KR20170042504A

KR20170042504A - 섬유성 질환의 치료에 사용하기 위한 ppar 화합물

Info

Publication number: KR20170042504A
Application number: KR1020167034694A
Authority: KR
Inventors: 이레나 콘스탄티노바; 쟝-미쉘 루카리니; 쟝-뤼이 쥬니앙; 피에르 브로카
Original assignee: 엥방티바
Priority date: 2014-06-13
Filing date: 2015-06-12
Publication date: 2017-04-19
Also published as: US20170189383A1; US10052311B2; EP3154543A1; WO2015189401A1; KR102347721B1; UA120851C2; CA2951337C; CA2951337A1; AU2015273454B2; PL3154543T3; ES2755183T3; PT3154543T; HRP20191941T1; TN2016000535A1; JP6557684B2; DK3154543T3; US20180333396A1; HUE046293T2; CN106573058A; RS59426B1

Abstract

본 발명은 섬유증 증상의 치료를 위한 pan-PPAR 작용제 또는 상기 작용제를 함유하는 약학적 조성물의 용도에 관한 것이다.

Description

섬유성 질환의 치료에 사용하기 위한 PPAR 화합물{PPAR compounds for use in the treatment of fibrotic diseases}

본 발명은 섬유성 질환의 치료를 위한 pan-PPAR 작용제 또는 상기 작용제를 함유하는 약학적 조성물의 용도에 관한 것이다.

간 섬유화는 서로 다른 세포 유형 간의 복잡한 상호 작용의 결과이다. 이것은 만성 손상에 반응하는 염증성 세포의 모집 및 간질성 세포(HSC)의 활성화에 의해 특징지어지고, 이는 세포질 외의 기질의 축적을 유도한다. 간질증은 일반적으로 간의 염증화 및 간세포 손상과 공존한다. 증가된 산화 스트레스는 이들의 원인에 상관없이 섬유화를 유도하는 모든 만성 간 질환에서 공통적인 요소이다. 손상된 간 세포, HSC 및 침윤성 염증성 세포는 활성 산소 종(ROS)의 주요 근원이다. 실제로, 산화적 스트레스는 염증성 세포의 모집 및 HSC의 활성화를 유도할 것이다. 따라서, 만성 간 손상 상황에서, 간세포 손상, ROS 생성, HSC 활성화 및 염증성 세포 모집의 악순환이 일어나, 손상에 대한 섬유화 반응을 증폭시킨다.

비-알콜성 지방간 질환 (NAFLD) 및 비-알코올성 지방성 간염 (NASH)과 같은 간 섬유화 질환에 대한 효과적인 치료에 대한 수단은 아직 여전히 충분하지 않다. NASH를 갖는 환자에게는 치료법이 확립되어 있지 않으며 그리고 임상 시험에서 여러 가지 치료적 선택이 시험되었다 (Vuppalanchi R and Chalasani N, Hepatology 2009, 49(1): 306-317; Dowman J.K et al., Q. J. Med. 2010, 103(2):71-83). 이들 연구는 많은 다른 종류의 화합물 (피브레이트, 티아졸리딘디온, 비구아니드, 스타틴, 칸나비노이드)과 치료 표적 (핵 수용체, 안지오텐신 수용체, 칸나비노이드 수용체, HMG-CoA 환원 효소)의 사용을 포함한다. 최근 티아졸리딘디온 (로지글리타존 및 피오글리타존)을 포함하는 연구는 이 약물들이 간 상태를 호전시킬 수 있지만 이러한 약물 치료는 울혈성 심부전 및 골다공증 위험이 높지 않고 체중 증가와 같은 바람직하지 않은 영향이 없다는 사실이 밝혀졌다(Dowman J.K et al., op. cit.; Shiri-Sverdlov R et al., J. Hepatol. 2006, 44: 732-41; Neuschwander-Tetri et al., Hepatology 2003, 38:1008-1017). 카나비노이드 투여와 관련된 임상 시험은 신경정신병학 장애의 우려가 제기되었다(Vuppalanchi R and Chalasani N, op. cit.). 현재 진행중인 다른 치료법은 NASH 약물에서 항산화 제로서 평가하려고 하고 있으나 그러나 아직까지 이러한 치료법 중 어느 것도 설득력있는 결과를 보여주지는 여전히 못했다(Nelson A et al., J. Clin. Gastroenterol. 2009, 43: 990-994). 간 질환 치료를 위한 후보군은 WO 2011/064350 및 US 2013/108573에 개시되어 있다. 그러나, 간 질환의 치료에 적합한 화합물, 특히 지방증, 염증성 및 콜라겐 침착과 같은 섬유화 과정의 여러 성분을 표적으로 할 수 있고, 그리고 현재 평가중에 있는 약물에서 관찰된 부작용을 피할 수 있는 화합물에 대한 필요성이 여전히 존재한다.

만성 통팥 질환(CKD)은 만성 신장 질환으로도 알려져 있으며, 몇 달 또는 몇 년 동안에 걸쳐 신장 기능에서의 점진적인 상실이다. CKD는 당해 기술 분야에서 일반적인 의미를 가지며, 콩팥, 신장 실질의 파괴 및 기능성 네프론 또는 사구체의 손실에 영향을 미치는 다양한 조건을 분류하는데 사용된다. 더욱이 CKD는 다른 원인으로 생길 수 있지만, 최종 경로는 신장 섬유증으로 유지된다는 점에 유의해야 한다. CKD의 병인의 예는, 이에 한정되지 않지는 않지만, 심혈관 질환, 고혈압, 당뇨병, 사구체 신염, 다낭성 신장 질환 및 신장 이식 거부를 포함한다. 사구체 경화증과 세뇨관 간질 섬유증을 특징으로 하는 신장 섬유증은 다양한 만성 신장 질환의 일반적인 증상이다. 신장 섬유증의 병인은 본질적으로 세포외 기질 (ECM) 성분의 과도한 축적 및 침착에 의해 특징되어 지는 단조로운 과정이다. 신장 섬유증은 투석 또는 신장 이식이 필요한 치명적인 질환으로, 궁극적으로 말기 신부전으로 이어지는 진행성 과정이다. 그러나, 만성 신장 질환의 악화를 늦추기 위해 명백하게 밝혀진 구체적인 치료법은 없다. 신장 손상은 손상되거나 침윤된 세포에 의한 TGF-β, 표피 성장 인자 (EGF), 혈소판 유도 성장 인자 (PDGF)와 같은 사이토카인/성장 인자의 방출과 관련되어 진다. TGF-β 생산의 증가는 신장 섬유 성장의 병인에서 가장 중요한 메커니즘 중 하나이다. TGF-β1은 섬유아세포 활성화를 자극하고 TGF-β 수용체와의 상호 작용을 통해 기질 발현을 유도하는데, 주로 두 개의 단백질 과 - 타입 I (TβRI) 및 타입 II (TβRII)로 구성된다. TGF-β1은 TβRII와 결합하여 TβRI 모집을 유도하여 이종 TGF-β 수용체 복합체를 초래한다. 이 복합체는 예비 섬유증화를 매개하는 두 개의 주요 Smads인 Smad2 및 Smad3를 인산화시키고 그리고 활성화시킨다. 세포질 외 조절된 키나아제 1/2 (ERK1/2)와 같은 다른 신호 전달 경로가 또한 TGF-β 수용체 활성화에 반응하여 활성화될 수 있다. 활성화된 ERK1/2는 폐쇄성 신장에서 관상 세포 어팝토시스에 기여한다. TGF-β 신호 전달의 활성화는 섬유아세포 활성화 및 섬유화 진행을 직접 촉진시키는 주요 기전으로 간주되기 때문에, 이 경로의 치료적 개입은 신장 섬유증을 정지시키거나 예방하는 전략으로 간주될 수 있다. CKD의 치료를 위한 후보군은 WO 2012/159107 및 WO 2014/013005에 개시되어 진다. 그러나, CKD의 치료에 적합한 화합물에 대한 필요성은 여전히 존재한다.

폐 섬유증 개질은 급성 호흡 곤란 증후군, 만성 폐색성 폐질환 및 천식과 같은 폐질환 상태에서 발생한다. 폐 섬유증은 간질에 세포질외 매트릭스가 과도하게 축적되어 호흡 부전을 일으키는 특징이 있다. 폐 섬유증은 유육종증, 과민성 폐렴, 콜라겐 혈관 질환 및 흡입 물질 노출을 비롯한 많은 다른 조건들로 인해 발생할 수 있다. 유의성 있는 수의 환자에서 폐 섬유증의 근본 원인을 찾을 수 없다. 이러한 원인을 알 수 없는 이러한 증상은 특발성 간질성 폐렴으로 불려왔다. 특발성 간질성 폐렴의 가장 흔한 형태는 특발성 폐 섬유증 (IPF)이다. IPF의 주요 조직학적 병리소견은 섬유 간 초점(즉, 새로운 섬유증), 염증, 허니콤 변화(즉, 후 섬유증) 및 정상 폐 구조(즉, 섬유증의 증상 없음)를 가진 간질 섬유증의 교대 구역의 일시적인 이질성을 갖는 보통의 간질성 폐렴의 것이다. IPF의 치료를 위한 후보군은 WO 2004/103296에 개시되어 있다. 폐 섬유증 질환의 치료를 위한 후보군은 WO 2009/149188에 개시되어 있다. 최근 로시글리타존(로지글리타존)과 같은 티아졸리딘디온(tiazolidinediones)을 포함하는 연구는 이들 약제가 폐 섬유증을 개선시킬 수 있지만 이러한 약물 치료는 울혈성 심부전의 보다 높은 위험과 같은 바람직하지 않은 효과가 없지 않다는 것이 밝혀졌다(Kung J et al., Expert Opin. Drug Saf. 2012, 11 (4) : 565-579]). 피르페니돈 (5-메틸-1-페닐-2-(1H)-피리돈)은 항-섬유 특성을 가지며 유럽 및 일본에서 IPF의 치료를 위해 승인되었다. 그러나, 폐 섬유증 질환의 치료에 적합한 대체 화합물이 여전히 필요하다.

섬유성 질환은 다양한 조직에서 콜라겐 및 다른 세포질 외 매트릭스 (ECM) 성분의 비정상적 및 과도한 침착에 의해 특징되어 진다. 이들의 병인학은 매우 다양하지만, 영향을 받은 조직에서 활성화된 표현형을 나타내는 ECM-생산 섬유아세포의 존재는 전형적으로 섬유성 질환이다. 섬유아세포 활성화는 I 형 및 III 형 콜라겐 및 피브로넥틴을 코딩하는 유전자의 전사 활성의 현저한 증가, 알파-평활근 액틴(α-SMA)의 발현의 개시 및 ECM 분해 활성의 감소로 특징되어 진다. 가장 흔한 전신성 섬유성 질환은 전신성 섬유증으로 알 수 없는 원인으로 인해 드문 만성 질환이다. 이것은 피부, 내장 기관 및 혈관벽의 결합 조직에 영향을 주는 임상적으로 이질적인 전신성 질환이다. 이것은 미세 혈관계의 변화, 면역계의 교란 및 결합 조직에서의 콜라겐 및 다른 매트릭스 물질의 대량 침착에 의해 특징되어 진다. 사이토카인, 성장 인자 및 부착 분자의 생성 및 효과뿐만 아니라 다양한 세포 유형(내피 세포, T-림프구, 단핵구, 섬유아세포, 비만 세포)의 기본 기능이 이 질환의 발병에 관여하는 것으로 알려져 있다. 전신성 섬유증은 종종 경피증으로 언급되어 진다. 경피증 질환의 범위는 모피아(발적, 선형 및 일반화), 유사-경피증 및 유사한 피부 및 조직 병리학적 발현을 갖는 오버랩-증후군과 같은 다양한 임상적 실체를 포함한다. 부가하여, 유전적 요인, 환경적 요인, 혈관 및 면역 체계 기능뿐만 아니라, 섬유아세포 및 기질 물질을 포함하는 전신성 섬유증의 복잡한 병태 생리학 및 내인 장기 침범의 복잡성은 종종 자가 면역 또는 결합 조직 질환으로 연구된 경피증 질환을 초래한다. 따라서, 전신적인 섬유증은 진단 절차 및 치료 요법과 관련하여 임상의에게 어려움이 되고 있다. 전신 섬유증의 임상 진단은 여러 분야 (예를 들어, 피부과 전문의, 류마티스 전문의, 폐 전문의, 신장 전문의 및 위장 전문의)의 주의를 필요로 하며, 그리고 확증을 위한 섬유 조직 및/또는 피부의 생검과 같은 침습적인 절차를 포함할 수 있다. 전신성 섬유증의 치료를 위한 후보군은 US 2013/0287794 및 US 2014/0038956에 개시되어 있다. 그러나, 전신성 섬유증의 치료에 적합한 대체 화합물이 여전히 필요하다.

퍼옥시좀 증식자-활성화 수용체(PPARs)는 유전자의 발현을 조절하는 전사 인자로서 기능하는 핵 수용체 단백질의 군이다. PPAR은 세포 분화, 발달 및 신진 대사 (탄수화물, 지질, 단백질)의 조절에 필수적인 역할을 한다. PPAR의 세 가지 유형이 확인되었다:

ㆍ 주로 간, 신장, 심장, 근육, 지방 조직 및 폐에서 발현되는 PPARα;

ㆍ 거의 모든 조직에서 발현되는 PPARγ;

ㆍ 심혈관계, 비뇨생식기, 호흡기, 소화기 및 근골격계에서 다양한 조직/세포에서 관찰되는 PPARδ.

PPAR 작용제는 PPAR에 작용하는 약물이다. 이들은 주로 중성 지방과 혈당을 낮추기 위해 대사성 질환의 증상을 치료하는 데 사용된다. PPARα 작용제는 본질적으로 피브레이트 (예를 들어, 페노피브레이트)의 부류로 구성된다. PPARγ 작용제는 본질적으로 티아졸리딘디이온 (예를 들어, 로시글리타존 및 피오글리타존)으로 구성된다. PPARδ 작용제는 안전 문제에 기인하여 결국적으로 중단된 후보 화합물인 GW501516이 포함한다.

PPAR 수용체 발현은 섬유증 질환에서 변형된다. 예를 들어, PPARγ의 감소 발현은 피부 생검뿐만 아니라 전신성 경피증 환자의 외피 피부 섬유아세포에서도 재현 가능하게 기술되었다(Lakota et al., Arthritis Res. Ther. 2012 May 1; 14 (3)). 경피증 환자로부터 폐 섬유 모세포에서도 또한 PPARγ의 낮은 발현이 보고되었다 (Bogatkevich et al, Pulm. Med. Vol 2012; 2012). PPARγ 작용제인 로시글리타존 및 피오글리타존은 생체 내에서 브레오마이신-유도된 피부와 폐 섬유증으로부터 잠식성을 보호하고 섬유아세포 세포주와 원발성 섬유아세포에서 예비섬유증의 생체 외 경로와 과정의 활성화를 방지한다 (Aoki et al, Respiration. 2009; 77 (3) : 311 -9; Samah et al, Eur J Pharmacol. 2012 Aug 15; 689 (1-3)). PPARα 수용체는 또한 다양한 자극에 대한 예비섬유증의 반응을 조절한다. 폐에서, 페노피브레이트인, 특정한 PPARα 작용제는 블레오마이신-유도된 섬유화를 예방했다 (Samah et al., 2012). 더욱이, PPARδ 작용제인 GW0742는 마우스에서의 블레오마이신 주입에 의해 유더된 폐 염증을 감소시키는 것으로 나타났다 (Galuppo et al, Int J Immunopathol Pharmacol. 2010 Oct-Dec; 23 (4) : 1033-46).

본 발명은 상기한 종래 기술의 문제점을 해결하기 위한 것이다.

pan-PPAR 작용제, 즉 3가지 PPAR 수용체 (PPARα, PPARγ 및 PPARδ) 모두를 활성화시키는 화합물은 다양한 섬유증의 증상의 치료에 유익한 효과를 발휘한다는 것이 밝혀졌다. 따라서, 본 발명은 섬유증의 증상의 치료 방법에 사용하기 위한 pan-PPAR 작용제를 제공한다. 본 발명은 또한 섬유증의 증상을 치료하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다.

일 실시 형태에 있어서, 섬유증의 증상은 심장, 폐, 간, 신장, 위장관, 피부 등과 같은 섬유증을 유발할 수 있는 임의의 기관에 영향을 미치는 증상이다.

또 다른 실시 형태에 있어서, 섬유증의 증상은: 간 섬유증, 지방간 질환, 비-알콜성 지방 간염, 만성 신장 질환, 특발성 폐 섬유증과 같은 폐 섬유증 장애 및 전신 경피증으로부터 선택된다.

이전의 것들과 조합될 수있는 또 다른 실시 형태에 있어서, pan-PPAR 작용제는 경구 투여를 위한 것이다.

상기와 같이 구성되는 본 발명은 pan-PPAR 작용제를 제공하여 상기한 종래 기술의 문제점을 해결한다.

도 1은 비히클, 화합물 A 및 로시글리타존으로 처리된 CCl₄-노출 마우스의 혈장 트리글리세리드 수준을 나타낸다.
도 2는 비히클, 화합물 A 및 로시글리타존으로 처리된 CCl₄-노출 마우스에서의 콜라겐 침착을 나타낸다.
도 3은 비히클, 화합물 A 및 로시글리타존으로 처리된 CCl₄-노출 마우스에서의 TGFβ-1 발현을 나타낸다.
도 4는 비히클, 화합물 A 및 로시글리타존으로 처리된 CCl₄-노출 마우스에서의 Col1a 발현을 나타낸다.
도 5는 비히클, 화합물 A 및 로시글리타존으로 처리된 CCl₄-노출 마우스에서의 α-SMA 발현을 나타낸다.
도 6은 비히클, 화합물 A 및 로시글리타존으로 처리된 CCl₄-노출 마우스에서의 MCP-1 발현을 나타낸다.
도 7은 비히클, 화합물 A 및 로시글리타존으로 처리된 CCl₄-노출 마우스에서의 피브로넥틴 발현을 나타낸다.
도 1에서 7에 대한 범례: 오일 그룹에서 막대는 왼쪽에서 오른쪽으로 비히클, 화합물 A(100mg/kg) 및 로시글리타존을 나타낸다; CCl₄ 그룹에서 막대는 왼쪽에서 오른쪽으로 비히클, 화합물 A (30mg/kg), 화합물 A (100mg/kg) 및 로시글리타존을 나타낸다.
도 8은 비히클, 캡토프릴, 로시글리타존, 피오글리타존 및 화합물 A로 처리된 항-GBM 노출 마우스에서의 혈청 우레아 준위를 나타낸다.
도 9는 비히클, 캡토프릴, 로시글리타존, 피오글리타존 및 화합물 A로 처리된 항-GBM 노출 마우스에서의 소변량을 나타낸다.
도 10은 비히클, 캡토프릴, 로시글리타존, 피오글리타존 및 화합물 A로 처리된 항-GBM 노출 마우스에서의 소변 알부민 준위를 나타낸다.
도 11은 비히클, 캡토프릴, 로시글리타존, 피오글리타존 및 화합물 A로 처리된 항-GBM 노출 마우스에서의 오스테오폰틴 준위를 나타낸다.
도 12는 비히클, 캡토프릴, 로시글리타존, 피오글리타존 및 화합물 A로 처리된 항-GBM 노출 마우스에서의 MCP-1 준위를 나타낸다.
도 13은 비히클, 캡토프릴, 로시글리타존, 피오글리타존 및 화합물 A로 처리된 항-GBM 노출 마우스에서의 TGFβR1 발현을 나타낸다.
도 14는 비히클, 캡토프릴, 로시글리타존, 피오글리타존 및 화합물 A로 처리된 항-GBM 노출 마우스에서의 Col1a 발현을 나타낸다.
도 15는 비히클, 캡토프릴, 로시글리타존, 피오글리타존 및 화합물 A로 처리된 항-GBM 노출 마우스에서의 Col3a 발현을 나타낸다.
도 16은 비히클 및 화합물 A로 처리된 항-GBM 노출 마우스에서의 병리학 사구체의 수를 나타낸다.
도 8에서 15에 대한 범례: 막대는 왼쪽에서 오른쪽으로 대조군 마우스, 비히클로 처리한 항-GBM 노출 마우스, 캡토프릴로 처리한 항-GBM 노출 마우스, 로지글리타존으로 처리한 항-GBM 노출 마우스, 피오글리타존으로 치료한 항-GBM 노출 마우스, 화합물 A(30mg/kg)로 처리된 항-GBM 노출 마우스 및 화합물 A (100mg/kg)로 처리된 항-GBM 노출 마우스를 나타낸다. 도 16에 대한 범례: 막대는 왼쪽에서 오른쪽으로 비히클로 치료된 항-GBM 노출 마우스 및 화합물 A (100mg/kg)로 처리된 항-GBM 노출 마우스를 나타낸다.
도 17은 비히클, 화합물 A 및 로시글리타존으로 처리된 블레오마이신-노출 마우스에서 콜라겐 침착을 나타낸다.
도 18은 비히클, 화합물 A 및 로시글리타존으로 처리된 블레오마이신-노출 마우스에서 TIMP-1 준위를 나타낸다.
도 19는 비히클, 화합물 A 및 로시글리타존으로 처리된 블레오마이신-노출 마우스에서 MCP-1 준위를 나타낸다.
도 20은 비히클, 화합물 A 및 로시글리타존으로 처리된 블레오마이신-노출 마우스에서 오스테오폰틴 준위를 나타낸다.
도 21은 비히클, 화합물 A 및 로시글리타존으로 처리된 블레오마이신-노출 마우스에서 TGFβR1 발현을 나타낸다.
도 22는 비히클, 화합물 A 및 로시글리타존으로 처리된 블레오마이신-노출 마우스에서 Col1a 발현을 나타낸다.
도 23은 비히클, 화합물 A 및 로시글리타존으로 처리된 블레오마이신-노출 마우스에서 Col3a 발현을 나타낸다.
도 24은 비히클, 화합물 A 및 로시글리타존으로 처리된 블레오마이신-노출 마우스에서 TIMP-1 발현을 나타낸다.
도 25는 비히클, 화합물 A 및 로시글리타존으로 처리된 블레오마이신-노출 마우스에서 MCP-1 발현을 나타낸다.
도 26은 비히클, 화합물 A 및 로시글리타존으로 처리된 블레오마이신-노출 마우스에서 오스테오폰틴 발현을 나타낸다.
도 27은 비히클, 화합물 A 및 로시글리타존으로 처리된 블레오마이신-노출 마우스에서 프브로넥틴 발현을 나타낸다.
도 17에서 27에 대한 범례: 식염수 군에서 막대는 왼쪽에서 오른쪽으로 비히클, A (100mg/kg) 및 로시글리타존을 나타낸다; 블레오마이신 군에서, 막대는 왼쪽에서 오른쪽으로 비히클, 화합물 A (30mg/kg), 화합물 A (100mg/kg) 및 로시글리타존을 나타낸다.
도 28은 비히클, 화합물 A 및 로시글리타존으로 처리된 블레오마이신-노출 마우스의 표피 두께를 나타낸다.
도 29는 비히클, 화합물 A 및 로시글리타존으로 처리된 블레오마이신-노출 마우스의 하이드록시프롤린 함량을 나타낸다.
도 30은 비히클, 화합물 A 및 로시글리타존으로 처리된 블레오마이신-노출 마우스의 콜라겐 함량을 나타낸다.
도 28에서 30에 대한 범례: Bleo = 블레오마이신; IVA30 = 화합물 A (30mg/kg); IVA100 = 화합물 A (100mg/kg); Ros = 로시글리타존.
도 31은 상기 화합물의 농도의 함수로서 화합물 A에 의한 PPARα, γ 및 δ 인간 수용체의 활성화를 나타낸다.
도 32는 상기 화합물의 농도의 함수로서 화합물 A에 의한 PPARα, γ 및 δ 뮤어라인 수용체의 활성화를 나타낸다.
도 33은 일차 인간 폐 섬유아세포에서 PDGF-유도된 증식에 대한 화합물 A, 페노피브르 산 및 로시글리타존의 효과를 나타낸다.
도 34는 일차 인간 피부 섬유아세포에서 PDGF-유도된 증식에 대한 화합물 A, 페노피브르 산 및 로시글리타존의 효과를 나타낸다.
도 35는 일차 인간 폐 섬유아세포에서 TGFβ-유도된 FMT에 대한 화합물 A, 페노피브르 산 및 로시글리타존의 효과를 나타낸다.
도 36은 일차 인간 피부 섬유아세포에서 TGFβ-유도된 FMT에 대한 화합물 A, 페노피브르 산 및 로시글리타존의 효과를 나타낸다.
도 33 내지 36에 대한 범례: Rosi = 로시글리타존; 페노 = 페노피브르 산.
도 1 내지 36에서, 화합물 A는 5-클로로-1-[(6-벤조티아졸일)술포닐]-1H-인돌-2-부탄산이다.

지방, 알코올, 바이러스 또는 화학 물질에 의해 야기된 만성 간 손상은 세포질 외 기질 과다-침전의 결과로 간 섬유화를 유발할 수 있는 콜라겐과 같은 많은 양의 세포질 외 기질을 분비하는 간 성상 세포의 활성화를 유도할 수 있다.

만성 신장 질환 (CKD)은 신장에 대한 다양한 상해의 결과로 정상 인구의 약 10%에 영향을 미친다. 이것은 간질 섬유증으로 특징되어 지어지는 진행성 과정이다. 상기 CKD 환자의 치료의 주요 목표는 CKD의 진행을 예방하거나 적어도 늦추는 것이다.

특발성 폐 섬유증 (IPF)으로도 불리는 폐 섬유증, 간질성 확산 폐 섬유증, 염증성 폐 섬유화 또는 섬유화 폐포는 염증성 폐 질환이고 그리고 폐포와 폐포 사이에 섬유 조직이 비정상적으로 형성되어 섬유화를 일으키는 염증 세포 침윤을 포함하는 폐포에 의해 유발된 폐포 사이의 비정상적인 형성을 특징으로 하는 이질적 그룹의 병태이다. IPF의 효과는 만성적이고, 진보적이며 그리고 때로는 치명적이다. 폐 섬유증에 대한 여러 연구에서 폐에서 일부 사이토카인의 지속적이고 증강된 발현이 염증 세포의 응집 및 세포질 외 기질 성분의 축적에 이어 폐 구조의 개조와 관련이 있음을 나타냈다. 특히, TNF-α 및 인터루킨 IL-1β와 같은 전염증성 사이토카인은 폐렴 및 폐 섬유증의 형성에 주요한 역할을 하는 것으로 나타났다. 부가하여, TGF-α 및 CTGF와 같은 프로피브로틱 사이토카인도 폐 섬유증의 발병 기전에 중요한 역할을 한다.

경피증은 소-혈관성 혈관 병증 및 면역-매개 섬유증으로 인해 두꺼운 피부와 다양한 정도의 기관 기능 장애를 유발하는 질환이다. 이 질병의 임상 증상은 극히 이질적이며 그리고 내부 장기의 침범 여부 및 정도에 따라 다르다. 환자는 국소화된 피부 섬유증(국소화된 경피증)에서 피부 및 내부 장기 침범을 포함한 전신 질환에 이르는 다양한 질병을 나타낼 수 있다. 국소성 경피증은 내부 장기가 관여하지 않는 다양한 형태의 피부 경화증을 포함한다. 이러한 형태의 경피증은 변형될 수 있지만 질병 활동을 통제하기 위한 전신 치료는 거의 필요하지 않다. 전신 경화증은 더욱이 피부와 기관의 침범 정도에 따라 두 가지 부분으로 나누어진다. 확산 전신성 경화증의 존재는 근위 사지, 몸통 및 얼굴에 광범위한 피부 경화증이 있음을 나타낸다. 제한된 전신 경화증이 있는 환자는 손, 전완, 발, 다리 및 얼굴에 섬유증이 제한된다. 확산과 제한된 전신 경화증은 내부 장기 침범과 관련이 있다; 그러나, 확산 전신성 경화증이 있는 환자는 임상적으로 유의성 있는 주요 장기 기능 이상의 위험이 높다. 제한된 전신 경화증이 있는 일부 환자는 더욱이 CREST 증후군을 갖는 것으로 분류될 수 있고, 석회증, 레이노 현상, 식도 운동 장애, 경증 및 피부 모세 혈관 확장을 수반할 수 있다. 경피증 사인 경화증은 피부 경화증이 없는 환자가 내부 장기에 혈관 및 섬유성 손상을 일으키는 드문 질환이다. 전신 경화증의 병태 생리는 혈관 손상과 섬유 아세포의 활성화를 포함하며 다양한 조직에서 콜라겐 및 기타 세포 외 단백질이 과잉 생산된다. 경피증은 면역 체계 활성화, 내피 기능 장애 및 섬유 아세포 활성의 증가로 특징되어 진다. 전신 경화증 발병으로 이어지는 정확한 발병 이벤트는 현재 알려지지 않았다. 인터류이킨-4 및 변형 성장 인자-베타(transforming growth factor-beta; TGF-β)를 포함한 여러 가지 사이토카인이 경피증 환자에서 섬유아세포 활성화에 관련되어 져 있다. 이들 사이토카인은 활성화된 면역 세포, 섬유아세포 및 내피 세포로부터 방출된다. 활성화된 섬유아세포는 피부 및 각종 내부 장기에서 구조적으로 정상적인 콜라겐 및 다른 세포질 외 기질 단백질을 정교하게 만든다.

본 발명은 pan-PPAR 작용제가 전술한 바와 같은 섬유증의 증상의 치료에 유익한 효과를 발휘한다는 발견에 기초한다. 본 발명의 내용에서, "pan-PPAR 작용제"라는 용어는 PPARα, PPARγ 및 PPARδ 수용체의 각각을 유의성 있게 활성화시키는 화합물, 즉 개별적으로 그의 각각의 EC50 값에 기초하여 PPARα 작용제, PPARγ 작용제 및 PPARδ 작용제로 간주되는 화합물을 의미하는 것으로 의도된다. 본 발명에 따르면, PPARα, PPARγ 및 PPARδ 수용체의 유의성 있는 활성화는 각각의 수용체에 대한 EC50이 ≤ 10^- ⁶M인 경우에 달성된다. 3개의 수용체 아형에 대한 EC50은 바람직하게 2차수 미만으로 상이하다 (즉, 2개의 수용체 아형에 대한 EC50의 비가 100 미만 또는 0.01 초과이다). 한 실시 형태에 있어서, pan-PPAR 작용제는 베자피브레이트가 아니다.

하나의 형태에 있어서, 본 발명은 따라서 섬유성 증상의 치료에 사용하기 위한 pan-PPAR 작용제를 제공한다.

일 실시 형태에 있어서, 섬유증 증상은 심장, 폐, 간, 신장, 위장관, 피부 등과 같은 섬유증을 유발할 수 있는 임의의 기관에 영향을 미치는 증상이다.

추가의 실시 형태에 있어서, 섬유증 증상은: 간 섬유증, 지방간 질환, 비-알코올성 지방성 간염, 만성 신장 질환, 폐 섬유증 장애, 전신 경피증으로부터 선택된다.

또 다른 실시 형태에 있어서, 섬유증 증상은 간 질환, 바람직하게는 간 섬유증, 지방간 질환 또는 비-알코올성 지방성 간염이다.

또 다른 실시 형태에 있어서, 섬유증 증상은 만성 신장 질환이다. 이 질환은 현저하게는 신병증(예를 들면 막성 신병증, 당뇨병성 신병증 및 고혈압 신병증), 사구체 신염 (예를 들면 막상 사구체 신염 및 급성 진행성 사구체 신염과 같은 막 사구 신피질 신염), 간질 신염, 루푸스 신염, 특발성 신증후군 (예를 들어, 최소 변화 신증후군 폐쇄성 병변 및 국소 분절성 사구체 경화증), 폐쇄성 폐색증, 다낭성 신장 질환 (예를 들어, 상염색체 우성 다낭성 신장 질환 및 상염색체 후낭성 다낭성 신장 질환) 및 신장 이식 거부 (예를 들어, 급성 및 만성 신장 거부 반응)로부터 선택된다.

또 다른 실시 형태에 있어서, 섬유증 증상은 폐 섬유증 장애, 바람직하게는 특발성 폐 섬유증이다.

더욱이 또 다른 실시 형태에 있어서, 섬유증 증상은 전신 경피증과 같은 피부 섬유증이다.

앞선 실시 형태 중 임의의 것과 조합될 수 있는 더욱이 또 다른 실시 형태에서, pan-PPAR 작용제는 경구 투여를 위한 것이다.

pan-PPAR 작용제는 투여용 약학 조성물로 제형화될 수 있다.

다른 측면에서, 본 발명은 따라서 본 발명의 제1 형태의 다양한 실시 형태에 있어서 상기한 바와 같은 섬유증의 증상의 치료에 사용하기 위한, 약제학적으로 허용되는 부형제와 함께 pan-PPAR 작용제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 일 실시 형태에 있어서, 상기 조성물은 치료적 유효량의 pan-PPAR 작용제를 포함한다. 본 발명과 관련하여, 용어 "치료적 유효량"은 원하는 효과를 제공하기에 충분한 양의 pan-PPAR 작용제를 의미한다. 궁극적으로, 주치의가 적절한 양과 용량을 결정한다.

또 다른 형태에서, 본 발명은 본 발명의 제1 형태의 다양한 실시 형태에 있어서 상기 기술된 바와 같은 섬유증 증상의 치료용 약제의 제조에서 pan-PPAR 작용제의 용도를 제공한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 치료적 유효량의 pan-PPAR 작용제를 이의 치료를 필요로 하는 대상자에게 투여하는 것을 포함하는, 본 발명의 제1 측면의 다양한 실시 형태에 있어서 상기 기재된 바와 같은 섬유증 증상를 치료하는 방법을 제공한다. 상기 대상자는 일반적으로 포유 동물, 바람직하게는 인간이다. 용어 "치료적 유효량"은 상기 언급된 것과 동일한 의미를 갖는다.

pan-PPAR 작용제는 일반적으로 하나 또는 그 이상의 약학적으로 허용 가능한 부형제와 조합하여 제제로서 투여될 것이다. 본 명세서에서 '부형제'라는 용어는 pan-PPAR 작용제 이외의 임의의 성분을 설명하기 위해 사용된다. 부형제의 선택은 특정 투여 방식, 용해도 및 안정성에 대한 부형제의 효과 및 투여 형태의 성질과 같은 요인에 크게 좌우될 것이다.

pan-PPAR 작용제의 전달에 적합한 약학적 조성물 및 이의 제조 방법은 당업자에게 바로 명백할 것이다. 이러한 조성물 및 그의 제조 방법은 예를 들어 본원에 참고로 인용된 Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th Edition (Mack Publishing Company, 1995)에서 찾을 수 있다.

경구 투여

pan-PPAR 작용제는 경구 투여될 수 있다. 경구 투여는 화합물이 위장관 및/또는 협측, 설하로 들어가도록 삼키는 것 또는 화합물이 입으로부터 직접 혈류로 들어가는 설하 투여를 포함할 수 있다. 경구 투여에 적합한 제제는 고체, 반고체 및 액체 계, 예를 들어 정제; 다-입자 또는 나노-입자, 액체 또는 분말을 함유하는 연질 또는 경질 캡슐; 로젠지 (액체로 채워진 것을 포함); 츄윙; 겔; 빠른 분산 복용 형; 막; 배주; 스프레이; 및 협측/점막 접착 패치를 포함한다.

액체 제제는 현탁액, 용액, 시럽 및 엘릭서를 포함한다. 이러한 제제는 연질 또는 경질 캡슐 (예를 들어, 젤라틴 또는 히드록시프로필메틸셀룰로즈로 제조됨)의 충전제로서 사용될 수 있으며, 전형적으로는 담체, 예를 들어 물, 에탄올, 폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 메틸 셀룰로즈 또는 적합한 오일 및 하나 이상의 유화제 및/또는 현탁제를 포함할 수 있다. 액체 제제는 또한 고체, 예를 들어 작은 봉지로부터의 재구성에 의해 제조될 수 있다.

정제 또는 캡슐 투여 형태의 경우, 투여량에 의존하여, 약물은 투여 형태의 1 중량 % 내지 80 중량 %, 보다 전형적으로 투여 형태의 5 중량 % 내지 60 중량 %를 구성할 수 있다. 약물 이외에, 정제는 일반적으로 붕해제를 함유한다. 붕해제의 예는 나트륨 전분 글리콜레이트, 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스, 칼슘 카르복시메틸 셀룰로오스, 크로스카멜로스 나트륨, 크로스포비돈, 폴리비닐 피롤리돈, 메틸 셀룰로오스, 미세결정 셀룰로오스, 저급 알킬-치환된 하이드록시 프로필 셀룰로오스, 전분, 예비 젤라틴화 전분 및 알긴산 나트륨을 포함한다. 일반적으로, 붕해제는 투여 형태의 1 중량 % 내지 25 중량 %, 바람직하게는 5 중량 % 내지 20 중량 %를 포함할 것이다.

결합제는 일반적으로 정제 제형에 응집성을 부여하기 위해 사용된다. 적합한 결합제는 미정질 셀룰로오스, 젤라틴, 당, 폴리에틸렌 글리콜, 천연 및 합성 검, 폴리비닐 피롤리돈, 예비 젤라틴화 전분, 히드록시 프로필 셀룰로오스 및 히드록시프로필 메틸셀룰로오스를 포함한다. 정제는 또한 락토오스 (일수화물, 분무-건조 일수화물, 무수물 등), 만니톨, 자일리톨, 덱스트로스, 수크로스, 소르비톨, 미세 결정질 셀룰로스, 전분 및 이염기성 인산 칼슘 이수화물과 같은 희석제를 함유할 수 있다.

정제 또는 캡슐은 임의로 계면 활성제, 예컨대 소듐 라우릴설페이트 및 폴리 소르베이트 80, 및 활택제, 예컨대 이산화규소 및 탈크를 포함할 수도 있다. 존재하는 경우, 계면 활성제는 정제의 0.2 중량 % 내지 5 중량 %를 포함할 수 있고, 활택제는 정제의 0.2 중량 % 내지 1 중량 %를 포함할 수 있다.

정제는 또한 일반적으로 마그네슘 스테아레이트, 칼슘 스테아레이트, 아연 스테아레이트, 나트륨 스테아릴 푸마레이트 및 마그네슘 스테아레이트와 소듐 라 우릴 술페이트의 혼합물과 같은 윤활제를 함유한다. 윤활제는 일반적으로 정제의 0.25 중량 % 내지 10 중량 %, 바람직하게는 0.5 중량 % 내지 3 중량 %를 포함할 수 있다.

가능한 다른 성분에는 항산화제, 착색제, 향료, 방부제 및 맛-차폐제를 포함한다.

예시적인 정제는 약 80 중량 %까지의 약물, 약 10 중량 % 내지 약 90 중량 %의 결합제, 약 0 중량 % 내지 약 85 중량 %의 희석제, 약 2 중량 % 내지 약 10 중량 %의 붕해제 및 약 0.25 중량 % 내지 약 10 중량 %의 윤활제를 함유한다.

정제 혼합물은 정제를 형성하기 위해 직접적으로 또는 롤러에 의해 압축되어 질 수 있다. 정제 블렌드 또는 블렌드의 일부는 타정 전에 습식-, 건식- 또는 용융-과립화, 용융 응결화 또는 압출될 수 있다. 최종 제제는 하나 이상의 층을 포함 할 수 있고 코팅되거나 코팅되지 않을 수 있다; 심지어 이것은 캡슐화되어 질 수도 있다.

비경구 투여

pan-PPAR 작용제는 또한 혈류, 근육 또는 내부 기관으로 직접적으로 투여될 수 있다. 비경구 투여를 위한 적합한 수단은 정맥 내, 동맥 내, 복강 내, 뇌척수 내, 심실 내, 요도 내, 흉골 내, 두개 내, 근육 내, 활액 내 및 피하를 포함한다. 비경구 투여에 적합한 장치는 바늘 (마이크로 바늘 포함함) 주사기, 무-바늘 주사기 및 주입 기술을 포함한다.

비경구 제제는 전형적으로 염, 탄수화물 및 완충제 (바람직하게는 3 내지 9의 pH)와 같은 부형제를 함유할 수 있는 수용액이지만, 그러나 예를 들어 일부 용도에 있어서 이들은 보다 적절하게는 멸균 비-수용액으로 또는 무균, 발열원-없는 물과 같은 적합한 비히클과 함께 조합되어 사용되어 지는 건조된 형태로 될 수 있다.

멸균 조건, 예를 들어, 동결 건조에 의한 비경구 제형의 제조는 당업자에게 공지된 표준 약학 기술을 사용하여 용이하게 달성될 수 있다.

비경구 용액의 제조에 사용되는 pan-PPAR 작용제의 용해도는 SMEDDS (Self Micro Emulsifying Drug Delivery System)와 같은 기술 또는 용해도 증강제의 혼입과 같은 적절한 제제 기술의 사용에 의해 증가될 수 있다.

비경구 투여용 제형은 즉시 방출 및/또는 변형 방출로 제형화 될 수 있다. 변형 방출 제형은 지연-, 지속-, 펄스-, 제어-, 표적화 및 프로그램된 방출을 포함한다. pan-PPAR 작용제는 활성 화합물의 변형된 방출을 제공하는 이식된 저장소로서 투여하기 위한 현탁액으로서 또는 고체, 반-고체 또는 요변성 액체로서 제형화 될 수 있다. 이러한 제제의 예는 약물-코팅된 스텐트 및 약물-함유 폴리(dl-락틱 -코글리콜) 산 (PGLA) 미세구를 포함하는 반-고체 및 현탁액을 포함한다.

흡입/ 비내 투여

pan-PPAR 작용제는 코 안으로 또한 전형적으로 건조 분말 (단독으로, 혼합물, 예를 들어, 락토스와의 건조블렌드로, 또는 혼합된 성분 입자로서, 예를 들어, 포스파티딜콜린과 같은 포스포리피드와 혼합되는 것의 어느 하나로)의 형태로, 흡입에 의해, 압축된 용기, 펌프, 분무기, 어토마이저 (바람직하게는 미세 미스트를 생성하기 위해 전기유체역학을 사용하는 어토마이저)로부터 에어로졸 스프레이와 같은 건조 분말 흡입기 또는 1,1,1,2-테트라플루오로에탄 또는 1,1,1,2,3,3,3-헵타플루오로프로판과 같은 적합한 추진제의 사용 또는 사용 없이 분무기, 또는 점비액으로 투여될 수 있다. 비강 내 사용을 위해, 분말은 생체 접착제, 예를 들어, 키토산 또는 사이클로덱스트린을 포함할 수 있다.

가압 용기, 펌프, 스프레이, 어토마이저 또는 분무기는 예를 들어 에탄올, 수성 에탄올 또는 활성제의 분산, 가용화 또는 방출 연장을 위한 적합한 대체 제제, 올리틴산 또는 올리고 락트산과 같은 임의의 계면 활성제를 포함하는 pan-PPAR 작용제의 용액 또는 현탁액을 함유한다.

건조 분말 또는 현탁액 제제에 사용하기 전에, 약물 제품은 흡입에 의한 전달에 적합한 크기(전형적으로 5마이크론 미만)로 미세화된다. 이는 나선형 제트 밀, 유동층 제트 밀링, 나노 입자를 형성하기 위한 초임계 유체 처리, 고압 균질화 또는 분무 건조와 같은 임의의 적절한 분쇄 방법에 의해 달성 될 수있다.

흡입기 또는 취입기에 사용하기 위한 캅셀 (예를 들어, 젤라틴 또는 히드록시프로필메틸셀룰로즈로 제조됨), 블리스터 및 카트리지는 pan-PPAR 작용제, 락토오스 또는 전분과 같은 적합한 분말 기제 및 성능 개질제 예컨대 l-류신, 만니톨, 또는 마그네슘 스테아레이트의 분말 혼합물을 함유하도록 제제화될 수 있다. 락토스는 무수물이거나 일수화물 형태일 수 있으며, 바람직하게는 일수화물 형태일 수 있다. 다른 적합한 부형제는 덱스트란, 글루코오스, 말토스, 소르비톨, 자일리톨, 프룩토스, 슈크로스 및 트레할로스를 포함한다.

미세한 미스트를 생성하기 위해 전기유체역학을 이용하는 어토마이저에 사용하기에 적합한 용액 제제는 작동 당 1μg 내지 20mg의 pan-PPAR 작용제를 함유할 수 있으며, 작동 부피는 1μl 내지 100μl에서 변할 수 있다. 전형적인 제제는 pan-PPAR 작용제, 프로필렌 글리콜, 멸균수, 에탄올 및 염화나트륨을 포함할 수 있다. 프로필렌 글리콜 대신에 사용될 수 있는 대안적인 용매는 글리세롤 및 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다.

멘톨 및 레보멘톨과 같은 적합한 향미제 또는 사카린 또는 사카린 나트륨과 같은 감미료가 흡입/비내 투여용을 위해 본 발명의 제제에 첨가될 수 있다.

흡입/비강 내 투여를 위한 제제는 예를 들어 PGLA를 사용하여 즉시 및/또는 변형 방출로 제형화 될 수 있다. 변형 방출 제형은 지연-, 지속-, 펄스-, 제어-, 표적화 및 프로그램된 방출을 포함한다.

건조 분말 흡입기 및 에어로졸의 경우에 있어서, 투여량 단위는 계량된 양을 전달하는 밸브에 의해 결정되어 진다. 본 발명에 따른 단위는 전형적으로 1μg 내지 10mg의 pan-PPAR 작용제를 함유하는 계량 투여량 또는 "퍼프 (puff)"를 투여하도록 배열되어 진다. 전반적인 1일 투여량은 전형적으로 1㎍ 내지 200㎎ 범위일 것이며, 이는 단일 투여로, 또는 보다 통상적으로 하루 동안 분할 투여량으로 투여될 수 있다.

국소 투여

pan-PPAR 작용제는 또한 피부 또는 점막에 국소적으로, 피부 (내로) 또는 경피적으로 투여될 수 있다. 이 목적을 위한 일반적인 제제는 젤, 하이드로 겔, 로션, 용액, 크림, 연고, 분말, 드레싱, 폼, 필름, 피부 패치, 웨이퍼, 임플란트, 스폰지, 섬유, 붕대 및 마이크로 유제가 포함한다. 리포좀이 또한 사용되어 질 수도 있다. 전형적인 담체는 알코올, 물, 광유, 액체 바셀린, 백색 바셀린, 글리세린, 폴리에틸렌 글리콜 및 프로필렌 글리콜을 포함한다. 침투 강화제가 혼입될 수도 있다.

국소 투여의 다른 수단은 전기 천공법, 이온 삼투압법, 음파 영동법, 초음파 도입법 및 미세 바늘 또는 니들-프리 (예를 들어, Powderject™, Bioject™ 등) 주사에 의한 전달을 포함한다.

국소 투여용 제제는 즉각적이고 및/또는 변형 방출이 되도록 제형화 될 수 있다. 변형된 방출 제형은 지연-, 지속-, 펄스-, 제어-, 표적화 및 프로그램된 방출을 포함한다.

구강 및 비경구 투여는 섬유성 중상의 유형에 관계없이 적합하다. 국소 투여는 섬유증 증상 예를 들어, 전신 경피증일때 적합하다. 흡입/비강 내 투여는 섬유증 증상이 예를 들어 폐 섬유증 또는 전신 경피증인 경우에 적합하다.

경구 투여의 경우, pan-PPAR 작용제는 약 100mg 내지 약 3,000mg/일 범위, 바람직하게는 약 500mg 내지 약 3,000mg/일 범위의 투여량 수준으로 환자에게 투여 될 수 있다. 1일 총 용량은 1회 또는 분할 투여로 투여될 수 있다. 본 발명에 따른 약제 학적 조성물은 전형적으로 약 100 내지 약 1000mg의 pan-PPAR 작용제, 예컨대 100, 200, 500, 750 또는 1000mg의 pan-PPAR 작용제를 함유할 수 있다.

전형적으로 1% 메틸 셀룰로스 용액 및 1% 메틸 셀룰로오스 + 0.5% 폴록사머 중의 pan-PPAR 작용제의 현탁액이 제조되었다. 25, 50 또는 200mg의 pan-PPAR 작용제를 함유하는 캡슐을 또한 제조되었다. pan-PPAR 작용제가 30%/70% w/w PEG400/ 0.05M 인산염 완충액, pH 8 (25-100 μg/ml)에 용해되는 IV 제형이 또한 제조되었다.

본 발명의 임의 형태의 임의의 이전 실시 형태와 조합될 수 있는 또 다른 실시 형태에 있어서, pan-PPAR 작용제는 5-클로로-1-[(6-벤조티아졸일)설포닐] ( "화합물 A"로도 언급됨)을 포함한다. 화합물 A 및 그의 제조 방법은 WO 2007/026097에 기재되어 있다. 화합물 A는 PPARα, PPARγ 및 PPARδ 수용체의 각각을 활성화시키는 것으로 밝혀졌다. 화합물 A는 그것의 약학적으로 허용 가능한 염 또는 용매화물 중 하나의 형태로 본 발명과 관련하여 사용될 수 있다. 용어 '용매화물'은 본원에서 화합물 A 및 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 용매 분자, 예를 들어 에탄올을 포함하는 분자 복합체를 기술하기 위해 사용되어 진다. 용어 '수화물'은 상기 용매가 물일 때 사용되어 진다. 화합물 A의 약학적으로 허용되는 염은 그의 산 부가 염기 및 염기를 포함한다.

적합한 산 부가 염은 무독성 염을 형성하는 산으로부터 형성된다. 예는 아세테이트, 아디페이트, 아스파테이트, 벤조에이트, 베실레이트, 비카보네이트/카보네이트, 비설페이트/설페이트, 붕산염, 캄실레이트, 시트레이트, 사이클라메이트, 이데실레이트, 에실레이트, 포르메이트, 글루세네이트, 글루코네이트, 글루쿠로네이트, 헥사플루오로포스페이트, 히벤츠에이트, 하이드로클로라이드/클로라이드, 하이드로브로마이드/브로마이드, 하이드로요다이드/요다이드, 이세티오네이트, 말테이트, 말레이트, 말레에이트, 말로네이트, 메실레이트, 메틸술페이트, 나프틸레이트, 2-나프실레이트, 니코티네이트, 니트레이트, 오로테이트, 옥살레이트, 팔미테이트, 파모에이트, 인산염/인산염 수소/인산염 이수소, 피로글루탐산염, 사카레이트, 스테아린산 염, 숙신산 염, 탄산염, 타르타르산 염, 토실산 염, 트리플루오로 아세트산 염 및 크시노포에이트 염을 포함한다.

적합한 염기 염은 무독성 염을 형성하는 염기로부터 형성된다. 예는 알루미늄, 아르기닌, 벤자틴, 칼슘, 콜린, 디에틸아민, 디올아민, 글리신, 라이신, 마그 글루민, 올아민, 칼륨, 나트륨, 트로메타민 및 아연 염을 포함한다.

산 및 염기의 반 염기가 또한 형성될 수 있고, 예를 들어 헤미설페이트 및 헤미칼슘 염이다.

화합물 A의 약학적으로 허용되는 염은 3가지 방법 중 하나 또는 그 이상에 의해 제조될 수 있다:

(i) 화합물을 목적하는 산 또는 염기와 반응시킴으로써;

(ii) 화합물의 적합한 전구체로부터 산- 또는 염기-불안정성 보호기를 제거하거나, 또는 목적하는 산 또는 염기를 사용하여 적합한 고리 전구체, 예를 들어, 락톤 또는 락탐을 개환하여; 또는

(iii) 적합한 산 또는 염기와의 반응에 의해 또는 적합한 이온 교환 컬럼에 의해 화합물의 하나의 염을 다른 염으로 전환시킴으로써 수행될 수 있다.

세 가지 반응은 모두 일반적으로 용액에서 수행된다. 생성된 염은 침전되어 여과에 의해 수집되거나 용매의 증발에 의해 회수될 수 있다. 생성된 염의 이온화 정도는 완전 이온화에서 거의 비이온화로 다양할 수 있다.

본 발명은 하기 실시예에 의해 예시되어 진다.

실시예 1: 마우스에서 사염화탄소-유도 간 섬유화의 전개에 대한 화합물 A의 효과, 및 공지된 PPARγ 작용제와의 비교

사염화탄소(CCl₄)가 마우스 모델에서 콜라겐 침착 및 간 섬유증을 유도하는, 간세포 미토콘드리아 기능 장애 및 산화 스트레스를 유도한다는 보고가 있다 (Yao T et al., Am J Physiol., 1994 Sep; 267 (3 Pt 1) : G476-84). 따라서 화합물 A와 PPAR δ 작용제 알려진, 로지글리타존의 효과가 CCl₄-유도 간 섬유화의 뮤어라인 모델에서 평가되었다.

마우스를 2가지 상이한 투여량 (30 및 100 mg/kg/일)으로 화합물 A 및 PPARγ 대조 화합물인 로지글리타존 (5 mg/kg/일)으로 22일 동안 매일 경구로 처리하였다. 치료가 끝나면 동물을 희생시키고 혈장 샘플과 간을 수확했다. 간 염증 및 섬유화에 관여하는 것으로 알려진 유전자의 콜라겐 침착 및 발현을 정량화하고 일부 관련 혈장 바이오 마커를 측정하였다.

22일 동안 비히클로 구강으로 처리된된 CCl₄-노출된 마우스는 간 조직에서 콜라겐 수준이 통계적으로 유의성 있게 증가하는 것으로 나타난 바와 같이 간 섬유화를 나타내었다. 화합물 A를 사용한 치료는 간 섬유화를 각각 80% (30mg/kg/day)와 89% (100mg/kg/day)로 현저하게 감소시켰으며 많은 관련 마커를 향상시켰다. 로지글리타존 치료는 대부분의 마커가 변하지 않았거나 악화된 경우에만 간 섬유화를 54%까지 감소시켰다.

재료 및 방법

실험은 실험 초기에 체중이 21-24g인 56마리의 수컷 C57BL/6J 마우스 (JANVIER LABS, C.S. 4105, Saint-Berthevin, France)를 사용하여 수행되었다. 표준 조건: 실온 (22 ± 2℃), 습도 측정 (55 ± 10%), 명암주기 (12h/12h) , 공기 보충 (15-20 시간 / 시간), 물과 음식 (SDS, RM1)을 자유롭게 사용할 수 있는 조건하에서 폴리프로필렌 케이지(바닥 면적 = 1032㎠)에 3 내지 10마리의 군으로 동물이 수용되었다. 마우스는 실험 전에 적어도 5일 동안 익숙해 질 수 있었다. 마우스는 지울 수 없는 마커를 사용하여 꼬리를 표시함으로써 번호가 매겨졌다.

화합물 A (3mg/mL 및 10mg/mL)와 로시글리타존 (0.5mg/mL)의 즉시 사용 가능한 현탁액이 5 ± 3℃에서 보관되었다. 비히클(메틸 셀룰로오스 400cP 1% + 0.1% Poloxamer 188)의 사용 가능한 현탁액 또한 5 ± 3℃에서 보관되었다. 사염화탄소 (CCl₄) (Sigma Chemical 사, Saint Quentin Fallavier, France)를 해바라기 유(v/v, 1/11)에 매일 투약하여 신선하게 제조되었다.

복용

마우스는 다음 그룹에 할당되었다:

1. 해바라기 유 (3주 동안 주 2회, ip) / 비히클 (하루 22회 po), n = 7,

2. 해바라기 유 (1주일에 2회 3주간), 화합물 A (하루에 100mg/kg/day, 하루 22 일간), n = 8,

3. 해바라기 유 (1주일에 2회 3주간) / 로시글리타존 (5mg/kg/d) (n = 8),

4. CCl₄ (3.5 mL/kg, 1주일에 2회 3주, ip) / 비히클 (하루 22회 po), n = 8,

5. CCl₄ (3.5 mL/kg, 1주일에 2회 3주, ip) / 화합물 A (30 mg/kg/d, 22일 동안 1일 1회, po), n = 8,

6. CCl₄ (3.5 mL/kg, 1주일에 2회 3주, ip) / 화합물 A (하루 100mg/kg/day, 22일 동안 1일 1회), n = 7,

7. CCl₄ (3.5 mL/kg, 1주일에 2회 3주, ip) / 로지글리타존 (5 mg/kg/d 하루 22회 po), n = 8.

3주간 동안 1주일에 2일, 마우스는 100μL의 CCl₄ (해바라기 유 내에 3.5mL/kg (v/v, 1/11)) 또는 100μL의 해바라기 유의 어느 하나가 아침에 복강 내 투여되었다. 병행하여, 마우스는 비히클, 화합물 A 또는 로시글리타존으로 22일 동안 매일(0일 내지 21일) 경구 투여되었다. 비히클, 화합물 A 또는 로지글리타존 및 CCl₄의 부수적인 투여와 함께, 비히클, 화합물 A 또는 로지글리타존을 해바라기 오일 또는 CCl₄ 투여 6시간 전에 투여하였다. 시험 화합물의 투여량은 경구 투여의 경우 10㎖/kg 체중이었다.

말단 혈액 샘플링

21일째에, 투여 2시간 후, 동물은 펜토바비탈 (60 mg/kg, ip)로 마취되고 심장 펀쳐를 이용하여 혈액을 수집하였다. 정확한 투여 시간과 샘플 수집 시간은 각 동물 별로 기록되었다. 혈액 샘플링 (총 혈액 0.9mL)을 미리 냉각시킨 2mL 리튬-헤파린 수집 튜브에 넣었다. 혈액 샘플은 부드럽게 혼합되고 분쇄된 얼음에 놓고 약 + 4℃에서 약 1500 x g에서 10분 동안 샘플린의 30분 내에 원심 분리되었다. 각 혈액 샘플링을 위해, 생성된 혈장을 2개의 분취 량 (각 100μL 이상)으로 분리하고 일회용 플라스틱 물질을 사용하여 폴리프로필렌 튜브로 옮겼습니다. 샘플을 곧 바로 직립 위치에서 -20℃로 유지되는 냉동실로 옮겼다.

말단 혈액 채취 후, 간 조직을 제거하였다:

- 첫 번째 조직 샘플 (약 50mg)을 수거하고 5 ± 3℃에서 파라포름 알데히드로 고정하고,

- 두 번째 조직 샘플 (200mg)을 액체 질소에서 동결시키고 -20℃에서 유지함.

측정된 파라미터

콜라겐

콜라겐을 정량하기 위해, 절편은 Picro-Sirius red로 염색되고 Maye's 헤마톡실린으로 대조 염색되었다. 모든 슬라이드를 디지털화하고 3개의 다른 섹션의 5개의 중첩되지 않는 필드를 이미지 J 소프트웨어 (버전 1.42, N.I.H., USA)를 사용하여 무작위로 분석하였다. 모든 슬라이드에 대해 분석은 엄격하게 동일한 조건에서 단일 실험자에 의해 수행되었습니다.

유전자 발현

mRNA 추출은 작은 냉동 간 샘플 (50-100mg)에서 수행되었다. 간단히, 샘플은 몰타르와 유봉으로 저온 절삭되었다. 이어서, 샘플은 Retsch MM300 장치에서 마블(2X5mn) 및 1ml의 Qiazol 용해 시약 (Qiagen Ref 79306)을 사용하여 균질화되었다. 제조사의 지시에 따라 Qiagen Rneasy 지질 키트 (Ref 74804)를 사용하여 간 균질 액에서의 RNA 추출을 완료했다. RNA 양은 Nanodrop (ND2000 Thermo Scientific)으로 측정하고 RNA 품질은 Bioanalyzer (2100 Agilent Technology)로 확인되어 졌다.

무작위-프라이밍 cDNA 합성은 제조사의 지시에 따라 Iscript 키트 (BIORAD ref 170-8891)를 사용하여 100ng 총 RNA에서 수행되었다. 실시간 PCR은 Iq ITaq SYBR Green Universal Rox (Ref 1725124 Biorad)를 사용하고 전용 QPCR 프라이머를 사용하여 ABI Prism 7900 서열 검출 시스템 (APPLIED BIOSYSTEMS)상에서 7.5 ng RNA 등가물로 수행하였다. 일부 mRNA 전사체에 대해, 형광 염색 FAM으로 표지하고 Universal PCR MasterMix No AmpErase UNG (APPLIED BIOSYSTEMS ref 4324020)를 사용하여 TaqMan 프로브를 사용하여 정량을 수행했다. 분석에 사용된 프라이머는 다음 표에 열거되어 있다:

실시간 PCR은 ABI PRISM 7900 장치에서 수행되었다. ABI7900에서 원 데이터를 텍스트 형식으로 내보냈다. 분석은 Excel에서 수행되었고, 상대적인 양의 전사물은 정규화를 위한 하우스 키핑 유전자로서 Rplp0 및 참고 대조로서 비처리 동물 (비히클 그룹)로부터의 평균 데이터를 사용하여 "Delta Delta CT 방법"(Livak et al. Methods 2001)을 사용하여 계산되었다. 각각의 RNA 샘플을 역전사하고 3중으로 정량화하였다.

간 바이오마커

간 단백질 추출 프로토콜:

T-PER®로 추출: 조직 단백질 추출 시약, prod# 78510 (lot : NG174004), Halt Protease Inhibitor Single-Use Cocktail, EDTA-무 (100X) - Prod # 78425 - Lot # NL178051 서모 피셔로 서모 사이언티픽.

간과 상층액의 샘플은 모든 실험 동안 얼음에 보관되었다. 추출을 위해, 제조 업체는 100μl T-Per + 1μl "Halt-protease"(100X)에 대해 10mg의 조직을 권장한다.

50㎖의 T-Per 완충액을 제조하고, "Halt-protease"(100X) 500㎕를 첨가하고, 혼합물을 얼음 상에 유지시켰다. 바로 해동한 간 50 내지 70mg의 샘플을 칭량하고 작은 조각으로 절단하고, 차가운 PBS 1ml를 첨가하여 조직을 세척하였다. 혼합물을 4℃에서 5분 동안 500g에서 원심 분리하고, 상등액을 버렸다. T-Per + 항 프로테아제 (100X) 100 ㎕/10mg을 첨가하여 Potter로 위 또는 아래로 5 또는 6개의 꼬임으로 간을 분쇄하였다. 혼합물을 4℃에서 5분 동안 10000g에서 원심 분리하였다. 상청액을 제거하고, 분주하고, 바이오마커의 후속 측정을 위해 -20℃로 유지하였다. MOS : Bip-03-062-01 (Kit BCA - Pierce BCA protein assay kit - Pierce Thermo scientific, Ref: 23225)에서 기술된 절차에 따라 H₂O mq에서 희석 1/10일 후 BCA 기술에 의해 단백질을 투여하기 위해 10㎕의 샘플이 사용되었다.

모든 단백질은 제조자의 지시에 따라 ELISA 키트로 정량화되었다:

TIMP-1: Mouse TIMP-1, R&D SYSTEMS®, Ref: TM100

TGF-β1: Quantikine Mouse/Rat/Porcine/Canine TGF-β1 immunoassay, R&D SYSTEMS®, ref: MB100B

데이터 처리 및 통계적 분석

모든 변수는 Graphpad 소프트웨어 (버전 5.1)를 사용하여 분석되었다. 변수는 다음과 같이 분석되었다:

- 실험 (CCl₄의 효과)을 검증하기 위해 그룹 1 대 그룹 4를 비교하기 위해 독립적인 샘플에 대한 스튜던트 t 검정을 사용,

- 화합물 A 또는 로지글리타존 단독의 효과를 조사하기 위해 그룹 1 대 그룹 2 및 그룹 1 대 그룹 3을 비교하기 위해 독립적인 샘플에 대한 스튜던트 t 검정을 사용,

- CCl₄-유도된 간 섬유화에 대한 화합물 A의 영향을 조사하기 위해 그룹 4 대 화합물 A 처리 그룹 (5, 6)을 비교하기 위해 일원 분산 분석 (one-way ANOVA)을 사용. ANOVA가 중요한 것으로 밝혀지면서, Dunnett의 테스트가 사용되었음,

- CCl₄-유도된 간 섬유화에 대한 로지글리타존의 효과를 조사하기 위해 그룹 4 대 로지글리타존 처리-그룹 (그룹 7)을 비교하기 위해 독립적인 샘플에 대한 스튜던트 t 검정을 사용.

도 1 내지 7에서, *는 p-값 <0.05를 나타내고; **는 p-값 <0.01을 나타내고; ***은 p-값 <0.001을 나타낸다.

결과

1/ 플라즈마 트리글리세라이드

CCl₄-노출된 마우스에서, 화합물 A (30 및 100 mg/kg/day)는 비히클에 비해 혈장 트리글리세라이드를 유의하게 감소시켰으며 (p <0.05 및 p <0.01), 로시글리타존은 혈장 트리글리세라이드를 유의성 없이 증가시켰다(도 1).

2/ 콜라겐 침착

CCl₄-노출된 마우스에서 화합물 A (30 및 100 mg/kg/day)는 비히클에 비해 콜라겐 수치를 유의하게 감소시켰으며 (각각 -80 %, p <0.01 및 -89 %, p <0.001), 로시글리타존은 콜라겐 수치를 유의하게 감소시켰다 (-54 %, p <0.05) (도 2).

3/ TGFβ -1 발현

로시글리타존이 TGFβ-1의 발현을 유의하게 증가시키는 반면, CCl₄-노출된 마우스에서 화합물 A (30 및 100 mg/kg/day)는 비히클에 비해 TGFβ-1의 발현을 유의하게 억제했다 (p <0.01 및 p <0.001) (p <0.001) (도 3).

4/ 콜라겐 I 형, 알파 I ( Col1a ) 발현

CCl₄-노출된 마우스에서 화합물 A (30 및 100 mg/kg/day)는 비히클에 비해 Col1a의 발현을 유의하게 억제했지만 (p <0.05 및 p <0.001), 로시글리타존은 Col1a의 발현을 유의성없이 증가시켰다 (도 4).

5/ α- SMA 발현

CCl₄-노출된 마우스에서 화합물 A (100 mg/kg/day)는 비히클에 비해 α-SMA의 발현을 억제하였으나 로시글리타존은 α-SMA의 발현을 유의하게 증가시키지 않았다 (도 5).

6/ MCP -1 발현

CCl₄-노출된 마우스에서 화합물 A (100 mg/kg/day)는 비히클에 비해 MCP-1의 발현을 유의하게 억제하였지만 (p <0.05), 로시글리타존은 효과가 없었다 (도 6).

7/ 피브로넥틴 발현

CCl₄-노출된 마우스에서 화합물 A (30 및 100 mg/kg/day)는 비히클 (p <0.001)에 비해 피브로넥틴의 발현을 유의하게 억제했지만 로시글리타존은 의미있게 도달하지 않고 피브로넥틴의 발현을 증가시켰다 (도 7).

상기 결과는 수컷 C57BL/6J 마우스에서 화합물 A (30 또는 100 mg/kg/일)를 22일 동안 경구 투여하면 CCl₄-유도된 간 섬유화가 감소됨을 보여준다. 용량 의존적인 효과가 화합물에 의해 얻어졌으며 100mg/kg/일의 화합물 A에서 콜라겐 수준의 최대 90% 감소가 관찰되었으며 관련 마커의 대부분이 유의하게 개선되었다. 대조적으로, 로시글리타존은 다른 마커에 영향을 미치지 않으면서 보다 덜 현저한 효과를 보였다.

실시예 2 : 마우스에서의 항- GBM 유도된 사구체 신염의 전개에 대한 화합물 A의 효과 및 공지된 PPARα 작용제 및 공지된 ICE와의 비교.

마우스에서 항-GBM (사구체 기저 멤브레인) 유도 사구체 신염은 CKD에 대한 새로운 화학 물질의 잠재력을 평가하기 위해 생체 내 모델에서 일반적으로 사용된다. 화합물 A, 로지타글리타존 및 피오글리타존 (PPARδ 작용제로 알려짐)과 캡토프릴(공지된 ICE - (안지오텐신) 전환 효소에 대한 억제제)의 효과가 따라서 이러한 모델에서 평가되었다.

두 가지 다른 용량 (30 및 100 mg/kg/day)에서 화합물 A, PPARγ 대조 화합물인 로지타글리타존 (3 mg/kg/day)과 피오글리타존 (30 mg / kg) 및 참조 ICE 화합물인 캡토프릴 10 mg/kg/day으로 7일 동안 매일 마우스에 투여했다. 처리가 끝나면, 동물을 희생시키고 혈장 샘플과 신장을 수확했다. CKD에 연루되어있는 것으로 알려진 유전자의 발현을 정량화하고 혈장 수준의 신장 매개 변수를 측정하였다.

7일간 비히클로 경구 투여한 항-GBM 노출 마우스는 비뇨기 요소, 알부민뇨, 신장 오스테오폰틴, 신장 MCP-1 단백질 수준, Col1 및 Col3 mRNA 발현이 비히클에 비해 통계적으로 유의하게 증가하는 것으로 나타내므로 사구체 신염 및 섬유증을 나타내었다. 7일 동안 화합물 A를 30 및 100 mg/kg/일로 처리하면 비뇨기 요소, 알부민뇨, 신장 오스테오폰틴, 신장 MCP-1 수준, Col1 및 Col3 mRNA 발현이 비히클 (100 mg/kg/day의 유의 수준)과 비교되었다. 대조적으로, 캡토프릴은 요로 요소, 알부민뇨, 신장 오스테오폰틴, 신장 MCP-1 단백질 수준에서 화합물 A와 유사한 효과를 보였으나 Col1 및 Col3 발현을 유의적으로 감소시키지 않았다; 그러나 로시글리타존과 피오글리타존은 비히클에 비해 신장 오스테오폰틴과 신장 MCP-1 수치가 유의하게 증가했다.

재료 및 방법

실험 초기에 8-10 주령인 암컷 C57BL/6J 마우스 (CERJ Janvier, route des Ch?nes secs, Le Genest Saint Isle - France)를 사용하여 실험이 수행되었다. 동물을 무작위로 폴리프로필렌 박스 (바닥 면적 = 1032㎠)에 3 내지 4의 그룹으로 무작위로 할당하였다. 마우스는 개별적으로 귀에 표시했다. 동물들은 실내 온도 (22 ± 2℃), 습도 측정 (55 ± 10%), 명암 사이클 (12h/12h), 공기 치환 (15-20부피/시간), 물과 음식 (SDS, RM1)을 자유롭게 섭취의 표준 조건 하에서 실험을 하기 전에 일주일 동안 익숙해지도록 되었다.

비히클 [1% Methylcellulose (METOLOSE SM400, 400Cps) + 0.1% 폴록사머 188] 내 화합물 A(각각 30 mg/kg 및 100 mg/kg의 용량에 상응하는, 3mg/mL 및 10 mg/mL)의 즉시 사용 가능한 현탁액이 사용할 때까지 5℃에서 보관되었다.

비히클 내 로지글리타존 (3 mg/kg의 용량에 상응하는 0.3 mg/mL)의 즉시 사용할 수 있는 현탁액이 사용할 때까지 5℃에서 보관되었다.

비히클 내 피오글리타존 (30 mg/kg의 용량에 상응하는 3 mg/mL)의 즉시 사용할 수 있는 현탁액이 사용할 때까지 5℃에서 보관되었다.

비히클 내 캡토프릴 (10 mg/kg의 용량에 상응하는 1 mg/mL)의 즉시 사용할 수 있는 현탁액이 사용할 때까지 5℃에서 보관되었다.

양 IgG 항체 (ab37385, Abcam) 제제는 얼음 위에서 4℃에서 수행되었다. 항체를 생리 혈청에 용해시켜 4 mg/ml 용액을 얻었다. 별도로, 완전 프로인트 보조제 (CFA)를 와류로 균질화하였다. 5ml 루어 락 시린지에 2.5ml의 CFA를 채웠다. 또 다른 5ml 루어 락 시린지에 양의 IgG 용액 2.5ml를 채웠다. 두 주사기는 모든 공기 방울을 제거하도록 주의하면서 마이크로 에멀젼 바늘로 연결되었다. 양 IgG 용액을 CFA로 통과시켰다. 2개의 주사기 사이의 혼합물을 저항의 현저한 증가가 관찰될 때까지 5분 동안 반복적으로 강제하였다. 이어서, 마이크로 에멀젼 바늘을 이녹스 커플러 루어 암컷/루어 암컷으로 대체하였다. 두 개의 주사기 사이의 혼합물은 몇 분 동안 다시 강제되었습니다. 물에서 표면 장력을 그런 다음 시험하였다. 공기 방울을 제거하도록 주의하면서 1ml 루어 락 주사기를 채웠습니다. 주사기를 사용할 때까지 4℃에서 보관된 23G 바늘이 추가되었다.

양 항-랫트 Glomeruli (GBM) 혈청 (PTX-001S, Probetex)은 사용하기 전까지 5℃에서 보관되었다.

투약

마우스는 다음 그룹에 할당되었다:

항-GBM 항체 투여 5일 전에, 동물은 O₂/이소플루란 (1L/3%) 마취 하에서, 양 IgG/CFA 에멀젼 (Sheep IgG 200μg/Mycobacterium tuberculosis H37Ra 500μg) 100μl의 3개의 부위(각각 엉덩이 상에 1개 및 목 부분에 1개)를 피하 주사하여 면역화시켰다.

0일째, 마우스를 칭량하고, 꼬리 정맥의 혈관 확장 및 주사에 대한 더 나은 가시성을 허용하기 위해 약 20-30분 동안 가열 램프 아래에 두었다. 각 동물은 주사 주입 콘으로 구속되었다. 마우스에게 300μl의 항-GBM 항체 혈청을 정맥 주사 하였다. 이어서, 마우스에게 화합물 A, 로시글리타존, 피오글리타존 및 캡토프릴을 경구 투여하고, 처리를 하루에 한 번(아침에) 추가로 7일 동안 계속 하였다. 마우스는 대략 격일로 체중 측정을 받았다.

6일째에 마우스를 계량하여 이뇨제 상자로 옮겨 24시간 동안 머물렀다. 비브스는 물의 섭취량을 측정하기 이뇨제 투여 전후에 체중을 측정했다. 7일째에 마우스를 칭량하고 구강 치료를 받고 이들의 초기 상자에 넣었다. 소변을 채취하고 원심 분리하고 측정한 다음 여러 검체를 -80℃에서 동결시켜 후속 검정(요소, 크레아티닌, 알부민 ...)을 했다.

7일 오후에 마우스를 O₂/이소플루란 (1L/3%) 혼합물로 마취시키고 혈액 샘플링이 파스퇴르 피펫으로 후두부 정맥동에서 시행되었다. 400μl의 전혈을 건조한 마이크로 튜브로 옮겼다. 혈장은 4℃에서 15분 동안 6000rpm에서 응고 30분 및 2 회 원심 분리 후 얻어졌다. 혈청을 분주하고 후속 분석(요소, 크레아티닌, 단백질, 아디포넥틴)을 위해 -80℃에서 동결시켰다. 그런 다음, 자궁 경부 탈구로 마우스를 안락사시키고 신장을 수확하고 무게를 측정했다. 마우스 1마리당 신장 피질이 분리되었다. 작은 조각을 후속 RNA 발현 분석을 위해 보관하였다. 나머지는 이후의 분석 (TGFβ1, OPN, MCP-1 ...)을 위해 액체 질소에서 직접 동결시켰다. 나머지 신장 중 절반을 조직학적 분석을 위해 24시간 동안 10% 완충 포르말린의 개별 조직학적 카세트에 넣었다.

측정된 매개 변수

유전자 발현

작은 냉동 신장 샘플(50-100mg)에서 mRNA 추출을 수행했다. 간단히, 샘플은 몰타르와 유봉으로 저온 절삭되었다. 이어서, 샘플은 Retsch MM300 장치에서 마블(2X5mn) 및 1ml의 Qiazol 용해 시약 (Qiagen Ref 79306)을 사용하여 균질화되었다. 제조사의 지시에 따라 Qiagen Rneasy 지질 키트 (Ref 74804)를 사용하여 신장 균질액에서의 RNA 추출을 완료했다. RNA 양은 Nanodrop (ND2000 Thermo Scientific)으로 측정하고 RNA 품질은 Bioanalyzer (2100 Agilent Technology)로 확인되어 졌다.

소변, 혈장 및 신장 바이오 마커

혈청 및 요중 검사 (요소, 크레아티닌, 알부민 및 단백질)는 Konelab 장치 및 상응하는 비색 검사로 수행되었다.

미세 알부민뇨는 형광 키트로 검사되었다: Albumin Blue Fluorescent Assay (Active Motif, Ref : 15002).

모든 신장 단백질은 제조자의 지시에 따라 ELISA 키트로 정량화하였다:

- 오스테오폰틴: Quantikine Mouse 오스테오폰틴 immunoassay, R&D SYSTEMS®, Ref　:MOST00

- MCP-1: Quantikine Mouse CCL2/JE/MCP-1 ELISA Kit, R&D SYSTEMS®, ref: MJE00

데이터 처리 및 통계 분석

Graphpad 소프트웨어 (버전 5.1)를 사용하여 모든 매개 변수를 분석했다. 매개 변수는 원-웨이 ANOVA (처리)를 사용하여 그룹 (1, 2, 3, 4, 5, 6 및 7)을 비교하여 분석되었다. ANOVA가 유의미한 것으로 판명되면 Dunnett의 검사를 사용하여 그룹 2를 모든 다른 그룹과 비교했다.

도 8 내지 16에서, *는 p-값 <0.05를 나타내고; **는 p-값 <0.01을 나타내고; ***은 p-값 <0.001을 나타낸다.

결과

1/ 혈청 우레아

항-GBM-노출된 마우스에서 화합물 A (100 mg/kg/day)는 비히클 (p <0.01)에 비해 우레아 수준을 유의하게 감소시켰지만 캡토프릴은 우레아 수준을 유의한 영향없이 감소시켰으며 로지글리타존과 피오글리타존은 우레아 수준을 유의하지 않게 증가시켰다(도 8).

2/ 소변량

항-GBM-노출된 마우스에서 화합물 A (30 및 100 mg/kg/day)는 비히클에 비해 소변량을 줄이지만 캡토프릴은 유의한 증가 없이 소변량을 감소시켰고 로지글리타존 및 피오글리타존은 각각 유의성에 도달하지 않고 요중 알부민을 증가시켰다 (도 9).

3/ 요로 알부민

항-GBM-노출된 마우스에서 화합물 A (100 mg/kg/day)는 알부민 수치가 비히클에 비해 유의하게 감소하지 않았고, 캡토프릴 또한 알부민 수치를 감소시키지 않았고 로지글리타존은 알부민 수치를 유의 수준까지 증가시켰으며 피오글리타존은 알부민 수준을 유의하게 증가했다 (p <0.001) (도 10).

4/ 신장 오스테오폰틴

항-GBM-노출된 마우스에서 화합물 A (100 mg/kg/day)는 비이클에 비해 오스테오폰틴 수치를 유의하게 감소시켰으며 (p <0.05), 캡토프릴은 또한 오스테오폰틴 수치를 유의하게 낮추었으며(p <0.05) 그리고 로지글리타존과 피오글리타존은 각각 유의성 있게 오스테오폰틴 수준을 증가했다 (각각 p <0.01 및 p <0.05) (도 11).

5/ 신장 MCP -1

항-GBM-노출된 마우스에서 화합물 A (100 mg/kg/day)는 비히클에 비해 MCP-1 수준을 유의하게 감소시켰지만 (p <0.001), 캡토프릴은 MCP-1 수준을 유의하게 낮추었으며(p <0.01) 로지글리타존 및 피오글리타존은 각각 MCP-1 농도를 유의하게 증가시켰다 (p <0.05) (도 12).

6/ TGFβR -1 발현

항-GBM-노출된 마우스에서 화합물 A (100 mg/kg/day)는 비히클에 비해 TGFβR-1 발현을 유의하게 억제했지만(p <0.01), 캡토프릴은 TGFβ-R1 발현에 아무런 영향을 주지않았고 로지글리타존과 피오글리타존은 유의성에 도달하지 않고 각각 TGFβR-1 발현을 상향 조절하였다 (도 13).

7/ 콜라겐 I형, 알파 I ( Col1a ) 발현

항-GBM-노출된 마우스에서 화합물 A (100 mg/kg/day)는 비히클에 비해 Col1a 발현을 유의하게 억제하였으며 (p <0.01), 캡토프릴은 Col1a 발현에 아무런 영향을 미치지 않았으며 로지글리타존과 피오글리타존은 각각 Col1a 발현을 유의하게 상향 조절하였다 (p <0.001) (도 14).

8/ 콜라겐 III 형, 알파 I ( Col3a ) 발현

항-GBM-노출된 마우스에서 화합물 A (100 mg/kg/day)는 비히클에 비해 Col3a 발현을 유의하게 억제하였으며 (p <0.001), 캡토프릴은 Col3a 발현에 아무런 영향을 미치지 않았고, 로지글리타존은 Col3a 발현을 유의하게 상향 조절시켰고(p <0.05), 그리고 피오글리타존은 유의성에 도달함이 없이 Col3a 발현을 상향 조절하였다 (도 15).

9/ 병리학 사구체

항-GBM-노출 마우스에서 화합물 A (100 mg/kg/day)는 병리학적인 사구체의 수를 현저히 감소시켰다 (p <0.001) (도 16).

실시예 3: 마우스에서의 블레오마이신 -유발 폐 섬유증의 전개에 대한 화합물 A의 효과 및 공지된 PPAR γ 작용제와의 비교

마우스의 블레오마이신-유발 폐 섬유증은 새로운 화학 물질의 항-섬유성 잠재성을 평가하는데 일반적으로 사용되는 생체 내 모델이다(Corbel et al, 2001; Manoury et al, 2006). 화합물 A와 알려진 PPARγ 작용제인 로시글리타존의 효과가 따라서 이러한 모델에서 평가되었다. C57BL/6J 마우스는 시험 화합물의 효과를 평가하기 위해 선택되었는데, 그 이유는 블레오마이신의 투여 후 폐에서의 섬유성 리모델링에 따른 조기 염증 반응을 나타내는 경향이 있기 때문이다.

마우스를 2가지 상이한 용량 (30 및 100 mg/kg/일) 및 로시글리타존 (5 mg/kg/일)으로 화합물 A로 15일 동안 매일 경구로 처리되었다. 치료가 끝나면, 동물을 희생시키고 혈장 샘플과 간을 수확했다. 폐 염증화 과정에 관여하는 것으로 알려진 유전자의 발현을 정량화하고 혈장 수준의 폐 변수를 측정하였다.

15일 동안 비히클로 구강 내로 처리된 블레오마이신-노출된 마우스는 폐 오스테오폰틴, 폐 MCP-1 및 폐 TIMP-1 수준의 통계적으로 유의한 증가에 의해 보여지는 바와 같이 폐 섬유증을 나타내었다. 화합물 A를 30 및 100 mg/kg/일에서 15일 동안 처리하면 비히클 TIMP-1의 수준이 유의하게 감소했다; 폐 MCP-1과 오스테오폰틴의 준위도 또한 통계적 유의성을 나타내지 않고 비히클에 비해 감소했다. 대조적으로, 블레오마이신-노출 마우스가 로지글리타존을 매일 5 mg/kg/day로 15일간 경구 투여했을 때, 폐 오스테오폰틴, 폐 MCP-1 및 폐 TIMP-1 준위는 비히클에 비해 통계적으로 유의성에 도달하지 않고 증가했다.

재료 및 방법

실험은 실험 시작시 체중이 20-25g인 77마리의 수컷 C57BL/6J 마우스 (JANVIER LABS, C.S. 4105, Saint-Berthevin F-53941, France)를 사용하여 수행되었다. 표준 조건: 실온 (22 ± 2℃), 습도 측정 (55 ± 10%), 명암주기 (12h/12h)공기 보충 (15-20 부피/시간), 물과 음식(SDS, RM1)을 자유롭게 사용할 수 있는 조건 하에서 폴리프로필렌 케이지(바닥 면적 = 1032㎠)에 3 내지 10마리의 군으로 동물이 수용되었다. 마우스는 실험 전에 적어도 5일 동안 수용될 수 있었다. 마우스는 지울 수 없는 마커를 사용하여 꼬리를 표시함으로써 번호가 매겨졌다.

화합물 A (3mg/mL 및 10mg/mL)와 로시글리타존 (0.5mg/mL)가 즉시 사용 가능한 현탁액으로 1% 메틸셀룰로스 (METOLOSE SM400, 400Cps) + 0.1% 폴록사머 188에 제제화되고 연구 동안에 5±3℃에서 보관되었다. 비히클로서 1% 메틸셀룰로오스 (METOLOSE SM400, 400Cps) + 0.1% Poloxamer 188가 사용되고 그리고 연구 동안 5 ± 3℃에서 보관되었다. 블레오마이신 (Laboratoire Bellon)은 사용 직전에 0.9% NaCl (프랑스, CDM Lavoisier)에 용해시켰다.

복용

마우스는 다음 그룹에 할당되었다:

1. 0.9% NaCl + 비히클 (1일 1회 15일간 투여), n = 11,

2. 0.9% NaCl + 화합물 A (100 mg/kg/day, 1일 1회 15일간 투여), n = 11,

3. 0.9% NaCl + 로지글리타존 (1일 1회 15일간 5 mg/kg/day), n = 11,

4. 블레오마이신 (0.3mg) + 비히클 (1일 1회 15일간 투여), n = 10,

5. 블레오마이신 (0.3mg) + 화합물 A (1일 1회 15일 동안 30 mg/kg/day), n = 9,

6. 블레오마이신 (0.3mg) + 화합물 A (100 mg/kg/일, 1일 1회 15일간 투여), n = 7,

7. 블레오마이신 (0.3mg) + 로지글리타존 (5 mg/kg/day 1일 1회 15일간 po) n = 6.

1일째, 마우스를 에토미데이트 (15-20 mg/kg, ip)로 마취시킨 다음 0.9% NaCl (50μL/마우스 (25 μL/비강))에서 블레오마이신 황산염 (0.3mg (300 IU)으로 또는 0.9 % NaCl (50 μL/마우스 (25 μL/비강))로 매일 투여하였다. 마우스를 비히클, 화합물 A 또는 로시글리타존으로 15일 (0일 내지 14일)동안 매일 일 회 경구 투여하였다. 비히클, 화합물 A 또는 로지글리타존의 투여는 0.9% NaCl 또는 블레오마이신 투여 6 시간 전에 1일째에 수행되었다. 시험 화합물의 투여량은 경구 투여의 경우 10 ㎖/kg 체중이었다.

말단 혈액 샘플링

14 일째에, 투여 후 2시간에, 동물을 펜토바비탈 (60 mg/kg, ip)로 마취시키고, 심장 관통을 사용하여 혈액을 수집하였다. 정확한 투여 시간과 샘플 수집 시간은 각 동물별로 기록되었다. 혈액 샘플링 (총 혈액 0.9mL)을 미리 냉각시킨 2mL 리튬-헤파린 수집 튜브에 넣었다. 혈액 샘플을 부드럽게 혼합하고 30분 내에 분쇄된 얼음에 놓고 약 + 4℃에서 약 1500 x g에서 10분 동안 원심 분리했다. 각 혈액 샘플링을 위해, 생성된 혈장을 2개의 분취량 (각 100μL 이상)으로 분리하고 일회용 플라스틱 물질을 사용하여 폴리프로필렌 튜브로 옮겼다. 샘플을 곧바로 직립 위치에서 -20℃로 유지되는 냉동실로 옮겼다.

폐 제거

말단 혈액 샘플링 후, 폐 조직을 제거하였다:

· 첫 번째 조직 샘플 (중간 엽)을 수확하고 파라포름알데히드로 고정하고 5 ± 3℃로 유지한다.

· 두 번째 조직 샘플 (오른쪽 엽)을 액체 질소에서 동결시키고 -20℃℃에서 유지한다.

측정된 매개 변수

콜라겐

콜라겐의 정량을 하기 위해, 절편은 Picro-Sirius red로 염색되고 Mayer's 헤마톡실린으로 대조 염색되었다. 모든 슬라이드를 디지털화하고 3개의 다른 섹션의 5개의 중첩되지 않는 필드를 이미지 J 소프트웨어 (버전 1.42, N.I.H., USA)를 사용하여 무작위로 분석하였다. 모든 슬라이드에 대해 분석은 엄격하게 동일한 조건에서 단일 실험자에 의해 수행되었습니다.

유전자 발현

mRNA 추출은 작은 냉동 폐 샘플 (50-100mg)에서 수행되었다. 간단히, 샘플은 몰타르와 유봉으로 저온 절삭되었다. 이어서, 샘플은 Retsch MM300 장치에서 마블(2X5mn) 및 1ml의 Qiazol 용해 시약 (Qiagen Ref 79306)을 사용하여 균질화되었다. 제조사의 지시에 따라 Qiagen Rneasy 지질 키트 (Ref 74804)를 사용하여 폐 균질 액에서의 RNA 추출을 완료했다. RNA 양은 Nanodrop (ND2000 Thermo Scientific)으로 측정하고 RNA 품질은 Bioanalyzer (2100 Agilent Technology)로 확인되어 졌다.

실시간 PCR은 ABI PRISM 7900 장치에서 수행되었다. ABI7900으로부터의 원 데이터는 텍스트 형식으로 내보냈다. 분석은 Excel에서 수행되었고, 상대적인 양의 전사물은 정규화를 위한 하우스 키핑 유전자로서 Rplp0 및 참고 대조로서 비처리 동물 (비히클 그룹)로부터의 평균 데이터를 사용하여 "Delta Delta CT 방법"(Livak et al. Methods 2001)을 사용하여 계산되었다. 각각의 RNA 샘플을 역전사하고 3중으로 정량화하였다.

폐 단백질 바이오마커

폐 단백질 추출의 프로토콜:

폐와 상층액의 샘플은 모든 실험 동안 얼음에 보관되었다. 추출을 위해, 제조 업체는 100μl T-Per + 1μl "Halt-protease"(100X)에 대해 10mg의 조직을 권장한다.

50㎖의 T-Per 완충액을 제조하고, "Halt-protease"(100X) 500㎕를 첨가하고, 혼합물을 얼음 상에 유지시켰다. 바로 해동한 50-70 mg의 폐 샘플을 칭량하고 작은 조각으로 절단하고 차가운 PBS 1ml를 첨가하여 조직을 세척하였다. 혼합물을 4℃에서 5분 동안 500g에서 원심 분리하고, 상등액을 버렸다. T-Per + 항 프로테아제 (100X) 100 ㎕/10mg을 첨가하여 포터 (Potter)로 5 ~ 6회 꼬여 위아래로 폐를 분쇄하였다. 혼합물을 4℃에서 5분 동안 10000g에서 원심분리 하였다. 상등액을 제거하고, 분주하고, 바이오마커의 후속 측정을 위해 -20℃로 유지하였다. MOS : Bip-03-062-01 (Kit BCA - Pierce BCA protein assay kit - Pierce Thermo scientific, Ref: 23225)에서 기술된 절차에 따라 H₂O mq에서 희석 1/10일 후 BCA 기술에 의해 단백질을 투여하기 위해 10㎕의 샘플이 사용되었다.

- 오스테오폰틴: Quantikine 마우스 오스테오폰틴 면역 측정법, R&D SYSTEMS®, Ref: MOST00

- MCP-1: Quantikine 마우스 CCL2/JE/MCP-1 ELISA 키트, R&D SYSTEMS®, ref: MJE00

- TIMP-1: 마우스 TIMP-1, R&D SYSTEMS®, Ref: TM100.

데이터 처리 및 통계 분석

Graphpad 소프트웨어 (버전 5.1)를 사용하여 모든 매개 변수를 분석했다. 매개 변수는 다음과 같이 분석되었다.

- 그룹 (1, 2 및 3)에 비교하기 위해 one-way ANOVA (처리)를 사용함. ANOVA가 유의미한 것으로 밝혀지면 2군과 3군에 대해 1군을 비교하기 위해 Dunnett의 검사가 사용되었다.

- 그룹 (1, 4, 5, 6 및 7)에 비교하기 위해 one-way ANOVA (처리)를 사용함. ANOVA가 유의미한 것으로 밝혀지면 그룹 4, 그룹 5, 그룹 6 및 그룹 7에 대해 그룹 1을 비교하기 위해 Dunnett의 검사가 사용되었다.

도 17 내지 27에서, *는 p-값 <0.05를 나타내고; **는 p-값 <0.01을 나타내고; ***은 p-값 <0.001을 나타낸다.

결과

1/ 콜라겐 침착

블레오마이신-노출 마우스에서 화합물 A (100 mg/kg/day)는 비히클에 비해 콜라겐 침착 수준을 유의하게 감소시켰다 (p <0.05). 로지글리타존은 또한 콜라겐 수치를 유의하게 감소시켰다 (p <0.05) (도 17).

2/ 폐 TIMP -1

블레오마이신-노출 마우스에서 화합물 A (30 및 100 mg/kg/day)는 비히클 (p <0.05)에 비해 TIMP-1 수치를 유의하게 감소시켰지만 로지글리타존은 유의성에 도달함이 없이 TIMP-1 수치를 증가시키지 않았다 (도 18).

3/ 폐 MCP -1

블레오마이신-노출 마우스에서 화합물 A (30 및 100 mg/kg/day)는 비히클에 비해 유의성에 도달함이 없이 MCP-1 수준을 감소시켰지만 로지글리타존은 유의성에 도달함이 없이 MCP-1 수치를 증가시켰다 (도 19).

4/ 폐 오스테오폰틴

블레오마이신-노출 마우스에서 화합물 A (30 및 100 mg/kg/day)는 비히클에 비해 유의성에 도달함이 없이 오스테오폰틴 수치를 감소시켰지만 로지글리타존은 유의성에 도달함이 없이 오스테오폰틴 수치를 증가시켰다 (도 20).

5/ TGFβR -1 발현

블레오마이신-노출 마우스에서 화합물 A (100 mg/kg/day)는 비히클에 비해 TGFβR-1 발현을 유의하게 억제했다 (p <0.05). 로지글리타존은 또한 TGFβ-1 발현을 유의하게 억제하였다 (p <0.05) (도 21).

6/ 콜라겐 I 형, 알파 I ( Col1a ) 발현

블레오마이신-노출 마우스에서 화합물 A (100 mg/kg/day)는 비히클에 비해 Col1a 발현을 유의하게 억제하였으며 (p <0.001), 로시글리타존은 Col1a 발현을 유의성에 도달함이 없이 상향조절시켰다 (도 22).

7/ 콜라겐 III 형, 알파 I ( Col3a ) 발현

블레오마이신-노출 마우스에서 화합물 A (100 mg/kg/day)는 비히클에 비해 Col3a 발현을 유의하게 억제하였지만 (p <0.001), 로시글리타존은 Col3a 발현을 유의성에 도달함이 없이 억제하였다 (도 23).

8/ TIMP -1 발현

블레오마이신-노출 마우스에서 화합물 A (30 및 100 mg/kg/day)는 비히클에 비해 유의성에 도달함이 없이 TIMP-1 발현을 억제했지만 로지글리타존은 TIMP-1 발현을 유의하게 상향조절시켰다 (p <0.05) (도 24).

9/ MCP -1 발현

블레오마이신-노출 마우스에서 화합물 A (30 및 100 mg/kg/day)는 비히클에 비해 유의성에 도달함이 없이 MCP-1 발현을 억제하였으나 로지글리타존은 TIMP-1 발현을 유의성에 도달함이 없이 상향조절시켰다 (도 25).

10/ 오스테오폰틴 발현

블레오마이신-노출 마우스에서 화합물 A (30 및 100 mg/kg/day)는 비히클에 비해 오스테오폰틴 발현을 유의하게 억제하였으며 (p <0.05), 로지글리타존은 오스테오폰틴에는 효과가 없었다 (도 26).

11/ 피브로넥틴 발현

블레오마이신-노출 마우스에서 화합물 A (100 mg/kg/day)는 비히클에 비해 피브로넥틴 발현을 유의하게 억제했지만 (p <0.05), 로지글리타존은 피브로넥틴 발현을 유의성에 도달함이 없이 상향조절시켰다 (도 27).

상기 결과는 수컷 C57BL/6J 마우스에서 화합물 A (30 또는 100 mg/kg/일)의 경구 투여가 폐에 블레오마이신 주입에 의해 유도된 염증성/섬유성 생체 지표의 증가를 감소시켰지만 로시글리타존은 효과가 없었거나, 또는 더욱이는 이러한 바이오마커에 해로운 영향을 준 것을 나타낸다. 종합적으로 말하면, 이들 데이터는 화합물 A가 마우스에서 블레오마이신-유도 폐 섬유증을 감소시킴을 보여준다.

실시예 4 : 마우스에서의 블레오마이신 -유도 피부 섬유증의 전개에 대한 화합물 A의 효과 및 공지된 PPARγ 작용제와의 비교

화합물 A는 블레오마이신-유도 피부 섬유증의 마우스 모델에서 시험되었다. 마우스를 21일 동안 2가지 상이한 용량 (30 및 100 mg/kg/일)으로 화합물 A로, 그리고 5 mg/kg/일에서 PPARγ 참조 화합물인 로시글리타존으로 매일 처리하였다. 치료가 끝나면 동물을 희생시키고 피부 샘플을 채취했다. 전신 섬유증 경로에 연루되는 것으로 알려진 유전자의 발현을 정량화하고 진피의 두께 및 콜라겐 함량을 측정 하였다.

21일 동안 비히클로 구강으로 처리된 블레오마이신-노출 마우스는 피부 두께와 콜라겐 함량이 통계적으로 유의하게 증가함을 나타냄으로서 피부 섬유증을 보였다. 21일 동안 30 및 100 mg/kg/day의 화합물 A로 처리는 비히클에 비해 피부 두께와 콜라겐 함량이 현저히 감소했다. 효과가 진피 두께에 관해 덜 나타났지만, 로지글리타존으로 5mg/kg/day로 21일간 매일 경구 투여한 블레오마이신-노출된 마우스에서도 비슷한 효과가 관찰되었다.

재료 및 방법

실험은 6주령 수컷 C56BL/6 마우스 (Janvier, Le Genest-Saint-Isle, France)에서 수행되었다. 표준 조건: 실온 (22 ± 2℃), 습도 측정 (55 ± 10%), 명암주기 (12h/12h)공기 보충 (15-20 부피/시간), 물과 음식(SDS, RM1)을 자유롭게 사용할 수 있는 조건 하에서 폴리프로필렌 케이지(바닥 면적 = 1032㎠)에 3 내지 10마리의 군으로 동물이 수용되었다. 마우스는 실험 전에 적어도 5일 동안 수용될 수 있었다. 마우스는 지울 수 없는 마커를 사용하여 꼬리를 표시함으로써 번호가 매겨졌다.

화합물 A (3mg/mL 및 10mg/mL)와 로시글리타존 (0.5mg/mL)가 즉시 사용 가능한 현탁액으로 1% 메틸셀룰로스 (METOLOSE SM400, 400Cps) + 0.1% 폴록사머 188에 제제화되고 연구 동안에 5±3℃에서 보관되었다. 비히클로서 1% 메틸셀룰로오스 (METOLOSE SM400, 400Cps) + 0.1% Poloxamer 188가 사용되고 그리고 연구 동안 5 ± 3℃에서 보관되었다.

복용

마우스는 다음 그룹에 할당되었다:

1. 0.9 % NaCl + 비히클 (21일 동안 하루에 한 번 po), n = 7,

2. 0.9 % NaCl + 화합물 A (100 mg/kg/day 21일 동안 하루에 한 번 po), n = 8,

3. 0.9 % NaCl + 화합물 A (30 mg/kg/day 21일 동안 하루에 한 번 po), n = 8,

4. 블레오마이신 (0.3 mg) + 로시글리타존 (5 mg/kg 21일 동안 하루에 한 번 po), n = 8,

5. 블레오마이신 (0.3 mg) + 비히클 (21일 동안 하루에 한 번 po), n = 6,

6. 블레오마이신 (0.3 mg) + 화합물 A (100 mg/kg/일 21일 동안 하루에 한 번 po), n = 7,

7. 블레오마이신 (0.3mg) + 화합물 A (30mg/kg 21일 동안 하루에 한 번 po) (n = 7).

피부 섬유증은 0.5 mg/ml 농도의 0.9 % NaCl (CDM Lavoisier, France)에 용해 된 블레오마이신 (프랑스, Laboratoire Bellon, 100 μL)의 매일 주사로, 상부 등에 1㎠의 한정된 영역 안으로 6일/주 투여되어 유도되었다. 0.9% NaCl을 대조군 (100μL 피하 주사)으로 사용하였다.

마우스는 비히클, 화합물 A 또는 로시글리타존으로 21일 동안 하루 1회 경구 투여되었다. 1일 째에 비히클, 화합물 A 또는 로시글리타존의 투여는 0.9% NaCl 또는 블레오마이신 투여 4시간 전에 수행하였다.

피부 샘플링

21일째, 자궁 경부 전위에 의해 마우스를 희생시키고, 피부 샘플을 취하여 분석을 위해 처리하였다.

측정된 매개 변수:

피부 및 지방층 두께

병변 피부 부위를 절제하고 4% 포르말린에 고정시키고 파라핀에 묻었다. 5 μm 두께의 절편을 해마톡실린과 에오신으로 염색하였다. 피부 두께는 각 마우스의 병변 피부에서 4개의 부위에서 표피-진피 접합부와 진피-피하 지방 접합부 사이의 거리를 측정함으로써 100배 배율로 분석하였다. 두 명의 독립적인 시험관이 측정 값의 변동성이 10% 이상인 경우 합의 전에 평가를 수행했다.

피부의 콜라겐 함량

하이드록시프롤린 분석

병변 피부 샘플에서의 콜라겐 함량은 히드록시프롤린 분석에 의해 조사되었다. 120℃에서 3시간 동안 6M HCl에서 펀치 생검 (Ø 3mm)을 소화한 후, 6M NaOH로 시료의 pH를 7로 조정했다. 그 후 샘플을 0.06M 클로르아민 T와 혼합하고 실온에서 20분간 배양하였다. 그 다음, 3.15M 과염소산과 20% p-디메틸아미노벤즈알데하이드를 첨가하고 샘플을 60℃에서 추가로 20분 동안 인큐베이션하였다. 흡광도는 Spectra MAX 190 마이크로플레이트 분광 광도계 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 사용하여 557nm에서 측정하였다.

Sircol 분석

Sircol 콜라겐 분석법(Biocolor)을 사용하여 세포 배양 상등액의 총 가용성 콜라겐을 정량화했다. 간략하게, 세포 배양 상등액을 시리우스 레드 염료와 실온에서 30분간 혼합하였다. 원심 분리 후, 펠렛을 알칼리 시약에 용해시켰다. 측정은 540nm의 파장에서 SpectraMax 190 마이크로 플레이트 분광 광도계 (Molecular Devices)를 사용하여 수행되었다.

데이터 처리 및 통계 분석

데이터는 평균 ± 평균의 표준 오차로 표현되었다. Student t-test가 통계 분석에 사용되었다. 0.05 미만의 p 값은 통계적으로 유의한 결과로 간주되었다.

도 28 내지도 30에서 *는 p-값 ≤0.05를 나타내고; **는 p-값 <0.01을 나타내고; ***은 p-값 <0.001을 나타낸다.

결과

마우스에 블레오마이신의 주입은 NaCl을 수용하는 마우스에 비해 진피의 두께를 증가시켰다 (도 28 참조 : 그룹 NaCl + 비히클에 비해 블레오마이신 + 비히클에서 57% 증가). 로지글리타존과 화합물 A (30 mg/kg)는 블레오마이신-노출 마우스에서 비히클에 비해 피부 두께를 유의하게 감소시켰다 (p≤0.05). 화합물 A (100 ㎎/㎏)는 비히클과 비교하여 블레오마이신-노출 마우스에서 피부 두께를 유의하게 감소시켰다 (p <0.001).

감소된 피부 두께와 일치하여, 화합물 A (30 및 100 mg/kg) 및 로시글리타존으로 처리된 마우스의 병소 피부에서의 하이드록시프롤린 함량은 비히클로 처리된 마우스의 손상 피부보다 유의하게 낮았고, 화합물 A (30 mg/kg)거 로지글리타존보다 더 효율적이다 (도 29).

화합물 A (30 및 100 mg/kg)와 로지글리타존은 또한 비히클에 비해 콜라겐 함량을 현저하게 감소시켰다 (도 30).

이 모든 결과는 화합물 A가 피부 섬유증을 예방하는 데 효율적이라는 것을 보여준다. 화합물 A (100 mg/kg)는 로시글리타존에 비해 피부 두께에 더 양호한 영향을 미친다.

실시예 5: 화합물 A에 의한 인간 및 뮤어라인 PPAR 수용체의 활성화

PPAR 수용체의 3가지 아형 모두를 활성화시키는 화합물 A의 능력은 일시적인 트랜스액티브 분석에 의해 결정되었다. 이러한 세포-기반의 분석은 키메라 인간 또는 마우스 PPARα-Gal4 수용체 발현 플라스미드 (또는 PPARβ-Gal4, 또는 PPARγ-Gal4) 및 5Gal4 pGL3 TK Luc 리포터 플라스미드로 형질 전환된 Cos-7 세포를 사용하여 수행하였다. 트랜스펙션은 화학 제제 (Jet PEI)에 의해 수행되었다. 형질 전환된 세포를 384-웰 플레이트에 분배시키고 24시간 동안 회복시켰다. 이어서, 배양 배지를 제거하고 시험 화합물 (5μM)을 함유하는 새로운 배지 (최종 농도는 10^-4M 내지 3 × 10^-10M 범위)를 첨가하였다. 하룻밤 배양 후, 루시퍼라제 발현을 제조사의 설명서 (Promega)에 따라 SteadyGlo를 첨가하여 측정하였다. 10^-5M의 페노피브르 산, 10^-8M의 GW501516 및 10^-6M의 로지글리타존을 참조로 사용하였다. 결과는 100%로 취해진 참조 (PPARα의 경우에는 페노피브르 산, PPARγ의 경우네는 로지글리타존, 및 PPARδ에 대해서는 GW501516)와 비교하여 백분율 활성으로 표시하였다. 인간 수용체의 경우, 결과는 6회 실험의 평균이며, 각각 4회 반복된다. 뮤어라인 수용체의 경우, 결과는 평균 5회 (PPARδ) 또는 6회 (PPARα 및 γ) 실험으로 각각 4회 반복되었다. 용량-효과 곡선과 EC50은 소프트웨어 Assay Explorer (MDL)를 사용하여 계산되었다. 결과는 아래 표와 도 31과 32에 나타내어 진다.

이러한 결과는 화합물 A가 각각의 아형에 대해 1μM 미만의 EC50을 갖는 PPAR 수용체의 3가지 아형 모두를 활성화시킨다는 것을 보여준다. 더욱이, 화합물 A는 PPAR 수용체의 3가지 아형 사이에서 균형 잡힌 활성을 갖는다는 것을 알 수 있다.

전반적으로, 실시예 1-5의 결과는 범-항섬유화 효과를 나타내기 위해 PPARα 및 PPARγ 작용제 활성과 함께 양호한 PPARδ 작동제 활성이 요구된다는 것을 제시한다.

실시예 6 : 폐 및 피부 섬유아세포의 증식에 대한 화합물 A의 효과 및 공지된 PPARγ 및 PPARα 작용제와의 비교

화합물 A가 PDGF-유도 폐 및 진피 섬유아세포의 증식을 억제하는 능력은 EdU (5-에티닐-2'-데옥시우리딘) 혼입 검정을 수행하여 결정되었다. 이러한 분석은 일차 인간 폐 또는 피부 섬유아세포 (Promocell)를 사용하여 수행되었다. 세포를 24시간 동안 전체 성장 배지에서 96-웰 플레이트에 플레이팅한 후, 무-혈청 배지에서 24시간 동안 기아 배양하였다. 이어서, 배지를 PDGF 및 화합물 A를 함유하는 새로운 배지 (10^-4M 내지 4.5 × 10^-8M 범위의 농도)로 또 다른 24시간 동안 배양하였다. 화합물 처리의 마지막 16시간 동안 세포에 EdU를 첨가하였다. 배양 배지를 그런 다음 제거하고, 세포를 포름알데히드로 고정시키고, 그리고 다이빙 세포의 DNA에 혼입된 EdU를 제조자의 지시(Invitrogen)에 따라 형광 Click-it 분석을 사용하여 정량화하였다. 3 10^-4M에서 1.4 10^-7M (PPARα) 범위로 되는 페노피브르산 및 3 10^-5M 내지 1.4 10^-8M (PPARγ) 범위로 되는 로지글리타존을 참조로 사용하였다. 결과는 총 세포 수 중 EdU-양성 세포의 %로 나타내었다. 결과는 생물학적 삼배수의 평균을 나타냈다. 투여량-효과 곡선 및 IC₅₀ 값은 GraphPad Prism 소프트웨어를 사용하여 계산하였다. 결과는 아래 표와 도 33과 34에 제시되었다.

실시예 7 : 폐 및 진피 섬유아세포의 근섬유아세포 변이로 섬유아세포에 대한 화합물 A의 효과 및 공지된 PPARγ 및 PPARα 작용제와의 비교

화합물 A가 TGFβ-유도 폐 및 진피 섬유아세포를 근섬유아세포 전이 (FMT)로 억제하는 능력은 근섬유아세포 마커인, 알파-평활근 악틴(α-SMA)에 대한 면역세포 화학분석을 수행함으로써 결정되었다. 이러한 분석은 일차 인간 폐 또는 피부 섬유아세포 (Promocell)를 사용하여 수행되었다. 세포를 24시간 동안 전체 성장 배지에서 96-웰 플레이트에 플레이팅한 후, 무-혈청 배지에서 24시간 동안 기아 배양하였다. 이어서, 배지를 TGFβ 및 화합물 A를 함유하는 새로운 배지 (10^-4M 내지 4.5 10^-8M 범위의 농도)로 48시간 동안 교체하였다. 이어서, 배양 배지를 제거하고, 세포를 포름알데히드로 고정시키고, 1차 마우스 α-SMA 항체 (시그마) 및 2차 형광-표지된 염소-항-마우스 항체 (Invitrogen)로 염색하였다. Meta Xpress 소프트웨어를 사용하여 α-SMA 발현을 정량화했다. 3 10^-4M에서 1.4 10^-7M (PPARα) 범위로 되는 농도에서 페노피브르 산 및 3 10^-5M 내지 1.4 10^-8M (PPARγ) 범위로 되는 로지글리타존 농도를 기준으로 사용하였다. 결과는 총 세포 수 중 α-SMA-양성 세포의 %로 나타내었다. 데이터는 100%로 취해진 TGFβ 단독 처리로 표준화되었다. 결과는 생물학적 삼배수의 평균을 나타낸다. 투여량-효과 곡선 및 IC₅₀ 값은 GraphPad Prism 소프트웨어를 사용하여 계산하였다. 결과는 아래 표와 도 35와 36에 나타냈다.

종합적으로 이들 시험관 내 기능 데이터는 화합물 A가 주요한 인간 폐 및 진피 섬유아세포에서 PDGF-유도 증식 및 TGFβ-유도 근섬유아세포 전이를 효율적으로 억제하여 생체 내 관찰된 항-섬유성 효과와 관련을 제공하고 있음을 입증한다. 부가하여, 이러한 결과는 pan-PPAR 작용화가 두 가지 핵심 섬유화 경로 상의 표적 세포에서의 항-섬유성 효과에서 단일 PPAR 활성화보다 우수할 수 있음을 제시한다.

Claims

섬유증 증상의 치료 방법에 사용하기 위한 pan-PPAR 작용제.
제 1항에 있어서, 여기서 상기 섬유증 증상은 심장, 폐, 간, 신장, 위장관, 피부와 같은 섬유증을 유발할 수 있는 임의의 기관에 영향을 미치는 증상임을 특징으로 하는 작용제.
제 1항 또는 제 2항 중 어느 한 항에 있어서, 여기서 상기 섬유증 증상은: 간 섬유증, 지방간 질환, 비-알콜성 지방간염, 만성 신장 질환, 폐 섬유증 장애, 전신 경피증으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 작용제.
제 3항에 있어서, 여기서 상기 섬유증 증상은 폐 섬유증 장애임을 특징으로 하는 작용제.
제 4항에 있어서, 여기서 상기 폐 섬유증 장애는 특발성 폐 섬유증임을 특징으로 하는 작용제.
제 3항에 있어서, 여기서 상기 섬유증 증상은 전신 경피증임을 특징으로 하는 작용제.
제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 여기서 상기 작용제는 경구 투여용임을 특징으로 하는 작용제.
섬유증 증상의 치료 방법에 사용하기 위한 pan-PPAR 작용제를 함유하는 약제 학적 조성물.
제 8항에 있어서, 상기 여기서 상기 섬유증 증상은 심장, 폐, 간, 신장, 위장관, 피부와 같은 섬유증을 전개할 수 있는 임의의 기관에 영향을 미치는 증상임을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제 8항 또는 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, 여기서 상기 섬유증 증상은: 간 섬유증, 지방간 질환, 비-알콜성 지방간염, 만성 신장 질환, 폐 섬유증 장애, 전신 경피증으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제 10항에 있어서, 여기서 상기 섬유증 증상은 폐 섬유증 장애임을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제 11항에 있어서, 여기서 상기 폐 섬유증 장애는 특발성 폐 섬유증임을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제 10항에 있어서, 여기서 상기 섬유증 증상은 전신 경피증임을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제 8항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 있어서, 여기서 상기 조성물은 경구, 비경구, 국소, 흡입 또는 비강 내 투여용 조성물임을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항의 사용을 위한 작용제 또는 제 8항 내지 제 14항 중 어느 한 항의 사용을 위한 약학적 조성물로, 여기서 상기 작용제는 5-클로로-1- [(6-벤조티아졸일)설포닐]-1H-인돌-2-부탄산임을 특징으로 하는 조성물.