JP6612255B2 - 羅漢果甘味成分含有組成物の製造方法 - Google Patents
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Description
羅漢果を水系溶媒で抽出する工程と、
前記抽出工程で得られた羅漢果の抽出液を、蛋白分解酵素を固定化した固定化酵素膜に供給して、該抽出液中の蛋白質を分解しながら、該固定化酵素膜を透過させる工程と、
を含むことを特徴とする、羅漢果甘味成分含有組成物の製造方法である。
また、本発明は上記製造方法によって得ることができる高精製羅漢果甘味成分含有組成物、すなわち、モグロシド類(モグロシドV、モグロシドIV、11−オキソーモグロシドV、シアメノシドI)の含量が70〜98重量%であり、蛋白質及びポリフェノールの総含量が5重量%以下である羅漢果甘味成分含有組成物である。
固定化酵素膜法(メンブランリアクター)は、膜処理法と酵素処理法を組み合わせて目的とする分子のみを集める方法であり、膜の表面又は内部に酵素が固定された固定化酵素膜を利用して除去目的成分を酵素分解し分離する方法である。すなわち、膜中の分子の拡散と酵素反応を組み合わせて特定の分子のみを集める固定化酵素膜を用いて該膜の片側の溶液に基質分子を投入すると、基質分子が酵素と反応して生成物が形成され、目的とする分子だけを膜を透過させて取り出す方法である。この方法は羅漢果などの天然物の精製物を製造レベルで製造する方法としては未だ用いられておらず、この点において極めてユニークな方法である。この方法では酵素は膜に固定化されているため、酵素由来の蛋白質が最終製品に混入することがなく、膜によって酵素を反応器内に閉じ込めた状態で目的成分を選択的に分離・精製することが可能である。さらに、固定化酵素膜法には、「特別な処理なしに酵素を固定化できる」、「無菌的操作が可能である(今までのバイオリアクターでは無菌的な処理は不可能であった。)」などの利点もある。
(羅漢果精製品の調製)
羅漢果乾燥原料5000gと水道水50Lをステンレス容器(50L)に入れ、攪拌しながら80℃、2時間加熱処理し、25℃まで冷却した。金網ザル(30メッシュ)にて残渣を取り除き、濾紙フィルター(孔径1μm)にて濾過し抽出液48Lを得た。この抽出液を合成吸着樹脂(三菱化学社製、ダイヤイオンHP20、2000ml)にて処理した。活性化(4%NaOH水2000mlを33ml/minの速度で通液した後、水6000mlで水洗する。次に4%H2SO4水2000mlを33ml/minの速度で通液した後、水6000mlで水洗した)した前記合成吸着樹脂に前記抽出液50Lを33ml/minの速度で通液し、水6000mlで水洗した。次に羅漢果甘味成分であるモグロシド類成分を溶出するため、40%v/vエタノール4000mlを33ml/minの速度で通液し、溶出液3900mlを得た。得られた溶出液のエタノールを除去するため、真空濃縮(ロータリーエバポレーター)で1100mlの濃縮液を得た。この濃縮液に水道水8850ml及び蛋白分解酵素(プロテアーゼM「アマノ」SD、天野エンザイム社製、商品名)50gを加え、10Lにして、これを固定化酵素膜法による精製のための試料とした。
前記固定化酵素膜法による精製、及びその後に行う固定化酵素膜の透過液の膜処理を、それぞれナノ濾過(NF)膜(ダイセン・メンブレン・システム社製、NF膜型番;NP010、硫酸ナトリウム阻止率25%〜40%、孔径:約50nm)、ナノ濾過(NF)膜(ダイセン・メンブレン・システム社製、NF膜型番;NP030、硫酸ナトリウム阻止率85%〜95%、孔径:約2nm)を用いて限外濾過方式にて行った。NP010膜を配置した反応槽(NP010膜反応槽)に前記試料を添加し、循環圧力0.5MPa、循環流量5L/min、35℃の条件で固定化酵素膜法を行い、当該固定化酵素膜からの透過液をNP030膜を配置した反応槽(NP030膜反応槽)に移送した。移送されたNP010膜透過液は、循環圧力1.0MPa、循環流量5L/min、35℃の条件で膜処理し、NP030膜透過液はNP010膜反応槽に戻してリサイクル運転を24時間行った。この時、両膜の透過液が同じ量になるよう循環圧力を微調整しながら行った。この操作により、NP010膜反応槽側で固定化酵素膜法が効率良く行われ、羅漢果より抽出された蛋白質及びポリフェノールが分離・除去され、低分子蛋白質及び低分子ポリフェノールと羅漢果成分であるモグロシド類がNP010膜を透過したと考えられた。また、当該NP030膜透過液は、NP010膜処理で低分子化された蛋白質及びポリフェノールだけがNP030膜より透過した液であり、モグロシド類はNP030膜を透過せず、したがって、NP030膜反応槽側にモグロシド類が精製されたと考えられた。
次に、NP010膜での処理を停止させ、NP030膜反応槽液にイオン交換水50Lを50ml/minの速度で添加して該反応槽を洗浄し、前記NP030膜反応槽液を外に移した。得られたNP030膜反応槽液を精密ろ過(0.45μm)し、粉末乾燥機(スプレードライヤー、条件入口温度180℃、出口温度80℃)で粉末化して羅漢果精製品を得た。当該羅漢果精製品の成分分析を行ったところ、モグロシド類含量75.5重量%、蛋白質含量1.1重量%、ポリフェノール含量(カテキン換算)(モグロシド類は含まない。以下、同様。)1.2重量%、水分含量0.5重量%であった。一方、前記固定化酵素膜による精製を行う前の試料については、モグロシド類含量45.2重量%、蛋白質含量17.4重量%、ポリフェノール含量3.2重量%、水分含量0.5重量%であった。このことから、前記固定化酵素膜法がモグロシド類の含量を選択的に増加させ、蛋白質及びポリフェノールの含量を低減させるうえで有効に働いたことが認められた。
なお、モグロシド類含量(モグロシドV)の測定は、HPLC分析[分析条件:カラム;SHODEX Asahipak NH2P−50 4E(ID4.6×250mm)、展開溶媒;75%CH3CN(isocratic)、流速;0.8ml/min、検出;OD210nm、チャージ量;20μL]によりモグロシドV標準品(和光純薬工業社製)を用いて行った。本実施例では、モグロシド類含量(Mo)は、主甘味成分であるモグロシドVの含量(重量%)を指す(以下の実施例も同様。)。また、蛋白質含量の測定は、ケルダール法により行った。また、ポリフェノール含量の測定は、FOLIN-Denis法(カテキン換算)により行った。
(甘味品質評価)
実施例1で得られた羅漢果精製品(モグロシド類含量75.5重量%、蛋白質含量1.1重量%、ポリフェノール含量1.2重量%)、市場に流通している羅漢果製品1(モグロシド含量5.0重量%、蛋白質含量9.5重量%、ポリフェノール含量15.4重量%)、羅漢果製品2(モグロシド含量50.2重量%、蛋白質含量17.4重量%、ポリフェノール含量7.8重量%)の3種類の羅漢果甘味成分含有組成物について甘味品質評価試験を行った。各試料をモグロシド類濃度が600ppmになるよう蒸留水で希釈した溶液を使用した。コントロールにはグラニュー糖(ショ糖)10%濃度の水溶液を使用した。甘味品質評価は、各羅漢果試料について、甘味品質の基本性能である、「まろやかさ、後味、苦み、こく、すっきり感、しつこさ、くせ、渋味、刺激」の項目について行った。甘味品質評価は、パネラー9人にて官能検査を行い、各項目について、該グラニュー糖水溶液と比較して各試料を以下の評価基準に基づき1〜5段階で評価した(グラニュー糖10%水溶液の評価点を1とした。)。表1にパネラー9人による全項目の評価結果の平均値と標準偏差値を示す。
<甘味品質の評価基準>
評価点 評価内容
5 : 顕著な変化
4 : 有意な変化
3 : やや変化
2 : わずかに変化
1 : 変化なし
表1の結果から、本発明に係る羅漢果精製品は良好な甘味品質を有することが分かった。モグロシド類含量が多い製品ほど、前記項目全てについて甘味品質評価が良好となっており、また、標準偏差の値から甘味品質評価のばらつきも少なかったことから、羅漢果製品に含まれるモグロシド類以外の蛋白質やポリフェノールが甘味品質評価を低下させていると考えられた。
(抗酸化能測定)
羅漢果甘味成分含有組成物中のモグロシド類の濃度と蛋白質及びポリフェノール成分が抗酸化性に与える影響を調べるために、実施例1で得られた羅漢果精製品(モグロシド類含量75.5重量%、蛋白質含量1.1重量%、ポリフェノール含量1.2重量%)、市場に流通している羅漢果製品1(モグロシド含量5.0重量%、蛋白質含量9.5重量%、ポリフェノール含量15.4重量%)、羅漢果製品2(モグロシド含量50.2重量%、蛋白質含量17.4重量%、ポリフェノール含量7.8重量%)の3種類の羅漢果製品の抗酸化能を、食物の抗酸化測定法として一般的であるDPPH法により調べた。
DPPH法に使用した試薬は、2−(N−モルホリノ)エタンスルホン酸(MES)、1,1−ジフェニル−2−ピクリルヒドラジル(DPPH)試薬、Trolox(6−ヒドロキシ−2,5,7,8−テトラメチルクロマン−2−カルボン酸)であり、いずれも和光純薬工業社より購入した。また、試験溶液として、MES緩衝液とDPPH液を調製した。MES緩衝液は、2−(N−モルホリノ)エタンスルホン酸1.72gを水40mlに溶解して調製した(200mM、pH6.0)。DPPH液は、1,1−ジフェニル−2−ピクリルヒドラジル0.0128gをエタノールにて40mlに希釈(800μM)して調製した。また、標準品であるTroloxは、20ppm溶液を標準試料溶液とした。
次に、前記羅漢果製品の各試料をモグロシド類含量の最終濃度が100ppm、200ppm、300ppmになるように50%エタノールで希釈し、それぞれ1.5mlに調製した。その後、これらにMES緩衝液0.75mlとDPPH液0.75mlを試験管で混合し3mlにした。そして、室温で20分間放置後、分光光度計で520nmにおける吸光度を測定した。各試料を20分室温で放置したときの各濃度における520nmの吸光度変化を図1に示す。
DPPHは活性酸素ではないが不対電子を持つラジカルで、活性酸素と同様に他の物質と反応し、酸化させる作用を持っている。DPPHは他の物質を酸化する能力を持っているときは「紫色」を示すが、他の物質を酸化する能力がなくなると「紫色」を失う性質を持っている。つまり、DPPHの紫色を消し去ることのできる物質は、DPPHの酸化能力を奪う=「抗酸化力を持っている」と理解できるので、図1に示したグラフ中の520nmの吸光度強度が低くなればなるほど、添加した物質には抗酸化能が存在することを示す。
図1から明らかなように、羅漢果製品1、羅漢果製品2、羅漢果精製品の順に抗酸化性が高くなっていた。また、標準品であるtrolox最終濃度20ppmの時に520nmの吸光度が0.94となったことより、羅漢果精製品はtrolox濃度20ppmにおける抗酸化能力の約2倍を有していることが分かった。一方、これに対して羅漢果製品1及び羅漢果製品2はモグロシド類同濃度での抗酸化能が低く、モグロシド濃度と抗酸化能力が比例していなかった。この結果から、モグロシド類の抗酸化能を蛋白質及びポリフェノールが阻害していると考えられた。
(SOD活性様作用(活性酸素消去効果)の測定)
実施例1で得られた羅漢果精製品(モグロシド類含量75.5重量%、蛋白質含量1.1重量%、ポリフェノール含量1.2重量%)、市場に流通している羅漢果製品1(モグロシド含量5.0重量%、蛋白質含量9.5重量%、ポリフェノール含量15.4重量%)、羅漢果製品2(モグロシド含量50.2重量%、蛋白質含量17.4重量%、ポリフェノール含量7.8重量%)の3種類の羅漢果製品がSOD(スーパーオキサイド・ディスムターゼ)活性様作用を有するかを、Cayman’s Superoxide Dismurase Assay Kit(Cayman Chemical社製)を用いて調べた。
最終SOD活性が0、0.025、0.05、0.1、0.15、0.2、0.25U/mlになるよう、緩衝液(Tris−HCl,pH8.0)で調製した溶液(10μl)に、キサンチン、キサンチンオキシダーゼ、及びテトラゾリウム塩を添加して230μlとし、20分間室温にてインキュベートした後、マイクロプレートリーダーで450nmにおける吸光度を測定した。各SOD活性濃度における吸光度のLR(linearized rate;例えばStdBのLR値=Std吸光度÷StdB吸光度)を用い、検量線を作成した。
各試料(前記3種類の羅漢果製品)のモグロシドVの最終濃度が1、5、10、25、50、100、250、500ppmの濃度になるように緩衝液(Tris−HCl,pH8.0)で調製した溶液に、キサンチン、キサンチンオキシダーゼ、及びテトラゾリウム塩を添加して230μlとし、20分間室温にてインキュベートした後、マイクロプレートリーダーで450nmにおける吸光度を測定した。検量線作成時と同様なLR値用い、検量線の一次方程式より以下の計算式にてSOD(U/ml)を算出し、その結果を図2に示す。
SOD(U/ml)={(サンプルLR−y軸切片)÷傾き×23}、(y=aX+b:a;傾き、b;y軸切片)
図2から明らかなように、試料のモグロシドV濃度が高いほど、高いSOD活性様作用を有していた。また、SOD活性様作用を蛋白質及びポリフェノールが阻害していると考えられた。
Claims (4)
- 羅漢果を水系溶媒で抽出する工程と、
前記抽出工程で得られた羅漢果の抽出液を、酸性プロテアーゼを固定化した固定化酵素膜に供給して、該抽出液中の蛋白質を分解しながら、該固定化酵素膜を透過させる工程と、
を含むことを特徴とする、羅漢果甘味成分含有組成物の製造方法。 - 羅漢果を水系溶媒で抽出する工程と、
前記抽出工程で得られた羅漢果の抽出液に精製処理を行う工程と、
前記精製工程で得られた羅漢果の抽出液を、酸性プロテアーゼを固定化した固定化酵素膜に供給して、該抽出液中の蛋白質を分解しながら、該固定化酵素膜を透過させる工程と、
を含むことを特徴とする、羅漢果甘味成分含有組成物の製造方法。 - 前記固定化酵素膜の透過液に膜処理を行うことにより、該透過液中の蛋白質とポリフェノールを透過除去する工程をさらに含む、請求項1又は2に記載の製造方法。
- 前記固定化酵素膜において、酸性プロテアーゼを固定化する膜が逆浸透膜又はナノ濾過膜である請求項1〜3のいずれか1項に記載の製造方法。
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