JP6557684B2 - 線維性疾患の治療に用いられるppar化合物 - Google Patents
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Description
・PPARα:主に肝臓、腎臓、心臓、筋肉、脂肪組織及び肺で発現する。
・PPARγ:実質的に全ての組織で発現する。
・PPARδ:特に心臓血管系、泌尿器系、呼吸器系、消化器系及び筋骨格系において様々な組織/細胞で観察される。
図8〜図15の凡例:バーは左から右に対照マウス、媒体で処置した抗GBM暴露マウス、カプトプリルで処置した抗GBM暴露マウス、ロシグリタゾンで処置した抗GBM暴露マウス、ピオグリタゾンで処置した抗GBM暴露マウス、化合物A(30mg/kg)で処置した抗GBM暴露マウス及び化合物A(100mg/kg)で処置した抗GBM暴露マウスを表す。
図16の凡例:バーは左から右に媒体で処置した抗GBM暴露マウス及び化合物A(100mg/kg)で処置した抗GBM暴露マウスを表す。
図17〜図27の凡例:生理食塩水群では、バーは左から右に媒体、化合物A(100mg/kg)及びロシグリタゾンを表す。ブレオマイシン群では、バーは左から右に媒体、化合物A(30mg/kg)、化合物A(100mg/kg)及びロシグリタゾンを表す。
図28〜図30の凡例:Bleo=ブレオマイシン;IVA30=化合物A(30mg/kg);IVA100=化合物A(100mg/kg);Ros=ロシグリタゾン。
図33〜図36の凡例:Rosi=ロシグリタゾン;Feno=フェノフィブリン酸。
上記PPARパンアゴニストは経口投与してもよい。経口投与では、化合物が胃腸管に入るよう飲み込んでもよく、及び/又は、化合物が口から直接血流に入るよう口腔投与、経舌投与又は舌下投与してもよい。経口投与に好適な製剤としては、固形、半固形及び液状システムが挙げられ、例えば錠剤;多粒子、ナノ粒子、液体若しくは粉末を含むソフト若しくはハードカプセル;トローチ剤(液体充填物を含む);咀嚼錠;ゲル;高速分散投与形態;フィルム;腟坐薬;スプレー;及び口腔/粘膜付着性パッチ等が挙げられる。
上記PPARパンアゴニストはまた、血流、筋肉又は内臓に直接投与してもよい。好適な非経口投与手段としては、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、くも膜下腔内投与、脳室内投与、尿道内投与、胸骨内投与、頭蓋内投与、筋肉内投与、滑液嚢内投与及び皮下投与が挙げられる。非経口投与に好適な装置としては、針(マイクロニードルを含む)付き注入器、針なし注入器及び輸液技術が挙げられる。
PPARパンアゴニストはまた、鼻腔内投与すなわち吸入により投与してもよく、典型的には、乾燥粉末吸入器から乾燥粉末(単独又は混合物(ラクトースとの乾燥ブレンド又はリン脂質(例えばホスファチジルコリン)等と混合した混合成分粒子等))の形態で、好適な噴霧剤(1,1,1,2−テトラフルオロエタン又は1,1,1,2,3,3,3−ヘプタフルオロプロパン等)を使用した又は使用しない加圧容器、ポンプ、スプレー、アトマイザー(好ましくは電気流体力学を用いて微細な霧を形成するアトマイザー)又はネブライザーからのエアロゾルスプレーとして、あるいは点鼻薬として投与してもよい。鼻腔内投与で使用する場合、上記粉末は、生体接着剤(キトサン又はシクロデキストリン等)を含んでいてもよい。
上記PPARパンアゴニストはまた、皮膚又は粘膜へ局所投与、皮膚(内)投与又は経皮投与してもよい。この目的のための典型的な製剤としては、ゲル、ヒドロゲル、ローション、溶液、クリーム、軟膏、散布剤、被覆材、発泡体、フィルム、皮膚パッチ、ウエハー、インプラント、スポンジ、線維、包帯及びマイクロエマルションが挙げられる。リポソームを使用してもよい。典型的な担体としては、アルコール、水、鉱油、流動ワセリン、白色ワセリン、グリセリン、ポリエチレングリコール及びプロピレングリコールが挙げられる。浸透促進剤を配合してもよい。
(i)上記化合物を所望の酸又は塩基と反応させる。
(ii)上記化合物の好適な前駆体から酸又は塩基に不安定な保護基を除去する、あるいは、所望の酸又は塩基を使用して好適な環状前駆体(ラクトン、ラクタム等)を開環させる。
(iii)適切な酸又は塩基と反応させるか、あるいは好適なイオン交換カラムを用いることにより、上記化合物の塩を別の塩に変換する。
四塩化炭素(CCl4)が、マウスモデルにおいて肝細胞ミトコンドリア機能不全及び酸化ストレスを誘導して、コラーゲン沈着及び肝線維症を引き起こすことが報告されている(Yao T et al.,Am J Physiol.1994 Sep;267(3 Pt 1):G476−84)。したがって、化合物A及び公知PPARγアゴニストであるロシグリタゾンの効果をCCl4誘導肝線維症のマウスモデルで評価した。
実験は、56匹の雄性C57BL/6Jマウス(JANVIER LABS社(フランス国サン=ベルトヴァンC.S.4105))を用いて行った。実験開始時のマウス体重は21〜24gであった。マウスを3〜10匹からなる各群に分けてポリプロピレン製ケージ(床面積=1032cm2)で標準的な条件下、すなわち室温(22±2℃)、湿度(55±10%)、明暗サイクル(12時間/12時間)、換気(15〜20体積/時)、水及び餌(SDS、RM1)の自由摂取で飼育した。実験前の少なくとも5日間はマウスを馴化した。消えない標識を尾に付けてマウスに番号を付けた。
マウスを以下の群に割り当てた。
1.ヒマワリ油(3週間週2回腹腔内投与)/媒体(22日間1日1回経口投与)、n=7
2.ヒマワリ油(3週間週2回腹腔内投与)/化合物A(100mg/kg/日を22日間1日1回経口投与)、n=8
3.ヒマワリ油(3週間週2回腹腔内投与)/ロシグリタゾン(5mg/kg/日を22日間1日1回経口投与)、n=8
4.CCl4(3.5mL/kgを3週間週2回腹腔内投与)/媒体(22日間1日1回経口投与)、n=8
5.CCl4(3.5mL/kgを3週間週2回腹腔内投与)/化合物A(30mg/kg/日を22日間1日1回経口投与)、n=8
6.CCl4(3.5mL/kgを3週間週2回腹腔内投与)/化合物A(100mg/kg/日を22日間1日1回経口投与)、n=7
7.CCl4(3.5mL/kgを3週間週2回腹腔内投与)/ロシグリタゾン(5mg/kg/日を22日間1日1回経口投与)、n=8
21日目の投与2時間後に、ペントバルビタール(60mg/kg、腹腔内投与)で動物に麻酔をかけ、心穿刺により採血した。動物毎に正確な投与時間及び試料採取時間を記した。血液試料(全血0.9mL)を予め冷却しておいた2mL容リチウム−ヘパリン採血管に入れた。この血液試料を穏やかに混合し、砕いた氷上に置き、採血30分以内に約+4℃、約1500×gで10分間遠心分離した。血液試料毎に、得られた血漿を2等分(それぞれ少なくとも100μL)し、使い捨てプラスチック材料を用いてポリプロピレン管に移した。試料を直立させた状態ですぐに冷凍庫に移して−20℃に保った。
・第1の組織試料(約50mg)を採取し、パラホルムアルデヒドで固定し、5±3℃とした。
・第2の組織試料(200mg)を液体窒素中で冷凍し、−20℃に保った。
コラーゲン
コラーゲンの定量は、切片をピクロシリウスレッドで染色し、マイヤーヘマトキシリンで対比染色した。全てのスライドをデジタル化し、image Jソフトウェア(バージョン1.42、米国国立衛生研究所)により3つの異なる切片の5つの重なっていない視野を無作為に分析した。全てのスライドは、厳密に同じ条件で一人の実験者により分析した。
少量の凍結肝臓試料(50〜100mg)のmRNA抽出を行った。簡単に説明すると、乳鉢と乳棒を用いて試料を低温ですり潰した。次いで、Retsch MM300装置で大理石(2×5mn)と1mlのQIAzol溶解試薬(Qiagen製、参照番号79306)を用いて試料を均質化した。Qiagen Rneasy lipid Kit(参照番号74804)を用いて製造者の指示に従って肝臓ホモジネートのRNA抽出を完了した。Nanodrop(ND2000、Thermo Scientific社)でRNA量を測定し、RNA特性をBioanalyzer(2100、Agilent Technology社)で確認した。
肝臓タンパク質抽出プロトコル:
T−PER(R)を用いた抽出:Tissue Protein Extraction Reagent(製品番号78510(ロット:NG174004)、Thermo Scientific社)とHalt Protease Inhibitor Single−Use Cocktail(EDTAフリー(100×)、製品番号78425(ロット番号NL178051)、Thermo Fischer社)
TIMP−1:マウスTIMP−1(R&D SYSTEMS(R)、参照番号TM100)
TGF−β1:Quantikineマウス/ラット/ブタ/イヌTGF−β1免疫アッセイ(R&D SYSTEMS(R)、参照番号MB100B)
Graphpadソフトウェア(バージョン5.1)を用いて全てのパラメータを解析した。パラメータは以下のようにして解析した。
・独立した試料に対してスチューデントのt検定を用いて第1群と第4群を比較して実験(CCl4の効果)を確認した。
・独立した試料に対してスチューデントのt検定を用いて第1群と第2群、第1群と群3を比較して化合物A又はロシグリタゾン単独の効果を調べた。
・一元配置分散分析(処置)を用いて第4群と化合物A処置群(5、6)を比較してCCl4誘導肝線維症に及ぼす化合物Aの効果を調べた。分散分析が有意であると分かれば、ダネットの検定を用いた。
・独立した試料に対してスチューデントのt検定を用いて第4群とロシグリタゾン処置群(第7群)を比較してCCl4誘導肝線維症に及ぼすロシグリタゾンの効果を調べた。
1/血漿トリグリセリド
CCl4暴露マウスにおいて、化合物A(30mg/kg/日及び100mg/kg/日)によって血漿トリグリセリドが媒体と比べて有意に低下した(それぞれp<0.05、p<0.01)。一方、ロシグリタゾンでは、有意水準に達することはなかったものの血漿トリグリセリドが増加した(図1)。
CCl4暴露マウスにおいて、化合物A(30mg/kg/日及び100mg/kg/日)によってコラーゲン量が媒体と比べて有意に低下し(それぞれ−80%(p<0.01)、−89%(p<0.001))、ロシグリタゾンでもコラーゲン量が有意に低下した(−54%(p<0.05))(図2)。
CCl4暴露マウスにおいて、化合物A(30mg/kg/日及び100mg/kg/日)によってTGFβ−1発現が媒体と比べて有意に阻害された(それぞれp<0.01、p<0.001)。一方、ロシグリタゾンではTGFβ−1発現が有意に上方制御された(p<0.001)(図3)。
CCl4暴露マウスにおいて、化合物A(30mg/kg/日及び100mg/kg/日)によってCol1a発現が媒体と比べて有意に阻害された(それぞれp<0.05、p<0.001)。一方、ロシグリタゾンでは、有意水準に達することはなかったもののCol1a発現が上方制御された(図4)。
CCl4暴露マウスにおいて、化合物A(100mg/kg/日)によって、有意水準に達することはなかったもののα−SMA発現が媒体と比べて阻害された。一方、ロシグリタゾンでは、有意水準に達することはなかったもののα−SMA発現が上方制御された(図5)。
CCl4暴露マウスにおいて、化合物A(100mg/kg/日)によってMCP−1発現が媒体と比べて有意に阻害された(p<0.05)。一方、ロシグリタゾンでは効果が見られなかった(図6)。
CCl4暴露マウスにおいて、化合物A(30mg/kg/日及び100mg/kg/日)によってフィブロネクチン発現が媒体と比べて有意に阻害された(p<0.001)。一方、ロシグリタゾンでは、有意水準に達することはなかったもののフィブロネクチン発現が上方制御された(図7)。
マウスの抗GBM(糸球体基底膜)誘導糸球体腎炎は、CKDを防ぐ新規化学物質の可能性を評価するためのインビボモデルとして一般的に用いられている。したがって、化合物A、ロシグリタゾン及びピオグリタゾン(公知PPARγアゴニスト)並びにカプトプリル(公知ICE((アンジオテンシン)変換酵素阻害剤))の効果を上記モデルで評価した。
実験開始時に8〜10週齢の雌性C57BL/6Jマウス(CERJ Janvier社(フランス国ルジュネスト=サン=ティスル、シェンセク通り))を用いて実験を行った。体重に基づいて3〜4匹からなる各群に分けてマウスを無作為にポリプロピレン製ボックス(床面積=1032cm2)に割り当てた。マウスは個々に耳に印を付けた。実験前にマウスを標準的な条件下、すなわち室温(22±2℃)、湿度(55±10%)、明暗サイクル(12時間/12時間)、換気(15〜20体積/時)、水及び餌(SDS、RM1)の自由摂取で1週間馴化した。
マウスを以下の群に割り当てた。
遺伝子発現
少量の凍結肝臓試料(50〜100mg)のmRNA抽出を行った。簡単に説明すると、乳鉢と乳棒を用いて試料を低温ですり潰した。次いで、Retsch MM300装置で大理石(2×5mn)と1mlのQIAzol溶解試薬(Qiagen製、参照番号79306)を用いて試料を均質化した。Qiagen Rneasy lipid Kit(参照番号74804)を用いて製造者の指示に従って肝臓ホモジネートのRNA抽出を完了した。Nanodrop(ND2000、Thermo Scientific社)でRNA量を測定し、RNA特性をBioanalyzer(2100、Agilent Technology社)で確認した。
血清及び尿アッセイ(尿素、クレアチニン、アルブミン及びタンパク質)をKonelab装置及び対応する比色分析試験を用いて行った。
・オステオポンチン:Quantikineマウスオステオポンチン免疫アッセイ(R&D SYSTEMS(R)、参照番号MOST00)
・MCP−1:QuantikineマウスCCL2/JE/MCP−1ELISAキット(R&D SYSTEMS(R)、参照番号MJE00)
Graphpadソフトウェア(バージョン5.1)を用いて全てのパラメータを解析した。一元配置分散分析(処置)を用いてこれらパラメータを解析して、各群(1、2、3、4、5、6及び7)を比較した。分散分析が有意であると分かれば、ダネットの検定を用いて第2群と他の全ての群とを比較した。
1/血清尿素
抗GBM暴露マウスにおいて、化合物A(100mg/kg/日)によって尿素量が媒体と比べて有意に低下した(p<0.01)。一方、カプトプリルでは、有意水準に達することはなかったものの尿素量が低下し、ロシグリタゾン及びピオグリタゾンではいずれも、有意水準に達することはなかったものの尿素量が増加した(図8)。
抗GBM暴露マウスにおいて、化合物A(30mg/kg/日及び100mg/kg/日)によって、有意水準に達することはなかったものの尿量が媒体と比べて低下した。一方、カプトプリルでも、有意水準に達することはなかったものの尿量が低下し、ロシグリタゾン及びピオグリタゾンではいずれも、有意水準に達することはなかったものの尿アルブミンが増加した(図9)。
抗GBM暴露マウスにおいて、化合物A(100mg/kg/日)によって、有意水準に達することはなかったもののアルブミン量が媒体と比べて低下した。一方、カプトプリルでも、有意水準に達することはなかったもののアルブミン量が低下し、ロシグリタゾンでは、有意水準に達することはなかったもののアルブミン量が増加し、ピオグリタゾンではアルブミン量が有意に増加した(p<0.001)(図10)。
抗GBM暴露マウスにおいて、化合物A(100mg/kg/日)によってオステオポンチン量が媒体と比べて有意に低下した(p<0.05)。一方、カプトプリルでもオステオポンチン量が有意に低下し(p<0.05)、ロシグリタゾン及びピオグリタゾンではいずれもオステオポンチン量が有意に増加した(それぞれp<0.01、p<0.05)(図11)。
抗GBM暴露マウスにおいて、化合物A(100mg/kg/日)によってMCP−1量が媒体と比べて有意に低下した(p<0.001)。一方、カプトプリルでもMCP−1量が有意に低下し(p<0.01)、ロシグリタゾン及びピオグリタゾンではいずれもMCP−1量が有意に増加した(p<0.05)(図12)。
抗GBM暴露マウスにおいて、化合物A(100mg/kg/日)によってTGFβR−1発現が媒体と比べて有意に阻害された(p<0.01)。一方、カプトプリルではTGFβ−R1発現に何ら効果が見られず、ロシグリタゾン及びピオグリタゾンではいずれも、有意水準に達することはなかったもののTGFβR−1発現が上方制御された(図13)。
抗GBM暴露マウスにおいて、化合物A(100mg/kg/日)によってCol1a発現が媒体と比べて有意に阻害された(p<0.01)。一方、カプトプリルではCol1a発現に何ら効果が見られず、ロシグリタゾン及びピオグリタゾンではいずれもCol1a発現が有意に上方制御された(p<0.001)(図14)。
抗GBM暴露マウスにおいて、化合物A(100mg/kg/日)によってCol3a発現が媒体と比べて有意に阻害された(p<0.001)。一方、カプトプリルではCol3a発現に何ら効果が見られず、ロシグリタゾンではCol3a発現が有意に上方制御され(p<0.05)、ピオグリタゾンでは、有意水準に達することはなかったもののCol3a発現が上方制御された(図15)。
抗GBM暴露マウスにおいて、化合物A(100mg/kg/日)によって病的糸球体数が有意に低下した(p<0.001)(図16)。
マウスのブレオマイシン誘導肺線維症は、新規化学物質の抗線維化作用の可能性を評価するのに一般的に用いられるインビボモデルである(Corbel et al,2001;Manoury et al,2006)。したがって、化合物A及び公知PPARγアゴニストであるロシグリタゾンの効果を上記モデルで評価した。C57BL/6Jマウスを選択して試験化合物の効果を評価したが、これはブレオマイシン投与により胃で初期炎症反応が生じて線維化リモデリングが起こる傾向があるためである。
77匹の雄性C57BL/6Jマウス(JANVIER LABS社(フランス国F−53941サン=ベルトヴァン、C.S.4105))を用いて実験を行った。実験開始時にマウスの体重は20〜25gであった。マウスを3〜10匹からなる各群に分けてポリプロピレン製ケージ(床面積=1032cm2)で標準的な条件下、すなわち室温(22±2℃)、湿度(55±10%)、明暗サイクル(12時間/12時間)、換気(15〜20体積/時)、水及び餌(SDS、RM1)の自由摂取で飼育した。実験前の少なくとも5日間はマウスを馴化した。消えない標識を尾に付けてマウスに番号を付けた。
マウスを以下の群に割り当てた。
1.0.9%NaCl+媒体(15日間1日1回経口投与)、n=11
2.0.9%NaCl+化合物A(100mg/kg/日を15日間1日1回経口投与)、n=11
3.0.9%NaCl+ロシグリタゾン(5mg/kg/日を15日間1日1回経口投与)、n=11
4.ブレオマイシン(0.3mg)+媒体(15日間1日1回経口投与)、n=10
5.ブレオマイシン(0.3mg)+化合物A(30mg/kg/日を15日間1日1回経口投与)、n=9
6.ブレオマイシン(0.3mg)+化合物A(100mg/kg/日を15日間1日1回経口投与)、n=7
7.ブレオマイシン(0.3mg)+ロシグリタゾン(5mg/kg/日を15日間1日1回経口投与)、n=6
14日目の投与2時間後に、ペントバルビタール(60mg/kg、腹腔内投与)で動物に麻酔をかけ、心穿刺により採血した。動物毎に正確な投与時間及び試料採取時間を記した。血液試料(全血0.9mL)を予め冷却しておいた2mL容リチウム−ヘパリン採血管に入れた。この血液試料を穏やかに混合し、砕いた氷上に置き、採血30分以内に約+4℃、約1500×gで10分間遠心分離した。血液試料毎に、得られた血漿を2等分(それぞれ少なくとも100μL)し、使い捨てプラスチック材料を用いてポリプロピレン管に移した。試料を直立させた状態ですぐに冷凍庫に移して−20℃に保った。
最終採血後、肺組織を摘出した。
・第1の組織試料(中葉)を採取し、パラホルムアルデヒドで固定し、5±3℃に保った。
・第2の組織試料(右葉)を液体窒素中で冷凍し、−20℃に保った。
コラーゲン
コラーゲンの定量は、切片をピクロシリウスレッドで染色し、マイヤーヘマトキシリンで対比染色した。全てのスライドをデジタル化し、image Jソフトウェア(バージョン1.42、米国国立衛生研究所)により3つの異なる切片の5つの重なっていない視野を無作為に分析した。全てのスライドは、厳密に同じ条件で一人の実験者により分析した。
少量の凍結肺試料(50〜100mg)のmRNA抽出を行った。簡単に説明すると、乳鉢と乳棒を用いて試料を低温ですり潰した。次いで、Retsch MM300装置で大理石(2×5mn)と1mlのQIAzol溶解試薬(Qiagen製、参照番号79306)を用いて試料を均質化した。Qiagen Rneasy lipid Kit(参照番号74804)を用いて製造者の指示に従って肺ホモジネートのRNA抽出を完了した。Nanodrop(ND2000、Thermo Scientific社)でRNA量を測定し、RNA特性をBioanalyzer(2100、Agilent Technology社)で確認した。
肺タンパク質抽出プロトコル:
T−PER(R)を用いた抽出:Tissue Protein Extraction Reagent(製品番号78510(ロット:NG174004)、Thermo Scientific社)とHalt Protease Inhibitor Single−Use Cocktail(EDTAフリー(100×)、製品番号78425(ロット番号NL178051)、Thermo Fischer社)
・オステオポンチン:Quantikineマウスオステオポンチン免疫アッセイ(R&D SYSTEMS(R)、参照番号:MOST00)
・MCP−1:QuantikineマウスCCL2/JE/MCP−1ELISAキット(R&D SYSTEMS(R)、参照番号MJE00)
・TIMP−1:マウスTIMP−1(R&D SYSTEMS(R)、参照番号TM100)
Graphpadソフトウェア(バージョン5.1)を用いて全てのパラメータを解析した。これらパラメータは以下のようにして解析した。
・一元配置分散分析(処置)を用いて各群(1、2及び3)を比較した。分散分析が有意であると分かれば、ダネットの検定を用いて第1群と第2群及び第3群とを比較した。
・一元配置分散分析(処置)を用いて各群(1、4、5、6及び7)を比較した。分散分析が有意であると分かれば、ダネットの検定を用いて第1群と第4群、第5群、第6群及び第7群とを比較した。
1/コラーゲン沈着
ブレオマイシン暴露マウスにおいて、化合物A(100mg/kg/日)によってコラーゲン沈着量が媒体と比べて有意に低下した(p<0.05)。ロシグリタゾンでもコラーゲン量が有意に低下した(p<0.05)(図17)。
ブレオマイシン暴露マウスにおいて、化合物A(30mg/kg/日及び100mg/kg/日)によってTIMP−1量が媒体と比べて有意に低下した(p<0.05)。一方、ロシグリタゾンでは、有意水準に達することはなかったもののTIMP−1量が増加した(図18)。
ブレオマイシン暴露マウスにおいて、化合物A(30mg/kg/日及び100mg/kg/日)によって、有意水準に達することはなかったもののMCP−1量が媒体と比べて低下した。一方、ロシグリタゾンでは、有意水準に達することはなかったもののMCP−1量が増加した(図19)。
ブレオマイシン暴露マウスにおいて、化合物A(30mg/kg/日及び100mg/kg/日)によって、有意水準に達することはなかったもののオステオポンチン量が媒体と比べて低下した。一方、ロシグリタゾンでは、有意水準に達することはなかったもののオステオポンチン量が増加した(図20)。
ブレオマイシン暴露マウスにおいて、化合物A(100mg/kg/日)によってTGFβR−1発現が媒体と比べて有意に阻害された(p<0.05)。ロシグリタゾンでもTGFβ−1発現が有意に阻害された(p<0.05)(図21)。
ブレオマイシン暴露マウスにおいて、化合物A(100mg/kg/日)によってCol1a発現が媒体と比べて有意に阻害された(p<0.001)。一方、ロシグリタゾンでは、有意水準に達することはなかったもののCol1a発現が上方制御された(図22)。
ブレオマイシン暴露マウスにおいて、化合物A(100mg/kg/日)によってCol3a発現が媒体と比べて有意に阻害された(p<0.001)。一方、ロシグリタゾンでは、有意水準に達することはなかったもののCol3a発現が阻害された(図23)。
ブレオマイシン暴露マウスにおいて、化合物A(30mg/kg/日及び100mg/kg/日)によって、有意水準に達することはなかったもののTIMP−1発現が媒体と比べて阻害された。一方、ロシグリタゾンではTIMP−1発現が有意に上方制御された(p<0.05)(図24)。
ブレオマイシン暴露マウスにおいて、化合物A(30mg/kg/日及び100mg/kg/日)によって、有意水準に達することはなかったもののMCP−1発現が媒体と比べて阻害された。一方、ロシグリタゾンでは、有意水準に達することはなかったもののTIMP−1発現が上方制御された(図25)。
ブレオマイシン暴露マウスにおいて、化合物A(30mg/kg/日及び100mg/kg/日)によってオステオポンチン発現が媒体と比べて有意に阻害された(p<0.05)。一方、ロシグリタゾンではオステオポンチンに何ら効果が見られなかった(図26)。
ブレオマイシン暴露マウスにおいて、化合物A(100mg/kg/日)によってフィブロネクチン発現が媒体と比べて有意に阻害された(p<0.05)。一方、ロシグリタゾンでは、有意水準に達することはなかったもののフィブロネクチン発現が上方制御された(図27)。
ブレオマイシン誘導皮膚線維症のマウスモデルで化合物Aを試験した。2つの異なる投与量(30mg/kg/日及び100mg/kg/日)の化合物A及び5mg/kg/日のPPARγ基準化合物ロシグリタゾンを21日間毎日マウスに経口投与した。この処置の終了時にマウスを屠殺し、皮膚試料を採取した。全身性線維症経路に関与していることが知られている遺伝子の発現を定量化し、真皮の厚さ及びコラーゲン量を測定した。
6週齢の雄性C56BL/6マウス(Janvier社(フランス国ルジュネスト=サン=ティスル))で実験を行った。マウスを3〜10匹からなる各群に分けてポリプロピレン製ケージ(床面積=1032cm2)で標準的な条件下、すなわち室温(22±2℃)、湿度(55±10%)、明暗サイクル(12時間/12時間)、換気(15〜20体積/時)、水及び餌(SDS、RM1)の自由摂取で飼育した。実験前の少なくとも5日間はマウスを馴化した。消えない標識を尾に付けてマウスに番号を付けた。
マウスを以下の群に割り当てた。
1.0.9%NaCl+媒体(21日間1日1回経口投与)、n=7
2.0.9%NaCl+化合物A(100mg/kg/日を21日間1日1回経口投与)、n=8
3.0.9%NaCl+化合物A(30mg/kg/日を21日間1日1回経口投与)、n=8
4.ブレオマイシン(0.3mg)+ロシグリタゾン(5mg/kg/日を21日間1日1回経口投与)、n=8
5.ブレオマイシン(0.3mg)+媒体(21日間1日1回経口投与)、n=6
6.ブレオマイシン(0.3mg)+化合物A(100mg/kg/日を21日間1日1回経口投与)、n=7
7.ブレオマイシン(0.3mg)+化合物A(30mg/kg/日を21日間1日1回経口投与)、n=7
21日目にマウスを頸椎脱臼により屠殺し、皮膚試料を採取し、分析のために処理した。
真皮及び脂肪層の厚さ
病変皮膚領域を切除し、4%ホルマリン中で固定し、パラフィン包埋した。厚さ5μmの切片をヘマトキシリンとエオシンで染色した。各マウスの病変皮膚の4つの部位において表皮真皮境界部と真皮皮下脂肪境界部の間の長さを測定して真皮の厚さを100倍の倍率で分析した。測定値に10%超の変動が生じる場合に備えて2人の独立した実験者が評価を行って意見を一致させた。
ヒドロキシプロリンアッセイ
ヒドロキシプロリンアッセイにより病変皮膚試料のコラーゲン量を調べた。パンチ生検(Φ3mm)を6M HCl中、120℃で3時間消化した後、6M NaOHで試料をpH7に調整した。その後、試料を0.06MクロラミンTと混合し、室温で20分間インキュベートした。次いで、3.15M過塩素酸及び20%p−ジメチルアミノベンズアルデヒドを添加し、試料をさらに20分間60℃でインキュベートした。Spectra MAX190マイクロプレート分光光度計(Molecular Devices社(米国カリフォルニア州サニーヴェイル))を用いて557nmで吸光度を測定した。
Sircolコラーゲンアッセイ(Biocolor社)を用いて細胞培地の上澄み中の全可溶性コラーゲンを定量した。簡単に説明すると、細胞培地の上澄みを室温で30分間シリウスレッド色素と混合した。遠心分離後、ペレットをアルカリ試薬に溶解させた。Spectra MAX190マイクロプレート分光光度計(Molecular Devices社)を用いて540nmの波長で測定を行った。
データは、平均±平均の標準誤差として表した。統計分析にはスチューデントのt検定を用いた。0.05未満のp値は統計的に有意な結果と見なした。
マウスにブレオマイシンを注射すると、NaClを投与したマウスと比べて真皮の厚さが増加した(図28を参照:NaCl+媒体群と比べてブレオマイシン+媒体群では57%増加)。ロシグリタゾン及び化合物A(30mg/kg)によって、ブレオマイシン暴露マウスの真皮の厚さが媒体と比べて有意に減少した(p≦0.05)。化合物A(100mg/kg)によって、ブレオマイシン暴露マウスの真皮の厚さが媒体と比べてさらに有意に減少した(p<0.001)。
3つのPPAR受容体亜型全てを活性化する化合物Aの能力を一過性トランス活性化アッセイにより測定した。この細胞アッセイは、キメラヒト又はマウスPPARα−Gal4受容体発現プラスミド(又はPPARδ−Gal4又はPPARγ−Gal4)及び5Gal4pGL3TK LucレポータープラスミドをトランスフェクトしたCos−7細胞を用いて行った。トランスフェクションは化学剤(Jet PEI)で行った。トランスフェクト細胞を384ウェルプレートに分配し、24時間置いて回収した。次いで、培地を除去し、試験対象の化合物を含む新しい培地(5μM)を添加した(最終濃度は10−4M〜3 10−10Mの範囲)。一晩インキュベート後、SteadyGlo(Promega社)を製造者の指示に従って添加してルシフェラーゼ発現を測定した。基準物質として10−5Mのフェノフィブリン酸、10−8MのGW501516及び10−6Mのロシグリタゾンを用いた。結果は、基準物質(PPARαではフェノフィブリン酸、PPARγではロシグリタゾン、PPARδではGW501516)を100%とした活性%で表した。ヒト受容体では結果は6回の実験(各回4連)の平均である。マウス受容体では結果は5回(PPARδ)又は6回(PPARα及びγ)の実験(各回4連)の平均である。Assay Explorerソフトウェア(MDL社)を用いて用量効果曲線及びEC50を算出した。結果を以下の表、図31及び図32に示す。
EdU(5−エチニル−2’−デオキシウリジン)取り込みアッセイを行ってPDGF誘導性肺及び皮膚線維芽細胞増殖を阻害する化合物Aの能力を測定した。このアッセイは初代ヒト肺線維芽細胞又は皮膚線維芽細胞(Promocell社)を用いて行った。これらの細胞を96ウェルプレート中の完全増殖培地に蒔いて24時間後、無血清培地で24時間飢餓状態とした。次いで、この培地をPDGF及び試験対象の化合物A(濃度:10−4M〜4.5 10−8Mの範囲)を含む新しい培地と交換してさらに24時間置いた。EdUを細胞に加えて該化合物処置をあと16時間行った。次いで、培地を除去し、細胞をホルムアルデヒドで固定し、蛍光Click−itアッセイ(Invitrogen社)を用いて製造者の指示に従って分裂細胞のDNAに取り込まれたEdUを定量した。基準物質として、3 10−4M〜1.4 10−7Mの範囲の各濃度のフェノフィブリン酸(PPARα)及び3 10−5M〜1.4 10−8Mの範囲の各濃度のロシグリタゾン(PPARγ)を用いた。結果は、全細胞数に対するEdU陽性細胞の%として表した。結果は生物学的反復3回の平均を表す。GraphPad Prismソフトウェアを用いて用量効果曲線及びIC50値を算出した。結果を以下の表、図33及び図34に示す。
筋線維芽細胞マーカーであるα平滑筋アクチン(α−SMA)について免疫細胞化学アッセイを行って、TGFβ誘導性の肺及び皮膚線維芽細胞から筋線維芽細胞への移行(FMT)を阻害する化合物Aの能力を測定した。このアッセイは初代ヒト肺又は皮膚線維芽細胞(Promocell社)を用いて行った。これらの細胞を96ウェルプレート中の完全増殖培地に蒔いて24時間後、無血清培地で24時間飢餓状態とした。次いで、この培地をTGFβ及び試験対象の化合物A(濃度:10−4M〜4.5 10−8Mの範囲)を含む新しい培地と交換してさらに48時間置いた。次いで、培地を除去し、細胞をホルムアルデヒドで固定し、マウスα−SMA一次抗体(Sigma社)及び蛍光標識ヤギ抗マウス二次抗体(Invitrogen社)で染色した。Meta Xpressソフトウェアを用いてα−SMA発現を定量化した。基準物質として、3 10−4M〜1.4 10−7Mの範囲の各濃度のフェノフィブリン酸(PPARα)及び3 10−5M〜1.4 10−8Mの範囲の各濃度のロシグリタゾン(PPARγ)を用いた。結果は、全細胞数に対するα−SMA陽性細胞の%として表した。TGFβ処置のみのものを100%としてデータを標準化した。結果は生物学的反復3回の平均を表す。GraphPad Prismソフトウェアを用いて用量効果曲線及びIC50値を算出した。結果を以下の表、図35及び図36に示す。
Claims (8)
- 5−クロロ−1−[(6−ベンゾチアゾリル)スルホニル]−1H−インドール−2−ブタン酸を含有する線維性疾患治療用医薬組成物。
- 上記線維性疾患が、心臓、肺、肝臓、腎臓、胃腸管、皮膚など、線維症を発症する可能性がある臓器に影響を及ぼす疾患である、請求項1に記載の医薬組成物。
- 上記線維性疾患が、肝線維症、脂肪肝疾患、非アルコール性脂肪性肝炎、慢性腎臓病、肺線維性疾患、全身性強皮症から選択される、請求項1又は2に記載の医薬組成物。
- 上記線維性疾患が肺線維性疾患である、請求項3に記載の医薬組成物。
- 上記肺線維性疾患が特発性肺線維症である、請求項4に記載の医薬組成物。
- 上記線維性疾患が全身性強皮症である、請求項3に記載の医薬組成物。
- 上記線維性疾患が非アルコール性脂肪性肝炎である、請求項3に記載の医薬組成物。
- 経口投与、非経口投与、局所投与、吸入投与又は鼻腔内投与用の組成物である請求項1〜7のいずれかに記載の医薬組成物。
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