UA120851C2 - Сполуки pрar для застосування в лікуванні фіброзних захворювань - Google Patents

Abstract

Представлений винахід належить до застосування агоніста пан-PPAR або до застосування фармацевтичної композиції, що містить зазначений агоніст, для лікування фіброзного стану.

Description

Галузь техніки

Винахід відноситься до застосування агоніста пан-РРАК (рецепторів, які активуються проліфератором пероксисом; від англ.: регохізоте ргоїїїегафг-асіїмаїей гесеріог5) або фармацевтичної композиції, яка містить такий агоніст, для лікування фіброзних захворювань.

Передумови створення винаходу

Фіброз печінки є результатом складних взаємодій між різними типами клітин. Він характеризується залученням запальних клітин в реакцію на хронічне ушкодження і активацією зірчастих клітин печінки (НС; від англ.: пераїйіс 5іейПасе сеїЇ5), що призводить до акумуляції позаклітинного матриксу. Стеатоз зазвичай існує спільно із запаленням печінки і гепатоцелюлярним пошкодженням. Підвищений оксидативний стрес є характерним фактором при всіх хронічних захворюваннях печінки, що призводять до фіброзу, незалежно від їх етіології.

Пошкоджені гепатоцити, НеС та інфільтруючи запальні клітини є основними джерелами активних форм кисню (КО5; від англ.: геасіме охудеп 5ресіе5). У свою чергу, оксидативний стрес викликає рекрутинг запальних клітин і активацію НЗС. Тому в разі хронічного пошкодження печінки виникає порочне коло з пошкодження гепатоцитів, продукції КО5, активації НЗС і рекрутингу запальних клітин, який підсилює фіброгенну відповідь на пошкодження.

Способи ефективного лікування фіброзних захворювань печінки, таких як неалкогольний стеатоз печінки (МАБГО; від англ.: поп-аІсопоЇїс їТацу Іймег аіїбзеазе) та неалкогольний стеатогепатит (МАБН; від англ.: поп-аІсопоїїс вієайпераїйі5), поки залишаються незадовільними. Не існує загальноприйнятого лікування пацієнтів з МАЗН, і деякі терапевтичні опції випробовуються в клінічних дослідженнях (Мирраїапспі К. апа Спаїазапі М., Нерайіоду 2009 49 (1): 306-317; Ооултпап УК еї аІ., 209 Меа. 2010 103 (2): 71-83). Ці дослідження включають застосування багатьох різних класів хімічних сполук (фібрати, тіазолідиндіони, бігуаніди, статини, канабіноїди) та різні терапевтичні цілі (ядерні рецептори, ангіотензинові рецептори, рецептори канабіноїдів, НМОИ-СоА-редуктази). Нещодавно в дослідженнях, в яких використовували тіазолідиндіони (розиглітазон і піоглітазон), показано, що ці лікарські засоби можуть покращувати стан печінки, однак лікування цими лікарськими засобами не позбавлене небажаних ефектів, таких як більш високі ризики застійної серцевої недостатності і остеопорозу, а також збільшення маси тіла, що надає психологічні ефекти на пацієнта |Осултап УК еї аї., див. вище; ЗПігі-змега|ом В. еї аї., У. Нерай!. 2006, 44: 732-41; Меизспулапае!-Теїгі єї а!., Нерашю|іоду 2003 38: 1008-1017). Клінічні дослідження, що включали введення канабіноїдів, виявили проблему нейропсихіатричних порушень (Мирраїапспі К. апа Спаїазапі М., див. вище)|. В інших способах лікування, що розробляються в даний час, для лікування МА5ЗН намагаються використовувати антиоксиданти, але жоден з цих способів лікування ще не дав переконливих результатів (Меїзоп А еї аї., 9). Сіїп. СзавігоепіегоЇ. 2009 43: 990-994). Сполуки-кандидати для лікування хвороб печінки розкриті в публікаціях (М/О 2011/064350 та 5 2013/108573). Однак все ще зберігається потреба в сполуках, які були б придатними для лікування хвороб печінки, зокрема - в сполуках, які були б націлені на деякі компоненти фіброзного процесу, такі як стеатоз, запалення та відкладення колагену, і були б позбавлені побічних дій, які спостерігаються при використанні лікарських засобів, досліджуваних в даний час.

Хронічна хвороба нирок (СКО; від англ.: спгопіс Кіідпеу адізеазе), також відома під назвою "хронічна ниркова недостатність", - це прогресивне зниження функції нирок протягом декількох місяців або років. Термін СКО має загальне значення в даній галузі техніки та використовується для класифікації численних станів, що вражають нирки, що викликають деструкцію ниркової паренхіми та втрату функціональних нефронів або ниркових клубочків. Також слід зазначити, що СКО може бути обумовлена різними причинами, але кінневим шляхом залишається фіброз нирок. Приклади етіології СКО включають, але не обмежуються цим, серцево-судинні захворювання, гіпертензію, діабет, гломерулонефрит, полікістозні захворювання нирок та відторгнення трансплантата нирки. Нирковий фіброз, що характеризується гломерулосклерозом та тубулоінтерстіцальним фіброзом, є поширеним проявом великого розмаїття хронічних хвороб нирок. Патогенез ниркового фіброзу є, по суті, монотонним процесом, який характеризується надмірним накопиченням та відкладенням компонентів позаклітинного матриксу (ЕСМ; від англ.: ехігасеїІшШаг таїгіх). Фіброз нирок - це прогресивний процес, який в кінцевому підсумку призводить до термінальної ниркової недостатності - важкого розладу, яке вимагає діалізу або трансплантації нирок. Тим не менш, не існує специфічного лікування, для якого було б точно показано, що воно уповільнює прогресування хронічної хвороби нирок.

Пошкодження нирок пов'язано з виділенням цитокінів/факторів росту, таких як ТОЕ-ВД (Трансформуючий фактор росту бета; від англ.: їгап5їоптіпуд дгоулй Тасіог беїа), епідермальний бо фактор росту (ЕСЕ; від англ.: ерідегтаї! дгоулй Тасіог) та тромбоцитарний фактор росту (РОСЕ;

від англ.: ріаїеІєї дегімей дгоуліи їТасіогр, пошкодженими або інфільтративними клітинами.

Підвищення продукції ТОБ-Д - один з найважливіших механізмів, що беруть участь в патогенезі ниркового фиброгенезу. ТОБ-В1 стимулює активацію клітин-фібробластів та індукує експресію матриксу через його взаємодію з рецепторами ТОЕ-р, які переважно складаються з двох родин білків - рецепторів типу І (ТВКІ) та типу ІІ (ТВКІЇ). ТОЕ-В1 зв'язується з ТВКІЇ, що приводить до рекрутингу ТВКІ з утворенням гетеромірного комплексу ТОЕ-В-рецептор. Комплекс фосфорилює та активує 5тад2 і ЗтайЗ - два основних типи білків 5таай (від англ.: Зітйаг 1

Моїпеге Адаїп5ї Юесарепіарієдіс), які опосередковують профіброзного явища. Інші сигнальні шляхи, такі як шлях через позаклітинно регульовану кіназу 1/2 (ЕККТ/2; від англ.: ехігасеїшіаг гедшіагеа Кіпазе 1/2), також можуть бути активовані у відповідь на активацію рецепторів ТОБЕ-Д.

Активована ЕКК1/2 бере участь у апоптозі клітин ниркових канальців в обструктивній нирці.

Оскільки вважається, що активація сигнального шляху через ТОЕ-ВД є основним механізмом, який безпосередньо стимулює активацію фібробластів та прогресування фіброзу, терапевтичне втручання в цей шлях може бути визнано стратегією для припинення розвитку або профілактики фіброзу нирок. Сполуки-кандидати для лікування СКО розкриті в публікаціях МО 2012/159107 та УМО 2014/013005). Однак все ще зберігається потреба в сполуках, придатних для лікування СКО.

Фіброзне ремоделювання легень виникає при таких хворобливих станах легень, як гострий респіраторний дистрес-синдром, хронічна обструктивна хвороба легень та астма. Легеневий фіброз характеризується надмірним відкладенням позаклітинного матриксу в інтерстиції, що призводить до респіраторної недостатності. Легеневий фіброз може бути викликаний багатьма різними станами, що включають саркоїдоз, гіперчутливий пневмоніт, колагеноз судин та вплив інгалянтів. У значного числа пацієнтів неможливо виявити першопричину легеневого фіброзу. Ці стани невідомої етіології були названі ідіопатичними інтерстиціальними пневмоніями. Найбільш поширеною формою ідіопатичної інтерстиціальної пневмонії є ідіопатичний легеневий фіброз (ІРР; від англ.: ідіораїйіс риїтопагу Ярго5і5). Початковою гістопатологічною картиною при ІРЕ є картина звичайної інтерстиціальної пневмонії з тимчасовою гетерогенністтю / зон інтерстиціального фіброзу, що чергуються, фібробластичних фокусів (тобто зон більш свіжого фіброзу), запалення, пористих змін (тобто зон старішого фіброзу) та нормальної легеневої

Зо архітектури (тобто тканини без ознак фіброзу). Сполуки-кандидати для лікування ІРЕ розкриті в

МО 2004/103296). Сполуки-кандидати для лікування фіброзних захворювань легенів розкриті в

МО 2009/149188)|. Нещодавно проведені дослідження, що включали тіазолідиндіони, такі як росглітазон, показали, що ці лікарські засоби можуть покращувати стан при легеневому фіброзі, але лікування цими лікарськими засобами не позбавлене небажаних ефектів, таких як більш високі ризики застійної серцевої недостатності (Кипд «). еї аїЇ., Ехреп Оріп. Огид Заї. 2012 11 (4):565-5791. Пірфенідон (5-метил-1-феніл-2-(1Н)-пірідон володіє антіфіброзними властивостями та схвалений в Європі і Японії для лікування ІРЕ. Однак все ще зберігається потреба в альтернативних сполуках, які були б придатними для лікування фіброзних захворювань легенів.

Фіброзні захворювання характеризуються аномальним та надмірним відкладенням колагену та інших компонентів позаклітинного матриксу (ЕСМ) в різних тканинах. Хоча їх етіологія дуже різна, типовим для фіброзних захворювань є присутність ЄСМ-продукуючих фібробластів, що демонструють активований фенотип в уражених тканинах. Активація фібробластів характеризується помітним зростанням транскрипційної активності генів, що кодують колаген типу І ії типу І та фібронектин, ініціацією експресії гладеньком'язового актину-альфа (0-5МА; від англ.: агрпа-5ітоосій тизсіе асііп) та зниженням деградаційної активності щодо ЄСМ. Найбільш частим системним фіброзними захворюванням є системний фіброз, який є рідкісним хронічним захворюванням з невідомою причиною. Це клінічно гетерогенний системний розлад, при якому вражається сполучна тканина шкіри, внутрішніх органів та стінок кровоносних судин. Він характеризується порушеннями мікроциркуляторного русла, розладами імунної системи та масивним відкладенням колагену і інших речовин матриксу в сполучній тканині. Відомо, що базові функції різних типів клітин (ендотеліальних клітин, Т-лімфоцитів, моноцитів, фібробластів, тучних клітин), а також продукція та ефекти цитокінів, факторів росту та молекул адгезії беруть участь в розвитку цього захворювання. Системний фіброз часто називають склеродермією. Спектр склеродерматозних захворювань включає широке розмаїття клінічних форм, таких як вогнищева склеродермія (плямиста, лінійна та генералізована), псевдосклеродермія та синдроми, що перекриваються з подібними шкірними (та гістопатологічними проявами. Крім того, складна патофізіологія системного фіброзу, що включає генетичні фактори, фактори навколишнього середовища, функції судинної та імунної систем, а також фібробласти та речовини матриксу, і складність уражень внутрішніх органів 60 призводять до того, що склеродерматозні захворювання часто вивчають як аутоімунні хвороби або захворювання сполучної тканини. Тому системний фіброз завжди був проблемою для клініцистів при виборі діагностичних процедур та схем лікування. Клінічна діагностика системного фіброзу часто вимагає уваги представників кількох дисциплін (наприклад, дерматологів, ревматологів, пульмонологів, нефрологів та гастроентерологів) і може включати інвазивні процедури, такі як біопсія фіброзної тканини та/або шкіри, для підтвердження діагнозу.

Сполуки-кандидати для лікування системного фіброзу розкриті в публікаціях (05 2013/0287794 та 05 2014/0038956). Однак зберігається потреба в альтернативних сполуках, придатних для лікування системного фіброзу.

Рецептори, що активуються проліфератором пероксисом (РРАК), - це група ядерних рецепторних білків, які функціонують як фактори транскрипції, що регулюють експресію генів.

РРАБК відіграють важливі ролі в регуляції диференціації, розвитку та метаболізму (вуглеводного, ліпідного, білкового) клітин. Ідентифіковано три підтипи РРАК: - РРАКа, які переважно експресуються в печінці, нирках, серці, м'язах, жировій тканині та легенях; - РРАКУ, які експресуються практично в усіх тканинах; - РРАКб, які зустрічаються в різних тканинах/клітинах, зокрема - в серцево-судинній, сечовивідній, дихальній, травній та скелетно-м'язовій системах.

Агоністами РРАБЕ є лікарські засоби, які діють на РРАБ. Їх використовують для лікування симптомів метаболічних хвороб, переважно - для зниження рівнів тригліцеридів та цукру в крові.

Агоністи РРАКа по суті належать до класу фібратів (наприклад - фенофібрат). Агоністи РРАКу по суті належать до тіазолідиндіонів (наприклад - розиглітазон та піоглітазон). Агоністи РРАКб включають СУУ5О1516 - сполука-кандидат, застосування якої в кінцевому підсумку припинили в зв'язку з проблемами з безпекою.

Експресія рецепторів РРАК модифікується при фіброзних захворюваннях. Наприклад, зниження експресії РРАКу відтворено описують в біоптатах шкіри та в експлантованих фібробластах шкіри, отриманих від пацієнтів з системною склеродермією (І акоїа еї аї., Агійгйів

Кез. Тпег. 2012 Мау 1; 14 (3)). Знижена експресія РРАКУу також описана в фібробластах легенів у пацієнтів зі склеродермією ІВодаїкемісп еї аї., Риїт. Мей. Мої. 2012; 20121). Агоністи РРАКУу розиглітазон та піоглітазон захищають гризунів від індукованого блеоміцином фіброзу шкіри та

Зо легенів іп мімо та запобігають активацію профіброзних шляхів та процесів іп міго у клітинних лініях фібробластів та у первинних фібробластах |Аокі еї аї., Кезрігайоп, 2009; 77(3):311-9; затанй еї аї., Еик. у). Рпаптасої. 2012 Аца 15; 689(1-3)). Рецептори РРАКа також модулюють профіброзну відповідь на різні стимули. У легенях фенофібрат - специфічний агоніст РРАКа - запобігав фіброз, індукований блеоміцином (Затанй еї аї., 2012 див.вище). Крім того, показано, що агоніст РРАКу СУУО742 знижує запалення легенів, викликане інстиляцією блеоміцину у мишей |СаПІюпрро еї аї. пі. У. Іттипорайої Рпагтасої, 2010 Осі-Оес; 23(4):1033-461.

Суть винаходу

В даний час виявлено, що агоністи пан-?РРАК, тобто сполуки, які активують всі три рецептора РРАК (РРАКа, РРАКУ та РРАКб), надають сприятливі ефекти при лікуванні різних фіброзних станів. Тому в цьому винаході запропонований агоніст пан-РРАК для застосування в способі лікування фіброзного стану. Даний винахід також запропоновані композиції і способи лікування фибротических стану.

В одному з варіантів здійснення даного винаходу фіброзним станом є стан, що вражає будь- який орган, в якому може розвинутисья фіброз, наприклад - серце, легені, печінку, шлунково- кишковий тракт, шкіру тощо.

В іншому варіанті здійснення даного винаходу фіброзним стан вибрано з: фіброзу печінки, стеатозу печінки, неалкогольного стеатогепатиту, хронічної хвороби нирок, фіброзного захворювання легенів, наприклад - ідіопатичного легеневого фіброзу, та системної склеродермії.

У наступному варіанті здійснення даного винаходу, який може бути об'єднаний з попередніми, агоніст пан-РРАК призначений для перорального введення.

Короткий опис креслень

Фіг. 1 демонструє рівні тригліцеридів в плазмі у мишей підданих дії ССІх, оброблених носієм, сполукою А та росиглітазоном.

Фіг. 2 демонструє відкладення колагену у мишей підданих дії ССіх, оброблених носієм, сполукою А та росиглітазоном.

Фіг. З демонструє експресію ТОЕД-1 у мишей підданих дії ССІх, оброблених носієм, сполукою

А та росиглітазоном.

Фіг. 4 демонструє експресію СоПа у мишей підданих дії ССіІх, оброблених носієм, сполукою бо А та росиглітазоном.

Фіг. 5 демонструє експресію а-ЗМА у мишей підданих дії ССії, оброблених носієм, сполукою

А та росиглітазоном.

Фіг. 6 демонструє експресію МСР-1 (моноцитарного хемотаксичного фактору 1; від англ.: топосуїе спетоайгасіапі ргоїеїп 1) у мишей підданих дії ССІх, оброблених носієм, сполукою А та росиглітазоном.

Фіг. 7 демонструє експресію фібронектину у мишей підданих дії ССіх, оброблених носієм, сполукою А та росиглітазоном.

Пояснення до Фігур 1-7: в групі тварин, які отримували олію, стовпчики представляють (зліва направо): носій, сполуку А (100 мг/кг) та розиглітазон; в групі з ССІ. стовпчики представляють (зліва направо): носій, сполуку А (30 мг/кг), сполуку А (100 мг/кг) та розиглітазон.

Фіг. 8 демонструє рівні сечовини в сироватці у підданих дії антитіл до базальної мембрани ниркових клубочків (ЗВМ; від англ.: діотегиїаг Ббахзетепі тетбгапе) мишей, які отримували лікування носієм, каптоприлом, росиглітазоном, піоглітазоном та сполукою А.

Фіг. 9 демонструє обсяги сечі у підданих дії антитіл до ВМ мишей, які отримували лікування носієм, каптоприлом, росиглітазоном, піоглітазоном та сполукою А.

Фіг. 10 демонструє рівні альбуміну в сечі у підданих дії антитіл до ВМ мишей, які отримували лікування носієм, каптоприлом, росиглітазоном, піоглітазоном та сполукою А.

Фіг. 11 демонструє рівні остеопонтіна у підданих дії антитіл до ЗВМ мишей, які отримували лікування носієм, каптоприлом, росиглітазоном, піоглітазоном та сполукою А.

Фіг. 12 демонструє рівні МСР-1 у підданих дії антитіл до ЗОВМ мишей, які отримували лікування носієм, каптоприлом, росиглітазоном, піоглітазоном та сполукою А.

Фіг. 13 демонструє експресію ТОЕВКІ у підданих дії антитіл до ЗВМ мишей, які отримували лікування носієм, каптоприлом, росиглітазоном, піоглітазоном та сполукою А.

Фіг. 14 демонструє експресію СоІ1а у підданих дії антитіл до ОВМ мишей, які отримували лікування носієм, каптоприлом, росиглітазоном, піоглітазоном та сполукою А.

Фіг. 15 демонструє експресію СоЇЗа у підданих дії анти-ЗВМ мишей, які отримували лікування носієм, каптоприлом, росиглітазоном, піоглітазоном та сполукою А.

Фіг. 16 демонструє кількість патологічних клубочків у підданих дії анти-ЗВМ мишей, які отримували лікування носієм та сполукою А.

Зо Пояснення до Фігур 8-15: стовпчики представляють (зліва направо): контрольних мишей; підданих дії антитіл до ОВМ мишей, які отримували лікування носієм; підданих дії антитіл до

СВМ мишей, які отримували лікування каптоприлом; підданих дії антитіл до ОВМ мишей, які отримували лікування росиглітазоном; підданих дії антитіл до ВМ мишей, які отримували лікування піоглітазоном; підданих дії антитіл до ОВМ мишей, які отримували лікування сполукою

А (30 мг/кг), та підданих дії антитіл до ОВМ мишей, які отримували лікування сполукою А (100 мг/кг). Пояснення до Фіг. 16: стовпчики представляють (зліва направо) контрольних мишей; підданих дії антитіл до ЗВМ мишей, які отримували лікування носієм, та підданих дії антитіл до

СВМ мишей, які отримували лікування сполукою А (100 мг/кг).

Фіг. 17 демонструє відкладення колагену у мишей підданих дії блеоміцину, які отримували лікування носієм, сполукою А та росиглітазоном.

Фіг. 18 демонструє рівні ТІМР-1 (тканинного інгібітора металопротеїназ-1; від англ.: їїє5це іппіріог ої теїайІПоргоїеіпазе5) у мишей підданих дії блеоміцину, які отримували лікування носієм, сполукою А та росиглітазоном.

Фіг. 19 демонструє рівні МСР-1 у мишей підданих дії блеоміцину, які отримували лікування носієм, сполукою А та росиглітазоном.

Фіг. 20 демонструє рівні остеопонтіну у мишей підданих дії блеоміцину, які отримували лікування носієм, сполукою А та росиглітазоном.

Фіг. 21 демонструє експресію ТОЕВКІ у мишей підданих дії блеоміцину, які отримували лікування носієм, сполукою А та росиглітазоном.

Фіг. 22 демонструє експресію СоІ1А у мишей підданих дії блеоміцину, які отримували лікування носієм, сполукою А та росиглітазоном.

Фіг. 23 демонструє експресію СоЇЗА у мишей підданих дії блеоміцину, які отримували лікування носієм, сполукою А та росиглітазоном.

Фіг. 24 демонструє експресію ТІМР-1 у мишей підданих дії блеоміцину, які отримували лікування носієм, сполукою А та росиглітазоном.

Фіг. 25 демонструє експресію МСР-1 у мишей підданих дії блеоміцину, які отримували лікування носієм, сполукою А та росиглітазоном.

Фіг. 26 демонструє експресію остеопонтіну у мишей підданих дії блеоміцину, які отримували лікування носієм, сполукою А та росиглітазоном.

Фіг. 29 демонструє експресію фібронектину у мишей підданих дії блеоміцину, які отримували лікування носієм, сполукою А та росиглітазоном.

Пояснення до Фігур 17-27: в групі з сольовим розчином стовпчики представляють (зліва направо): носій, сполуку А (100 мг/кг) та розиглітазон; в групі з блеоміцином стовпчики представляють (зліва направо): носій, сполуку А (30 мг/кг), сполуку А (100 мг/кг) та розиглітазон.

Фіг. 28 демонструє товщину дерми у мишей підданих дії блеоміціну, які отримували лікування носієм, сполукою А та росиглітазоном.

Фіг. 29 демонструє вміст гідроксипроліну у мишей підданих дії блеоміціну, які отримували лікування носієм, сполукою А та росиглітазоном.

Фіг. 30 демонструє вміст колагену у мишей підданих впливу блеоміціну, які отримували лікування носієм, сполукою А та росиглітазоном.

Пояснення до фігур 28-30: Вісо - блеоміцин; ІММАЗО - сполука А (30 мг/кг); ІМАТ00 - сполука

А (100 мг/кг); Коз - розиглітазон.

Фіг. 31 демонструє активацію рецепторів РРАК а, у та б людини сполукою А як функцію концентрації цієї сполуки.

Фіг. 32 демонструє активацію рецепторів РРАК са, у та б миші сполукою А як функцію концентрації цієї сполуки.

Фіг.33 демонструє дію сполуки А, фенофіброєвої кислоти та розиглітазону на індуковану тромбоцитарним фактором зростання (РОСЕ; від англ.: ріагеїІєїаепймей дтоуУлЛи Тасюг) проліферацію в первинних фібробластах легені людини.

Фіг. 34 демонструє дію сполуки А, фенофіброєвої кислоти та розиглітазону на індуковану

РОСЕ проліферацію в первинних фібробластах дерми людини.

Фіг. 35 демонструє дію сполуки А, фенофіброєвої кислоти та розиглітазону на індукований

ТОВ перехід фібробластів в міофібробласти (ЕМТ; від англ.: йЯБбгоріавіє їо туойбгобріавіб їгап5йіоп) в первинних фібробластах легені людини.

Фіг. 36 демонструє дію сполуки А, фенофіброєвої кислоти та розиглітазону на індукований

ТОВ ЕМТ в первинних фібробластах дерми людини.

Пояснення до Фігур 33-36: Нові - розиглітазон; Гепо - фенофіброєва кислота.

На фігурах 1-36 сполукою А є 5-хлор-1-((6б-бензотіазоліл)усульфоніл|-1 Н-індол-2-бутанова

Зо кислота.

Детальний опис винаходу

Хронічне пошкодження печінки, викликане жирами, алкоголем, вірусом або хімічною речовиною, може індукувати активацію зірчастих клітин печінки для секреції великої кількості позаклітинного матриксу, наприклад - колагену, що може привести до фіброзу печінки внаслідок надлишкового відкладення позаклітинного матриксу.

Хронічна хвороба нирок (СКО) є результатом різних пошкоджень нирок, що вражають приблизно 1095 всього населення. Це прогресивний процес, який характеризується інтерстиціальним фіброзом. Первинною метою лікування пацієнтів 3 СКО є профілактика або щонайменше уповільнення прогресування СКО.

Легеневий фіброз, так званий ідіопатичним легеневим фіброзом (ІЕР), інтерстиціальним дифузним легеневим фіброзом, запальним легеневим фіброзом або фіброзним альвеолітом, є запальним порушенням функції легенів та гетерогенної групою станів, що характеризуються аномальним утворенням фіброзної тканини між альвеолами, викликаний альвеолітом, що включає запальну клітинну інфільтрацію в альвеолярні септи з результуючим фіброзом. Ефекти

ІРЕ є хронічними, прогресуючими та часто фатальними. Велика кількість досліджень, присвячених легеневому фіброзу, показала, що постійна та підвищена експресія деяких цитокінів в легенях призводить до рекрутингу запальних клітин та акумуляції компонентів позаклітинного матриксу з подальшим ремоделюванням архітектури легені. Зокрема, продемонстровано, що прозапальні цитокіни, такі як фактор некрозу пухлин альфа (ТМЕ-а; від англ.: їштог песгові5 Тасіог аІрпа) і інтерлейкін І--138, відіграють важливі ролі в формуванні пневмоніту та легеневого фіброзу. Крім того, профіброзні цитокіни, такі як трансформуючий фактор росту альфа (ТОБ-с; від англ.: їгапетогтіпд дгоул Тасіог аІрпа) і фактор росту сполучної тканини (СТОЕ; від англ.: соппесіїме їіз5уе дгоулп Тасіог), також відіграють критичні ролі в патогенезі легеневого фіброзу.

Склеродермія - це хвороба, яка викликає потовщення шкіри та дисфункцію органів різного ступеня тяжкості, є результатом васкулопатії дрібних судин і іммунноопосередкованого фіброзу.

Клінічні прояви цієї хвороби є дуже гетерогенними і залежать від наявності та ступеня ураження внутрішніх органів. Пацієнти можуть мати спектр проявів хвороби, що варіюються від локалізованого фіброзу шкіри (локалізована склеродермія) до системного порушення з бо ураженням шкіри та внутрішніх органів. Локалізована склеродермія включає різні форми склерозу шкіри без ураження внутрішніх органів. Ці форми склеродермії можуть бути спотворюючими, але лише дуже рідко для контролю активності хвороби необхідна системна терапія. Системний склероз далі поділяють на два різновиди хвороби в залежності від ступеня ураження шкіри та органів. Наявність дифузного системного склерозу означає наявність поширеного склерозу шкіри на проксимальних ділянках кінцівок, тулубу та обличчі. Пацієнти з обмеженим системним склерозом мають фіброз, обмежений кистями рук, передпліччям, ступнями, гомілками та обличчям. Як дифузний, так і обмежений системний склероз пов'язані з ураженням внутрішніх органів; проте пацієнти з дифузним системним склерозом мають більший ризик клінічно значущої дисфункції основних органів. Деяких пацієнтів з обмеженим системним склерозом можна додатково класифікувати як таких що мають СКЕ5Т-синдром (від англ.:

Саїсіпозіз, Наупацйавє рипєпотепоп, Езорпадеєа! адувтоїйййу, Зсієгодасіууу, сшапеоив

ТеІєапдіесіазіах) з супутніми кальцинозом, феноменом Рейно, дискінезією стравоходу, склеродактилією та шкірними телеангіоектазіями. Склеродермія без склерозу - рідкісний розлад, при якому у пацієнтів розвиваються судинні та фіброзні пошкодження внутрішніх органів під час відсутності склерозу шкіри. Патофізіологія системного склерозу включає пошкодження судин та активацію фібробластів, а також гіперпродукцію колагену та інших позаклітинних білків в різних тканинах. Склеродермія характеризується активацією імунної системи, дисфункцією ендотелію та підвищеною активністю фібробластів. Точні провокуючі фактори, що призводять до розвитку системного склерозу, в даний час невідомі. Кілька цитокінів, включаючи інтерлейкін-4 та трансформуючий фактор росту бета (ТОБЕ-Д), беруть участь в активації фібробластів у пацієнтів зі склеродермією. Ці цитокіни виділяються з активованих імунних клітин, фібробластів та ендотеліальних клітин. Активовані фібробласти виробляють структурно нормальний колаген та інші білки позаклітинного матриксу в шкірі і різних внутрішніх органах.

Представлений винахід грунтується на виявленому факті, який полягає в тому, що агоністи пан-РРАК мають позитивні ефекти при лікуванні фіброзних станів, таких як стани, зазначені вище. У контексті даного винаходу термін "агоніст пан-РРАК" відноситься до сполуки, яка значуще активує всі рецептори - РРАКа, РРАКУу та РРАКОб, тобто до сполуки, яку можна окремо визнати агоністом РРАКа, агоністом РРАКУ та агоністом РРАКО на підставі відповідних значень

ЕСзо. Відповідно до даного винаходу, значна активація рецепторів РРАКа, РРАКу та РРАКб досягнута, якщо значення ЕСзо для кожного рецептора менше або дорівнює 105 М. Значення

ЕСвхо для трьох підтипів рецепторів переважно розрізняються за величиною менше ніж на 2 порядки (тобто відношення ЕСзхо для двох підтипів рецепторів або менше 100, або більше 0,01).

У варіанті здійснення даного винаходу агоніст пан-РРАК не є безафібратом.

Тому в одному з аспектів представленого винаходу запропанован агоніст пан-РРАК для застосування в лікуванні фіброзного стану.

В одному з варіантів здійснення даного винаходу фіброзний стан є станом, що вражає будь- який орган, в якому може розвинутися фіброз, такий як серце, легені, печінка, шлунково- кишковий тракт, шкіра, тощо

В іншому варіанті здійснення даного винаходу фіброзний стан вибрано з: фіброзу печінки, стеатозу печінки, неалкогольного стеатогепатиту, хронічної хвороби нирок, фіброзного захворювання легенів, системної склеродермії.

У наступному варіанті здійснення даного винаходу фіброзний стан є захворюванням печінки, переважно - фіброзом печінки, стеатозом печінки або неалкогольним стеатогепатитом.

У наступному варіанті здійснення даного винаходу фіброзний стан є хронічною хворобою нирок. Хвороба, зокрема, вибрана з нефропатії (наприклад, мембранозної нефропатії, діабетичної нефропатії та гіпертонічної нефропатії), гломерулонефриту (наприклад, мембранозного гломерулонефриту та мембранопроліферативного гломерулонефриту, такого як швидко прогресуючий гломерулонефрит), інтерстиціального нефриту, вовчакового нефриту, ідіопатичного нефротичного синдрому (наприклад, нефротичного синдрому з мінімальними змінами та фокального сегментарного гломерулосклерозу), обструктивної уропатії, полікістозної хвороби нирок (наприклад, аутосомно-домінантної полікістозної хвороби нирок та аутосомно- рецесивної полікістозної хвороби нирок) та відторгнення трансплантата нирки (наприклад, гострого і хронічного відторгнення трансплантата нирки).

У наступному варіанті здійснення даного винаходу фіброзний стан є фіброзним захворюванням легенів, переважно - ідіопатичним легеневим фіброзом.

У наступному варіанті здійснення даного винаходу фіброзний стан є фіброзом шкіри, таким як системна склеродермія.

У наступному варіанті здійснення даного винаходу, який може бути об'єднаний з будь-яким з попередніх варіантів здійснення даного винаходу, агоніст пан-РРАК призначений для перорального введення.

Агоніст пан-РРАК може бути включений в фармацевтичну композицію для введення.

Тому в іншому аспекті даний винахід забезпечує фармацевтичну композицію, що включає агоніст РРАК спільно з фармацевтично прийнятним наповнювачем, для застосування в лікуванні фіброзного стану, зазначеного вище в різних варіантах здійснення першого аспекту винаходу. В одному з варіантів здійснення даного винаходу композиція містить терапевтично ефективну кількість агоніста пан-РРАК. У контексті даного винаходу термін "терапевтично ефективна кількість" означає кількість агоніста пан-РРАЕ, достатня для забезпечення бажаного ефекту. В кінцевому підсумку, лікар, що лікує вибирає відповідну кількість та схему дозування.

У наступному аспекті даний винахід забезпечує застосування панагоніста РРАК для отримання медикаменту для лікування фіброзного стану, зазначеного вище в різних варіантах здійснення першого аспекту винаходу.

У наступному аспекті даний винахід забезпечує спосіб лікування фіброзного стану, зазначеного вище в різних варіантах здійснення першого аспекту винаходу, який включає введення суб'єкту, що цього потребує, терапевтично ефективної кількості агоніста пан-РРАВ.

Суб'єктом в характерному випадку є ссавець, переважно - людина. Термін "терапевтично ефективна кількість" має таке ж значення, як зазначено вище.

Агоніст пан-РРАК зазвичай вводять у вигляді композиції в комбінації з одним або більше фармацевтично прийнятними наповнювачами. Термін "наповнювач" в контексті даного винаходу використовують для позначення будь-якого інгредієнта, що відрізняється від агоніста пан-РРАК. Вибір наповнювача (або наповнювачів) у великій мірі буде залежати від таких чинників, як конкретний спосіб введення, вплив наповнювача на розчинність та стабільність і природа лікарської форми.

Фармацевтичні композиції, придатні для доставки агоніста пан-РРАК, та способи їх отримання будуть очевидними для фахівців в даній області техніки. Такі композиції та способи їх отримання можна знайти, наприклад, в публікації (БРетіпдіоп'є Рпаптасеціїса! Зсіеєпсев5, 1911

Едйіоп (Маск Рибіїзніпяа Сотрапу, 1995)), зміст якої повністю включено в дану публікацію як

Зо посилання.

Пероральне введення

Агоніст РРАК-пан можна ввести перорально. Пероральне введення може включати проковтування, при якому сполука потрапляє в шлунково-кишковий тракт, та/або букальне, лінгвальне або сублінгвальне введення, за якими сполука проникає в кровоток безпосередньо з ротової порожнини. Композиції, придатні для перорального введення, включають тверді, напівтверді та рідкі системи, такі як таблетки; м'які або тверді капсули, що містять безліч частинок або наночастинки, рідини або порошки; таблетки для розсмоктування (в тому числі заповнені рідиною); жувальні гумки; гелі; швидко диспергуючі лікарські форми; плівки; овули; спреї; та букальні/мукоадгезивні пластирі.

Рідкі композиції включають суспензії, розчини, сиропи та еліксири. Такі композиції можна використовувати як наповнювачі для м'яких або твердих капсул (виготовлених, наприклад, з желатину або гідроксипропілметилцелюлози), і в характерному випадку вони містять носій, наприклад - воду, етанол, поліетиленгліколь, пропіленгліколь, метилцеллюлозу або відповідну олію, та один або більше емульгуючих засобів та/або суспендуючих засобів. Рідкі композиції можна також приготувати за допомогою розчинення твердих речовин, наприклад - з саше.

У разі таблетованих або капсульованих лікарських форм, в залежності від дози, лікарський засіб може становити від 1 мас. 95 до 80 мас. 95 дозованої форми, переважно - від 5 мас. 95 до 60 мас. 95 дозованої форми. Крім лікарського засобу, таблетки зазвичай містять дезінтегруючий засіб. Приклади дезінтегруючих засобів включають натрію крохмалю гліколят, натрій карбоксиметилцелюлозу, натрій кросскармелозу, кросповідон, полівінілпіролідон, метилцеллюлозу, мікрокристалічну целюлозу, гідроксипропілделюлозу, заміщену нижчими алкільними групами, крохмаль, попередньо желатинізований крохмаль та альгінат натрію. У конкретному випадку дезінтегруючий засіб становитиме від 1 мас. 95 до 25 мас. 95, переважно - від 5 мас. 95 до 20 мас. 95 дозованої форми.

Зв'язуючі речовини зазвичай використовують для додавання когезивних властивостей таблетованій композиції. Відповідні зв'язуючі речовини включають мікрокристалічну целюлозу, желатин, цукор, поліетиленгліколь, натуральні та синтетичні камеді, полівінілпіролідон, попередньо желатинізований крохмаль, гідроксипропілцелюлозу та гідроксипропілметилцелюлозу. Таблетки можуть також містити розчинники, наприклад - лактозу 60 (моногідрат, моногідрат, висушений розпиленням, безводну лактозу тощо), манітол, ксилітол,

декстрозу, сахарозу, сорбіт, мікрокристалічну целюлозу, крохмаль та двохосновного фосфату кальцію дигідрат.

Таблетки або капсули можуть також необов'язково містити поверхнево-активні засоби, такі як натрію лаурилсульфат та полісорбат 80, і речовини, що забезпечують ковзання, такі як діоксид кремнію і тальк. Якщо вони присутні, то поверхнево-активні засоби можуть становити від 0,2 мас. 95 до 5 мас. 95 таблетки, а речовини, що забезпечують ковзання, можуть становити від 0,2 мас. 95 до 1 мас. 95 таблетки.

Таблетки також зазвичай містять змащуючі засоби, такі як стеарат магнію, стеарат кальцію, стеарат цинку, стеарилфумарат натрію та суміші стеарату магнію з лаурилсульфатом натрію.

Змащуючі засоби зазвичай складають від 0,25 мас. 95 до 10 мас. 95, переважно - від 0,5 мас. 95 до З мас. 95, таблетки.

Іншими можливими інгредієнтами є антиоксиданти, барвники, смакові добавки, консерванти та агенти, що маскують смак.

Характерна таблетка містить до приблизно 80 мас. 95 лікарського засобу, від приблизно 10 мас. 95 до приблизно 90 мас. 95 зв'язуячої речовини, від приблизно 0 мас. 95 до приблизно 85 мас. 96 розчинника, від приблизно 2 мас. 95 до приблизно 10 мас. 95 дезінтегруючого засобу та від приблизно 0,25 мас. 95 до приблизно 10 мас. 95 змащуючого засобу.

Суміші для таблетування можна спресувати безпосередньо або за допомогою роликового пресу з отриманням таблеток. Суміші для таблетування або порції цих сумішей перед таблетуванням можна альтернативно піддати вологому гранулюванню, сухому гранулюванню або гранулюванню з розплаву, затвердінню з розплаву або екструдуванню. Кінцева композиція може містити один або більше шарів та може містити або не містити покриття; крім того, вона може бути інкапсульованою.

Парентеральне введення

Агоніст пан-РРАК також можна ввести безпосередньо в кровоток, в м'яз або у внутрішній орган. Відповідні способи парентерального введення включають внутрішньовенне, внутрішньоартеріальне, внутрішньочеревне, внутрішньотекальне, внутрішньошлуночкове, внутрішньоуретральне, внутрішньостернальне, внутрішньочерепне, внутрішньом'язове, внутрішньосиновіальне та підшкірне введення. Відповідні пристрої для парентерального

Зо введення включають вушко (в тому числі - мікроголкове) ін'єктори, безголкові ін'єктори та інфузійні пристрої.

Парентеральні композиції переважно є водними розчинами, які можуть містити наповнювачі, такі як солі, вуглеводи та буферні агенти (переважно для підтримки рнН в діапазоні від З до 9), але для деяких прикладних задач більш придатними можуть бути стерильний неводний розчин або суха форма для використання разом із відповідним носієм, таким як стерильна, апірогенна вода.

Приготування парентеральних композицій в стерильних умовах, наприклад - за допомогою ліофілізації, легко може бути виконано з використанням стандартних фармацевтичних способів, добре відомих фахівцям в даній галузі техніки.

Розчинність агоніста пан-?РАК, що використовують для приготування парентеральних розчинів, можна підвищити за рахунок використання відповідних способів складання композицій, таких як включення агентів, що підвищують розчинність, або відповідних технологій, таких як БМЕРО5 (самомікроемульгуюча система доставки лікарських засобів; від англ.: 5еїї

Місто Етиївітуїпа Огид Оєїїмегу Зувіет).

Композиції для парентерального введення можуть бути складені як композиції з безпосереднім та/або модифікованим вивільненням. Композиції з модифікованим вивільненням включають композиції з відстроченим, безперервним, пульсуючим, контрольованим, спрямованим та програмованим вивільненням. Агоніст пан-РРАК може бути включений в композицію у формі суспензії або у твердій, напівтвердій формі або у формі тиксотропної рідини для введення у формі депо, що імплантується, що забезпечує модифіковане вивільнення активної сполуки. Приклади таких композицій включають стенти, вкриті лікарським засобом, та напівтверді форми і суспензії, що містять навантажені лікарським засобом мікросфери полі-аЇ- молочної-со-гліколевої кислоти (РОГ А; від англ.: роїу (аІ-Іасіїс-содіусоїїс)асіа).

Інгаляційне/інтраназальне введення

Агоніст пан-РРАК також можна ввести інтраназально або за допомогою інгаляції, в конкретному випадку - у формі сухого порошку (окремо, у формі суміші, наприклад - у формі сухої суміші з лактозою, або у формі частки зі змішаних компонентів, наприклад - в суміші з фосфоліпідами, такими як фосфатидилхолін) з інгалятора сухого порошку, у формі розпилюючого аерозолю з контейнера, що знаходиться під тиском, насосу, розпилювача, 60 атомізатора (переважно - з атомізатора, в якому для отримання тонкого туману використовують електрогідродинаміку) або небулайзера, з використанням або без використання відповідного палива, наприклад - 1,1,1,2-тетрафторетану або 1,1,1,2,3,3,3-гептафторпропану, або у формі назальних крапель. При інтраназальному застосуванні порошок може містити біоадгезивний агент, наприклад - хітозан або циклодекстрин.

Контейнер під тиском, насос, розпилювач, атомізатор або небулайзер містить розчин або суспензію агоніста пан-РРАК, що містять, наприклад, етанол, водний розчин етанолу або відповідний альтернативний агент для диспергування, солюбілізації або тривалого вивільнення активної речовини, пропеллент (або пропелленти) як розчинник та необов'язкову поверхнево- активну речовину, наприклад - сорбітану триолеат, олеїнову кислоту або олігомолочну кислоту.

Перед вживанням композиції у формі сухого порошку або суспензії лікарський препарат мікронізують до розміру, придатного для доставки за допомогою інгаляції (в конкретному випадку - менше 5 мікрометрів). Це може бути забезпечено будь-яким придатним способом тонкого подрібнення, таким як розмелювання на спіральному струменевому млині, розмелювання на струменевому млині з киплячим шаром, переробка надкритичної рідини з отриманням наночастинок, гомогенізація високого тиску або сушка розпиленням.

Капсули (виготовлені, наприклад, з желатину або гідроксипропілметилцелюлози), блістери та картриджі для використання в інгаляторі або інсуфляторі можна приготувати так, щоб вони містили порошкоподібну суміш агоніста пан-РРАК, придатної порошкоподібної основи, наприклад - лактози або крохмалю, та модифікатора експлуатаційних властивостей, наприклад - Ілейцину, манітолу або стеарату магнію. Лактоза може бути безводною або мати форму моногідрату, переважний другий варіант. Іншими придатними наповнювачами є декстран, глюкоза, мальтоза, сорбітол, ксиліт, фруктоза, сахароза та трегалоза.

Придатна композиція у формі розчину для використання в атомізаторі на основі електрогідродинаміки для отримання тонкого туману може містити від 1 мг до 20 мг агоніста пан-РРАК на одне спрацювання, а обсяг, що виділяється при спрацюванні, може варіюватися від 1 мкл до 100 мкл. Типова композиція може містити агоніст пан-РРАК, пропіленгліколь, стерильну воду, етанол та хлорид натрію. Альтернативними розчинниками, які можна використовувати замість пропіленгліколю, є гліцерин та поліетиленгліколь.

Відповідні смакові добавки, такі як ментол та левоментол, або підсолоджувачі, такі як

Зо сахарин або сахарин натрію, можна додати до композицій даного винаходу, призначеним для інгаляційного/інтраназального введення.

Композиції для інгаляційного/інтраназального введення можуть бути складені так, щоб вони були призначені для негайного та/або модифікованого вивільнення, з використанням, наприклад, РОГА. Композиції з модифікованим вивільненням включають композиції з відстроченим, безперервним, пульсуючим, контрольованим, спрямованим та програмованим вивільненням.

У разі інгаляторів сухого порошку та аерозолів одиниця дозування визначається за допомогою клапану, який доставляє відведену кількість. Пристрої даного винаходу переважно влаштовані так, що вони вводять відміряну дозу або "викид", що містить від 1 мкг до 10 мкг агоністу пан-РРАК. Загальна добова доза переважно буде знаходитись в діапазоні від 1 мкг до 200 мкг, причому її можна ввести у вигляді однієї дози або частіше у вигляді дрібних доз протягом дня.

Місцеве введення

Агоніст РРАК також можна вводити місцево - (інтра)дермально або трансдермально - через шкіру або слизову оболонку. Типовими композиціями, призначеними для цієї мети, є гелі, гідрогелі, лосьйони, розчини, креми, мазі, присипки, пов'язки, піни, плівки, шкірні пластирі, прокладки, імплантати, губки, волокнисті матеріали, бандажі та мікроемульсії. Також можуть бути використані ліпосоми. Типові носії включають спирт, воду, мінеральну олію, вазелінову олію, медичний вазелін, гліцерин, поліетиленгліколь та пропіленгліколь. Також можуть бути включені підсилювачі пенетрації.

Іншими способами місцевого введення є доставка за допомогою електропорації, іонофорезу, фонофорезу, сонофорезу та мікроголюкова або безголкова (наприклад,

Ромаегіесі м, Віо)есі "м тощо) ін'єкція.

Композиції для місцевого введення можуть бути складені так, щоб вони забезпечували негайне та/або модифіковане вивільнення. Композиції з модифікованим вивільненням включають композиції з відстроченим, безперервним, пульсуючим, контрольованим, спрямованим та програмованим вивільненням.

Пероральний та парентеральний способи введення застосовні незалежно від типу фіброзного стану. Місцеве введення може бути застосовано в тому випадку, якщо фіброзний бо стан є, наприклад, системною склеродермією. Інгаляційне/нтраназальне введення може бути застосовано в тому випадку, якщо фіброзний стан є, наприклад, легеневим фіброзом або системною склеродермією.

При пероральному введенні агоніст РРАК можна ввести пацієнту в дозах, що знаходяться в діапазоні від приблизно 100 мг на день до приблизно 3000 мг на день, переважно - від приблизно 500 мг на день до приблизно 3000 мг на день. Загальну денну дозу можна ввести у вигляді однієї дози або у вигляді дрібних доз. Фармацевтична композиція даного винаходу, як правило, може містити від приблизно 100 мг до приблизно 1000 мг агоніста пан-РРАВ, наприклад - 100 мг, 200 мг, 500 мг, 750 мг або 1000 мг агоніста пан-РРАВ.

У конкретному випадку були приготовані суспензії агоніста пан-РРАК в 1 95 -ому розчині метилцелюлози та у 1 95 -ому розчині метилцелюлози з додаванням 0,5 9о полоксамеру. Також були приготовані капсули, що містять 25 мг, 50 мг або 200 мг агоніста РРАК. Також були приготовані композиції для внутрішньовенного введення, в яких агоніст пан-?РРАК був розчинений в 30 мас. 95/70 мас. 96 ПЕГ400/0,05 М фосфатному буфері, рН 8 (від 25 мкг/мл до 100 мкг/мл).

У ще одному варіанті здійснення даного винаходу, який може бути об'єднаний з будь-яким з попередніх варіантів здійснення будь-якого з аспектів даного винаходу, агоністом РРАК-пан є

Б-хлор-1-(б-бензотіазоліл)усульфоніл|-1 Н-індол-2-бутанова кислота (також позначається як "сполука А". Сполука А та спосіб її отримання описані в публікації (МО 2007/026097)|. Виявлено, що сполука А активує всі, рецептори РРАКа, РРАКу та РРАКО. В контексті даного винаходу можна використовувати сполуку А у формі однієї з її фармацевтично прийнятних солей або сольватів. При використанні в контексті даного винаходу термін "сольват" означає молекулярний комплекс, що містить сполуку А та одну або більше фармацевтично прийнятних молекул розчинника, наприклад - етанолу. Термін "гідрат" використовується в тому випадку, коли розчинником є вода. Фармацевтично прийнятні солі сполуки А включають його кислотно- адитивні та основні солі.

Відповідні кислотно-адитивні солі отримують з кислот, що утворюють нетоксичні солі.

Прикладами є такі солі, як ацетат, адипат, аспартат, бензоат, бесилат, бікарбонат/карбонат, бісульфат/сульфат, борат, камсилат, цитат, цикламат, едісилат, есилат, форміат, фумарат, глюцептат, глюконат, глюкуронати, гексафторфосфат, гібензат, гідрохлорид/хлорид, гідробромід/бромід, гідройодид/йодид, ізетіонат, лактат, малат, малеат, малонат, мезілат, метілсульфат, нафтілат, 2-напсілат, нікотинат, нітрат, оротат, оксалат, пальмітат, памоат, фосфат/гідрофосфат/дигідрофосфат, піроглутамат, сахарат, стеарат, сукцинат, танат, тартрат, тозилат, трифторацетат та ксінофоат.

Відповідні основні солі отримують з основ, що утворюють нетоксичні солі. Приклади включають солі алюмінію, аргініну, бензатину, кальцію, холіну, діетиламіну, діоламіну, гліцину, лізину, магнію, меглуміну, оламіну, калію, натрію, трометаміну та цинку. Також можна отримати полусолі кислот та основ, наприклад - гемісульфатні та гемікальцієві солі.

Фармацевтично прийнятні солі сполуки А можуть бути отримані одним або більше з трьох способів: () за допомогою проведення реакції сполуки з бажаною кислотою або бажаною оновою; (ії) за допомогою видалення захисної групи, лабільної в кислоті або основі, від придатного попередника сполуки або за допомогою розкриття кільця у придатному циклічному попереднику, наприклад - у лактоні або лактамі, з використанням бажаної кислоти або бажаної основи; або (ії) за допомогою перетворення однієї солі сполуки в іншу в реакції з відповідною кислотою або основою або з використанням відповідної іонообмінної колонки.

Всі три реакції переважно виконують в розчині. Отриману сіль можна осадити таї зібрати за допомогою фільтрації або виділити за допомогою випаровування розчинника. Ступінь іонізації отриманої солі може варіюватися від повної іонізації до по суті відсутності іонізації.

Винахід проілюстровано наступними прикладами.

Приклад 1: дія сполуки А на розвиток фіброзу печінки у мишей викликаного тетрахлористим вуглецем та його порівняння з відомим агоністом РРАКУу

Повідомлялось |Мао Т еї аї!., Ат / РНузіої. 1994 5ер;267(3 РІ 1):0476-84|, що тетрахлористий вуглець (ССіх) викликає дисфункцію мітохондрій в гепатоцитах та оксидативний стрес в моделі на мишах, що призводить до відкладення колагену та фіброзу печінки. Відповідно, дія сполуки А та розиглітазону, відомого агоніста РРАКУ, оцінили на моделі індукованого ССі4 фіброзу печінки у мишей.

Мишам протягом 22 днів щодня перорально вводили сполуку А в двох різних дозах (30 мг/кг/день та 100 мг/кг/день) та розиглітазон - контрольна сполука, що є агоністом РРАКУ, в дозі, бо що дорівнює 5 мг/кг/день. Після закінчення лікування тварин евтанізували та отримали зразки плазми крові і печінки. Кількісно визначили відкладення колагену та експресію генів, щодо яких відомо, що вони беруть участь в запаленні та фіброзі печінки, і виміряли рівні кількох відповідних плазматичних біомаркерів.

У мишей, що піддали дії ССії та отримували перорально носій протягом 22 днів, був виявлений фіброз печінки, про що свідчило статистично значуще підвищення вмісту колагену у тканині печінки. Лікування сполукою А статистично значуще знижувало фіброз печінки на 80 95 (30 мг/кг /день) та 89 95 (100 мг/кг/день), відповідно, та покращувало показники по багатьом відповідним маркерам. Лікування росиглітазоном знижувало фіброз печінки всього на 54 95, при цьому показники за багатьма маркерами або не змінювалися, або погіршувалися.

Матеріали та методи.

Експерименти були виконані на 56 самцях мишей лінії С57ВІ /5ЮУ (9АММІЕК ГАВ5, С5 4105,

Заїіпі-Вегйпеміп, Франція), маса тіла яких до початку експерименту знаходилась в діапазоні від 21 г до 24 г. Тварин утримували групами, що включали від З до 10 тварин, в поліпропіленових клітинах (площа підлоги становить 1032 см?) в стандартних умовах: кімнатна температура (2270 хз 2 С), відносна вологість повітря (55 Фо ж 10 Фо), цикл "світло/темрява" (12 год./12 год.), обмін повітря (15-20 обсягів/год.), вода та корм (5ЗО5, КМІ) за потребою. Мишам дали можливість звикнути до умов протягом щонайменше 5 днів до початку експерименту. Мишей пронумерували, позначивши їх хвости незмивними маркерами.

Готові до вживання суспензії сполуки А (З мг/мл та 10 мг/мл) та розиглітазону (0,5 мг/мл) зберігали при 5 "С ж 3 "С. Готові до вживання композиції носія (метилцелюлоза 400 сП 1 95 плюс полоксамер 188 0,1 95) також зберігали при 5"С ж 3 "С. Тетрахлористий вуглець (СсСів) (Зідта Спетіса! Со, Заїпі Оцепіїп РаІаміег, Франція) готували знову в кожен з днів дозування в соняшниковій олії (обсяг/обсяг 1/11).

Дозування.

Мишей розділили на наступні групи: 1. Соняшникова олія (два рази на тиждень протягом З тижнів, внутришньочеревно) / носій (один раз на день протягом 22 днів перорально), п--7; 2. Соняшникова олія (два рази на тиждень протягом З тижнів, внутрішньочеревно) / сполука

А (100 мг/кг/день один раз на день протягом 22 днів перорально), п--8;

Зо З. Соняшникова олія (два рази на тиждень протягом З тижнів, внутрішньочеревно) / розиглітазон (5 мг/кг/день один раз на день протягом 22 днів перорально), п--8; 4. СС (3,5 мл/кг, двічі на тиждень протягом З тижнів, внутрішньочеревно) / носій (один раз на день протягом 22 днів перорально), п-8; 5. ССіх (3,5 мл/кг, двічі на тиждень протягом З тижнів, внутрішньочеревно) / сполука А (30 мг/кг/день один раз на день протягом 22 днів перорально), п-8; б. ССіх (3,5 мл/кг, двічі на тиждень протягом З тижнів, внутрішньочеревно) / сполука А (100 мг/кг/день один раз на день протягом 22 днів перорально), п: 7; 7. СО: (3,5 мл/кг, двічі на тиждень протягом З тижнів, внутрішньочеревно) / розиглітазон (5 мг/кг/день один раз на день протягом 22 днів перорально), п-8.

Два рази на тиждень протягом З тижнів мишам внутрішньочеревно вводили вранці або 100 мкл СС: (3,5 мл/кг в соняшниковій олії (обсяг/обсяг 1/11) або 100 мкл соняшникової олії.

Паралельно мишам перорально вводили один раз на день протягом 22 днів (з дня 0 до дня 21) носій, сполуку А чи росиглітазон. В дні одночасних введень носія, сполуки А чи розиглітазону та

Ссіх носій, сполука А чи росиглітазон вводили за б годин до введення соняшникової олії або

Ссі«. Введений обсяг досліджуваних сполук дорівнював 10 мл/кг маси тіла в разі пероральних введень.

Завершальне отримання зразків крові

У день 21 через 2 години після дозування тварин наркотизували пентобарбіталом (60 мг/кг, внутрішньочеревно) та отримували кров за допомогою пункції серця. У кожної тварини записали точний час дозуваннята час отримання проби. Проби крові (0,9 мл цільної крові) помістили в попередньо охолоджені пробірки для забору крові, що містили 2 мл літій-гепарину. Проби крові обережно перемішували, розміщали в колотий лід та центрифугували в межах 30 хвилин після забору крові при приблизно 150094 протягом 10 хвилин при температурі, яка дорівнює приблизно -4 70. У кожному зразку крові отриману плазму розділили на 2 аліквоти (щонайменше 100 мкл кожна) та перенесли з використанням одноразового полімерного матеріалу в поліпропіленові пробірки. Проби негайно поставили в вертикальному положенні в морозильну камеру, де вони зберігалися при -20 "С.

Після заключного забору крові тканину печінки видаляли: - Перший зразок тканини (приблизно 50 мг) отримали, зафіксували параформальдегіду та 60 зберігали при 5 "С ж 3 С,

- Другий зразок тканини (200 мг) заморозили в рідкому азоті та зберігали при -20 "С.

Виміряні параметри

Колаген

Для кількісного визначення колагену зрізи пофарбували червоним барвником пікросіріус та дофарбували гематоксиліном Майєра. Всі зрізи оцифрували та 5 полів, що неперекриваються з

З різних зрізів випадковим чином проаналізували з використанням програми Ітаде ./ (версія 1.42, М.І.Н., США). Аналіз всіх зрізів виконав один експериментатор суворо в одних й тих самих умовах.

Експресія генів

Екстракцію мРНК виконали на маленьких заморожених зразках печінки (50-100 мг). Коротко кажучи, зразки кріогенно подрібнили з використанням ступки та пестика. Потім зразки гомогенізували з використанням мармуру (2 х 5 мм) та 1 мл лізуючого реагенту Оіа?о! (Оіадеп

Кеї 79306) в апараті Кеїхспй ММ300. Екстракцію РНК з гомогенатів печінки закінчили з використанням набору Оіадеп Кпеаву І іріа Кії (Кеї 74804) відповідно до інструкцій виробника.

Кількість РНК визначали з використанням Маподгор (МО2000 Тпегто Зсіепійіс), а якість РНК підтвердили за допомогою біоаналізатора (2100 Адііепі ТесппоїІоду).

Синтез кКДНК способом випадкових праймерів виконали на 100 нг тотальної РНК з використанням набору Ізсгірі (ВІОКАЮ геї 170-8891) згідно з інструкціями виробника. ПЛР в реальному часі виконали з 7,5 нг РНК еквівалентів на системі детектування послідовностей АВІ

Ргізт 7900 (АРР/ЛЕО ВІОЗУЗТЕМ5) з використанням Ід ІТад 5УВК Огееп Опімегза! Нох (Неї 1725124 Віогад) та спеціалізованих ОРСК праймерів. Для деяких мРНК транскриптів кількісне визначення виконали з використанням зондів ТадМап, мічених флуорохромом ЕАМ, та з використанням Опімегзаї РСК МабзіегмМіх Мо АтрЕгазе ОМО (АРРІЕЮО ВІОЗУЗТЕМ5, геї 4324020). Праймери, використані в аналізах, перераховані в наведеній нижче таблиці: мішені праймерів великий, РО Вема2Вріро РЕ |дюаоддіссіссподідаа (ЗЕО ІО МО: 2) фактор росту бета 1 М'Таті ВЕУ дссасасасадсаайнсйне (ЗЕО ІО МО: 4) альфа 1 МСоІтаївЕМм дадассаддаададассасіда (ЗЕО ІЮ МО: 6) . МЕпТЕм онНаїстасдсідсешаад (З5ЕО ІО МО: 7) (0-ЗМА гладенькі м'язи, аорта |Масіа2ВЕМ Шессаїдісаїсссаана (ЗЕО І МО: 10

МОР-1 ліганд 2 МОСсіІ2ВЕМ дссіасісайддодаїсаїс (5ЕО І МО: 12

ПЛР в реальному часі виконали на апараті АВІ РКІЗМ 7900. Необроблені дані з АВІ7900 експортували в текстовий формат. Аналіз виконали з використанням Ехсеї, відносна кількість транскриптів розрахували з використанням методу "Оена ОеМа СТ" (І їмак еї аІ., Меїйоа» 2001),

Зо використавши Кріро як конститутивний ген для нормалізації та усереднені дані від тварин, що не отримували лікування (група, що отримувала носій) як порівняльний контроль. Всі зразки

РНК піддавали зворотній транскрипції та кількісно оцінили в трьох паралельних дослідах.

Біомаркери печінки

Протокол екстракції білків печінки:

Екстракція з використанням Т-РЕНЄ: реагент для екстракції тканинних білків, Мо продукту 78510 (партія: МОе174004), виробництва компанії Тпепто 5сіепіййс, з інгібітором протеази Наї!

Ргоїєазе Іппіріюг 5іпдіє-Озе СосКіаїЇ, без ЕДТА (100Х) - Мо продукту 78425 - партія Мо МІ 178051, виробництва компанії Тпепто Рі5спег.

Зразки печінки та супернатант під час експерименту тримали на кризі. Для екстракції виробник рекомендує використовувати 10 мг тканини на 100 мкл Т-Рег плюс 1 мкл "Наї- ргоїєазе" (100Х).

Приготували 50 мл буферу Т-Рег, до яких додали 500 мкл "НаЇСргоїєеазе" (100Х), та суміш тримали на кризі. Щойно розморожені зразки печінки масою від 50 мг до 70 мг зважили, нарізали на дрібні шматочки та додали 1 мл холодного фосфатного буферного розчину для промивання тканини. Суміш центрифугували при 5009 протягом 5 хвилин при 4"С та супернатант видалили у відходи. Додали 100 мкл/1Омг Т-Рег з антіпротеазами (100Х) та подрібнили печінку гомогенізатором Поттера, зробивши 5-6 оборотів вгору та вниз. Суміш центрифугували при 100009 протягом 5 хвилин при 4 "С. Супернатант видалили, розділили на аліквоти та зберігали при-20 "С для подальшого вимірювання біомаркерів. Зразки по 10 мкл використовували для дозування білків в ВСА-способі після розведення водою в співвідношенні 1/110 згідно з процедурою, описаною в МО5: ВАР-03-062-01 (набір ВСА - набір для аналізу білків

Рієтсе ВСА-Ріетсе Тнепто 5сієпійіс, Веї: 23225).

Всі білки кількісно визначали з використанням набору для твердофазного імуноферментного аналізу (ЕГІБА; від англ.: еплуте-їїпкей іттипозогрепі аззау) згідно з інструкціями виробників:

ТІМР-1: ТІМР-1 миші, КВ 5У5ТЕМЗ5е, Веї: ТМ100.

ТОРЕ-В81: набір для імунологічного аналізу на ТОЕ-В1 миші/цури/свині/собаки Оцапійкіпе, КО

ЗУЗТЕМ5У, геї: МВ1О00ОВ.

Обробка та статистичний аналіз даних

Всі параметри проаналізували з використанням програми Сгарпраєд (версія 5.1). Параметри аналізували наступним чином: - З використанням І-тесту Стьюдента для незалежних зразків для порівняння групи 1 з групою 4 з метою валідації експерименту (дія СсСів), - З використанням І-тесту Стьюдента для незалежних зразків для порівняння групи 1 з групою 2 та групи 1 з групою З з метою дослідження дії сполуки А чи росглітазона окремо, - З використанням однофакторного дисперсійного аналізу АМОМА (від англ.: апапїузів ої магіацноп) (обробка) для порівняння групи 4 з групами, які отримували сполуку А (5, 6), з метою дослідження дії сполуки А на індукований ССі« фіброз печінки. Якщо виявляли, що результати

АМОМА були статистично значущими, використовували тест Даннет, - З використанням І-тесту Стьюдента для незалежних зразків для порівняння групи 4 з групою, що одержувала лікування росиглітазоном (група 7), з метою дослідження дії розиглітазону на індукований СсСі фіброз печінки.

На фігурах 1-7 " позначає значення р « 0,05; "" позначає значення р « 0,01; их позначає значення р « 0,001.

Результати

Зо 1) Тригліцериди плазми

У мишей, підданих дії ССіІх, сполука А (30 та 100 мг/кг/день) статистично значуще знизило тригліцериди в плазмі в порівнянні з носієм (р «0,05 та р «0,01, відповідно), тоді як розиглітазон підвищив рівні тригліцеридів в плазмі, але рівень статистичної значущості не було досягнуто (Фіг. 1). 2) Відкладення колагену

У мишей, підданих дії ССіІх, сполука А (30 та 100 мг/кг/день) статистично значуще знизило рівні колагену в порівнянні з носієм (-80 95, р «0,01 та -89 95, р «0,001, відповідно), та розиглітазон також статистично значуще знизив рівні колагену (-54 95, р «0,05) (Фіг. 2). 3) Експресія ТОЕВД-1

У мишей, підданих дії ССім, сполука А (30 та 100 мг/кг/день) статистично значуще інгібувала експресію ТОЕрД-1 в порівнянні з носієм (р «0,01 та р «0,001, відповідно), тоді як розиглітазон статистично значуще підвищив експресію ТОЕр-1 (р «0,001) (Фіг. 3). 4) Експресія колагену І типу, альфа І (СоПа)

У мишей, підданих дії ССім, сполука А (30 та 100 мг/кг/день) статистично значуще інгібувала експресію СоїІТа в порівнянні з носієм (р «0,05 та р «0,001, відповідно), тоді як розиглітазон підвищив експресію Сої/1а, але рівень статистичної значущості не було досягнуто (Фіг. 4). 5) Експресія а-ЗМА

У мишей, підданих дії ССІ4, сполука А (100 мг/кг/день) значно інгібувала експресію а-5МА в порівнянні з носієм, але рівень статистичної значущості не був досягнутий, тоді як розиглітазон підвищив експресію а-ЗМА, але рівень статистичної значущості теж не був досягнутий (фіг. 5). 6) Експресія МСР-1

У мишей, підданих дії ССії, сполука А (100 мг/кг/день) статистично значуще інгібувала експресію МОР-1 в порівнянні з носієм (р «0,05), тоді як розиглітазон не чинив дії (Фіг. б). 7) Експресія фібронектину

У мишей, підданих дії ССім, сполука А (30 та 100 мг/кг/день) статистично значуще інгібувала експресію фібронектину в порівнянні з носієм (р «0,001), тоді як розиглітазон підвищив експресію фібронектину, але рівень статистичної значущості не було досягнуто (Фіг. 7).

Вищенаведені результати показують, що пероральне введення сполуки А (30 мг/кг/день або 100 мг/кг/день) протягом 22 днів самцям мишей лінії С57ВІ/64) знизило фіброз печінки, бо викликаний ССі- З використанням цієї сполуки було отримано дозозалежний ефект, та максимальне 90 95 -ве зниження рівнів колагену, що спостерігали при введенні сполуки А в дозі 100 мг/кг/день; ця ж доза значуще покращувала показники за більшіостю асоційованих маркерів.

На противагу цьому, розиглітазон надав значно менш виражений ефект, причому найчастіше не чинив дію на інші маркери.

Приклад 2: дія сполуки А на розвиток гломерулонефриту у мишей, викликаного антитілами до клубочкової базальної мембрани, та порівняння з відомими агоністами РРАКУ та з відомим інгібітором АПФ

Гломерулонефрит у мишей, викликаний антитілами до клубочкової базальної мембрани (СВМ; від англ.: Сіотегшаг Вазетепі Метрьгапе) - це часто використовувана модель іп мімо для оцінки ефективності нових хімічних сполук проти СКО. Відповідно, на цій моделі оцінили дію сполуки А, розиглітазону та піоглітазону (відомих агоністів РРАК) та каптоприлу (відомого інгібітору АПФ - ангіотензинперетворювального ферменту).

Мишам щодня протягом 7 днів вводили з'єднання А в двох різних дозах (30 мг / кг / день і 100 мг / кг / день), контрольні з'єднання-агоністи РРАК 4 датта розиглітазон (З мг / кг / день) і піоглітазон (30 мг / кг / день) і контрольне з'єднання-інгібітор АПФ каптоприл в дозі 10 мг / кг / день.

В кінці лікування тварин умертвили і отримали зразки плазми і нирок. Кількісно оцінили експресію генів, щодо яких відомо, що вони беруть участь в СКО, і виміряли рівні показників функції нирок в плазмі.

У мишей, підданих дії антитіл до СВМ, яким перорально вводили носій протягом 7 днів, розвинулися гломерулонефрит та фіброз, про що свідчать статистично значуще зростання рівня сечовини в сечі, альбумінурія, підвищення рівня остеопонтіна в нирках, рівня білка МСР-1 в нирках, підвищення експресії МРНК Сої11 та СоІЗ в порівнянні з групою мишей, які отримували тільки носій.

Лікування сполукою А в дозах, що дорівнюють 30 мг/кг/день та 100 мг/кг/день, протягом 7 днів знизило рівні сечовини в сечі, альбумінурію, кількість остеопонтіна в нирках, кількість білку

МСР-1 в нирках, експресію мРНК Сої!ї та СоїЗ в порівнянні з групою мишей, що одержувала тільки носій (результати є статистично значущими для дози, що дорівнює 100 мг/кг/день). При порівнянні показано, що каптоприл надав подібний з сполукою А дія на рівень сечовини в сечі,

Зо альбумінурію, рівень остеопонтіна в нирках, рівень білка МСР-1 в нирках, але не викликав статистично значуще зниження експресії Со!ї та СоїІЗ; однак розиглітазон та піоглітазон статистично значуще підвищили рівні остеопонтіна та МСР-1 в нирках в порівнянні з групою мишей, що одержувала тільки носій.

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ

Експерименти провели з використанням самок мишей лінії С57ВІ /6) (СЕКУ дапмієг, гоше де5 Спепе5 5ес5, Ге Сепеві зЗаїпі Ізіє, Франція) у віці від 8 тижнів до 10 тижнів на початку експерименту. Тварин випадковим чином розподілили по поліпропіленовим кліткам (площа підлоги становить 1032 см37) групами по 3-4, виходячи з маси тіла. Мишам ненесли індивідуальні мітки на вуха. Тваринам дали можливість звикнути до стандартних умов протягом тижня до початку експерименту: кімнатна температура (2270 ж 2 7С), відносна вологість повітря (55 905 ж 10 95), цикл "світло/темрява" (12 год./12 год.), обмін повітря (15-20 обсягів/год.), вода та корм (505, ЕМ'І) за потребою.

Готові до вживання суспензії сполуки А (3 мг/мл так 10 мг/мл, що відповідало дозам, що дорівнюють 30 мг/кг та 100 мг/кг, відповідно) в носії (1 96 метилцделюлози (МЕТО! О5Е 5М400, 400 СП) плюс 0, 1 95 Роїохатег 188) зберігали при 5 "С до використання.

Готові до вживання суспензії розиглітазону (0,3 мг/мл, що відповідало дозі, що дорівнює З мг/кг) в носії зберігали при 5 "С до використання.

Готові до вживання суспензії піоглітазону (3 мг/мл, що відповідало дозі, що дорівнює 30 мг/кг) в носії зберігали при 5 "С до використання.

Готові до вживання суспензії каптоприлу (1 мг/мл, що відповідало дозі, що дорівнює 10 мг/кг) в носії зберігали при 5 "С до використання.

Препарат антитіл Ідс вівці (ар37385, Абсат) перенесли при 4 "С на кригу. Антитіла розчинили в фізіологічній сироватці з отриманням розчину з концентрацією 4 мг/мл. Окремо гомогенізували повний ад'ювант Фрейнда (СЕА, від англ: Егеипаб адіимап) за допомогою вихрової мішалки. Шприць з наконечником "І цег ГосК" об'ємом 5 мл заповнили 2,5 мл СЕРА.

Інший шприць з наконечником "І цег Госк" 5 мл об'ємом заповнили 2,5 мл розчину до вівці.

Обидва шприця з'єднали з голкою для отримання мікроемульсій, видаливши всі бульбашки повітря. Розчин до вівці перенесли в СЕРА. Суміш багаторазово перекачували з одного шприця в інший протягом 5 хвилин, поки не виявили помітне зростання опору. Потім голку для бо отримання мікроемульсій замінили перехідником з нержавіючої сталі з двома "жіночими"

частинами роз'ємів "Гчег ГосКк". Суміш знову перекачували з одного шприця в інший протягом кількох хвилин. Потім визначили поверхневий натяг водного розчину. Шприці з "І ек Госк" заповнили об'ємом по 1 мл, повністю видаливши бульбашки повітря. Наділи на шприці голки калібру 230 та зберігали шприці при 4 "С до використання.

Сироватку вівці з антитілами до ниркових клубочків (ЗВМ) (РТХ-0015, Ргобеїех) зберігали при 5 "С до використання.

Дозування

Мишей розділили на наступні групи: ен жненнння МЕРДИТНИ КО 2. - | Імунізація емульсією й .

Група )/| Кількість мишей о. антитіло Лікування

ІЧЦе/НКЗ7Ка вівці до СОВМ 200 мкг/500 мкг 300 мкл 6 | тю

За 5 днів до введення антитіла до ВМ тварин імунізували за допомогою підшкірної ін'єкції в три ділянки тіла (по одній ін'єкції в кожне стегно та одна ін'єкція в задню частину шиї) 100 мкл емульсії ІдС вівцібЕБА (200 мкг Ідс вівці/500 мкг НЗКа Мусобрасіегішт Ішибрегсціов5ів) під анестезією сумішшю Ог/ізофлурану (1 л/З 95).

У день 0 мишей зважили та помістили приблизно на 20-30 хвилин під інфрачервоний ламповий обігрівач, щоб домогтися вазодилатації каудальних вен та кращої їх видимості для ін'єкції. Рухливість кожної тварини обмежили, помістивши його в конус для ін'єкцій. Мишам виконали внутрішньовенну ін'єкцію 300 мкл сироватки, яка мала антитіла до ЗВМ. Потім мишам перорально ввели сполуку А, розиглітазон, піоглітазон та каптоприл, і продовжували лікування один раз на день (вранці) протягом наступних 7 днів. Мишей зважували приблизно через кожні два дні.

У день б мишей зважили та перенесли в ящик для вимірювання діурезу, де вони залишалися протягом 24 годин. Серветки зважували до та після діурезу, щоб виміряти кількість поглиненої води. У день 7 мишей зважили, дали перорально ліки та повернули у вихідну клітку.

Сечу зібрали, центрифугували, виміряли та заморозили кілька аліквот при -80С для подальших аналізів (на сечовину, креатинін, альбумін тощо).

Опівдні дня 7 мишей анестезували сумішшю Ог/ізофлурану (1 л/З 95) та провели забір проб крові з ретроорбітального синусу піпеткою Пастера. По 400 мкл цільної крові помістили в сухі мікропробіркі. Після згортання протягом 30 хвилин та 2 центрифугування при 6000 об/хв

Зо протягом 15 хвилин при 4 "С отримали сироватки. Сироватки розділили на аліквоти та заморозили при -80 "С для подальших аналізів (на сечовину, креатинін, білки, адипонектин).

Потім мишей піддали евтаназії за допомогою цервікальної дислокації та видалили і зважили нирки. Відокремили кору однієї нирки у кожної тварини. Маленькі шматочки зберегли для подальшого аналізу експресії РНК, докладно описаного нижче. Залишок безпосередньо заморозили в рідкому азоті для подальших аналізів (Тов Беїа-1, ОРМ,

МОР-1 ...). Половину нирки, що залишилася помістили в окрему гістологічну касету в 10 95-вий забуферований розчин формаліну на 24 години для гістологічного аналізу.

Виміряні параметри

Експресія генів

Екстракцію мРНК виконали на маленьких заморожених зразках тканини нирки (50-100 мгГг).

Коротко кажучи, зразки кріогенно подрібнили за допомогою ступки та маточки. Потім зразки гомогенізували з використанням мармуру (2 х 5 мм) та 1 мл лізуючого реагенту Оіаої! (Оіадеп

Кеї 79306) в апараті Кеїхсп ММ300. Екстракцію РНК з гомогенатів нирок завершили з використанням набору Оіадеп Кпеазу Гірій Ки (Кеї. 74804) згідно з інструкціями виробника.

Кількість РНК визначили з використанням Маподгор (МО2000 Трпепгто зсіепійіс), а якість РНК підтвердили з використанням біоаналізатора (2100 Адіїепі Тесппоіоду).

Синтез кКДНК способом випадкових праймерів виконали на 100 нг тотальної РНК з використанням набору Ізсгірі (ВІОКАЮ геї 170-8891) згідно з інструкціями виробника. ПЛР в реальному часі виконали з 7,5 нг РНК еквівалентів на системі детектування послідовностей АВІ

Ргізт 7900 (АРР/ЛЕО ВІОЗУЗТЕМ5) з використанням Ід ІТад 5УВК Огееп Опімегза! Кох (Кеї

1725124 Віогад) та спеціалізованих ОРСК праймерів. Для деяких мРНК транскриптів кількісне визначення виконали з використанням зондів ТадМап, мічених флуорохромом ЕАМ, та з використанням Опімегза! РСК МазіегМіх Мо АтрЕгазе ОМО (АРРІЇТЕЮ ВІОБУБЗТЕМ5, геї 4324020). Праймери, використані в аналізах, перераховані в наведеній нижче таблиці:

Назва . . - . . вати великий, РО Вема2Вріро РЕ дідаддіссіссндаїдаа (ЗЕО І МО: 2

Рецептор Мати гм даїсцдсссаїснсасаї (ЗЕО І МО: 13) тал аорту бета | Мапи ВЕМ саасадайссанцшсйнса (ЗЕО І МО: 14)

МСоІТатїгУу ааадчаїдсідагдайсісс (5ЕО І МО: 5)

МсСоїЗа1 РУ дадаїсаааїаадасодааї (ЗЕО ІЮО МО: 15)

ПЛР в реальному часі виконали на апараті АВІ РКІЗМ 7900. Необроблені дані з АВІ7900 експортували в текстовий формат. Аналіз виконали з використанням Ехсеї, відносна кількість транскриптів розрахували з використанням методу "Оена ОеМйа Ст" |Сїмак еї аї., Меїпоаз 20011, використовуючи Кріро як конститутивний ген для нормалізації та усередненя даних від тварин, що не отримували лікування (група, що отримувала носій) як порівняльний контроль. Всі зразки

РНК піддали зворотній транскрипції та кількісно оцінили в трьох паралельних дослідах.

Біомаркери сечі, плазми та нирок

Аналізи плазми та сечі (сечовина, креатинін, альбумін та білки) виконали з використанням апарату Копеїаб та відповідних колориметричних тестів.

Мікроальбінурію проаналізували з використанням набору для дослідження флуоресценції:

АІритіп Віпе Ріногезсепі Авзау (Асіїме Моїй, Неї: 15002).

Всі білки нирки кількісно визначали з використанням набору для ЕГІ5А згідно з інструкціями виробника: - Остеопонтін: імунологічний аналіз на остеопонтін у мишей Оцапіїкіпе, КО ЗУ5ТЕМ52,

Веї: МО5ТО0О, - МОР-1: набір для ЕГІЗА у мишей Оцапіїкіпе Моизе ССІ 2/)Е/МСР-1, НО 5У5ТЕМ5У, Неї:

МпоО.

Обробка та статистичний аналіз даних

Всі параметри проаналізували з використанням програми Сгарпраа (версія 5.1). Параметри аналізували з використанням однофакторного дисперсійного аналізу АМОМА (обробка) для порівняння груп 1, 2, 3, 4, 5, 6 та 7. Якщо виявляли, що результати АМОМА були статистично значущими, то використовували тест Даннет для порівняння групи 2 з іншими групами.

На фігурах 8-16 " позначає значення р « 0,05; "7" позначає значення р « 0,01; их позначає значення р « 0,001.

Результати 1) Сечовина в сироватці

У мишей, підданих діїу антитіл до СОВМ, сполука А (100 мг/кг/день) статистично значуще знизила рівні сечовини в порівнянні з носієм (р «0,01), тоді як каптоприл знизив рівень сечовини, але рівень статистичної значущості не було досягнуто, а розиглітазон та піоглітазон підвищили рівні сечовини, але рівень статистичної значущості не було досягнуто (Фіг. 8). 2) Обсяг сечі

У мишей, підданих дії антитіл до СОВМ, сполука А (30 мг/кг/день та 100 мг/кг/день) знизила обсяг сечі в порівнянні з носієм, але рівень статистичної значущості не був досягнутий, тоді як каптоприл також знизив обсяг сечі, але рівень статистичної значущості не було досягнуто, а розиглітазон та піоглітазон підвищили рівень альбуміну в сечі, але рівень статистичної значущості не було досягнуто (Фіг. 9). 3) Альбумін у сечі

У мишей, підданих дії антитіл до ОВМ, сполука А (100 мг/кг/день) знизила рівні альбуміну в порівнянні з носієм, але рівень статистичної значущості не був досягнутий, тоді як каптоприл також знизив рівні альбуміну, але рівень статистичної значущості не було досягнуто, розиглітазон підвищив рівні альбуміну, але рівень статистичної значущості не було досягнуто, а піоглітазон статистично значуще підвищив рівні альбуміну (р «0,001) (фіг. 10). 4) Остеопонтін у нирках

У мишей, підданих дії антитіл до ВМ, сполука А (100 мг/кг/день) статистично значуще знизила рівні остеопонтіна в порівнянні з носієм (р «0,05), тоді як каптоприл також статистично значуще знизив рівні остеопонтіна (р «0, 05), а розиглітазон та піоглітазон статистично значуще підвищили рівні остеопонтіна (р «0,01 та р «0,05, відповідно) (Фіг. 11). 5) МОСР-1 у нирках

У мишей, підданих дії антитіл до ВМ, сполука А (100 мг/кг/день) статистично значуще знизила рівні МСР-1 в порівнянні з носієм (р «0,001), тоді як каптоприл також статистично значуще знизив рівні МСР-1 (р « 0,01), а розиглітазон та піоглітазон статистично значуще підвищили рівні МСР-1 (р «0,05) (Фіг. 12). 6) Експресія ТОЕВК-1

У мишей, підданих дії антитіл до ВМ, сполука А (100 мг/кг/день) статистично значуще інгібувала експресію ТОЕДВКЕ-1 в порівнянні з носієм (р «0,01), тоді як каптоприл не чинив дію на експресію ТОЕВКЕ-1, а розиглітазон та піоглітазон підвищили експресію ТОЕДВК-1, але рівень статистичної значущості не було досягнуто (Фіг. 13). 7) Експресія колагену типу І, альфа І (СоПТа)

У мишей, підданих дії антитіл до ВМ, сполука А (100 мг/кг/день) статистично значуще інгібувала експресію Со1Та в порівнянні з носієм (р «0,01), тоді як каптоприл не чинив дії на експресію СоїТа, а розиглітазон та піоглітазон статистично значуще підвищили експресію СоПа (р 0,001) (Фіг. 14). 8) Експресія колагену типу ІІІ, альфа І (СоїЗа)

У мишей, підданих дії антитіл до ВМ, сполука А (100 мг/кг/день) статистично значуще інгібувала експресію СоїЇЗа в порівнянні з носієм (р «0,001), тоді як каптоприл не чинив дії на експресію СоїЗа, а розиглітазон та піоглітазон підвищили експресію СоїЗа (р «0,001), але рівень статистичної значущості не було досягнуто (Фіг. 15). 9) Патологічні ниркові клубочки

У мишей, підданих дії антитіл до ЗВМ, сполука А (100 мг/кг/день) статистично значуще знизила кількість патологічних ниркових клубочків (р «0,001) (Фіг. 16).

Приклад 3: дія сполуки А на розвиток легеневого фіброзу у мишей індукованого блеоміцином та порівняння з відомим агоністом РРАКУу

Зо Індукований блеоміцином легеневий фіброз у мишей - це модель іп мімо, яку часто використовують для оцінки антіфіброзної ефективності нових хімічних сполук (Согбеї еї аї., 2001;

Мапошигу еї а1ї., 20061. Відповідно, на цій моделі оцінили дію сполуки А та розиглітазону, відомого агоністу РРАКУ. Для оцінки дії досліджуваних сполук були обрані миші лінії С57ВІ /6У, оскільки вони схильні до розвитку ранньої запальної відповіді в легенях з подальшим фіброзним ремоделюванням після введення блеоміціну.

Мишам щодня перорально протягом 15 днів вводили сполуку А в двох різних дозах (30 мг/кг/день та 100 мг/кг/день) таї розиглітазон у дозі, що дорівнює 5 мг/кг/день. В кінці лікування тварин евтанізували та отримали проби плазми та печінку. Кількісно оцінили експресію генів, щодо яких відомо, що вони беруть участь в процесі запалення в легенях, та виміряли рівні в плазмі показників функції легень.

У підданих дії блеоміціну мишей, яким перорально вводили носій протягом 15 днів, розвинувся легеневий фіброз, про що свідчить статистично значуще підвищення рівнів остеопонтіна, МСР-1 і ТІМР-1 в легких. Лікування сполукою А в дозах, що дорівнюють 30 мг/кг/ день та 100 мг/кг/день, протягом 15 днів статистично значуще знизило рівні ТІМР-1 в легенях в порівнянні з носієм; рівні МСР-1 та остеопонтіну в легенях також знизилися в порівнянні з носієм, але рівень статистичної значущості не був досягнутий. На противагу цьому, в разі, коли підданих дії блеоміціну мишей щодня перорально вводили росиглітазон в дозі, що дорівнює 5 мг/кг/день, протягом 15 днів, рівні МСР-1 та ТІМР-1 в легенях зросли в порівнянні з носієм, але рівень статистичної значущості не був досягнутий.

Матеріали та методи

Експерименти були проведені з використанням 77 самців мишей лінії С57ВІ /659У (ФАММЕКН

АВ5, 0.5. 4105, баіпі-ВенНеміп Е-53941, Франція), маса тіла яких становила від 20 г до 25 г на початку експерименту. Тварин помістили групами по 3-10 в поліпропіленові клітини (площа підлоги становить один тисяча тридцять дві см") в стандартних умовах: кімнатна температура (2270 хз 2 С), відносна вологість повітря (55 95 ж 10 Фо), цикл "світло/темрява" (12 год./12 год.), обмін повітря (15-20 обсягів/год.), вода та корм (505, ЕМІ1) за потребою. Мишам дозволили адаптуватися до цих умов протягом щонайменше 5 днів до початку експерименту. Мишей пронумерували, позначивши їх хвости незмивними маркерами.

Сполука А (3 мг/мл та 10 мг/мл) та розиглітазон (0,5 мг/мл) були приготовані в 1 95 бо метилцелюлозі (МЕТОГОБЕ 5М400, 400 СП) плюс 0,1 96 Роїохатег 188 в формі готових до вживання суспензій та під час дослідження зберігалися при 5 С ж 3 "б. 1 95 метилцеллюлозу (МЕТОГО5БЕ 5М400, 400 сП) плюс 0,1 95 Роїохатег 188 використовували як носій та зберігали при 5 "С хз З "С під час дослідження. Блеоміцин (І арогайоіге ВеПоп) розчиняли в 0,9 95 розчині масі (СОМ І амоїізіег, Франція) безпосередньо перед використанням.

Дозування

Мишей розділили на наступні групи: 1. 0,9 95 Масі плюс носій (один раз на день протягом 15 днів перорально), п--11, 2. 0,995 МасСі плюс сполука А (100 мг/кг/день один раз на день протягом 15 днів перорально), п--11, 3. 0,995 МасСіІ плюс росиглітазон (5 мг/кг/день один раз на день протягом 15 днів перорально), п--11, 4. Блеоміцин (0,3 мг) плюс носій (один раз на день протягом 15 днів перорально), п-10, 5. Блеоміцин (0,3 мг) плюс сполука А (30 мг/кг/ день один раз на день протягом 15 днів перорально), п--9, 6. Блеоміцин (0,3 мг) плюс сполука А (100 мг/кг"/день один раз на день протягом 15 днів перорально), п--7, 7. Блеоміцин (0,3 мг) плюс росиглітазон (5 мг/кг/ день один раз на день протягом 15 днів перорально), п--6.

У день 1 мишей анестезували етомідатом (15-20 мг/кг, внутрішньочеревно) та потім інтраназально ввели блеоміціну сульфат (0,3 мг (300 МО) в 0,9 95 Масі (50 мкл/миша (25 мкл/ніздрю)) або 0,9 95 Масі (50 мкл/миша (25 мкл/ніздрю)). Мишам перорально вводили один раз на день протягом 15 днів (з дня 0 до дня 14) носій, сполуку А чи росіглітазон. Введення носія, сполуку А чи росіглітазон у день 1 виконали за б годин до введення 0,9 95 Масі або блеоміціну. Введений обсяг досліджуваних сполук дорівнював 10 мл/кг маси тіла при пероральних введениях.

Завершальне отримання проб крові

У день 14 через 2 години після дозування тварин анестезували пентобарбіталом (60 мг/кг, внутрішньочеревно) та зібрали кров, виконавши пункцію серця. Для кожної тварини записали точний час введення дози та час отримання проб крові. Пробу крові (0,9 мл цільної крові)

Зо помістили в попередньо заморожені пробірки для забору крові об'ємом 2 мл з покриттям з літій- гепарину. Проби крові обережно перемішали, помістили в колотий лід та центрифугували в межах 30 хвилин після забору крові при приблизно 15009 протягом 10 хвилин при температурі, приблизно ї- 4 С. Плазму, отриману з кожної проби крові, розділили на дві аліквоти (щонайменше по 100 мкл кожна) таі перенесли з використанням одноразового полімерного матеріалу в поліпропіленові пробірки. Проби відразу ж у вертикальному положенні помістили в морозильну камеру, де вони зберігалися при -20 "С.

Видалення легень

Після заершального відбору проб крові видалили легеневу тканину: - Перший зразок тканини (середня доля) отримали, зафіксували параформальдегідом та зберігали при 5 "С ж 3 с. - Другий зразок тканини (права доля) заморозили в рідкому азоті та зберігали при -20 "С.

Виміряні параметри

Колаген

Для кількісного визначення колагену зрізи пофарбували червоним барвником пікросіріус та дофарбували гематоксиліном Майєра. Всі зрізи оцифрували та 5 полів, що неперекриваються з З різних зрізів випадковим чином проаналізували з використанням програми Ітаде ./ (версія 1.42, М.І.Н., США). Аналіз всіх зрізів виконав один експериментатор суворо в одних й тих самих умовах.

Експресія генів

Екстракцію мРНК виконали на маленьких заморожених зразках легенів (50-100 мг). Коротко кажучи, зразки кріогенно подрібнили з використанням ступки та маточки. Потім зразки гомогенізували з використанням мармуру (2 х 5 мм) та 1 мл лізуючого реагенту Оіа?о! (Оіадеп

Кеї 79306) в апараті Кеїхсп ММ300. Екстракцію РНК з гомогенатів легень закінчили з використанням набору Оіадеп Кпеаву І іріа Кії (Кеї 74804) відповідно до інструкцій виробника.

Кількість РНК визначили з використанням Маподгор (МО2000 Тпегто Зсіепійіс), а якість РНК підтвердили за допомогою біоаналізатора (2100 Адііепі ТесппоїІоду).

Синтез кКДНК способом випадкових праймерів виконали на 100 нг тотальної РНК з використанням набору Ізсгірі (ВІОКАЮ геї 170-8891) згідно з інструкціями виробника. ПЛР в реальному часі виконали з 7,5 нг РНК еквівалентів на системі детектування послідовностей АВІ бо Ргізт 7900 (АРР/ЛЕО ВІОЗУЗТЕМ5) з використанням Ід ІТад 5УВК Огееп Опімегза! Нох (Неї

1725124 Віогад) та спеціалізованих ОРСК праймерів. Для деяких мРНК транскриптів кількісне визначення виконали з використанням зондів ТадМап, мічених флуорохромом ЕАМ, та з використанням Опімегзаї РСК МабзіегмМіх Мо АтрЕгазе ОМО (АРРІЕЮО ВІОЗУЗТЕМ5, геї 4324020). Праймери, використані в аналізах, перераховані в наведених нижче таблицях: великий, РО Вема2Вріро РЕ дідаддіссіссндаїдаа (5ЕО 10 МО: 2)

Рецептор Мати гм даїсцдсссаїснсасаї (ЗЕО І МО: 13) топ фактору ролу бета | Мати вЕМ саасадайссанцшсйнса (ЗЕО І МО: 14) альфа 1 МсоІтТатївЕМм ддадассдддаддассасідо (ЗЕО І МО: 6 альфа 1 МсоЇЗаї! ВЕМ тдадіавцісісайдсснас (ЗЕО ІЮО МО: 16 (остеопонтін) | фосфопротеїн 1 М5ррІівВЕМ адіссісаісідіддсаїса (ЗЕО ІЮО МО: 18

МОР-1 ліганд 2 МОСсіІ2ВЕМ дссіасісайддодаїсаїс (5ЕО І МО: 12

Еп!і . . МЕпТЕм онНаїстасдсідсешаад (5ЕО І МО: 19) 77 (бюбронетни Мемаву (оосвопосродіса сво то чо)

ПЛР в реальному часі виконали на апараті АВІ РКІЗМ 7900. Необроблені дані з АВІ7900 експортували в текстовий формат. Аналіз виконали з використанням Ехсеї, відносну кількість транскриптів розрахували з використанням методу "СОейа ОеМа СТ" | їмак еї аІ., Меїпоаз 20011, використовуючи Кріро як конститутивний ген для нормалізації та усереднення даних від тварин, що не отримували лікування (група, що отримувала носій) як порівняльний контроль.

Всі зразки РНК піддали зворотній транскрипції та кількісно оцінили в трьох паралельних дослідах.

Біомаркери легеневих білків

Протокол екстракції легеневих білків

Екстракція з використанням Т-РЕНЄ: реагент для екстракції тканинних білків, Мо продукту 78510 (партія: МОе174004), виробництва компанії Тпепто 5сіепіййс, з інгібітором протеази Наї!

Ргоїєазе Іппіріюг 5іпдіє-Озе СосКаї, без ЕДТА (100Х) - Мо продукту 78425 - партія Мо МІ 178051, виробництва компанії Тпегто Різспег.

Зразки тканини легенів та супернатант під час експерименту тримали на кризі. Для екстракції виробник рекомендує використовувати 10 мг тканини на 100 мкл Т-Рег плюс 1 мкл "На!-ргоївазе" (100Х).

Приготували 50 мл буферу Т-Рег, до якого додали 500 мкл "Наїї-ргоївазе" (100Х), та суміш тримали на кризі. Щойно розморожені зразки легені масою від 50 мг до 70 мг зважили, нарізали на дрібні шматочки та додали 1 мл холодного фосфатного буферного розчину для промивання тканини. Суміш центрифугували при 5009 протягом 5 хвилин при 4 "С та супернатант видалили у відходи. Додали 100 мкл//Омг Т-Рег з антіпротеазами (100Х) та подрібнили легеню гомогенізатором Поттера, зробивши 5-6 оборотів вгору та вниз. Суміш центрифугували при

Зо 100009 протягом 5 хвилин при 4 "С. Супернатант видалили, розділили на аліквоти та зберігали при -20 "С для подальшого вимірювання біомаркерів. Зразки по 10 мкл використовували для дозування білків в ВСА-способі після розведення водою в співвідношенні 1/10 згідно з процедурою, описаною в МО5: ВАР-03-062-01 (набір ВСА - набір для аналізу білків Ріегсе ВСА-

Рієтсе ТнНегто Зсієпійіс, Вег: 23225).

Всі білки кількісно визначили з використанням набору для ЕГІЗА згідно з інструкціями виробника: - Остеопонтін: імунологічний аналіз на остеопонтін у мишей Оцапіїкіпе, КО 5У5ТЕМ52,

Веї: МО5ТО0О, - МОР-1: набір для ЕГІЗА у мишей Оцапіїкіпе Моизе ССІ 2/)Е/МСР-1, НО 5У5ТЕМ5У, Неї:

Мутпоо, - ТІМР-1: ТІМР-1 миші, КАВ 5У5ТЕМЗ5У, Веї: ТМ100.

Обробка та статистичний аналіз даних

Всі параметри проаналізували з використанням програми Сгарпраєд (версія 5.1). Параметри аналізували наступним чином: - з використанням однофакторного дисперсійного аналізу АМОМА (обробка) для порівняння груп 1, 2 та 3. Якщо виявляли, що результати АМОМА були статистично значущими, то використовували тест Даннет для порівняння групи 1 з групою 2 та групою 3, - з використанням однофакторного АМОМА (обробка) для порівняння груп 1, 4, 5, 6 та 7.

Якщо виявляли, що результати АМОМА були статистично значущими, то використовували тест

Даннет для порівняння групи 1 з групою 4, з групою 5, з групою 6 та з групою 7).

На фігурах 17-27 " позначає значення р « 0,05; 7" позначає значення р « 0,01; и позначає значення р « 0,001.

Результати 1) Відкладення колагену

У мишей, підданих дії блеоміціну, сполука А (100 мг/кг/день) статистично значуще знизила рівні відкладення колагену в порівнянні з носієм (р «0,05). Росіглітазон також статистично значуще знизив рівні колагену (р «0,05) (Фіг. 17). 2) ТІМР-1 в легенях

У мишей, підданих дії блеоміціну, сполука А (30 мг/кг/день та 100 мг/кг/день) статистично значуще знизила рівні ТІМР-1 в порівнянні з носієм (р «0,05), тоді як росіглітазон підвищив рівні

ТІМР-1, але рівень статистичної значущості не було досягнуто (Фіг. 18).

З) МОСР-1 в легенях

У мишей, підданих дії блеоміціну, сполука А (30 мг/кг/день та 100 мг/кг/день) знизила рівні

МОР-1 в порівнянні з носієм, але рівень статистичної значущості не був досягнутий, тоді як росіглітазон підвищив рівні МСР-1, але рівень статистичної значущості не було досягнуто (Фіг. 19). 4) Остеопонтін в легенях

У мишей, підданих дії блеоміціну, сполука А (30 мг/кг/день та 100 мг/кг/день) знизила рівні остеопонтіна в порівнянні з носієм, але рівень статистичної значущості не був досягнутий, тоді як росіглітазон підвищив рівні остеопонтіна, але рівень статистичної значущості не було

Зо досягнуто (Фіг. 20). 5) Експресія ТОЕВК-1

У мишей, підданих дії блеоміціну, сполука А (100 мг/кг/день) статистично значуще інгібувала експресію ТОЕВК-1 в порівнянні з носієм (р «0,05). Росіглітазон також статистично значуще інгібував експресію ТОЕВЕ-1 (р «0,05) (Фіг. 21). б) Ккспресія колагену І типу, альфа І (СоПа)

У мишей, підданих дії блеоміціну, сполука А (100 мг/кг/день) статистично значуще інгібувала експресію Сої/Та в порівнянні з носієм (р «0,001), тоді як росіглітазон підвищив експресію Со/1Та, але рівень статистичної значущості не було досягнуто (Фіг. 22). 7) Експресія колагену ІІЇ типу, альфа І (СоїЗа)

У мишей, підданих дії блеоміціну, сполука А (100 мг/кг/день) статистично значуще інгібувала експресію СоїЗа в порівнянні з носієм (р «0,001), тоді як росіглітазон інгібував експресію СоїЗа, але рівень статистичної значущості не було досягнуто (Фіг. 23). 8) Експресія ТІМР-1

У мишей, підданих дії блеоміціну, сполука А (30 мг/кг/день та 100 мг/кг/день) інгібувала експресію Соїа в порівнянні з носієм, але рівень статистичної значущості не був досягнутий, тоді як росіглітазон статистично значуще підвищив експресію ТІМР-1 (р«е0,05) (Фіг. 24). 9) Експресія МСР-1

У мишей, підданих дії блеоміціну, сполука А (30 мг/кг/день та 100 мг/кг/день) інгібувала експресію МСОР-1 в порівнянні з носієм, але рівень статистичної значущості не був досягнутий, тоді як росіглітазон підвищив експресію ТІМР-1, але рівень статистичної значущості не було досягнуто (Фіг. 25). 10) Експресія остеопонтіну

У мишей, підданих дії блеоміціну, сполука А (30 мг/кг/день та 100 мг/кг/день) статистично значуще інгібувала експресію остеопонтіна в порівнянні з носієм (р «0,05), тоді як росіглітазон не чинив дії на остеопонтін (фіг. 26). 11) Експресія фібронектіну

У мишей, підданих дії блеоміціну, сполука А (100 мг/кг/день) статистично значуще інгібувала експресію фібронектіну в порівнянні з носієм (р «0,05), тоді як росіглітазон підвищив експресію фібронектіну, але рівень статистичної значущості не було досягнуто (Фіг. 27).

Наведені вище результати показують, що пероральне введення сполуки А (30 мг/кг/день або 100 мг/кг/день) самцям мишей лінії С57ВІ /6.) зменшило підвищення рівнів запальних/фіброзних біомаркерів, індукована інстиляцією блеоміціну в легені, тоді як росіглітазон не чинив дії, або надав навіть шкідливий вплив на ці біомаркери. У сукупності, ці дані показують, що сполука А знижує індукований блеоміціном легеневий фіброз у мишей.

Приклад 4: дія сполуки А на розвиток фіброзу шкіри у мишей індукованого блеоміціном та порівняння з відомим агоністом РРАКУу

Сполуку А випробували на моделі індукованого блеоміцином фіброзу шкіри у мишей.

Мишам протягом 21 дня щодня перорально вводили сполуку А в двох різних дозах (30 мг/кг"/"день та 100 мг/кг/день) та контрольну сполуку - агоніст РРАКУу росиглітазон в дозі, що дорівнює 5 мг/кг/день. В кінці лікування тварин евтанізували та брали зразки шкіри. Кількісно визначали експресію генів, щодо яких відомо, що вони беруть участь в шляху системного фіброзу, та визначали товщину дерми та вміст колагену у ній.

У мишей, підданих дії блеоміцину, яким перорально вводили носій протягом 21 дня, розвинувся фіброз шкіри, про що свідчить статистично значуще збільшення товщини дерми та вміст колагену. Введення сполуки А в дозах, що дорівнюють 30 мг/кг/день та 100 мг/кг/день, протягом 21 дня значуще знизило товщину дерми та вміст колагену в порівнянні з носієм.

Подібний ефект спостерігали у мишей, підданих дії блеоміцину, яким перорально вводили росиглітазон в дозі, що дорівнює 5 мг/кг/день, протягом 21 дня, хоча ефект щодо товщини дерми був менш вираженим.

Матеріали та методи

Експерименти були проведені на б-тижневих самцях мишей лінії С57ВІ /6 (дапмієг, І е

Сепеві-Заїпі-Ізіє, Франція). Тварин розмістили групами по 3-10 в поліпропіленові клітини (площа підлоги становить одна тисяча тридцять два см?) в стандартних умовах: кімнатна температура (2270 хз 2 С), відносна вологість повітря (55 95 ж 10 Фо), цикл "світло/темрява" (12 год./12 год.), обмін повітря (15-20 обсягів/год.), вода та корм (505, ЕМІ1) за потребою. Мишам дозволили адаптуватися до цих умов протягом щонайменше 5 днів до початку експерименту. Мишей пронумерували, позначивши їх хвости незмивними маркерами.

Сполуку А (3 мг/мл та 10 мг/мл) та розиглітазон (0,5 мг/мл) приготували в 1 95

Зо метилцелюлозі (МЕТОГОБЕ 5М400, 400 СП) плюс 0,1 96 Роїохатег 188 у формі готових до вживання суспензій та під час дослідження зберігали при 5 С ж 3 "б. 1 95 метилцеллюлозу (МЕТОГО5БЕ 5М400, 400 сП) плюс 0,1 95 Роїохатег 188 використовували як носій та зберігали при 5 "С ж 3 "С під час дослідження.

Дозування

Мишей розділяли на наступні групи: 1. 0,9 95 Масі плюс носій (один раз на день протягом 21 дня перорально), п--7, 2. 0,9 96 Масі плюс сполука А (100 мг/кг/день один раз на день протягом 21 дня перорально), п-в, 3. 0,9 96 Масі плюс сполука А (30 мг/кг/день один раз на день протягом 21 дня перорально), п-8, 4. Блеоміцин (0,3 мг) плюс росиглітазон (5 мг/кг"/день один раз на день протягом 21 дня перорально), п-8, 5. Блеоміцин (0,3 мг) плюс носій (один раз на день протягом 21 дня перорально), п-6, 6. Блеоміцин (0,3 мг) плюс сполука А (100 мг/кг7/день один раз на день протягом 21 дня перорально), п--7, 7. Блеоміцин (0,3 мг) плюс сполука А (30 мг/кг/день один раз на день протягом 21 дня перорально), п--7.

Фіброз шкіри викликали щоденними ін'єкціями блеоміцину (100 мкл блеоміцину (І аб)гагоіге

ВепПоп, Франція) розчиняли в 0,9 95 Масі (СОМ І амоїізіег, Франція) в концентрації, що дорівнює 0,5 мг/мл, та вводили 6 днів на тиждень у визначені зони площею 1 см: в верхній частині спини). 0,9 95 масі використовували як контроль (підшкірні ін'єкції 100 мкл).

Мишам перорально вводили носій один раз на день протягом 21 дня, сполуку А чи росиглітазон. Введення носія, сполуки А чи розиглітазону в день 1 виконали за 4 години до введення 0,9 95 Масі або блеоміцину.

Отримання зразків шкіри

В день 21 мьішей евтанізували за допомогою цервікальної дислокації, отримували зразки шкіри та обробляли їх для аналізу.

Виміряні параметри:

Товщина дерми та підшкірної жирової клітковини

Пошкоджені ділянки шкіри посікли, зафіксували в 4 95 -вому формаліні та залили в парафін.

Зрізи товщиною 5 мкм пофарбували гематоксиліном та еозіном. Товщину дерми проаналізували при 100-кратному збільшенні за допомогою вимірювання відстані між епідермально- дермальною сполукою та сполукою між дермою та підшкірною жировою клітковиною в чотирьох ділянках пошкодженої шкіри у кожної миші. Два незалежних дослідника проводили оцінку до консенсусу в разі варіабельності вимірювань, що перевищувала 10 95.

Вміст колагенау в шкірі

Аналіз на гідроксіпролін

Вміст колагену в пошкоджених зразках шкіри визначали за допомогою аналізу на гідроксіпролін. Після обробки пункцій біоптатів (2 З мм) ЄМ розчином НСІ протягом трьох годин при 120 "С рН зразків довели до 7 6М розчином Маон. Після цього зразки змішали з 0,06 М хлораміну Т та інкубували протягом 20 хвилин при кімнатній температурі. Потім додали 3,15 М перхлорної кислоти та 2095 п-диметиламінобензальдегід та інкубували зразки протягом наступних 20 хвилин при 60 "С. Оптичну щільність визначали при довжині хвилі, що дорівнює 557 нм, мікропланшетним спектрофотометром 5ресіга МАХ 190 (МоїІесшаг Оеєемісе5, Каліфорнія,

США).

Аналіз 5ігсої

Загальний вміст розчинного колагену в супернатантах клітинних культур кількісно визначали з використанням аналізу на колаген 5ігсо! (ВіосоЇог). Коротко кажучи, супернатант клітинної культури змішали з червоним барвником сиріус та залишили на 30 хвилин при кімнатній температурі. Після центрифугування гранулу осаду розчинили в лужному реагенті.

Вимірювання виконували з використанням мікропланшетного спектрофотометра ЗресігаМах 190 (МоїІесшаг Оемісе5) при довжині хвилі, що дорівнює 540 нм.

Обробка та статистичний аналіз даних

Дані виразили як середнє значення ж стандартна помилка середнього. Для статистичних аналізів використовували ї-тест Стьюдента. Значення р менше 0,05 вважали статистично значущим результатом.

На фігурах с 28 по 30 " позначає значення р х 0,05; 7" позначає значеня р « 0,01; 77 позначає значення р « 0,001.

Зо Результати

Ін'єкція блеоміцину мишам призвела до збільшення товщини дерми в порівнянні з мишами, які отримували Масі (див. Фіг. 28: збільшення на 57 95 в групі, що отримувала блеоміцин плюс носій, в порівнянні з групою, що одержувала Масі плюс носій). Росиглітазон та сполука А (30 мг/кг) статистично значуще знизили товщину дерми у мишей, підданих дії блеоміцину, в порівнянні з мишами, які отримували носій (рх0,05). Сполука А (100 мг/кг) більш значуще зменшила товщину дерми у мишей, підданих дії блеоміцину, в порівнянні з носієм (р «0,001).

Відповідно зі зменшенням товщини дерми, вміст гідроксипроліну в пошкодженій шкірі у мишей, які отримували лікування сполукою А (30 мг/кг/день та 100 мг/кг/день) та росиглітазоном, було статистично значуще нижче, ніж в пошкодженій шкірі мишей, які отримували носій; сполука А (30 мг/кг) була більш ефективною, ніж розиглітазон (Фіг. 29).

Сполука А (30 мг/кг/день та 100 мг/кг/день) та розиглітазон також статистично значуще знизили вміст колагену в порівнянні з носієм (Фіг. 30).

У сукупності ці результати показують, що сполука А ефективно запобігає фіброз шкіри.

Сполука А (100 мг/кг) надає навіть більш виражену дію на товщину дерми в порівнянні з росиглітазоном.

Приклад 5: активація РРАК рецепторів людини та миші сполукою А

Здатність сполуки А активувати всі три підтипи РРАК рецепторів визначали за допомогою аналізів з тимчасової трансактівації. Ці аналізи на клітинній основі виконували з використанням клітин Со5-7, трансфікованих плазмідою, що експресує химерний рецептор РРАКа-СаїЇ4 людини або миші (або РРАКО-СаіІ4, або РРАКу-Саї1І4) та 5саіІ4 роІ З ТК ис репортерного плазмідою.

Трансфекції виконували за допомогою хімічного агенту (Че! РЕЇ). Трансфіковані клітини розподілили по 384-лунковим планшетам та дали їм можливість відновитися протягом 24 годин.

Потім культуральне середовище видалили й додали свіжу середу, що містила сполуку, яка підлягала випробуванню (5 мкМ) (кінцева концентрація варіювалася від 10-4 М до 3.10-10 М).

Після інкубації протягом ночі вимірювали експресію люціферази за допомогою додавання

Зіеадусбіо згідно з інструкціями виробника (Рготеда) Як контроль використовували фенофіброєву кислоту в концентрації 10-5 М, СУУ501516 в концентрації 10-8 М та розиглітазон в концентрації 10-6 М. Результати виразили у відсотках активності в порівнянні з контролями (фенофіброєва кислота для РРАКа, розиглітазон для РРАКу та СУУ50О1516 для РРАКб), бо прийнятими за 10095. Для рецепторів людини результати є середнім значенням за 6 експериментами, кожен з яких складався з 4 паралельних дослідів. Для рецепторів миші результати є середнім значенням за 5 (РРАКб) або 6 (РРАКа та РРАКУ) експериментами, кожен з яких складався з 4 паралельних дослідів. Криві "доза-ефект" та ЕСзо були розраховані з використанням програми Аззау Ехріогег (МОМ). Результати представлені в таблиці, наведеній нижче, на Фіг. 31 та Фіг. 32. ди дн при р х: розрахункове значення (плато не досягнуто).

Ці результати показують, що сполука А активує всі три підтипи рецепторів РРАК з ЕС5о менше 1 мкМ для кожного підтипу. Крім того, можна бачити, що сполука А має збалансовану активність між трьома підтипами РРАК рецепторів.

В цілому, результати прикладів 1-5 свідчать про те, що для забезпечення агоністичного ефекту необхідна добра агоністична активність РРАКО спільно з агоністичною активністю

РРАКа та РРАКУ, щоб надавати пан-антіфіброзний ефект.

Приклад 6: дія сполуки А на проліферацію легеневих та дермальних фібробластів і порівняння з відомими агоністами РРАКУу та РРАКа

Здатність сполуки А інгібувати індуковану РОСЕ проліферацію легеневих та дермальних фібробластів визначали шляхом виконання аналізів з включенням Ей (5-етиніл-2'- дезоксіуридину). Ці аналізи були виконані з використанням первинних фібробластів легень або шкіри людини (РготосеїЇ). Клітини культивували в 96б-ямкових планшетах в повному культуральному середовищі протягом 24 годин з подальшим голодуванням протягом 24 годин в безсироватковому середовищі. Потім середовище замінили свіжим середовищем, яке мало

РОСЕ та досліджувану сполуку А (в концентраціях, що варіювали від 107 М до 4,5.108 М), на наступні 24 години. ЕДО додали до клітин на останні 16 годин обробки сполукою. Потім культуральне середовище видалили, клітини зафіксували формальдегідом та включений в ДНК клітин, які діляться ЕД кількісно визначали з використанням флуоресцентного аналізу Сіїск-й згідно з інструкціями виробника (Іпмйгодеп). Фенофіброєву кислоту в концентраціях, що варіювалися від 3.107 М до 1,4.107 М (РРАКа), та розиглітазон в концентраціях, що варіювалися від 3.109 М до 1,4.108 М (РРАРБУу), використовували як контроль. Результати виражали якою ЕдО-позитивних клітин від загального числа клітин. Результати представляють

Зо собою середнє з трьох паралельних біологічних дослідів. Криві "доза-ефект" та значення ІС5О розраховували з використанням програми СсгарпРаа Р'гізт. Результати представлені в таблиці, наведеній нижче, та на Фіг. 33 та 34. тд

МС: Не конвергує.

Пример 7: дія сполуки А на перехід фібробластів в міофібробласти в разі легеневих та дермальних фібробластів і порівняння з відомими агоністами РРАКУу та РРАКа

Здатність сполуки А інгібувати викликаний ТЕР перехід легеневих та дермальних фібробластів в міофібробласти (ЕМТ; від англ.: Ябгобріавів то туойгобіавів Ігапейіоп) визначали за допомогою проведення імуногістохімічних аналізів на маркер міофібробластів - гладком'язовий са-актин (0-5МА; від англ.: «а-5тооїй птизсіе асііп). Ці аналізи виконували з використанням первинних легеневих або шкірних фібробластів людини (Рготосеї|). Клітини культивували в 96-ямкових планшетах в повному культуральному середовищі протягом 24 годин з подальшим голодуванням протягом 24 годин в безсироватковому середовищі. Потім середовище замінювали свіжим середовищем, яке мало ТОЕДВ та досліджувану сполуку А (в концентраціях, що варіювалися від 107 М до 4,5.108 М), на наступні 48 годин. Потім культуральне середовище видалили, клітини зафіксували формальдегідом та пофарбували первинним антитілом миші проти с-ЗМА (Зідта) і вторинним антитілом кози проти антитіл миші, міченим флуоресцентною міткою (Іпмігодеп). Експресію -5МА кількісно визначали з використанням програми Меїа Хрге55. Фенофіброєву кислоту в концентраціях, що варіювалися від 3.107 М до 1,4.107 М (РРАКОа), та розиглітазон в концентраціях, що варіювалися від 3.10-5 М до 1,4.10-8 М (РРАКу), використовували як контроль. Результати виражали якуб а-5МА- позитивних клітин від загального числа клітин. Дані нормалізували щодо обробки тільки ТОЕВД, яку прийняли за 100 95. Результати представляють собою середнє за трьома паралельними біологічними дослідами. Криві "доза-ефект" та значення ІСво розраховували з використанням програми СгарпРай Ргіхт. Результати представлені в таблиці, наведеній нижче, та на Фіг. 35 і

Зб.

Фенофіброєва кислота

ІСсво (мКМ) 10,79 1118

МС: Не конвергує.

У сукупності, ці функціональні дані, отримані іп міго, демонструють, що сполука А ефективно інгібує індуковану РОСЕ проліферацію та індукований ТОВ перехід в міофібробласти первинних легеневих та дермальних фібробластів людини, забезпечуючи таким чином зв'язок з антіфіброзними ефектами, що спостерігалися іп мімо. Крім того, ці результати дозволяють припустити, що пан-РРАК агонізм може перевершувати активацію одиночних РРАК щодо антіфіброичних ефектів в клітинах-мішенях, пов'язаних з двома ключовими фіброгенними шляхами.

ПЕРЕЛІК ПОСПІДОВНОСТЕЙ

«В» ЩУЄМпПУА «3202 СПОНУКИ РРАН ДНЯ ЗАСТОСУВАННЯ Б ПІКУВАННІ «НБРОЗНИХ ЗАХНОРЮВАНЬ «ад» ТНЗОБОрО ОПеЄ УУСУММ «Во ЕРЗАЗОУ187.6 «і» 2034-12-28 «Од» Райепінт еп о «2195 1 «із 20 «иі2» ДНК «813» нпучна послідовність «Р «РЗ» праймер «ДО саюсосладавсасс 20 «ох 7 «Рі 70 «ох ДНЕ ках» штучна послідовність киг кг» праймер «4005 3

Фіоносфессіссподюва г «дід» З «і» 20 «вій» ДНЕ «218» штучна паспідовність «ЕЕ «ий» праймер «пох З ассдоссси ссідессю га ке 4 «Ті ЗВ «1» ДНК «ТУ» штучна послілевність «о» «аг» праймер «400» 4 песдезсасзссацненс 20 «10» в «Ді» 29 «1» ДНК «214» ннучна паоєпідовніст «ах «а» праймер

«Оз В дазпоюсісзюодчсє го «ЕР: В «Ті 23 «Та» ДНК «а1Я» шнучня послідЮВНІСТЬ «23» праймер «а» В дав сов ддассасдд 020 «а У «ар» 25 «12з ДНЕ «Ва» інтучна послідавність «ей «273» праймер «Не у опеаюівсосодсняац 22 «Ті 23 «таз ДНК «ЕТ3е штучна послідовність «ВО «232 праймер «ап» В сесвспсірсолієно фе 29 «ее 9 «в» 2 «З13» ДНК «Ф1Я» шнтучня послідовність «ЕЙ «ФУ» праймер «4005 З саддддасіва стюосано «й ТО «віз 50 «12» ДНЕ «213» штучна послідовність «ТО

Меса оісссвоца со кад» і «Різ 20 «рід» ДНК «213» штучна посліловність

«дом Ті зассссік спін 90

«10» 12

«із 0

«їй» ДНК

«вій» штучна послідовність

«их

«ВРУ» праймер

«апо» 12 пссасют одеса 5 ке 13

«Вії» Зп

«В1йз ДНЕ

«їй» штучна паслідовність

«Вих

«вгу» праймер

«аю» 13 здіспосесаютсзе 20

«10» 14

«Й» и

«ЕТ ДНК

«АБУ» штучня послідовність ке

«во» праймер

«о ТА свасадснс син ся 002

«ві тА

«11» РО

«Ріг» ДНК

«Же штучна послідовність

«ВШОх

«ва» працмев

«доз ТО

«1 16

«еів ві кві ДНК

«13» інтучна послідовність

«и

«йде ТЕ іч саноссча є 8

«1 7

«ев» 2

«212» ДНК ката» цптучна посліДдОВНІСТЬ

«ик

«ад 7 гіссавсрі сосіясвойє га

«10 ІВ

«Вів 2

«Во» ДНК

«Вій» штучна послідовність

«ШиМх

«РІЗ» позимер

«ад» ІВ пісснсяс ккодсвіса 20

«Р» ТО

«Різ 79

«РІ» ДНК

«Рій» штучна послІДОВНІСТЬ

«ад» З

«рід о

«різ 22

«вій» ниучна послідовність

«Ру»

«аа» праймер

«00» 20 гесасвсю сс 22

Claims (1)

1. ФОРМУЛА ВИНАХОДУ

   1. Застосування агоніста пан-РРАК в лікуванні фіброзного стану, де агоніст пан-РРАК являє собою 5-хлор-1-(6-бензотіазоліл)усульфоніл|-1 Н-індол-2-бутанову кислоту.

   2. Застосування за п. 1, де фіброзний стан є станом, вражаючим будь-який орган, в якому може розвинутися фіброз, наприклад: серце, легеня, печінка, нирка, шлунково-кишковий тракт, шкіра.

   З. Застосування за п. 1 або п. 2, де фіброзний стан вибраний з: фіброзу печінки, стеатозу печінки, неалкогольного стеатогепатиту, хронічної хвороби нирок, фіброзного захворювання легенів, системної склеродермії.

   4. Застосування за п. 3, де фіброзний стан є фіброзним захворюванням легень.

   5. Застосування за п. 4, де фіброзне захворювання легень є ідіопатичним легеневим фіброзом.

   6. Застосування за п. 3, де фіброзний стан є системною склеродермією.

   7. Застосування за п. 3, де фіброзний стан є неалкогольним стеатогепатитом.

   8. Застосування за будь-яким з пп. 1-7, де зазначений агоніст призначений для перорального введення.

   9. Застосування фармацевтичної композиції, що містить агоніст пан-РРАК, в лікуванні фіброзного стану, де агоніст пан-РРАК являє собою 5-хлор-1-(6-бензотіазоліл)усульфоніл|-1 Н- індол-2-бутанову кислоту.

   10. Застосування за п. 9, де фіброзний стан є станом, що вражає будь-який орган, в якому може розвинутися фіброз, наприклад: серце, легеня, печінка, нирка, шлунково-кишковий тракт, шкіра.

   11. Застосування за п. 9 або п. 10, де фіброзний стан вибраний з: фіброзу печінки, стеатозу печінки, неалкогольного стеатогепатиту, хронічної хвороби нирок, фіброзного захворювання легенів, системної склеродермії.

   12. Застосування за п. 11, де фіброзний стан є фіброзним захворюванням легень.

   13. Застосування за п. 12, де фіброзне захворювання легень є ідіопатичним легеневим фіброзом.

   14. Застосування за п. 11, де фіброзний стан є системною склеродермією.

   15. Застосування за п. 11, де фіброзний стан є неалкогольним стеатогепатитом.

   16. Застосування за будь-яким з пп. 9-13, де зазначена композиція є композицією для перорального, парентерального, місцевого, інгаляційного або інтраназального введення. Тригліцериди в плазмі 1Вщ І В Б ! я і Шк еншй Олія со.

   ФІГ. 1 Колаген (пікресіріує) па жк. й прин їх о. ва азам ААМхуАУМАя. ниши ПЕШИННИИХ ШУ Я Олія СС,

   ФІГ. 2

   ТОКр- КА й ДЕ т оОї- до точи н ній С панни Олія сок

   ФІГ. З Со ко Е хо Б- З х | ще во Я ж . Ж фах оо джу Олія | сс

   ФІГ. 4

   «-5МА й.й 1 щі хх Ме г от ще ше 05- І ЩЕ в.о і ІІ. Олія сс

   ФГ. 5

   МОР.

   2.5 ї«й . ад і я Олія сс,

   ФІГ. 6

   «Фібронектін щ Й | : кеш Ж: ін . т КІ; хх зі Е Ек ЖЕ шк В не шк М 4 шк, : І ж ЖЖ - | ПИТ . Соня СО, шк Носін 777 Сполука А 30 мг/кг 0000) СполукаА МО мокг 00000) Розиглітазон 5 мг/кг Умовні позначення до фігур 1-7

   ФІГ. 7

   : - тт

   85 304 ш Фе З

   20. щ з - ЖЖ - ша Г7 Безантитілдо ОВМ шщ Антитіла до ВМ плюс носій р) Антитіла до ОВМІ плюс Каптоприл 10 мг/кг Антитіла до чВМІ плюс Розиглітазон 3 мМі/кг 000000 Антитіладо ВМ плюс ІШоглітазон 30 мг/кг ш Антитіла до ВМ плюс Сполука А 30 мт/кг Антитіла до САМ плюс Сполука А 100 мт/кг Умовні позначення до фігур 8-16

   ФІГ. 16

   Відкладення колагену (Інкросіріус) по 154 Ша; - Ожжж о рийтя Щи | ОГО в 0-й й А- - 53 Фізіологічний Блесміщщин розчин

   ФІГ. 17 ТІМР-Ї1 у легенях г Ж «МК тей ! - щ ще | Ж Ж ш ЖК | тТо- п іх | жоокжкжжжкки Я х . ДПІ | - Фізіологічний Блеоміин розчин

   ФІГ. 18 з8

   МСР-1 у легенях шо. жк Е 00 п ФізіологічНИЙ Блеоміин розчини

   РН. 19 Остеопонтін у легенях КІ дБ ж з ЕЕ й : - З- Кз й ! - - ! Ед що Ще Фізіологічний Блеоміннн розчин

   ЧЕ. 20 т г ТОЕВКІ ш що ми Я "«е ко ШИ ! зе ; до 1 "І | ЩЕ - п | о ФизіологічНИий Блеоміцин розчин

   ЧУ. 21 В Со т іа Ек й Ж з» жкяж а Ш ШИ Фізіологічний Блеоміннн розчин

   ФІГ. 22

   СоЗ шо СН нщ я д Є ще що Фізіологічний Блесмінинн розчин ФІГ, 23 ТІМЕ-1 415 к я д' й Е Е міну ! - 1 м Чизіологічний Блеоміщин розчин

   ФІГ. 24

   МЄР-ї у легенях

   В. сх ї- жк Е го що? Фізіологічний Блеоміцнн розчин

   ФІГ. 25 Єктеопонтін то ї- «ЕЕ 40 ук сх шо ЗО- не ще Е - - | Ж і - - - 22» 11 А- 2 Фізіологічний Блеоміцинн розчин

   ФІГ. 26

   Остеопонтін яко спра шк У ш - ся ! х В й й т з я, ш З КК - жжж о, /'і ет ТІЇ з Физіологічний Блеоміцин розчин ШИ ос 00000 Сполука А 30 мг/кг ро) Сполука А 00 мг/кг ши Разнглітазон З мг/кг Умовні позначення до фігур 17-27

   ФІГ. 27 з кре аз ; - МАН ; жжж ге Ж ще : Роз - і : їж 1.5 ж З щі Я ще ї Е , : : щ | Е и : З вк З Її: айви : з - З К; з : з щк ШЕ КЕ З ; й в 14 | що т - ше : З : | ! ее ШЕ : З ; | : х не : ! : : як ШЕ : З ; | : - ще : | : Ж : ШЕ Е З ; | : З 0,5 ще : | : ! ! НЕ ше ! | ; | : Ба ще Блесминн о Блеоминно Блеоміцин Блеомішинно МаСіплює Масбінлює Масіплює нплює плює плюс плас Сполука А Сполука А Носн Сполука в Снолука А Носно Рознслітазан о ЗО юр Ню мре/вг іїе- Лі 30 мкг (п-на) Т00 мікріпнВ) (3-7) по пев їй жене 036 Бе та туції 85 Н о яг ж р має : ІЗ : т | : : в : : и Еш Й Н Її Н зе о : не я : п ! че Е сх ри і х З 7 ту Я а ! Ї : жк Тооош-к м ! збе ще ВЕ Е зе Н ОО К - Н й Е ная ще як ШЕ ! Н : 7 як | | НЕ у жк -- Н | Е Е К К Бай Н | Е Е Кк.

   К -е Н Г К Е Е К ек Н | Е Е Кк.

   К щі ше ! ! ! : ОБ женИ | ше мк : й К Е Е.

   З - : й | Е Е: З Ка ше ! ! ! : Блесомічнк Блеоміцнн о Блеоміннн о Блеомішнн о МаСінлює Мабіплює МаСіплює пос вплюЄ плюс плюс Сполукв А Спелукн А 0 БПося СполуювА Сполука А Носій о Бознглітатюн о Зб міт З0О0 меЖг ї- Мімгжгів- Я НК мокрі; це -як йп-ях ї-

   й жве0 03 кох о ОВ жк до, СУХХУУХУК ККУ, КЗ

   ЕЕ. як як ї ; у І | ! М: 155 | Й : ак Х КУ З ГУ їх Бо» як ! ! ї ну к ї Ше Е ! Е х пу5 зак КУ : 5 : : ДИМ - ШЕ !

   т з. ШЕ - - КК КЕ Е Е : | ще ши й х ШЕ : | : | ; в що | | щ- іс хх З Е Е : Е ї З т : ще : | Е ! ; У ЩЕ : ! Е | ; 5 05 ЩЕ | ще що ще З у з З Е З З - З ще | | ! | Е се: ШЕ : | ше : ще : | ! | ; Х З Х Е ; ї З Х ; ЩЕ Е Е З ! : і Е і Блеоміцин о БВлеоміпннио Блесшішнн о Блеомшнк о МасСіплює Мабіплює ОМаСі дес плюс ллює пЛлюЄ плюс сполука А Сполука А 0 Посів Снелука А Сполука Босш Розпливювн о ЗімгижЕе НюЮ мг ше? міжеів-с МО мкг ні і-7 і-ї їн-8) їп-75 чат « ВРРАНе 160- шк « ВРРАБА 1404 з ж Я - у як | ви : в НВ ! а Я і У ЗОВ ск з ! ий Фе Я . Я я а 40- КИ Я ке що як КОЖ НІ ! Зх х Кн КО ех й я пн ше и ни 5о- Іов кінці МОЇ у 120 АЙ ру. т Я з ІК І Я ; Я Е 100. / пМеРАКе ко во Я « теРАНЕ ще Ей ни - з о : й ж зе 80- лиш ПРРАНУ і к БОС и, що Л пи ан - -8 -0 -7 -в -З -4 Іов Їкінщ М)

   ФІГ. 37 Інлукована РОС Е нроліферація в первинних легеневих фФібробластах людини Е | т се т - ! г їх : І! зе ТТ жо 204 ої 1 І: «ж 7еРозиглітазон ж в ще маше: рою Фенофіброєва Е і ші в КУ й Я й х | і. шк я кислота мк ! х 2 | Е 103 х ге | У Щ | У

   : . че - з й 1 й Ко МПоє кінп.О.мКк Мі

   ФІГ. 33

   Індукована РОС проліферація в первинних дермальних фібробластах людини ЖЕ т ї- Е не ! «ке ІА З і о 15 т ще УА 337 є її Ї | ; ше -- Розиглітазон Е нини шо ши: ЩЕ, ох «а Фенофіброєва КЗ ІЗ ве 3 х Ї ї М Шо г з Ж 49 І ше! Кк ше кислота іні я ! й Ек Пн В КЗ Би х ІН ке х І зх й е зі в ше -Й -ї 0 1 Е КІ Ноз кінц.мМЕ МІ

   ФІГ. 34 індукована ТС ЕМ (експресія 4 ЗМ АХ в первинних легеневих фібробластах людини 150 ш ж я ; кл: шк НЕ як Розиглітазон Е х і І ж в. 0 ї КЗ -Ф вч ; Е виш и не 5о-ю Фенофібросва КЕ н кА кислота зи ва Бо 3 - х сечі С -к й ! - Ж - ще о 1 2 З Пов кінц.мМК МЕ

   ФІГ. 35

   Індукавана ТОСЕрВ ЕМ (експресія п-5 МАХ в периинних дермальних фіоробластах жлодини - 2004 щ ве "я м ! її я год 327 мо 1504 с . І ІА 337 Е | Ї : І! т «5 РозигліІТазОнН щ З з Х Ж | вон Кз і ті дтп рез х | пи в Фенофіброєва і ї 5 в З : етхс» З 100-1 і | . ш кислота А З й Що к- - | 5 я-і ; іу г ! ке шо ; ї «г в (0) 1 ? Моє кінц.мМК Мі

   ФІГ. З6