을 포함하며; 적합한 발광 물질은 루미놀(luminal)을 포함하며; 생물발광 물질은 루시퍼라아제(luciferase), 루시페린(luciferin) 및 에쿼린(aequorin)을 포함하고, 적합한 방사능 물질은 125I, 131I, 35S 또는 3H 를 포함한다.
본 발명의 융합 단백질의 치료학적으로 유효한 양은 일반적으로 치료 목적을 달성하기 위해 필요한 량을 말한다. 상기 언급한 바와 같이, 어떤 경우에, 융합 단백질 및 이의 표적 단백질과의 결합 상호작용은 표적의 기능을 방해할 것이다. 또한, 투여 요구량은 융합 단백질과 이의 특정 표적과의 결합 친화도에 의해 결정되며, 또한 투여되는 융합 단백질이 자유 부피(free volume) 또는 투여되는 개체로부터 사라지는 속도에 의해 결정될 것이다. 본 발명의 융합 단백질 또는 이의 단편 치료적으로 유효한 투여량에 대한 공통 범위는 약 0.1 mg/체중kg 내지 약 250 mg/체중kg이나, 이에 한정되지 않는다. 공통 투여 빈도는 예를 들어 하루에 두 번 내지 한 달에 한번일 것이다.
융합 단백질이 사용될 때, 표적에 특이적으로 결합하는 가장 작은 억제 단편이 바람직하다. 예를 들어, 펩타이드 분자는 표적에 결합하는 능력을 보유하도록 디자인될 수 있다. 이런 펩타이드는 화학적으로 합성될 수 있고 및/또는 재조합 DNA 기술에 의해 생산될 수 있다 (예를 들어,Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7889-7893 (1993) 참조). 또한, 제형은 치료되어야 할 특정 지표를 위해 필요한, 바람직하게는 상호 보완적인 활성을 가지는, 서로에게 반대되는 효과를 나타내지 않는 하나 이상의 유효 화합물을 함유할 수 있다. 또는, 또한, 조성물은 이의 기능을 향상시키는 예를 들어, 세포독성 제제(cytotoxic agent), 사이토카인(cytokine), 화학요법제(chemotherapeutic agent), 성장-억제제(growth-inhibitory agent), 항-염증제(항-inflammatory agent) 또는항-감염제(항-infective agent)와 같은 약제를 포함할 수 있다. 이런 분자들은 목적에 충분히 효과적인 양으로 적합하게 조합되어 존재한다.
또한, 유효 성분은 예를 들어, 코아세르베이션(coacervation) 기술 또는 계면중합(interfacial polymerization) 기술, 예를 들어, 하이드록시메틸셀룰로즈(hydroxymethylcellulose) 또는 젤라틴-마이크로캡슐(gelatin-microcapsules) 및 폴리(메틸메트아크릴레이트) 마이크로캡슐(poly-(methylmethacrylate) microcapsules)에 의해 만들어진 마이크로캡슐 또는 콜로이드 드러그 운반 시스템(colloidal drug delivery systems) (예를 들어, 리포좀, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀전, 나노-파티클 및 나노캡슐) 또는 마크로에멀전에 각각 넣어질 수 있다.
생체 내 투여를 위해 사용되는 제형은 멸균되어야 한다. 이는 멸균된 여과막을 통해 여과를 의해 손쉽게 달성된다.
지효성 제제(sustained-release preparations)가 제조될 수 있다. 적합한 지효성 제제는 융합 단백질을 함유하는 고체 소수성 폴리머(solid hydrophobic polymers) 반투과성 매트리스(semipermeable matrices)를 포함하며, 상기 매트리스는 예를 들어, 필름, 또는 마이크로 캡슐과 같은 성형품의 형태이다. 지효성 매트리스는 폴리에스터(polyesters), 하이드로젤(hydrogels) (예를 들어, 폴리(2-하이드록시에틸-메트아크릴레이트(poly(2-hydroxyethyl-methacrylate)) 또는 폴리(바이닐알콜)(poly(vinylalcohol))), 폴리락타이드(polylactides) (U.S. Pat. No. 3,773,919), L-글루탐산(glutamic acid) 및 γ 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비분해성의(non-degradable) 에틸렌-바이닐 아세테이트, LUPRON DEPOT™와 같은 분해성 락틱산-글라이콜릭산 공중합체 (락트산-글라이콜릭산(lactic acid-glycolic acid) 공중합체 및 류프로라이드 아세테이트(leuprolide acetate)로 구성되는 주사 가능한 마이크로스피어), 및 폴리-D-(-)-3-하이드록시부티르산(poly-D-(-)-3-hydroxybutyric acid)을 포함한다. 에틸렌-바이닐 아세테이트 및 락트산-글라이콜릭산과 같은 폴리머들이 100일 동안 분자의 방출 가능하게 하는 반면, 하이드로젤은 단백질의 방출을 더 짧은 기간 동안 가능하게 한다.
약학적 조성물
본 발명의 융합 단백질 (“활성 화합물(active compounds)”로도 불리는), 및 이의 유도체, 단편, 유사체 및 동족체는 투여를 위해 적합한 약학적 조성물로 포함될 수 있다. 이러한 조성물은 특히 융합 단백질 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다. 본 발명에서 사용한 용어 “약학적으로 허용 가능한 담체”는 약학적으로 투여하기 적합한 모든 용매, 분산매, 코팅, 항생제 및 항 진균제, 등장액 및 흡수 지연제 및 등등을 포함한다. 적합한 담체는 통상의 기술 분야에서 표준 참고 문헌이고 참조로서 본 발명에 포함되는 Remington’s Pharmaceutical Sciences 가장 최근 에디션에 기재된다. 이러한 담체 또는 희석제의 바람직한 예시는 증류수(water), 식염수(saline), 링거액(ringer’s solutions), 덱스트로스 용액(dextrose solution) 및5% 인간 혈청 알부민을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 불휘발성유(fixed oils)과 같은 리포좀 및 비-수용성 비지클 또한 이용될 수 있다. 이러한 이용미디어(media) 및 약제의 약학적으로 활성 물질로의 이용은 통상의 기술 분야에 자명하다. 활성 화합물과 충돌하는 종래의 미디어 또는 약제를 제외하고는 조성물에 이용하는 것이 고려된다. 추가적인 활성 화합물(Supplementary active compounds) 또한 조성물에 포함될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 목적하는 투여 경로에 적합하게 제형화될 수 있다. 투여 경로의 예시는 비경구(parenteral) 투여, 예를 들어, 정맥 주사의(intravenous), 피내(intradermal), 피하(subcutaneous), 구강(oral) (예를 들어, 흡입), 경피(transdermal) (즉, 국소), 경점막(transmucosal) 및 직장(rectal) 투여를 포함한다. 비경구, 피내 또는 피하 적용 용액 또는 현탁액은 하기의 요소들을 포함할 수 있다: 주사를 위한 증류수, 식염수, 불휘발성유, 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycols), 글리세린(glycerine), 프로필렌 글리콜(propylene glycol) 또는 다른 합성된 용액(synthetic solvents)과 같은 멸균 희석제; 벤질 알코올(benzyl alcohol) 또는 메틸 파라벤(methyl parabens)과 같은 항생제; 아스코르빈산(ascorbic acid) 또는 소듐 바이설파이트(sodium bisulfate)와 같은 항산화제; EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid)와 같은 킬레이트제(chelating agents); 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트와 같은 완충제, 및 소듐 클로라이드(sodium chloride) 또는 덱스트로즈(dextrose)와 같은 긴장성(tonicity)을 맞추기 위한 약제. Ph는 염산(hydrochloric acid) 또는 수산화나트륨(sodium hydroxide)과 같은 산 또는 염기로 맞춰질 수 있다. 비경구 제제(parenteral preparation)는 유리 또는 플라스틱으로 만들어진 앰플, 일회용 주사기 또는 주사액병에 동봉될 수 있다.
주사에 적합한 약학적 조성물은 멸균 주사용액 또는 분산제(dispersion)의 즉석 제조(extemporaneous preparation)를 위한 멸균된 수용액 (물에 녹는) 또는 분산제 및 멸균 분말을 포함한다. 정맥 투여를 위해 적합한 담체는 생리식염수, 세균 발육 억제제(bacteriostatic water), Cremophor EL™ (BASF, Parsippany, N.J.) 또는 PBS(phosphate buffered saline)를 포함한다. 모든 경우에, 조성물은 소독되어야 하고, 주사하기 쉬운 유체여야 한다. 제조 및 보관 조건 하에 안정해야 하며 박테리아 및 진균류와 같은 미생물의 오염이 방지되어야 한다. 담체는 용액 또는 분산매(dispersion medium)를 함유한, 예를 들어, 증류수, 에탄올, 폴리올(polyol) (예를 들어, 글리콜, 프로필렌 글리콜 및 폴리에틸렌글리콜 액체 등등) 및 이의 적절한 혼합물일 수 있다. 적절한 유동성이 예를 들어, 레시틴(lecithin)와 같은 코팅에 의해, 분산시 요구되는 입자 사이즈 유지에 의해 및 계면활성제의 이용에 의해 유지될 수 있다. 다양한 항생제 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르빈산, 티메로살(thimerosal) 등등에 의해 미생물이 억제될 수 있다. 많은 경우에, 등장액(isotonic agents), 예를 들어, 당류(sugars), 만니톨, 소르비톨, 소듐 클로라이드와 같은 폴리 알코올(polyalcohols)을 조성물에포함하는 것이 바람직할 것이다. 조성물에 흡수를 지연시키는 약제, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트(aluminum monostearate) 및 젤라틴(gelatin)을 포함하여 주사 가능한 조성물의 장기적인 흡수가 유발될 수 있다.
멸균 주사액은 필요한 양의 활성 화합물과 상기에 열거된 성분 하나 또는 이의 조합과 함께 적절한 용매에 포함하여 제조될 수 있으며, 필요하다면, 그 후에 여과되어 멸균될 수 있다. 일반적으로, 분산제(dispersions)는 활성 화합물 및 필요하다면 상기 열거된 다른 성분들을, 기본 분산매를 함유하는 멸균된 비지클에 포함하여 제조할 수 있다. 멸균 주사액을 제조하기 위한 멸균 분말(sterile powders)의 경우, 제조 방법은 상기 멸균-여과 용액으로부터 활성 성분 및 다른 추가적인 원하는 성분의 분말을 수득하는 진공 건조 및 동결 건조이다.
구강용 조성물은 일반적으로 비활성 희석제(inert diluent) 또는 식용 담체를 포함한다. 상기 물질들은 젤라틴 캡슐에 포함되거나 알약으로 압축된다. 치료적 구강 투여를 위해, 활성 화합물은 첨가제와 함께 포함될 수 있으며 알약, 트로키 (troches) 또는 캡슐의 형태로 사용될 수 있다. 또한, 구강 조성물은 구강 청결제로 이용하기 위해 액상 담체를 이용하여 제조될 수 있으며, 상기 액상 담체에 포함된 화합물은 입을 통해서 휙 지나가서 뱉거나 삼켜진다. 약학적으로 호환 가능한 결합제 및/또는 보조 물질이 조성물의 일부로 포함될 수 있다. 알약(tablets), 정제(pills), 캡슐(capsules), 트로키(troches) 및 등등은 하기의 성분, 또는 유사한 천연 화합물을 포함할 수 있다: 미세 결정 성 셀룰로오스, 검 트라가 칸트 또는 젤라틴과 같은 결합제(binder); 전분 또는 락토오스와 같은 첨가물, 알긴산, Primogel, 또는 옥수수 전분과 같은 붕해제(disintegrating agent); 마그네슘 스테아레이트 또는 스테로트(Sterotes)와 같은 윤활제(lubricant); 콜로이드 성 이산화 규소와 같은 활택제(glidant), 수크로오스 또는 사카린(saccharin)과 같은 감미제; 또는 페퍼민트, 메틸 살리실레이트, 또는 오렌지 향료와 같은 향미제(flavoring agent).
흡입 투여를 위해, 화합물은 적합한 압축 가스, 예를 들어, 카본 디옥사이드와 같은 가스를 함유하는 압축 컨테이너 또는 용기, 또는 분무기로부터 에어로졸 스프레이 형태로 전달된다.
또한, 전신 투여는 점막 또는 경피 방법으로 투여될 수 있다. 점막 또는 경피 투여를 위해, 스며들기 위한 장벽으로 적합한 침투제(penetrants)가 제형으로 이용된다. 이런 침투제는 통상의 기술 분야에 자명하며, 예를 들어, 점막 투여를 위한 세정제(detergents), 담즙염(bile salts) 및 후시딕 산 유도체(fusidic acid derivatives)를 포함한다. 점막 투여는 비강 스프레이(nasal sprays) 또는 좌약(suppositories) 이용을 통해 달성될 수 있다. 경피 투여를 위해, 활성 화합물은 통상의 기술 분야에 일반적으로 알려진 연고, 고약(salves), 젤 또는 크림으로 제조된다.
또한, 화합물은 직장 전달을 위해 좌약 (예를 들어, 코코아 버터 및 다른 글리세라이드와 같은 종래의 좌약 베이스) 또는 정체 관장(retention enemas)의 형태로 제조될 수 있다.
한 실시태양에서, 활성 화합물은 주입(implants) 및 마이크로캡슐(microencapsulated) 전달 시스템을 포함한 방출 조절 제형과 같이 화합물을 몸에서 빨리 제거되지 않게 할 수 있는 담체와 함께 제조될 수 있다. 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리 안 하이드 라이드, 폴리 글리콜 산, 콜라겐, 폴리 오르토 에스테르 및 폴리 락트산과 같은 생분해성, 생체 적합한 폴리머들이 이용될 수 있다. 이런 제형의 제조 방법은 통상의 기술자들에게 자명하다. 또한 재료들은 Alza Corporation 및 Nova Pharmaceuticals, Inc로부터 상업적으로 얻을 수 있다. 또한 리포좀 현탁액이 약학적으로 허용 가능한 담체로 이용될 수 있다. 이는 통상의 기술자들에게 자명한 방법, 예를 들어 U.S. Patent No. 4,522,811에 기재된 방법에 따라 제조될 수 있다.
투여 및 균일 투여(uniformity of dosage)가 용이한 단위 투여 제형(dosage unit forms)의 구강 또는 비경구 조성물 제조에 특히 유리하다. 본 발명에서 사용된 바와 같이 단위 투여 제형은 개체에게 단일 투여량(unitary dosages)으로 처리 적합한 물리적으로 분리된 단위를 말하며; 약학적 담체와 함께 원하는 치료적 효과를 나타낼 수 있도록 계산되어 미리 정량된 활성 화합물을 함유하는 각각의 단위를 말한다. 구체적인 본 발명의 단위 투여 제형은 활성 화합물의 독특한 특성, 성취할 특정 치료적 효과 및 개체의 치료를 위한 활성 화합물의 조제와 같은 통상의 기술 분야에서 고유한 제한에 영향을 받고 직접적으로 의존한다.
약학적 조성물은 투여 설명서가 붙은 컨테이너, 팩, 또는 디스펜서에 포함될 수 있다.
본 발명은 하기의 실시예에서 본 발명에 기재된 청구항을 제한하지 않는 범위에서 더 기재될 것이다.
실시예들
실시예 1: AAT - Fc 융합 단백질들과 유도체들
본발명에 의거한 AAT-Fc 융합 단백질들의 전형적인, 그러나 비제한적인 실시예들은 다음의 서열들을 포함한다. 이 실시예들은 경첩 서열 및/또는 링커 서열을 포함하나, 본 발명의 융합 단백질들은 적절한 길이 및/또는 유연성을 가진 경첩 서열 및/또는 링커 서열을 사용해 만들 수 있다. 대신 융합 단백질은 경첩 서열 및/또는 링커 서열 없이 만들어 질 수도 있다. 예를 들어, 폴리펩타이드 요소들은 직접 부착될 수 있다.
AAT-Fc 융합 단백질의 예시는 본 발명에 기재된 AAT-hFc1 (인간 IgG1 Fc)이다. 하기에 나타낸 바와 같이, 융합 단백질의 AAT 폴리펩타이드 부분은 밑줄쳐져 있으며 (서열번호 2), 경첩 서열은 정자로 표시되어 있고 (서열번호 43), 융합 단백질의 IgG-Fc 폴리펩타이드부분은 이텔릭체로 표시하였다 (서열번호 3).
AAT - hFc1 (인간 IgG1 Fc )
EDPQGDAAQKTDTSHHDQDHPTFNKITPNLAEFAFSLYRQLAHQSNSTNIFFSPVSIATAFAMLSLGTKADTHDEILEGLNFNLTEIPEAQIHEGFQELLRTLNQPDSQLQLTTGNGLFLSEGLKLVDKFLEDVKKLYHSEAFTVNFGDTEEAKKQINDYVEKGTQGKIVDLVKELDRDTVFALVNYIFFKGKWERPFEVKDTEEEDFHVDQVTTVKVPMMKRLGMFNIQHCKKLSSWVLLMKYLGNATAIFFLPDEGKLQHLENELTHDIITKFLENEDRRSASLHLPKLSITGTYDLKSVLGQLGITKVFSNGADLSGVTEEAPLKLSKAVHKAVLTIDEKGTEAAGAMFLEAIPMSIPPEVKFNKPFVFLMIEQNTKSPLFMGKVVNPTQKEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (서열번호 16)
AAT-Fc 융합 단백질의 예시는 본 발명에 기재된 AAT-hFc2 (인간 IgG2 Fc)이다. 하기에 나타낸 바와 같이, 융합 단백질의 AAT 폴리펩타이드 부분은 밑줄쳐져 있으며 (서열번호 2), 경첩 서열은 정자로 표시되어 있고 (서열번호 44), 융합 단백질의 IgG-Fc 폴리펩타이드부분은 이텔릭체로 표시하였다 (서열번호 4).
AAT - hFc2 (인간 IgG2 Fc )
EDPQGDAAQKTDTSHHDQDHPTFNKITPNLAEFAFSLYRQLAHQSNSTNIFFSPVSIATAFAMLSLGTKADTHDEILEGLNFNLTEIPEAQIHEGFQELLRTLNQPDSQLQLTTGNGLFLSEGLKLVDKFLEDVKKLYHSEAFTVNFGDTEEAKKQINDYVEKGTQGKIVDLVKELDRDTVFALVNYIFFKGKWERPFEVKDTEEEDFHVDQVTTVKVPMMKRLGMFNIQHCKKLSSWVLLMKYLGNATAIFFLPDEGKLQHLENELTHDIITKFLENEDRRSASLHLPKLSITGTYDLKSVLGQLGITKVFSNGADLSGVTEEAPLKLSKAVHKAVLTIDEKGTEAAGAMFLEAIPMSIPPEVKFNKPFVFLMIEQNTKSPLFMGKVVNPTQK ERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호 17)
AAT-Fc 융합 단백질의 예시는 본 발명에 기재된 AAT-MM-EL-hFc1 (인간 IgG1 Fc, Met351Glu/Met358Leu)이다. 하기에 나타낸 바와 같이, 융합 단백질의 AAT 폴리펩타이드 부분은 밑줄쳐져 있으며 (서열번호 34), 경첩 서열은 정자로 표시되어 있고 (서열번호 43), 융합 단백질의 IgG-Fc 폴리펩타이드부분은 이텔릭체로 표시하였고 (서열번호 3), Met351Glu 돌연변이는 상 자안에 들어가 있으며, Met358Leu 돌연변이는 회색으로 음영처리 하였다.
AAT - MM - EL - hFc1 (인간 IgG1 Fc , Met351Glu / Met358Leu )
Figure 112019012303744-pct00021
(서열번호 18)
AAT-Fc 융합 단백질의 예시는 본 발명에 기재된 AAT-MM-EL-hFc2 (인간 IgG2 Fc, Met351Glu/Met358Leu)이다. 하기에 나타낸 바와 같이, 융합 단백질의 AAT 폴리펩타이드 부분은 밑줄쳐져 있으며 (서열번호 34), 경첩 서열은 정자로 표시되어 있고 (서열번호 44), 융합 단백질의 IgG-Fc 폴리펩타이드부분은 이텔릭체로 표시되어있으며 (서열번호 4), Met351Glu 돌연변이는 상자안에 들어가 있고, Met358Leu 돌연변이는 회색으로 음영처리 하였다.
AAT - MM - EL - hFc2 (인간 IgG2 Fc , Met351Glu / Met358Leu )
Figure 112019012303744-pct00022
(서열번호 19)
AAT-Fc 융합 단백질의 예시는 본 발명에 기재된 AAT-MM-LL-hFc1 (인간 IgG1 Fc, Met351Leu/Met358Leu)이다. 하기에 나타낸 바와 같이, 융합 단백질의 AAT 폴리펩타이드 부분은 밑줄쳐져 있으며 (서열번호 35), 경첩 서열은 정자로 표시되어 있고 (서열번호 43), 융합 단백질의 IgG-Fc 폴리펩타이드부분은 이텔릭체로 표시되어 있고 (서열번호 3), Met351Leu 돌연변이는 검은색 음영처리 되었으며, Met358Leu 돌연변이는 회색으로 음영처리 하였다.
AAT - MM - LL - hFc1 (인간 IgG1 Fc , Met351Leu / Met358Leu )
Figure 112019012303744-pct00023
(서열번호 36)
AAT-Fc 융합 단백질의 예시는 본 발명에 기재된 AAT-MM-LL-hFc2 (인간 IgG2 Fc, Met351Leu/Met358Leu)이다. 하기에 나타낸 바와 같이, 융합 단백질의 AAT 폴리펩타이드 부분은 밑줄쳐져 있으며 (서열번호 35), 경첩 서열은 정자로 표시되어 있고 (서열번호 44), 융합 단백질의 IgG-Fc 폴리펩타이드부분은 이텔릭체로 표시되어 있고 (서열번호 4), Met351Leu 돌연변이는 검은색 음영처리되어 있으며, Met358Leu돌연변이는 회색으로 음영처리 하였다.
AAT - MM : LL - hFc2 (인간 IgG2 Fc , Met351Leu / Met358Leu )
Figure 112019012303744-pct00024
(서열번호 20)
AAT-Fc 융합 단백질의 예시는 본 발명에 기재된 AAT-hFc1-AAT (인간 IgG1)이다. 하기에 나타낸 바와 같이, 융합 단백질의 AAT 폴리펩타이드 부분은 밑줄쳐져 있으며 (서열번호 2), 경첩 서열은 정자로 표시되어 있고 (서열번호 44), ASTGS 링커는 정자로 표시되어 있으며 (서열번호 45), 융합 단백질의 IgG-Fc 폴리펩타이드부분은 이텔릭체로 표시하였다 (서열번호 3).
AAT - hFc1 - AAT (인간 IgG1 )
EDPQGDAAQKTDTSHHDQDHPTFNKITPNLAEFAFSLYRQLAHQSNSTNIFFSPVSIATAFAMLSLGTKADTHDEILEGLNFNLTEIPEAQIHEGFQELLRTLNQPDSQLQLTTGNGLFLSEGLKLVDKFLEDVKKLYHSEAFTVNFGDTEEAKKQINDYVEKGTQGKIVDLVKELDRDTVFALVNYIFFKGKWERPFEVKDTEEEDFHVDQVTTVKVPMMKRLGMFNIQHCKKLSSWVLLMKYLGNATAIFFLPDEGKLQHLENELTHDIITKFLENEDRRSASLHLPKLSITGTYDLKSVLGQLGITKVFSNGADLSGVTEEAPLKLSKAVHKAVLTIDEKGTEAAGAMFLEAIPMSIPPEVKFNKPFVFLMIEQNTKSPLFMGKVVNPTQKEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKASTGSEDPQGDAAQKTDTSHHDQDHPTFNKITPNLAEFAFSLYRQLAHQSNSTNIFFSPVSIATAFAMLSLGTKADTHDEILEGLNFNLTEIPEAQIHEGFQELLRTLNQPDSQLQLTTGNGLFLSEGLKLVDKFLEDVKKLYHSEAFTVNFGDTEEAKKQINDYVEKGTQGKIVDLVKELDRDTVFALVNYIFFKGKWERPFEVKDTEEEDFHVDQVTTVKVPMMKRLGMFNIQHCKKLSSWVLLMKYLGNATAIFFLPDEGKLQHLENELTHDIITKFLENEDRRSASLHLPKLSITGTYDLKSVLGQLGITKVFSNGADLSGVTEEAPLKLSKAVHKAVLTIDEKGTEAAGAMFLEAIPMSIPPEVKFNKPFVFLMIEQNTKSPLFMGKVVNPTQK (서열번호 21)
전형적인 AAT-Fc 융합 단백질은 다음의 기술들을 사용해 만들어졌다.
인간 AAT를 암호화하는 유전자는 인간 간 cDNA로부터 PCR 증폭되었다. AAT 또는 Fc 지역안의 특정 지점 돌연변이는 중복(overlapping) PCR을 통해 형성되었다. AAT 암호화 유전자는 경첩부분과 함께 프레임에 ?춰서, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, 또는 IgM의 CH2 도메인과 CH3도메인을 뒤에 달고 AAT 삽입지점의 업스트림에 포유동물 분비 신호 서열을 포함하는 포유동물 발현 벡터에 클로닝 되었다. 이 발현 벡터들은 포유동물 세포 (특히 HEK293 또는 CHO 세포)에 트랜스팩션되어, 8% CO2 와 37℃ 하에서 며칠간 배양되었다. 재조합 AAT-Fc 융합 단백질은 발현세포의 상층액에서 단백질 A 크로마토그래피를 통해 정제되었다. 중요한 것은, 거의 중성에 근접한 pH 완충액 (Gentle Ag/Ab Elution Buffer, Thermo Scientific)이 단백질 A 레진에서 추출(elude)하기 위해 사용되었다는 점이다. 아마도 저산도 처리에 의한 AAT의 올리고머화 때문에, 저산도 처리후 AAT의 NE를 억제하는 능력이 손상(compromised)되므로, AAT-Fc 융합 단백질은 단백질 A 레진에서 표준 저산도 완충액을 사용해서 추출할 수 없다. 도 1F는 저산도 추출이 AAT의 호중구 엘라스타제를 억제하는 능력에 미치는 효과를 나타낸다. AAT-Fc 융합 단백질은 단백질 A와 중성 추출 완충액 또는 CaptureSelect-Alpha-1 Antitrypsin affinity matrix (BAC BV)으로 정제 될 수 있다.
정제된 AAT-Fc 융합 단백질들은 그것들의 호중구 엘라스타제 (NE)을 억제하는 능력을 결정함으로서 시험되었다. 도 1B 및 1D 는 정제된 혈청 유래의 AAT (sdAAT)와 AAT-Fc 융합 단백질의 환원 SDS-PAGE 젤을 나타낸다 (도 1B- 레인 1: sdAAT, 레인 2: AAT-Fc (서열번호 16), 레인 3: AAT-EL-Fc (서열번호 18), 도 1D AAT-Fc-AAT (서열번호 20). 단백질들은 쿠마시 블루로 시각화되었다.
인간 호중구 엘라스타제 (NE) 활성을 감시하기 위해서 형광 마이크로플레이트 분석이 사용되었다. 억제횔동은 다음의 시험을 사용해 잔여 NE 활성의 동시적 감소를 통해 측정되었다. 이 시험 완충액은 100 mM Tris pH 7.4, 500 mM NaCl, 및 0.0005% Triton X-100으로 구성되어 있다. 인간 NE는 최종 5nM 농도로 사용되었다 (그러나 1-20nM 로도 사용될 수 있다). 형광 펩타이드 기질 AAVP-AMC이 이 시험에서 최종 농도 100 μM로 사용되었다. Molecular Devices사의 Gemini EM plate reader가 시험 동력학(kinetics)을 읽기 위해 각각 370 nm, 440 nm 및 420 nm의 excitation, emission 및 컷오프 파장으로 사용되었다. 시험은 상온에서 10분간 매 5에서 10초 간격으로 읽어졌다. 초당 Vmax는 잔여 NE 활성에 대응되며, 이는 억제제의 각각의 농도와 대응해 plot되었다. x축과의 절편이 시험에서 NE의 시작농도를 완전히 불활성시키는데 필요한 억제제의 농도를 표시한다. 인간 혈청 유래의 AAT (sdAAT)가 이 시험들에서 양성 대조군으로 사용되었다. 도 1C에서 보여지듯이 AAT-Fc 융합 단백질은 강력한 NE 억제력을 나타낸다. 하나의 Fc 폴리펩타이드에 두개의 AAT 폴리펩타이드가 융합된 융합체(AAT-Fc-AAT)는 sdAAT 및 하나의 AAT로 이루어진 AAT-Fc 보다 강화된 능력을 나타낸다 (도 1E). 여기에 제시된 발견들은 AAT가 Fc에 융합되어서도 NE를 억제하는 능력을 유지함을 처음으로 나타낸다. 특히 흥미로운것은, AAT-Fc-AAT가 더 강력한 NE억제제라는 점이다.
도 1F는 AAT-EL-Fc (M351E, M358L) 융합 단백질의 산화에 의한 불활성에 대한 저항을 나타낸다. AAT융합 단백질 AAT-Fc (야생형), AAT-EL-Fc (M351E, M358L), 및 AAT-EM-Fc (M351E) 33mM H2O2 처리된 후, 처리되지 않은 융합 단백질과 NE 억제 시험으로 비교되었다. AAT-EL-Fc에 의한 NE 억제는, 시험된 다른 단백질들과 반대로 손상되지 않았다.
더 나아가서, AAT-Fc는 래트(rats)에서 혈청 유래 AAT보다 더 긴 혈청 반감기를 보였다 (도 1H). 이 연구에서 각 실험 단백질 당 3 마리의 래트가 10mg/kg농도로 sdAAT 또는 AAT-Fc를 I.V. 주사하였다. 혈청 시료가 48 시간에 걸쳐 다양한 시점에서 채취되었다. 혈청 AAT농도는 ELISA를 이용해 측정되었다. 이 발견들은 본발명의 융합 단백질들이 개선된 약물 동태학적 성질을 갖고 있으며, 많은 수의 인간 염증 질환들과 감염질환을 치료하는데 혈청 유래 AAT보다 우월한 치료 체재임을 나타낸다.
실시예 2: AAT-TNFa 표적 분자 융합 단백질들
본 발명에 기재된 연구들은 인간 AAT와 항-TNF 또는 TNF 수용체의 유래체와의 융합으로 구성된 재조합 AAT 유래체의 몇몇의, 비제한적 실시예들을 나타낸다. 아래에 제시된 이 실시예들은 본 발명의 다른 특징들을 설명하기 위해 제공되었다. 이 실시예들은 또한 본 발명을 수행함에 유용한 방법을 설명한다. 이 실시예들은 본 발명을 제한하지 않으며, 제한할 의도또한 가지고 있지 않다.
아래의 융합 단백질들은 (i) 항-TNF 항체 D2E7 (Adalimumab 또는 Humira®라고도 알려짐), 또는 (ii) 타입 Type 2 TNF-수용체(TNFR2-ECD)의 세포밖 도메인으로부터 나왔거나 그로부터 유래한 사이토카인 표적 폴리펩타이드를 포함한다. 융합 단백질의 AAT 폴리펩타이드 부분에 밑줄이 쳐져있으며, 융합 단백질의 항체불변영역(CH1-hinge-CH2-CH3, or CL)은 이텔릭체로 표시되어 있고, D2E7-VH, D2E7-VK 및 TNFR2-ECD은 굵은 글씨로 표시되어있다. 이 실시예들은 경첩 서열 및/또는 링커 서열을 포함하나, 본 발명의 융합 단백질들은 적절한 길이 및/또는 유연성을 가진 경첩 서열 및/또는 링커 서열을 사용해 만들 수 있다. 대신 융합 단백질은 경첩 서열 및/또는 링커 서열 없이 만들어 질 수도 있다. 예를 들어, 폴리펩타이드 요소들은 직접 부착될 수 있다.
AAT-TNF 융합 단백질의 예시는 본 발명에 기재된 D2E7-경쇄(Light Chain)-AAT (G3S)2 링커이다. 하기에 나타낸 바와 같이, 융합 단백질의 AAT 폴리펩타이드 부분은 밑줄쳐져 있으며 (서열번호 2), ID2E7-VK은 굵은 글씨로 표시되어 있고 (서열번호 37), (G3S)2 링커는 정자로 표시되어 있으며 (서열번호 46), 항체불변영역은 이텔릭체로 표시되어 있다 (서열번호 38).
D2E7 - 경쇄 - AAT ( G 3 S ) 2 링커
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQRYNRAPYTFGQGTKVEIK RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGSGGGSEDPQGDAAQKTDTSHHDQDHPTFNKITPNLAEFAFSLYRQLAHQSNSTNIFFSPVSIATAFAMLSLGTKADTHDEILEGLNFNLTEIPEAQIHEGFQELLRTLNQPDSQLQLTTGNGLFLSEGLKLVDKFLEDVKKLYHSEAFTVNFGDTEEAKKQINDYVEKGTQGKIVDLVKELDRDTVFALVNYIFFKGKWERPFEVKDTEEEDFHVDQVTTVKVPMMKRLGMFNIQHCKKLSSWVLLMKYLGNATAIFFLPDEGKLQHLENELTHDIITKFLENEDRRSASLHLPKLSITGTYDLKSVLGQLGITKVFSNGADLSGVTEEAPLKLSKAVHKAVLTIDEKGTEAAGAMFLEAIPMSIPPEVKFNKPFVFLMIEQNTKSPLFMGKVVNPTQK (서열번호 22)
AAT-TNF 융합 단백질의 예시는 본 발명에 기재된 D2E7-경쇄-AAT ASTGS 링커이다. 하기에 나타낸 바와 같이, 융합 단백질의 AAT 폴리펩타이드 부분은 밑줄쳐져 있으며 (서열번호 2), ID2E7-VK은 굵은 글씨로 표시되어 있고 (서열번호 37), ASTGS 링커는 정자로 표시되어 있으며 (서열번호 46), 항체불변영역은 이텔릭체로 표시되어 있다 (서열번호 38).
D2E7 - 경쇄 - AAT ASTGS 링커
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQRYNRAPYTFGQGTKVEIK RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECASTGSEDPQGDAAQKTDTSHHDQDHPTFNKITPNLAEFAFSLYRQLAHQSNSTNIFFSPVSIATAFAMLSLGTKADTHDEILEGLNFNLTEIPEAQIHEGFQELLRTLNQPDSQLQLTTGNGLFLSEGLKLVDKFLEDVKKLYHSEAFTVNFGDTEEAKKQINDYVEKGTQGKIVDLVKELDRDTVFALVNYIFFKGKWERPFEVKDTEEEDFHVDQVTTVKVPMMKRLGMFNIQHCKKLSSWVLLMKYLGNATAIFFLPDEGKLQHLENELTHDIITKFLENEDRRSASLHLPKLSITGTYDLKSVLGQLGITKVFSNGADLSGVTEEAPLKLSKAVHKAVLTIDEKGTEAAGAMFLEAIPMSIPPEVKFNKPFVFLMIEQNTKSPLFMGKVVNPTQK (서열번호 23)
AAT-TNF 융합 단백질의 예시는 본 발명에 기재된 D2E7-중쇄-AAT (G3S)2 링커이다. 하기에 나타낸 바와 같이, 융합 단백질의 AAT 폴리펩타이드 부분은 밑줄쳐져 있으며 (서열번호 2), ID2E7-VH 은 굵은 글씨로 표시되어 있고 (서열번호 39), (G3S)2 링커는 정자로 표시되어 있으며 (서열번호 46), 항체불변영역은 이텔릭체로 표시되어 있다 (서열번호 40).
D2E7 - Heavy Chain ( 중쇄 )- AAT ( G 3 S ) 2 링커
EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSAITWNSGHIDYADSVEGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVSYLSTASSLDYWGQGTL VTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGSGGGSEDPQGDAAQKTDTSHHDQDHPTFNKITPNLAEFAFSLYRQLAHQSNSTNIFFSPVSIATAFAMLSLGTKADTHDEILEGLNFNLTEIPEAQIHEGFQELLRTLNQPDSQLQLTTGNGLFLSEGLKLVDKFLEDVKKLYHSEAFTVNFGDTEEAKKQINDYVEKGTQGKIVDLVKELDRDTVFALVNYIFFKGKWERPFEVKDTEEEDFHVDQVTTVKVPMMKRLGMFNIQHCKKLSSWVLLMKYLGNATAIFFLPDEGKLQHLENELTHDIITKFLENEDRRSASLHLPKLSITGTYDLKSVLGQLGITKVFSNGADLSGVTEEAPLKLSKAVHKAVLTIDEKGTEAAGAMFLEAIPMSIPPEVKFNKPFVFLMIEQNTKSPLFMGKVVNPTQK (서열번호 24)
AAT-TNF 융합 단백질의 예시는 본 발명에 기재된 D2E7-중쇄-AAT ASTGS 링커이다. 하기에 나타낸 바와 같이, 융합 단백질의 AAT 폴리펩타이드 부분은 밑줄쳐져 있으며 (서열번호 2), ID2E7-VK은 굵은 글씨로 표시되어 있고 (서열번호 39), ASTGS 링커는 정자로 표시되어 있으며 (서열번호 45), 항체불변영역은 이텔릭체로 표시되어 있다 (서열번호 40).
D2E7 - 중쇄 - AAT ASTGS 링커
EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSAITWNSGHIDYADSVEGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVSYLSTASSLDYWGQGTL VTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKASTGSEDPQGDAAQKTDTSHHDQDHPTFNKITPNLAEFAFSLYRQLAHQSNSTNIFFSPVSIATAFAMLSLGTKADTHDEILEGLNFNLTEIPEAQIHEGFQELLRTLNQPDSQLQLTTGNGLFLSEGLKLVDKFLEDVKKLYHSEAFTVNFGDTEEAKKQINDYVEKGTQGKIVDLVKELDRDTVFALVNYIFFKGKWERPFEVKDTEEEDFHVDQVTTVKVPMMKRLGMFNIQHCKKLSSWVLLMKYLGNATAIFFLPDEGKLQHLENELTHDIITKFLENEDRRSASLHLPKLSITGTYDLKSVLGQLGITKVFSNGADLSGVTEEAPLKLSKAVHKAVLTIDEKGTEAAGAMFLEAIPMSIPPEVKFNKPFVFLMIEQNTKSPLFMGKVVNPTQK (서열번호 25)
AAT-TNF 융합 단백질의 예시는 본 발명에 기재된TNFR2-ECD-Fc1-AAT(G3S)2 링커이다. 하기에 나타낸 바와 같이, 융합 단백질의 AAT 폴리펩타이드 부분은 밑줄쳐져 있으며 (서열번호 2), TNFR2-ECD은 굵은 글씨로 표시되어 있고 (서열번호 41), 경첩 서열은 정자로 표시되어 있으며 (서열번호 43), (G3S)2 링커는 정자로 표시되어 있고 (서열번호 46), 항체불변영역은 이텔릭체로 표시되어 있다 (서열번호 42).
TNFR2 - ECD - Fc1 - AAT ( G 3 S ) 2 링커
LPAQVAFTPYAPEPGSTCRLREYYDQTAQMCCSKCSPGQHAKVFCTKTSDTVCDSCEDSTYTQLWNWVPECLSCGSRCSSDQVETQACTREQNRICTCRPGWYCALSKQEGCRLCAPLRKCRPGFGVARPGTETSDVVCKPCAPGTFSNTTSSTDICRPHQICNVVAIPGNASMDAVCTSTSPTRSMAPGAVHLPQPVSTRSQHTQPTPEPSTAPSTSFLLPMGPSPPAEGSTGDEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPQVKFNWYVDGVQVHNAKTKPREQQYNSTYRVVSVLTVLHQNWLDGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK GGGSGGGSEDPQGDAAQKTDTSHHDQDHPTFNKITPNLAEFAFSLYRQLAHQSNSTNIFFSPVSIATAFAMLSLGTKADTHDEILEGLNFNLTEIPEAQIHEGFQELLRTLNQPDSQLQLTTGNGLFLSEGLKLVDKFLEDVKKLYHSEAFTVNFGDTEEAKKQINDYVEKGTQGKIVDLVKELDRDTVFALVNYIFFKGKWERPFEVKDTEEEDFHVDQVTTVKVPMMKRLGMFNIQHCKKLSSWVLLMKYLGNATAIFFLPDEGKLQHLENELTHDIITKFLENEDRRSASLHLPKLSITGTYDLKSVLGQLGITKVFSNGADLSGVTEEAPLKLSKAVHKAVLTIDEKGTEAAGAMFLEAIPMSIPPEVKFNKPFVFLMIEQNTKSPLFMGKVVNPTQK (서열번호 26)
AAT-TNF 융합 단백질의 예시는 본 발명에 기재된 TNFR2-ECD-Fc1-AAT ASTGS 링커이다. 하기에 나타낸 바와 같이, 융합 단백질의 AAT 폴리펩타이드 부분은 밑줄쳐져 있으며 (서열번호 2), TNFR2-ECD은 굵은 글씨로 표시되어 있고 (서열번호 41), 경첩 서열은 정자로 표시되어 있으며 (서열번호 43), ASTGS 링커는 정자로 표시되어 있고 (서열번호 46), 항체불변영역은 이텔릭체로 표시되어 있다 (서열번호 42).
TNFR2 - ECD - Fc1 - AAT ASTGS 링커
LPAQVAFTPYAPEPGSTCRLREYYDQTAQMCCSKCSPGQHAKVFCTKTSDTVCDSCEDSTYTQLWNWVPECLSCGSRCSSDQVETQACTREQNRICTCRPGWYCALSKQEGCRLCAPLRKCRPGFGVARPGTETSDVVCKPCAPGTFSNTTSSTDICRPHQICNVVAIPGNASMDAVCTSTSPTRSMAPGAVHLPQPVSTRSQHTQPTPEPSTAPSTSFLLPMGPSPPAEGSTGDEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPQVKFNWYVDGVQVHNAKTKPREQQYNSTYRVVSVLTVLHQNWLDGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKASTGSEDPQGDAAQKTDTSHHDQDHPTFNKITPNLAEFAFSLYRQLAHQSNSTNIFFSPVSIATAFAMLSLGTKADTHDEILEGLNFNLTEIPEAQIHEGFQELLRTLNQPDSQLQLTTGNGLFLSEGLKLVDKFLEDVKKLYHSEAFTVNFGDTEEAKKQINDYVEKGTQGKIVDLVKELDRDTVFALVNYIFFKGKWERPFEVKDTEEEDFHVDQVTTVKVPMMKRLGMFNIQHCKKLSSWVLLMKYLGNATAIFFLPDEGKLQHLENELTHDIITKFLENEDRRSASLHLPKLSITGTYDLKSVLGQLGITKVFSNGADLSGVTEEAPLKLSKAVHKAVLTIDEKGTEAAGAMFLEAIPMSIPPEVKFNKPFVFLMIEQNTKSPLFMGKVVNPTQK (서열번호 27)
전형적인 AAT-TNF 표적 분자 융합 단백질은 다음의 기술들을 사용해 만들어졌다.
항-TNF 항체, D2E7의 variable heavy (VH) 및 variable kappa (VK) 영역을 암호화하는 유전자는 유전자 합성으로 통해 형성되었다. D2E7-VH 유전자는, CH1 도메인, 경첩 도메인, CH2 도메인, 및 CH3 도메인으로 구성된 인간 IgG1 항체 중쇄 불변지역과 함께 VH 도메인 삽입지점의 업스트림에 포유동물 분비 신호 서열을 포함하는 포유동물 발현 벡터에 클로닝 되었다(D2E7-HC). D2E7-VK 유전자는 인간 항체 카파 경쇄 불변(kappa light chain constant) (CL) 도메인과 함께 VK 도메인 삽입지점의 업스트림에 포유동물 분비 신호 서열을 포함하는 포유동물 발현 벡터에 클로닝 되었다 (D2E7-LC). AAT를 암호화하는 유전자와 인접한 5` 링커 서열은 D2E7 중쇄 유전자 (D2E7-HC-AAT)의 CH3 도메인 또는 D2E7 경쇄 유전자의 (D2E7-LC-AAT)
CL 도메인의 3`끝부분과 프레임에 ?춰 위에 묘사된 포유동물 발현 벡터에 클로닝 되었다. TNF 수용체(Receptor) 2 의 세포외 도메인(TNFR2-ECD)은 유전자 합성을 통해 형성되었으며, 인간 IgG1 (hFc1)의 CH2, CH3을 뒤에 달고, TNFR2-ECD 삽입지점의 업스트림에 포유동물 분비 신호 서열을 포함하는 포유동물 발현 벡터에 클로닝 되었다. AAT를 암호화하는 유전자와 인접한 5` 링커 서열은 TNFR2-ECD-hFc1의 3`끝부분과 프레임에 ?춰 포유동물 발현 벡터에 클로닝 되었다(TNFR2-ECD-hFc1-AAT).
The D2E7-HC-AAT발현백터는 D2E7-LC또는 D2E7-LC-AAT 발현벡터와 함께포유동물 세포 (특히 HEK293 또는 CHO 세포)에 트랜스팩션되어 각각 AAT가 중쇄의 C-말단에 융합된 D2E7항체 또는 중쇄 및 경쇄 모두에 융합된 D2E7항체를 형성했다. D2E7-LC-AAT는 D2E7-HC발현벡터와 함께 포유동물 세포에 트랜스팩션되어 AAT가 경쇄의 C-말단에 융합된 D2E7항체를 형성했다. TNFR2-hFc1-AAT 발현 벡터는 포유동물 세포에 트랜스팩션되었다. 트랜스팩션된 세포들은 8% CO2 와 37℃ 하에서 며칠간 배양되었다.
재조합 AAT-TNF 융합 단백질은 발현세포의 상층액에서 단백질 A 크로마토그래피를 통해 정제되었다. 거의 중성에 근접한 pH 완충액 (Gentle Ag/Ab Elution Buffer, Thermo Scientific)이 단백질 A 레진에서 추출(elude)하기 위해 사용되었다.
도 2B는 D2E7단독 (레인 1) 및 D2E7의 중쇄에 AAT이 융합된 유도체 (레인 2)의 SDS-PAGE 젤을 나타낸다. 단백질들은 쿠마시 블루를 통해 시각화 되었다.
정제된 AAT-Fc 융합 단백질들은 그것들의 호중구 엘라스타제 (NE)을 억제하는 능력을 결정함으로서 시험되었다. 인간 혈청 유래의 AAT (sdAAT)가 이 시험들에서 양성 대조군으로 사용되었다. NE 억제 시험은 상기에 기재된 바와 같이 수행되었다. 도 2C는 AAT-TNF 표적 분자 융합 단백질이 sdAAT와 유사한 호중구 엘라스타제 억제를 보임을 입증함으로써, AAT의 억제능력이 항체와의 결합으로 인해 손상되지 않았음을 나타냈다.
실시예 3 AAT - Fc - SLPI 및 AAT - Fc - 엘라핀
본 발명에 기재된 연구들은 인간 AAT 및 WAP 도메인을 가지고 있는 단백질의 융합으로 구성된 AAT 재조합 파생물들의 비제한적 실시예들을 나타낸다. 아래에 제시된 실시예들은 본 발명의 다른 특징들을 설명하기 위해 제공되었다. 실시예들은 또한 본 발명을 수행함에 유용한 방법을 설명한다. 융합 단백질의 AAT 폴리펩타이드 부분에 밑줄이 쳐져있으며, Fc 부분은 이텔릭체로 표시되어 있고, WAP 도메인을 갖고 있는 폴리펩타이드는 굵은 글씨로 표시되어 있다. 실시예들은 경첩 서열 및/또는 링커 서열을 포함하나, 본 발명의 융합 단백질들은 적절한 길이 및/또는 유연성을 가진 경첩 서열 및/또는 링커 서열을 사용해 만들 수 있다. 대신 융합 단백질은 경첩 서열 및/또는 링커 서열 없이 만들어 질 수도 있다. 예를 들어, 폴리펩타이드 요소들은 직접 부착될 수 있다.
AAT- Fc-SLPI 융합 단백질의 예시는, 본 발명에 기재된 AAT-hFc1-SLPI (인간 IgG1 Fc)이다. 하기에 나타낸 바와 같이, 융합 단백질의 AAT 폴리펩타이드 부분은 밑줄쳐져 있으며 (서열번호 2), 경첩 부위는 정자로 표시되어 있고 (서열번호 43), ASTGS 링커는 정자로 표시되어 있으며 (서열번호 45), Fc 부분은 이텔릭체로 표시되어 있고 (서열번호 2), WAP 도메인을 갖고 있는 폴리펩타이드는 굵은 글씨로 표시하였다 (서열번호 9).
AAT - hFc1 - SLPI (인간 IgG1 Fc )
EDPQGDAAQKTDTSHHDQDHPTFNKITPNLAEFAFSLYRQLAHQSNSTNIFFSPVSIATAFAMLSLGTKADTHDEILEGLNFNLTEIPEAQIHEGFQELLRTLNQPDSQLQLTTGNGLFLSEGLKLVDKFLEDVKKLYHSEAFTVNFGDTEEAKKQINDYVEKGTQGKIVDLVKELDRDTVFALVNYIFFKGKWERPFEVKDTEEEDFHVDQVTTVKVPMMKRLGMFNIQHCKKLSSWVLLMKYLGNATAIFFLPDEGKLQHLENELTHDIITKFLENEDRRSASLHLPKLSITGTYDLKSVLGQLGITKVFSNGADLSGVTEEAPLKLSKAVHKAVLTIDEKGTEAAGAMFLEAIPMSIPPEVKFNKPFVFLMIEQNTKSPLFMGKVVNPTQKEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKASTGSSGKSFKAGVCPPKKSAQCLRYKKPECQSDWQCPGKKRCCPDTCGIKCLDPVDTPNPTRRKPGKCPVTYGQCLMLNPPNFCEMDGQCKRDLKCCMGMCGKSCVSPVKA (서열번호 28)
AAT- Fc-SLPI 융합 단백질의 예시는, 본 발명에 기재된 AAT-hFc1-SLPI (인간 IgG1 Fc) 이다. 하기에 나타낸 바와 같이, 융합 단백질의 AAT 폴리펩타이드 부분은 밑줄쳐져 있으며 (서열번호 2), 경첩 부위는 정자로 표시되어 있고 (서열번호 43), ASTGS 링커는 정자로 표시되어 있으며 (서열번호 45), Fc 부분은 이텔릭체로 표시되어 있고 (서열번호 2), WAP 도메인을 갖고 있는 폴리펩타이드는 굵은 글씨로 표시하였다 (서열번호 12).
AAT - hFc1 - 엘라핀 (인간 IgG1 Fc )
EDPQGDAAQKTDTSHHDQDHPTFNKITPNLAEFAFSLYRQLAHQSNSTNIFFSPVSIATAFAMLSLGTKADTHDEILEGLNFNLTEIPEAQIHEGFQELLRTLNQPDSQLQLTTGNGLFLSEGLKLVDKFLEDVKKLYHSEAFTVNFGDTEEAKKQINDYVEKGTQGKIVDLVKELDRDTVFALVNYIFFKGKWERPFEVKDTEEEDFHVDQVTTVKVPMMKRLGMFNIQHCKKLSSWVLLMKYLGNATAIFFLPDEGKLQHLENELTHDIITKFLENEDRRSASLHLPKLSITGTYDLKSVLGQLGITKVFSNGADLSGVTEEAPLKLSKAVHKAVLTIDEKGTEAAGAMFLEAIPMSIPPEVKFNKPFVFLMIEQNTKSPLFMGKVVNPTQKEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKASTGSAVTGVPVKGQDTVKGRVPFNGQDPVKGQVSVKGQDKVKAQEPVKGPVSTKPGSCPIILIRCAMLNPPNRCLKDTDCPGIKKCCEGSCGMACFVPQ (서열번호 29)
SLPI 및 엘라핀을 암호화하는 유전자들은 인간 비장 cDNA (Zyagen)로부터 PCR로 증폭되었다. 이 유전자들은 실시예 1의 포유동물 발현 벡터에 AAT-Fc 유전자와 프레임에 ?춰 클로닝 되었다. 이 발현 벡터들은 포유동물 세포 (특히 HEK293 또는 CHO 세포)에 트랜스팩션되어, 8% CO2 와 37℃ 하에서 며칠간 배양되었다. 재조합 AAT-Fc-WAP 융합 단백질은 발현세포의 상층액에서 단백질 A 크로마토그래피를 통해 정제되었다. 거의 중성에 근접한 pH 완충액 (Gentle Ag/Ab Elution Buffer, Thermo Scientific)이 AAT-Fc-WAP 도메인 융합 단백질을 단백질 A 레진에서 추출(elude)하기 위해 사용되었다.
도 3B는 AAT-Fc-WAP융합 단백질의 SDS-PAGE 젤을 나타낸다 (레인 1 AAT-Fc-엘라핀, 레인 2 AAT-Fc-SLPI). 단백질들은 쿠마시 블루로 염색되어 시각화되었다. 정제된 AAT-Fc-WAP 융합 단백질들은 그것들의 호중구 엘라스타제 (NE)을 억제하는 능력을 결정함으로서 시험되었다. 인간 혈청 유래의 AAT (sdAAT) 및 AAT-Fc 융합 단백질이 본 실험들에서 양성 대조군으로 사용되었다. NE 억제 시험은 상기에 기재된 바와 같이 수행되었다. sdAAT 대비, AAT-Fc-WAP 표적 분자 융합 단백질은 더 증강된 NE억제력을 나타낸다 (도 3C).
실시예 4 AAT -알부민
본 발명에 기재된 연구들은 인간 AAT 및 알부민 폴리펩타이드의 융합으로 구성된 AAT 재조합 파생물들의 비제한적 실시예들을 나타낸다. 아래에 제시된 실시예들은 본 발명의 다른 특징들을 설명하기 위해 제공되었다. 실시예들은 또한 본 발명을 수행함에 유용한 방법을 설명한다. 실시예들은 본 발명을 제한하지 않으며, 제한할 의도 또한 가지고 있지 않다. AAT 부분에 밑줄이 쳐져있으며, 알부민 부분은 이텔릭체로 표시되어 있다. 예를 들어, 폴리펩타이드 요소들은 직접 부착될 수 있다.
하나의 전형적인 AAT-알부민 융합 단백질은 본 발명에 기재된 AAT-HSA이다. 하기에 나타낸 바와 같이, AAT 폴리펩타이드 부분은 밑줄쳐져 있으며 (서열번호 2), ASTGS 링커는 정자로 표시하였고 (서열번호 45), 알부민 폴리펩타이드 부분은 이텔릭체로 표시하였다 (서열번호 14).
AAT - HSA
EDPQGDAAQKTDTSHHDQDHPTFNKITPNLAEFAFSLYRQLAHQSNSTNIFFSPVSIATAFAMLSLGTKADTHDEILEGLNFNLTEIPEAQIHEGFQELLRTLNQPDSQLQLTTGNGLFLSEGLKLVDKFLEDVKKLYHSEAFTVNFGDTEEAKKQINDYVEKGTQGKIVDLVKELDRDTVFALVNYIFFKGKWERPFEVKDTEEEDFHVDQVTTVKVPMMKRLGMFNIQHCKKLSSWVLLMKYLGNATAIFFLPDEGKLQHLENELTHDIITKFLENEDRRSASLHLPKLSITGTYDLKSVLGQLGITKVFSNGADLSGVTEEAPLKLSKAVHKAVLTIDEKGTEAAGAMFLEAIPMSIPPEVKFNKPFVFLMIEQNTKSPLFMGKVVNPTQKASTGSDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL (서열번호 30)
하나의 전형적인 AAT-알부민 융합 단백질은 본 발명에 기재된 AAT-HSA 도메인 3이다. 하기에 나타낸 바와 같이, 융합 단백질의 AAT 폴리펩타이드 부분은 밑줄쳐져 있으며 (서열번호 2), ASTGS 링커는 정자로 표시하였고 (서열번호 45), 알부민 폴리펩타이드 부분은 이텔릭체로 표시하였다 (서열번호 15).
AAT - HSA 도메인 3
EDPQGDAAQKTDTSHHDQDHPTFNKITPNLAEFAFSLYRQLAHQSNSTNIFFSPVSIATAFAMLSLGTKADTHDEILEGLNFNLTEIPEAQIHEGFQELLRTLNQPDSQLQLTTGNGLFLSEGLKLVDKFLEDVKKLYHSEAFTVNFGDTEEAKKQINDYVEKGTQGKIVDLVKELDRDTVFALVNYIFFKGKWERPFEVKDTEEEDFHVDQVTTVKVPMMKRLGMFNIQHCKKLSSWVLLMKYLGNATAIFFLPDEGKLQHLENELTHDIITKFLENEDRRSASLHLPKLSITGTYDLKSVLGQLGITKVFSNGADLSGVTEEAPLKLSKAVHKAVLTIDEKGTEAAGAMFLEAIPMSIPPEVKFNKPFVFLMIEQNTKSPLFMGKVVNPTQKASTGSEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVA (서열번호 31)
인간 혈청 알부민(HSA)을 암호화하는 유전자는 인간 간 cDNA (Zyagen)로부터 PCR 증폭되었다. HSA또는 HSA의 도메인 3이 AAT의 3`끝부분에 프레임에 ?춰 AAT의 업스트림에 포유동물 분비 신호 서열을 갖고 있는 벡터에 클로닝 함으로써 포유동물 발현 벡터가 형성되었다.
이 발현 벡터들은 포유동물 세포 (특히 HEK293 또는 CHO 세포)에 트랜스팩션되어, 8% CO2 와 37℃ 하에서 며칠간 배양되었다. 재조합 AAT-HSA 융합 단백질은 발현세포의 상층액에서 바인딩 완충액은 20mM Tris, 150mM NaCl, pH 7.4로 구성되고 추출(elution)완충액은 20mM Tris, 2M MgCl2 pH 7.4로 구성된 CaptureSelect- Alpha-1 Antitrypsin affinity matrix (BAC BV)를 사용해 정제되었다.
도 4B는 쿠마시 블루로 시각화된 AAT-HSA 융합 단백질의 SDS-PAGE 젤을 나타낸다. 정제된 AAT- HSA 융합 단백질들은 그것들의 호중구 엘라스타제 을 억제하는 능력을 결정함으로서 시험되었다. NE 억제 시험은 상기에 기재된 바와 같이 수행되었다. 인간 혈청 유래의 AAT (sdAAT)가 이 시험들에서 양성 대조군으로 사용되었다. sdAAT 대비, AAT- HS 융합 단백질은 비슷한 NE억제력을 보여주며, 이는 알부민과의 융합이 AAT의 NE 억제 능력을 손상시키지 않았음을 입증한다 (도 4C).
기타 실시태양
본 발명은 이에 대한 자세한 설명과 더불어 기재되었으나, 상기 기재는 설명(illustrate)를 의도한 것일뿐, 첨부된 청구항의 범위에 의해 정의 되는 발명의 범위를 제한하기 위함이 아니다. 다른 측면들, 이점들 및 변형들은 하기의 청구항의 범위에 속한다.
<110> InhibRx LLC et al. <120> SERPIN FUSION POLYPEPTIDES AND METHODS OF USE THEREOF <130> 42967-502001WO <140> PCT/US2012/044730 <141> 2012-06-28 <150> US 61/502,055 <151> 2011-06-28 <150> US 61/570,394 <151> 2011-12-14 <150> US 61/577,204 <151> 2011-12-19 <150> US 61/638,168 <151> 2012-04-25 <160> 46 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> reactive site loop portion of the alpha-1 antitrypsin (AAT) protein <400> 1 Gly Thr Glu Ala Ala Gly Ala Met Phe Leu Glu Ala Ile Pro Met Ser 1 5 10 15 Ile Pro Pro Glu Val Lys Phe Asn Lys 20 25 <210> 2 <211> 394 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Glu Asp Pro Gln Gly Asp Ala Ala Gln Lys Thr Asp Thr Ser His His 1 5 10 15 Asp Gln Asp His Pro Thr Phe Asn Lys Ile Thr Pro Asn Leu Ala Glu 20 25 30 Phe Ala Phe Ser Leu Tyr Arg Gln Leu Ala His Gln Ser Asn Ser Thr 35 40 45 Asn Ile Phe Phe Ser Pro Val Ser Ile Ala Thr Ala Phe Ala Met Leu 50 55 60 Ser Leu Gly Thr Lys Ala Asp Thr His Asp Glu Ile Leu Glu Gly Leu 65 70 75 80 Asn Phe Asn Leu Thr Glu Ile Pro Glu Ala Gln Ile His Glu Gly Phe 85 90 95 Gln Glu Leu Leu Arg Thr Leu Asn Gln Pro Asp Ser Gln Leu Gln Leu 100 105 110 Thr Thr Gly Asn Gly Leu Phe Leu Ser Glu Gly Leu Lys Leu Val Asp 115 120 125 Lys Phe Leu Glu Asp Val Lys Lys Leu Tyr His Ser Glu Ala Phe Thr 130 135 140 Val Asn Phe Gly Asp Thr Glu Glu Ala Lys Lys Gln Ile Asn Asp Tyr 145 150 155 160 Val Glu Lys Gly Thr Gln Gly Lys Ile Val Asp Leu Val Lys Glu Leu 165 170 175 Asp Arg Asp Thr Val Phe Ala Leu Val Asn Tyr Ile Phe Phe Lys Gly 180 185 190 Lys Trp Glu Arg Pro Phe Glu Val Lys Asp Thr Glu Glu Glu Asp Phe 195 200 205 His Val Asp Gln Val Thr Thr Val Lys Val Pro Met Met Lys Arg Leu 210 215 220 Gly Met Phe Asn Ile Gln His Cys Lys Lys Leu Ser Ser Trp Val Leu 225 230 235 240 Leu Met Lys Tyr Leu Gly Asn Ala Thr Ala Ile Phe Phe Leu Pro Asp 245 250 255 Glu Gly Lys Leu Gln His Leu Glu Asn Glu Leu Thr His Asp Ile Ile 260 265 270 Thr Lys Phe Leu Glu Asn Glu Asp Arg Arg Ser Ala Ser Leu His Leu 275 280 285 Pro Lys Leu Ser Ile Thr Gly Thr Tyr Asp Leu Lys Ser Val Leu Gly 290 295 300 Gln Leu Gly Ile Thr Lys Val Phe Ser Asn Gly Ala Asp Leu Ser Gly 305 310 315 320 Val Thr Glu Glu Ala Pro Leu Lys Leu Ser Lys Ala Val His Lys Ala 325 330 335 Val Leu Thr Ile Asp Glu Lys Gly Thr Glu Ala Ala Gly Ala Met Phe 340 345 350 Leu Glu Ala Ile Pro Met Ser Ile Pro Pro Glu Val Lys Phe Asn Lys 355 360 365 Pro Phe Val Phe Leu Met Ile Glu Gln Asn Thr Lys Ser Pro Leu Phe 370 375 380 Met Gly Lys Val Val Asn Pro Thr Gln Lys 385 390 <210> 3 <211> 217 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 1 5 10 15 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 20 25 30 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 35 40 45 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 50 55 60 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 65 70 75 80 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 85 90 95 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 100 105 110 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu 115 120 125 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 130 135 140 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 145 150 155 160 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 165 170 175 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 180 185 190 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 195 200 205 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 210 215 <210> 4 <211> 216 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 1 5 10 15 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 20 25 30 Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val 35 40 45 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 50 55 60 Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln 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50 55 60 Gln Tyr Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 65 70 75 80 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 85 90 95 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln 100 105 110 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met 115 120 125 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 130 135 140 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu Asn Asn 145 150 155 160 Tyr Asn Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 165 170 175 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Ile 180 185 190 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln 195 200 205 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 210 215 <210> 6 <211> 216 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 1 5 10 15 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 20 25 30 Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp 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Gly Gln Cys Lys Arg Asp Leu Lys Cys Cys Met Gly Met 85 90 95 Cys Gly Lys Ser Cys Val Ser Pro Val Lys Ala 100 105 <210> 10 <211> 51 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Thr Arg Arg Lys Pro Gly Lys Cys Pro Val Thr Tyr Gly Gln Cys Leu 1 5 10 15 Met Leu Asn Pro Pro Asn Phe Cys Glu Met Asp Gly Gln Cys Lys Arg 20 25 30 Asp Leu Lys Cys Cys Met Gly Met Cys Gly Lys Ser Cys Val Ser Pro 35 40 45 Val Lys Ala 50 <210> 11 <211> 117 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Met Arg Ala Ser Ser Phe Leu Ile Val Val Val Phe Leu Ile Ala Gly 1 5 10 15 Thr Leu Val Leu Glu Ala Ala Val Thr Gly Val Pro Val Lys Gly Gln 20 25 30 Asp Thr Val Lys Gly Arg Val Pro Phe Asn Gly Gln Asp Pro Val Lys 35 40 45 Gly Gln Val Ser Val Lys Gly Gln Asp Lys Val Lys Ala Gln Glu Pro 50 55 60 Val Lys Gly Pro Val Ser Thr Lys Pro Gly Ser Cys Pro Ile Ile Leu 65 70 75 80 Ile Arg Cys Ala Met Leu Asn Pro Pro Asn Arg Cys Leu Lys Asp Thr 85 90 95 Asp Cys Pro Gly Ile Lys Lys Cys Cys Glu Gly Ser Cys Gly Met Ala 100 105 110 Cys Phe Val Pro Gln 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975 Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu 980 <210> 31 <211> 595 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AAT-HSA Domain 3 fusion protein <400> 31 Glu Asp Pro Gln Gly Asp Ala Ala Gln Lys Thr Asp Thr Ser His His 1 5 10 15 Asp Gln Asp His Pro Thr Phe Asn Lys Ile Thr Pro Asn Leu Ala Glu 20 25 30 Phe Ala Phe Ser Leu Tyr Arg Gln Leu Ala His Gln Ser Asn Ser Thr 35 40 45 Asn Ile Phe Phe Ser Pro Val Ser Ile Ala Thr Ala Phe Ala Met Leu 50 55 60 Ser Leu Gly Thr Lys Ala Asp Thr His Asp Glu Ile Leu Glu Gly Leu 65 70 75 80 Asn Phe Asn Leu Thr Glu Ile Pro Glu Ala Gln Ile His Glu Gly Phe 85 90 95 Gln Glu Leu Leu Arg Thr Leu Asn Gln Pro Asp Ser Gln Leu Gln Leu 100 105 110 Thr Thr Gly Asn Gly Leu Phe Leu Ser Glu Gly Leu Lys Leu Val Asp 115 120 125 Lys Phe Leu Glu Asp Val Lys Lys Leu Tyr His Ser Glu Ala Phe Thr 130 135 140 Val Asn Phe Gly Asp Thr Glu Glu Ala Lys Lys Gln Ile Asn Asp Tyr 145 150 155 160 Val Glu Lys Gly Thr Gln Gly Lys Ile Val Asp Leu Val Lys Glu Leu 165 170 175 Asp Arg Asp Thr Val Phe 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<211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> reactive site loop of a variant of the fusion alpha-1 antitrypsin polypeptide <400> 32 Gly Thr Glu Ala Ala Gly Ala Glu Phe Leu Glu Ala Ile Pro Leu Ser 1 5 10 15 Ile Pro Pro Glu Val Lys Phe Asn Lys 20 25 <210> 33 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> reactive site loop of a variant of the fusion alpha-1 antitrypsin polypeptide <400> 33 Gly Thr Glu Ala Ala Gly Ala Leu Phe Leu Glu Ala Ile Pro Leu Ser 1 5 10 15 Ile Pro Pro Glu Val Lys Phe Asn Lys 20 25 <210> 34 <211> 394 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> alpha-1 antitrypsin polypeptide portion of the AAT-MM-EL-hFc1 fusion protein <400> 34 Glu Asp Pro Gln Gly Asp Ala Ala Gln Lys Thr Asp Thr Ser His His 1 5 10 15 Asp Gln Asp His Pro Thr Phe Asn Lys Ile Thr Pro Asn Leu Ala Glu 20 25 30 Phe Ala Phe Ser Leu Tyr Arg Gln Leu Ala His Gln Ser Asn Ser Thr 35 40 45 Asn Ile Phe Phe Ser Pro Val Ser Ile Ala Thr Ala Phe Ala Met Leu 50 55 60 Ser Leu Gly Thr Lys Ala Asp Thr His Asp Glu Ile Leu Glu Gly Leu 65 70 75 80 Asn Phe Asn Leu Thr Glu Ile Pro Glu Ala Gln Ile His Glu Gly Phe 85 90 95 Gln Glu Leu Leu Arg Thr Leu Asn Gln Pro Asp Ser Gln Leu Gln Leu 100 105 110 Thr Thr Gly Asn Gly Leu Phe Leu Ser Glu Gly Leu Lys Leu Val Asp 115 120 125 Lys Phe Leu Glu Asp Val Lys Lys Leu Tyr His Ser Glu Ala Phe Thr 130 135 140 Val Asn Phe Gly Asp Thr Glu Glu Ala Lys Lys Gln Ile Asn Asp Tyr 145 150 155 160 Val Glu Lys Gly Thr Gln Gly Lys Ile Val Asp Leu Val Lys Glu Leu 165 170 175 Asp Arg Asp Thr Val Phe Ala Leu Val Asn Tyr Ile Phe Phe Lys Gly 180 185 190 Lys Trp Glu Arg Pro Phe Glu Val Lys Asp Thr Glu Glu Glu Asp Phe 195 200 205 His Val Asp Gln Val Thr Thr Val Lys Val Pro Met Met Lys Arg Leu 210 215 220 Gly Met Phe Asn Ile Gln His Cys Lys Lys Leu Ser Ser Trp Val Leu 225 230 235 240 Leu Met Lys Tyr Leu Gly Asn Ala Thr Ala Ile Phe Phe Leu Pro Asp 245 250 255 Glu Gly Lys Leu Gln His Leu Glu Asn Glu Leu Thr His Asp Ile Ile 260 265 270 Thr Lys Phe Leu Glu Asn Glu Asp 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Ser Leu His Leu 275 280 285 Pro Lys Leu Ser Ile Thr Gly Thr Tyr Asp Leu Lys Ser Val Leu Gly 290 295 300 Gln Leu Gly Ile Thr Lys Val Phe Ser Asn Gly Ala Asp Leu Ser Gly 305 310 315 320 Val Thr Glu Glu Ala Pro Leu Lys Leu Ser Lys Ala Val His Lys Ala 325 330 335 Val Leu Thr Ile Asp Glu Lys Gly Thr Glu Ala Ala Gly Ala Leu Phe 340 345 350 Leu Glu Ala Ile Pro Leu Ser Ile Pro Pro Glu Val Lys Phe Asn Lys 355 360 365 Pro Phe Val Phe Leu Met Ile Glu Gln Asn Thr Lys Ser Pro Leu Phe 370 375 380 Met Gly Lys Val Val Asn Pro Thr Gln Lys Glu Pro Lys Ser Cys Asp 385 390 395 400 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 405 410 415 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 420 425 430 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 435 440 445 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 450 455 460 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 465 470 475 480 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 485 490 495 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 500 505 510 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 515 520 525 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 530 535 540 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 545 550 555 560 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 565 570 575 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 580 585 590 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 595 600 605 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 610 615 620 Gly Lys 625 <210> 37 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D2E7-VK portion of a fusion protein <400> 37 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Arg Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 38 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> antibody constant region of a fusion protein <400> 38 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 39 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D2E7-VH portion of a fusion protein <400> 39 Glu Val Gln Leu 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<213> Artificial Sequence <220> <223> ASTGS linker <400> 45 Ala Ser Thr Gly Ser 1 5 <210> 46 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> (G3S)2 linker <400> 46 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser 1 5

Claims (53)

  1. 서열번호 2의 아미노산 서열 또는 서열번호 1, 32 및 33으로 이루어진 군에서 선택되는 반응성 루프 서열을 포함하는 AAT 폴리펩타이드를 포함하는 적어도 하나의 인간 알파-1 안티트립신 (AAT) 폴리펩타이드를 갖는 분리된 융합 단백질(fusion protein)로서,
    상기 AAT 폴리펩타이드는 서열번호 6의 아미노산 서열과 적어도 98% 일치하는 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린(immunoglobulin) Fc 폴리펩타이드와 작동 가능하게 연결된 것을 특징으로 하는, 융합 단백질.
  2. 제1항에 있어서, 상기 AAT 폴리펩타이드 및 면역 글로불린 Fc 폴리펩타이드는 경첩 부위(hinge region), 링커 부위(linker region), 또는 경첩 부위 및 링커 부위 모두를 통해 작동 가능하게 연결된 것을 특징으로 하는, 융합 단백질.
  3. 제1항에 있어서, 상기 융합 단백질은 서열번호 43, 44, 45 또는 46의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 융합 단백질.
  4. 제1항에 있어서, 상기 인간 AAT 폴리펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열의 반응성 루프를 포함하는 것을 특징으로 하는, 융합 단백질.
  5. 제1항에 있어서, 상기 인간 AAT 폴리펩타이드는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 융합 단백질.
  6. 제1항에 있어서, 상기 인간 AAT 폴리펩타이드는 서열번호 32의 아미노산 서열의 반응성 루프를 포함하는 것을 특징으로 하는, 융합 단백질.
  7. 제1항에 있어서, 상기 인간 AAT 폴리펩타이드는 서열번호 33의 아미노산 서열의 반응성 루프를 포함하는 것을 특징으로 하는, 융합 단백질.
  8. 제1항에 있어서, 상기 융합 단백질은 서열번호 9 내지 13으로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 WAP 도메인-포함 폴리펩타이드를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 융합 단백질.
  9. 제1항에 있어서, 상기 융합 단백질은 서열번호 9 또는 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 SLPI 폴리펩타이드를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 융합 단백질.
  10. 제1항에 있어서, 상기 면역 글로불린 Fc 폴리펩타이드는 하기 특징을 갖는 것인, 융합 단백질:
    a) 상기 면역 글로불린 Fc 폴리펩타이드는 FcRn 결합이 향상되도록 변형되고;
    b) 상기 면역 글로불린 Fc 폴리펩타이드는, Met252Tyr, Ser254Thr, Thr256Glu, Met428Leu 또는 Asn434Ser 돌연변이 중 적어도 하나를 포함하며; 또는
    c) 상기 면역글로불린 Fc 폴리펩타이드는 Met252, Ser254, Thr256, Met428, 및 Asn434로 이루어진 군에서 선택되는 위치에 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다.
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  13. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 분리된 융합 단백질을 포함하는, 인간인 개체에서 기종(emphysema), 만성 폐쇄성 폐질환(chronic obstructive pulmonary disease, COPD), 급성 심근경색(acute respiratory distress syndrome, ARDS), 알러지성 천식(allergic asthma), 낭포성 섬유증(cystic fibrosis), 폐암(cancers of the lung), 허혈성-재관류 손상(ischemia-reperfusion injury), 심장 이식(cardiac transplantation) 이후의 허혈성/재관류 손상, 심근경색증(myocardial infarction), 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 화농성 관절염(septic arthritis), 건선성 관절염(psoriatic arthritis), 강직성 척추염(ankylosing spondylitis), 크론병(Crohn's disease), 건선(psoriasis), 타입 I(type I diabetes) 및/또는 타입 II 당뇨병 (type II diabetes), 폐렴(pneumonia), 패혈증(sepsis), 이식편대 숙주병(graft versus host disease, GVHD), 상처 치료, 전신성 홍반성 낭창(Systemic lupus erythematosis) 및 다발성 경화증(Multiple sclerosis)에서 선택되는 질병 또는 장애의 증상을 치료 또는 완화하기 위한 약학적 조성물.
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