KR20230143965A - 타우로데옥시콜린산 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 폐섬유증 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

타우로데옥시콜린산 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 폐섬유증 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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성승용
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Abstract

본 발명은 타우로데옥시콜린산의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 폐섬유증 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 타우로데옥시콜린산의 약학적으로 허용가능한 염을 투여한 특발성 폐섬유증 동물모델 및 폐섬유증 세포모델에서 폐 섬유화 및 폐 섬유화 관련 인자 발현이 감소하는 것을 확인하였으므로, 상기 타우로데옥시콜린산 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 폐섬유증 예방 또는 치료용 조성물의 유효성분으로 이용될 수 있다.

Description

타우로데옥시콜린산 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 폐섬유증 예방 또는 치료용 조성물{Composition for preventing or treating pulmonary fibrosis comprising taurodeoxycholic acid or pharmaceutically acceptable salts thereof as an active ingredient}
본 발명은 타우로데옥시콜린산(taurodeoxycholic acid) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 폐섬유증 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
염증의 원인은 병원체 감염에 의한 PAMPs(병원체 연관 분자유형, Pathogen-associated molecular patterns)과 조직의 비감염 손상에 의한 DAMPs (손상 연관 분자유형, Damage-associated molecular patterns)으로 알려져 있으며, 이로 인해 유발된 면역세포, 혈관, 염증 매개체들이 관여하는 생체 내 보호 반응이나 염증반응 조절 실패는 염증성 질환을 야기하는 것으로 알려져 있다. 한편 현재 염증성 질환의 치료제로 스테로이드, NSAIDs(비스테로이드 염증 치료제, Non-steroidal anti-inflammatory drugs), 항체 치료제, JAK 억제제 등이 처방되고 있으나 스테로이드 약물은 전신성 부작용으로 인해 단기간 처방에 머물고 있으며, NSAIDs는 임상 단계에서 충분한 효능을 보여주지 못하고 있는 상황이다. 아울러 항체 치료제의 경우 비교적 빠른 반응성과 장기간 투약은 가능하나, 주사 부위 부작용이 있고, 체내 중화항체 생성으로 점진적 효능감소가 나타나며, 환자 부담 비용이 높다는 단점이 있다. 한편 JAK 억제제는 항염증 효능은 우수하나 중증 감염을 증가시킬 위험이 있으며, 임상시험에서 심혈관계 부작용 및 발암성 위험이 확인된 바 있다. 난치성 염증 질환은 재발률이 높으며, 치료를 위해 장기 투여가 필요한 질환이다. 하지만 현재까지 개발된 치료제들은 이러한 시장 미충족 수요를 만족시키지 못하고 있으며, 따라서 새로운 치료제 개발이 필요한 상황이다.
체내 염증 반응의 핵심이 되는 NLRP3 염증복합체(Inflammasome) 형성은 미생물 감염 및 세포 손상에 대한 반응으로 인한 caspase-1 활성화 및 pro-inflammatory 사이토카인 IL-1β/IL-18의 분비를 매개하는 선천 면역의 중요한 구성 요소 중 하나이다. 염증복합체는 염증 반응의 활성화를 담당하는 선천성 면역계의 세포질 다중단백질 다중결합체(cytosolic multiprotein oligomer)로, 염증복합체의 활성화는 caspase-1을 통한 gasdermin-D의 절단뿐만 아니라, 전-염증성 사이토카인 pro-IL-1β와 pro-IL-18의 IL-1β 및 IL-18로의 단백질 분해, 성숙 및 분비를 촉진한다. 그리고 이러한 염증복합체 활성화의 조절에 있어 장애가 생기면 암, 대사성 질환, 퇴행성 질환, 염증성 질환 등 다양한 질환이 유발된다. 구체적으로 NLRP3 염증복합체의 비정상적인 활성화는 궤양성 대장염, 통풍, 다발성경화증, 관절염, 패혈증, 염증성 신경질환 등 다양한 염증성 질환의 발병과 병증악화에 연관되어 있다. 이러한 NLRP3 염증복합체는 바이러스, 박테리아와 같은 병원균의 PAMP 및 calcium influx, 미토콘드리아 활성산소, 세포 외 APT와 같은 DAMP 자극에 의해서도 활성화된다.
한편 P2X7 수용체는 P2Xn 퓨린 수용체군에 속하는 복합체로 구성된 이온 통로 수용체이며, P2X7을 자극하면 칼륨이온의 세포 외 방출과 칼슘이온 및 나트륨 이온을 세포 안으로의 빠른 이동을 촉진하는 역할을 하고 있다. 체내외 염증인자 발생으로 인한 질병 상태에서는 세포 외 ATP의 농도가 크게 상승하여 P2X7 수용체가 활성화되며, 이는 NLRP3 염증복합체를 촉진 시키는 칼륨이온의 배출과 세포 내 이온 불균형을 촉발하게 된다. 아울러 NLRP3 염증복합체에 의해 활성화 및 이로 인한 pro-IL-1β/pro-IL-18 활성화를 통해 세포 사멸 및 주변 조직의 염증반응 심화가 진행되게 된다. 이와 같이 염증반응 진행에서 중요하게 작용하는 P2X7 수용체는 다양한 면역세포, 표피세포 또는 신경세포 등에 광범위하게 발현되고 있으며, P2X7 수용체 신호전달은 NLRP3 활성화의 정규 및 비정규 경로 모두를 활성화시키기 때문에, ATP-P2X7 상호작용은 NLRP3 염증복합체 활성화에 있어 매우 중요하다고 할 수 있다. 일례로 괴사한 세포에서 방출되어지는 높은 농도의 ATP는 pro-inflammatory DAMPs로 작용하여 P2X7 수용체에 결합하고 NLRP3 염증복합체를 활성화 시킨다.
염증반응의 주요 조절 인자인 NLRP3 염증복합체를 표적으로 진행된 신약개발 시도는 과거 수차례 시도된 바 있다. 근래에 이르러 pro-caspase, gasdermin D, ASC, NLR 단백질, AIM2, IF116, pyrin 등으로 이루어진 정규 및 비정규 경로를 통해 염증복합체가 활성화된다는 점과, 이러한 과정에서 염증복합체의 조절 장애가 발생하면 다양한 질환을 유발된다는 것이 알려지면서, 염증복합체 관련 신호에 관여하는 단백질을 표적으로 한 약물의 개발이 2010년 이후 활발해지기 시작했다. 개발되어진 염증복합체 조절제로는 P2X7 수용체 antagonist, NLRP3 inhibitor, caspase-1 inhibitor가 대표적이라 할 수 있다. 구체적으로 P2X7 antagonist는 화이자, 아스트라제네카, 얀센과 같은 글로벌 제약사에서 류마티스 관절염, 크론병, 우울증 등을 적응증으로 하여 개발에 착수하였으나 임상에서 효능이 미달되어 대부분 개발이 중단되었다. Caspase-1 inhibitor는 임상에서 유효성 목표 미달 및 안전성 문제로 2020년 중단됨에 따라 글로벌 개발 파이프라인이 없는 상태이다. NLRP3 inhibitor는 OLATEC, IMFLAZOME, IFM THERAPETICS, NODTHERA, AC Immune과 같은 벤처기업에서 골관절염, 수축기 심부전, 파킨슨병, 염증성 장 질환, 알츠하이머병 등을 적응증으로 하여 개발 중이다. 전술한 바와 같이 이러한 염증복합체 조절제 신약들은 대부분 임상시험에서 성공을 거두지 못하였으며, 이의 원인은 이들이 표적하는 신약 표적만으로는 NLRP3 염증복합체를 활성화시키는 pro-inflammatory pathway의 다양성을 효과적으로 억제하지 못하기 때문인 것으로 알려져 있다. 즉 현재까지 알려진 염증복합체 조절제 신약인 P2X7 수용체 antagonist, NLRP3 inhibitor, caspase-1 inhibitor는 IL-1β, IL-18과 같은 염증 활성으로 촉발되는 염증성 사이토카인에 대해 선택적으로 억제하나, 염증개시 단계에서 촉발되는 염증성 사이토카인 TNF-α는 억제하지 못하는 한계가 있다. 이는 NLRP3 또는 P2X7 만을 선택적으로 표적으로 하는 신약이 가지고 있는 기본적인 한계로, 염증 활성단계 만을 선택적으로 차단하는 약리기전 만으로는 다양한 우회경로를 통한 염증반응을 억제하지 못하는 것이라 할 수 있다. 즉 보상적인 우회경로의 대체 활성으로 현 염증복합체 조절제 신약에 대한 환자 약물 반응성 및 항염증 효과가 미충족되는 경우가 다수 임상에서 보고되고 있다.
이에 더하여, NLRP3와 P2X7에 내재해 있는 유전적 중복성과 다형성 때문에, 현 염증복합체 조절제 신약들이 실제 임상에서는 목표한 약효 반응률이 나오지 않는다는 것도 밝혀졌다. 구체적으로 NLPR3 염증복합체와 동일한 단백질 도메인을 가지는 유사 NLRP 염증복합체군에 존재하기 때문에, 이것이 원인이 되어 염증복합체 조절제 신약들의 표적 이탈(off-target) 부작용 발생됨이 알려져 있다. P2X7 단백질과 NLRP3 단백질은 수백~수천개의 SNP(단일 핵산염기 다형현상, Single nucleotide polymorphism)가 밝혀져 개인별 유전자 다양성이 매우 높아 약물 반응률 및 유효성의 개체차가 크게 발생하는 경우가 많아서, 이를 표적하는 신약이 개인적 편차 없이 광범위한 약효를 가지는 치료제가 될 가능성은 낮다고 할 수 있다. 이상에서 기술한 것과 같이 현재까지 개발된 염증복합체 표적 신약, P2X7 수용체 antagonist, NLRP3 inhibitor, caspase-1 inhibitor는 목표한 임상적 효능을 갖기에는 많은 한계점을 가지고 있다고 할 수 있다.
한편 기존 염증복합체 표적 신약의 단점을 극복하기 위한 시도로, 최근 염증복합체의 상위 신호를 조절하는 GPCR19을 표적으로 치료제의 개발이 진행되고 있다. 구체적으로 TUDCA와 INT-747(Obeticholic acid, OCA), 그리고 INT-777(S-EMCA)등이 대표적인 예이며, TUDCA의 경우 현재 2형 당뇨병, 궤양성 대장염, 루게릭병 등의 질환에 대해, 그리고 INT-747은 담즙성 경변증, 비알코올성 지방간염, 간경화 등의 질환에 대해 임상시험이 진행되고 있는 중이다. 이들 모두는 담즙산 유도체들이며, GPCR19의 작용제로서 연구가 진행 중이다. 특히 GPCR19는 주로 면역세포에서 특이적으로 높게 발현되며, 면역세포 매개 항염증 효과를 선택적으로 유도하기 때문에 정상세포에 영향을 주는 비특이적인 부작용이 낮은 장점이 있다. 이는 기존 항염증제인 스테로이드제, JAK 억제제의 대상 약물 표적이 염증 부위 외 전신에 분포하고 있기에, 표적에 대한 약리작용 외에도 광범위한 전신 반응이 유도되며, 그 결과 전신 대사 부작용, 감염 위험 증가 및 고발암성의 부작용 위험이 보고되고 있는 점을 고려할 때, GPCR19 표적 신약이 안전성 측면에서 큰 장점을 가질 것으로 판단된다.
현재까지 개발된 GPCR19 표적 치료제의 경우, 아직 임상에서 효능이 입증된 신약이 없는 상황이다. 가장 앞서 개발 중이었던 GPCR19 표적 치료제의 경우, 항염증 효과가 높지 않아서 염증성 질환을 대상으로 한 임상 3상 시험을 실패한 사례가 있다. 사실 초기의 GPCR19 표적 치료제들은 GPCR19의 항염증 기전에 대한 정확한 고찰 없이 인위적으로 GPCR19을 고발현시킨 세포주를 이용하여 도출된 신약이며, 이는 체내에서의 GPCR19를 통한 염증 개시, 활성 단계를 올바르게 반영하지 않는 시스템을 통해 개발된 신약들이었으며, 이러한 개발 환경으로 인해 임상 실패 사례가 발생된 것으로 판단된다. 따라서 GPCR19 표적 치료를 통해 염증 개시 및 활성화 모두를 차단할 수 있는 광범위한 항염효과를 지닌 신약 개발이 여전히 필요한 상황이다.
한편 최근 GPCR19 조절제로서 새롭게 연구되고 있는 화합물로는 담즙산(Bile acid)이 알려져 있다. 담즙산은 소수성 및 친수성 영역을 함께 가지는 양친매성 분자이다. 담즙산의 생성과정을 살펴보면, 콜레스테롤(cholesterol)을 전구체(precursor)로 간에서 시토크롬 P450(cytochrom P450) 효소에 의해서 콜산(cholic acid)와 케노디옥시콜산(chenodeoxyholic acid) 형태의 1차 담즙산(primary bile acid)이 만들어지며, 이후, 간세포들에 의해 타우린(taurine), 글리신(glycine)과 결합하여 더욱 친수성을 가지면서 장으로 이동, 장내 미생물에 의해 2차 담즙산(secondary bile acid)의 형태로 바뀐다. 2차 담즙산은 간-장 순환을 통해서 간으로 재흡수, 혈관을 통해서 다양한 조직으로 이동하여 다양한 생리적 기능을 수행한다. 구체적으로, 양친매성 특징을 통한 지방의 소화, 산성을 통한 유해한 장내 미생물의 과증식 억제, 장관순환 과정 중 콜레스테롤의 배출 등의 역할을 한다. 또한, 세포핵 수용체인 파네소이드 X 수용체(farnesoid X receptor;FXR) 및 세포막 G 단백질 결합 수용체(G protein-coupled receptor)인 G 단백질 결합 담즙산 수용체 1(G protein-coupled bile acid receptor1; GPBAR1, GPCR19) 등의 수용체를 통해서 신호전달을 하는 것으로 알려졌다. 구체적으로 파네소이드 X 수용체에 결합한 담즙산은 당합성(gluconeogenesis)과 지질합성(lipogenesis) 유전자를 억제하여 간에서의 당합성과 지질합성을 억제하며, G 단백질 결합 담즙산 수용체 1과의 결합은 체내의 대사량 촉진, 인슐린(insulin) 분비 촉진, 사이토카인(cytokine) 분비 억제 등의 역할을 한다. 특히, G 단백질 결합 담즙산 수용체 1과의 결합은 염증반응(inflammation response)를 억제하기 때문에, 담즙산을 치료제로 하는 염증 및 자가면역질환과 관련된 피부, 신경, 위, 장, 간, 관절 등의 질환 치료 연구가 활발히 진행되고 있다.
섬유증(fibrosis)은 세포외 매트릭스, 특히 원섬유(fibrillar) 콜라겐의 비정상적이거나 과도한 축적으로 정의될 수 있으며, 다양한 조직의 구조 및 기능을 변화시키는 손상(injury) 또는 염증에 따른 콜라겐 매트릭스의 비정상적인 축적을 말한다. 염증은 폐에서 섬유증의 발달에 중심이 되고 비만세포를 비롯한 염증 세포는 폐섬유증에서 풍부하게 발견된다.
폐섬유증은 폐포 및 폐의 간질성 조직의 팽윤 및 흉터를 유발하는 만성 질환으로, 이와 같은 흉터 조직이 건강한 조직을 대체하여 염증을 유발하며, 만성 염증은 섬유증의 전조로 파악될 수 있다. 이와 같은 폐 조직의 손상으로 인하여 폐가 뻣뻣하게 될 수 있고, 개체가 자가호흡이 어려워지게 될 수 있다.
이중 특발성 폐섬유증(Idiopathic Pulmonary Fibrosis, IPF)은 만성, 진행성, 원인을 알 수 없는 돌이킬 수 없는 섬유질 간질성 폐렴의 특이 형태로서 정의되며, 노인에서 주로 발생한다. 미국에서는 10만 명이 특발성 폐섬유증을 앓고 있으며, 진단 후 수년 내 사망할 위험성이 높고 예후가 좋지 않다. 치료 옵션은 증상 및 기관 기능을 개선하기 위해 질병의 진행을 중지하고 산소를 보충하는 것으로 한정된다. IPF의 임상 과정에는 종종 입원으로 이어지는 급성 악화가 포함된다.
특발성 폐섬유증 환자에게 항섬유화 효과가 있는 퍼페니돈(pirfenidone)과 닌테다닙(nintedanib) 약물을 사용한다. 이들 약물의 약리기전은 구체적으로 퍼페니돈은 섬유아세포의 증식과 콜라겐의 합성을 억제함으로써 항섬유화 작용을 나타내며, 닌테다닙은 섬유성 성장인자 수용체들을 표적으로 하는 저분자 타이로신카이나제 억제제(Tyrosine kinase inhibitor)로, 주요 표적이 되는 수용체는 혈소판유래 성장인자 수용체(PDGFRα, β), 섬유아세포 성장인자수용체(FGFR1, 2, 3), 혈관내피 성장인자수용체(VEGFR1, 2, 3)이며, 표적 수용체와 경쟁적으로 결합하여 세포 내에서의 신경전달 과정을 차단하는 병리 기전을 가진다. 이들 약물은 질병의 진행 속도를 지연하는 효과가 있는 것으로 입증되었으나 근본적으로 질환을 치료하지는 못하며, 퍼페니돈의 경우 사용자의 10% 이상은 소화기계(소화불량, 식욕부진, 구역, 설사 등), 피로, 두통, 발진등의 부작용을 나타내며, 사용자의 1~10%는 중추신경계(불면, 어지러움, 졸음 등), 피부(광과민증, 가려움증 등), 소화기계(미각 이상, 복통, 복부팽만 등), 체중감소, 간수치 상승, 가슴 통증, 관절통, 무력증 등의 부작용, 사용자의 1% 미만은 혈관부종, 무과립구증 등의 부작용이 보고되어 있으며, 닌테다닙의 경우 사용자의 10% 이상에서 위장관계 이상(설사, 구토, 구역, 복통), 간담도 이상(간효소 상승, 알라닌아미노기전이효소(ALT) 상승), 대사 및 영양 이상, 식욕 감소를 보이며, 사용자의 1~10%에서는 간담도 이상(약물에 의한 간 손상, 아스파르트산아미노기전이효소(AST) 상승, 알칼리성인산분해효소(ALKP) 상승, 감마글루타밀전이효소(GGT) 상승), 혈관 이상(고혈압, 출혈), 대사 및 영양 이상(체중 감소), 신경계 이상(두통), 사용자의 1% 미만에서 위장관계 이상(췌장염), 간담도 이상(고빌리루빈혈증), 혈액과 림프계통 이상(혈소판 감소증), 피부 및 피하조직 이상(탈모)의 부작용이 보고되었다. 또한, 현재 특발성 폐섬유증 치료제로 개발 중인 약물로는 pentraxin-2, CTGF(connective tissue growth factor) 억제제, autotaxin 억제제, PI3 kinase/mTOR 억제제, galectin-3 억제제 등의 약물이 개발 중에 있고, 많은 임상 연구들이 진행되고 있지만, 아직까지 이 질병을 완치할 수 있는 약물은 없고, 질병이 진행된 환자는 경우에 따라 폐 이식을 고려해야 할 수 있다. 따라서 이러한 특발성 폐섬유증에 대해 치료 효과를 나타낼 수 있는 치료제 개발이 시급한 실정이다.
아울러, 이러한 종래기술을 비롯한 기존의 특발성 폐섬유증의 치료를 위해 마련된 약학 조성물의 경우, 부분적 치료 효과가 제공되거나 효과의 제공 수준이 미미하여 유의성을 갖추지 못하여 폐섬유증의 발병 혹은 진행을 지연하거나 치료할 수 있는 근본적 효과를 제공하지 못하는 문제점이 있다.
또한, 종래기술을 비롯한 기존의 특발성 폐섬유증의 치료를 위해 마련된 약학 조성물의 경우, 화학 성분에 기초한 조성의 생체 친화성이 낮고, 부작용 발생률이 높았으며, 생산성을 고려한 대량 생산 및 품질 관리에서 어려움을 겪고 있다.
이에, 본 발명자들은 폐섬유증에서 우수한 치료 효과를 보이며 안전하고 부작용이 적은 치료제를 개발하기 위해 노력한 결과, 타우로데옥시콜린산의 약학적으로 허용가능한 염을 투여한 특발성 폐섬유증 동물모델 및 폐섬유증 세포모델에서 폐 섬유화 및 폐 섬유화 관련 인자 발현이 감소하는 것을 확인하여, 상기 타우로데옥시콜린산 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 폐섬유증 예방 또는 치료용 조성물의 유효성분으로 이용할 수 있음을 밝힘으로써, 본 출원에 이르게 되었다.
WO 2019-139956 (2019.07.18) WO 2015-189401(2015.12.17) WO 2017-152048 (2017.09.08) WO 2019-126089 (2019.06.27)
최원일, 특발성폐섬유증 치료의 현재와 미래, J Korean Med Assoc. 2021;64(4):256-263
본 발명의 목적은 효과가 우수하고 부작용이 적은 폐섬유증 예방, 치료 또는 개선용 조성물로, 타우로데옥시콜린산(taurodeoxycholic acid) 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 함유하는 폐섬유증 예방, 치료 또는 개선용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 타우로데옥시콜린산(taurodeoxycholic acid) 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 함유하는 폐섬유증 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 타우로데옥시콜린산 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 함유하는 폐섬유증 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
아울러, 본 발명은 타우로데옥시콜린산 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 함유하는 폐섬유증 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명자들은 블레오마이신에 의해 유도된 특발성 폐섬유증 동물모델 및 TGF-β에 의해 유도된 폐섬유증 세포모델에 타우로데옥시콜린산(taurodeoxycholic acid)의 약학적으로 허용가능한 염을 투여한 결과 폐 섬유화 및 폐 섬유화 관련 인자 발현이 감소하는 것을 확인하였으므로, 상기 타우로데옥시콜린산 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 폐섬유증 예방 또는 치료용 조성물의 유효성분으로 이용될 수 있다.
도 1은 블레오마이신에 의해 유도된 특발성 폐섬유증 동물모델을 제작하고, 상기 동물모델에 타우로데옥시콜산(taurodeoxycholic acid)의 소듐염인 소듐 타우로데옥시콜레이트(sodium taurodeoxycholate, 이하 "HY209"라 함)를 투여하는 방법을 모식화한 도이다.
도 2는 블레오마이신에 의해 유도된 특발성 폐섬유증 동물모델에 HY209 투여 후 체중 변화를 확인한 도이다.
도 3은 블레오마이신에 의해 유도된 특발성 폐섬유증 동물모델에 HY209 투여 후 폐 무게 변화를 확인한 도이다(*나트로솔 투여군 대비 p<0.05, #폐섬유화군 대비 p<0.05).
도 4는 블레오마이신에 의해 유도된 특발성 폐섬유증 동물모델에 HY209 투여 후 조직병리학적 변화를 확인한 도이다(#대조군 대비 p<0.05, *나트로솔 투여군 대비 p<0.05, **폐섬유화군 대비 p<0.05).
도 5는 블레오마이신에 의해 유도된 특발성 폐섬유증 동물모델에 HY209 투여 후 α-SMA 발현 분포 변화를 확인한 도이다(*나트로솔 투여군 대비 p<0.05, #폐섬유화군 대비 p<0.05).
도 6은 인간 폐섬유세포인 MRC5 세포주에 TGF-β로 섬유화를 유도하고, 동시에 HY209 또는 TUDCA를 처리한 후 Col1α1, α-SMA 또는 PAI-1의 발현의 변화를 확인한 도이다(*TGF-β 단독처리군 대비 p<0.05; **TGF-β 단독처리군 대비 p<0.01).
도 7a는 인간 단핵구 세포(human monocytic cell)인 U937 세포주를 PMA(phorbol 12-myristate 13-acetate)를 이용하여 대식세포로 분화하고, BzATP(2'(3')-O-(4-Benzoylbenzoyl)adenosine 5'-triphosphate)로 염증 반응을 유도한 후, HY209 또는 TUDCA 처리에 따른 염증성 사이토카인 IL-1β 생성 억제 효능을 측정한 도이다.
도 7b는 U937 세포주를 PMA(phorbol 12-myristate 13-acetate)를 이용하여 대식세포로 분화하고, Pam2CSK4(Pam2CysSerLys4)로 염증 반응을 유도한 후, HY209 또는 TUDCA 처리에 따른 염증성 사이토카인 TNF-α 생성 억제 효능을 측정한 도이다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
본 발명에 있어서 용어 "예방"이란 본 발명의 조성물 투여로 질환의 발생, 확산 및 재발을 억제시키거나 지연시키는 모든 행위를 의미하고, 용어 "치료"란 본 발명의 조성물 투여로 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에 있어서 용어 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 제공하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 일반적인 모든 경로를 통하여 경구 또는 비경구 투여될 수 있다. 또한, 조성물은 활성물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
본 발명은 타우로데옥시콜린산(taurodeoxycholic acid) 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 함유하는 폐섬유증(Pulmonary Fibrosis) 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명에서, 상기 타우로데옥시콜린산은 담즙산의 일종으로, 타우린이 접합된 데옥시콜린산(taurine-conjugated deoxycholic acid) 형태이며, 하기 [화학식 1]로 기재되는 화학 구조를 갖고, 보다 구체적으로 하기 [화학식 2]로 기재되는 화학 구조를 갖는다:
[화학식 1]
,
[화학식 2]
.
또한, 상기 타우로데옥시콜린산은 동물의 사체, 예컨대 소, 돼지, 양, 개, 염소 또는 토끼와 같은 동물로부터 분리한 것, 시판되는 것, 합성한 것 모두 무방하게 사용할 수 있다.
본 발명에서, 상기 폐섬유증은 폐에서의 과도한 섬유성 연결 조직의 형성 또는 발달(섬유증)로 인해, 흉터가 생긴(섬유성) 조직의 발달을 의미한다. 구체적으로, 폐섬유증은 폐포 및 폐의 간질성 조직의 팽윤 및 흉터를 유발하는 만성 질환이다. 이와 같은 흉터 조직이 건강한 조직을 대체하여 염증을 유발하며, 만성 염증은 섬유증의 전조로 파악될 수 있다. 이와 같은 폐 조직의 손상으로 인하여 폐가 뻣뻣하게 될 수 있고, 개체가 자가호흡이 어려워지게 될 수 있다.
또한, 상기 폐섬유증은 구체적으로 특발성 폐섬유증(Idiopathic Pulmonary Fibrosis), 비특이성 간질성 폐렴(Nonspecific Interstitial Pneumonia), 급성간질성 폐렴 (Acute Interstitial Pneumonia), 특발성 기질화 폐렴(Cryptogenic Organizing Pneumonia), 호흡계기관지염 관련성 간질설 폐질환(Respiratory Bronchiolitisassociated Interstitial Lung), 박리성 간질성 폐렴 (Desquamative Interstitial Pneumonia), 임파구성 간질성 폐렴(Lymphoid Interstitial Pneumonia), 간질성 폐섬유증 또는 미만성 폐섬유증일 수 있고, 보다 구체적으로 특발성 폐섬유증일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 폐섬유증은 다양한 원인, 예를 들면 미세입자(석면, 돌가루, 금속 분진, 담배연기에 존재하는 입자들, 실리 카 분진 등)의 흡입에 의해 유도되는 폐의 미세 손상에 의해 발병할 수 있다. 또한, 폐섬유증은 다른 질병(자가면역질환, 바이러스 또는 박테리아 감염 등)의 부차적인 영향으로 발생할 수 있고, 세포독성 제제(블레오마이신, 부설판 및 메토트렉세이트 등); 항생제(니트로푸란토인 및 술파살라진 등); 부정맥 치료제(아미오다론 및 토카이니드 등); 항염증 약물(금 및 페니실아민 등); 불법 약물(마약, 코카인 및 헤로인 등)과 같은 특정 약물들에 의해 유발될 수 있다. 상기 특발성 폐섬유증의 경우에는 이와 같은 원인 이외의 다른 알 수 없는 원인에 의해 나타나는 것일 수 있다.
본 발명에서, 상기 조성물은 폐 섬유화 관련 인자, 예컨대 Col1α1, α-SMA 또는 PAI-1의 발현을 감소시킴으로써, 상기 폐섬유증을 예방 또는 치료할 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 블레오마이신에 의해 유도된 특발성 폐섬유증 동물모델에 타우로데옥시콜린산의 약학적으로 허용가능한 염을 투여한 결과 폐 섬유화 및 폐 섬유화 관련 인자인 α-SMA 발현이 감소하는 것을 확인하였다. 또한, TGF-β에 의해 유도된 폐섬유증 세포모델에 타우로데옥시콜린산의 약학적으로 허용가능한 염을 투여한 결과 폐 섬유화 관련 인자인 Col1α1, α-SMA 및 PAI-1 발현이 감소하는 것을 확인하였다. 이에, 상기 타우로데옥시콜린산 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 폐섬유증 예방 또는 치료용 약학 조성물의 유효성분으로 이용될 수 있다.
본 발명의 타우로데옥시콜린산은 약학적으로 허용되는 염, 이로부터 제조될 수 있는 가능한 용매화물, 수화물, 라세미체, 또는 입체이성질체를 모두 포함한다.
본 발명의 타우로데옥시콜린산은 약학적으로 허용가능한 염의 형태로 사용할 수 있으며, 염으로는 약학적으로 허용가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산 부가염이 유용하다. 산 부가염은 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요드화수소산, 아질산 또는 아인산과 같은 무기산류와 지방족 모노 및 디카르복실레이트, 페닐-치환된 알카노에이트, 하이드록시 알카노에이트 및 알칸디오에이트, 방향족 산류, 지방족 및 방향족 설폰산류와 같은 무독성 유기산으로부터 얻는다. 이러한 약학적으로 무독한 염류로는 설페이트, 피로설페이트, 바이설페이트, 설파이트, 바이설파이트, 니트레이트, 포스페이트, 모노하이드로겐 포스페이트, 디하이드로겐 포스페이트, 메타포스페이트, 피로포스페이트 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드, 플루오라이드, 아세테이트, 프로피오네이트, 데카노에이트, 카프릴레이트, 아크릴레이트, 포메이트, 이소부티레이트, 카프레이트, 헵타노에이트, 프로피올레이트, 옥살레이트, 말로네이트, 석시네이트, 수베레이트, 세바케이트, 푸마레이트, 말리에이트, 부틴-1,4-디오에이트, 헥산-1,6-디오에이트, 벤조에이트, 클로로벤조에이트, 메틸벤조에이트, 디니트로 벤조에이트, 하이드록시벤조에이트, 메톡시벤조에이트, 프탈레이트, 테레프탈레이트, 벤젠설포네이트, 톨루엔설포네이트, 클로로벤젠설포네이트, 크실렌설포네이트, 페닐아세테이트, 페닐프로피오네이트, 페닐부티레이트, 시트레이트, 락테이트, 하이드록시부티레이트, 글리콜레이트, 말레이트, 타트레이트, 메탄설포네이트, 프로판설포네이트, 나프탈렌-1-설포네이트, 나프탈렌-2-설포네이트 또는 만델레이트를 포함한다.
본 발명에 따른 산 부가염은 통상의 방법, 예를 들면, 본 발명의 타우로데옥시콜린산을 과량의 산 수용액 중에 용해시키고, 이 염을 수혼화성 유기 용매, 예를 들면 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴을 사용하여 침전시켜서 제조할 수 있다. 또한, 이 혼합물에서 용매나 과량의 산을 증발시켜서 건조하거나 또는 석출된 염을 흡입 여과시켜 제조할 수도 있다.
또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염은, 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물 염을 여과하고, 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속염으로는 소듐, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하고, 보다 구체적으로 타우로데옥시콜린산의 경우 소듐염을 제조하는 것이 적합하다. 또한, 이에 대응하는 은염은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염을 적당한 은염(예, 질산은)과 반응시켜 얻는다.
본 발명의 타우로데옥시콜린산 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 치료적으로 유효한 양으로 포함할 수 있고, 약학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 "유효한 양 또는 유효량"은 질환을 늦추거나 또는 최소화하거나; 또는 질환의 치료 또는 관리에서 치료상 이점을 제공하기에 충분한 본 발명의 화합물의 양을 말한다.
상기 약학적으로 허용가능한 담체로는 예컨대, 경구 투여용 담체 또는 비경구 투여용 담체가 사용될 수 있다. 경구 투여용 담체는 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등을 포함할 수 있다. 또한, 비경구 투여용 담체는 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등을 포함할 수 있으며, 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).
본 발명의 약학 조성물은 인간을 비롯한 포유동물에 어떠한 투여 경로로도 투여할 수 있다. 경구 또는 비경구적으로 투여할 수 있다.
비경구적인 투여방법으로는 예를 들어, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장내 투여일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 예컨대, 본 발명의 약학 조성물을 주사형 제형으로 제조하여 이를 30 게이지의 가는 주사 바늘로 피부를 가볍게 단자 (prick)하는 방법, 또는 피부에 직접적으로 도포 또는 부착하는 방법으로 투여될 수도 있다.
본 발명의 약학 조성물은 상술한 바와 같은 투여 경로에 따라 경구 투여용 또는 비경구 투여용 제제로 제형화 할 수 있다.
경구 투여용 제제의 경우에 본 발명의 조성물은 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 슬러리제, 현탁액 등으로 당업계에 공지된 방법을 이용하여 제형화될 수 있다. 예를 들어, 경구용 제제는 활성성분을 고체 부형제와 배합한 다음 이를 분쇄하고 적합한 보조제를 첨가한 후 과립 혼합물로 가공함으로써 정제를 수득할 수 있다. 적합한 부형제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 및 말티톨 등을 포함하는 당류와 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분 및 감자 전분 등을 포함하는 전분류, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸-셀룰로즈 등을 포함하는 셀룰로즈류, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 등과 같은 충전제가 포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있다. 나아가, 본 발명의 약학 조성물은 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
비경구 투여용 제제의 경우에는 주사제, 크림제, 로션제, 외용연고제, 오일제, 보습제, 겔제, 패치제, 에어로졸 및 비강흡입제의 형태로 당업계에 공지된 방법으로 제형화할 수 있다. 이들 제형은 모든 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975. Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania 18042, Chapter 87: Blaug, Seymour)에 기재되어 있다.
본 발명의 약학 조성물의 총 투여량은 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있고, 또는 다중 투여량(multiple dose)으로 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 질환의 증상에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있다. 구체적으로 본 발명의 조성물의 전체 용량은 1일당 환자 체중 1 ㎏ 당 약 0.01 ㎍ 내지 1,000 mg, 보다 구체적으로 0.1 ㎍ 내지 100 mg일 수 있다. 그러나 상기 본 발명의 약학 조성물의 용량은 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 질환의 중증도, 식이, 배설율 등 다양한 요인들을 고려하여, 당 분야의 통상적인 지식을 가진 자가 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 본 발명에 따른 약학 조성물은 본 발명의 효과를 보이는 한 그 제형, 투여 경로 및 투여 방법에 특별히 제한되지 아니한다.
또한, 본 발명의 약학 조성물은 개별 치료제로 투여되거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있다. 다른 치료제와 병용하여 투여되는 경우, 본 발명의 조성물과 다른 치료제는 동시에, 개별적으로 또는 순차적으로 투여될 수 있다. 이때 다른 치료제라 함은 폐섬유증 질환의 치료 또는 개선 효과를 갖는 것으로 이미 알려져 있는 물질일 수 있다. 본 발명의 약학 조성물이 다른 치료제와 병용하여 투여될 경우, 본 발명의 조성물과 다른 치료제는 각각 별도의 용기로 분리시켜 제형화 되거나, 같은 제형에서 함께 복합 제형화 될 수 있다.
또한, 본 발명은 타우로데옥시콜린산 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 함유하는 폐섬유증 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명에서, 상기 타우로데옥시콜린산 또는 이의 약학적으로 허용되는 염에 대한 내용은 전술한 바와 동일하므로, 구체적인 설명은 상기 내용을 원용하고, 이하에서는 건강기능식품 조성물의 특유한 구성에 대해서만 설명하도록 한다.
한편, 본 발명자들은 블레오마이신-유도된 특발성 폐섬유증 동물모델 및 TGF-β에 의해 유도된 폐섬유증 세포모델에 타우로데옥시콜린산의 약학적으로 허용가능한 염을 투여한 결과 폐 섬유화 및 폐 섬유화 관련 인자 발현이 감소하는 것을 확인하였으므로, 상기 타우로데옥시콜린산 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 폐섬유증 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물의 유효성분으로 이용될 수 있다.
본 발명의 건강기능식품 조성물은 분말, 과립, 환, 정제, 캡슐, 캔디, 시럽 및 음료 중에서 선택된 어느 하나의 제형으로 제조될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 건강기능식품 조성물은 질환을 예방하거나 개선하기 위해 섭취할 수 있는 것이면 특별히 제한되지 않는다. 본 발명의 건강기능식품 조성물을 식품첨가물로 사용하는 경우, 상기 건강기능식품 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분은 그의 사용 목적(예방 또는 개선)에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시 본 발명의 건강기능식품 조성물에 대하여 15 중량부 이하, 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가된다. 그러나 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로 사용될 수 있다. 상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 건강기능식품 조성물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 수프, 음료수, 차 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다. 또한, 본 발명의 건강기능식품 조성물은 식품, 특히 기능성 식품으로 제조될 수 있다.
본 발명의 기능성 식품은 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소 및 조미제를 포함한다. 예컨대, 드링크제로 제조되는 경우에는 유효성분 이외에 천연 탄수화물 또는 향미제를 추가 성분으로서 포함할 수 있다. 상기 천연 탄수화물은 모노사카라이드(예컨대, 글루코오스, 프럭토오스 등), 디사카라이드(예컨대, 말토스, 수크로오스 등), 올리고당, 폴리사카라이드(예컨대, 덱스트린, 시클로덱스트린 등) 또는 당알코올(예컨대, 자일리톨, 소르비톨, 에리쓰리톨 등)인 것이 바람직하다. 상기 향미제는 천연 향미제(예컨대, 타우마틴, 스테비아 추출물 등)와 합성 향미제(예컨대, 사카린, 아스파르탐 등)를 이용할 수 있다. 상기 건강기능식품 조성물 외에 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 더 함유할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 블레오마이신-유도된 특발성 폐섬유증 동물모델 제작 및 실험설계
폐섬유증에 있어서 타우로데옥시콜산(taurodeoxycholic acid, TDCA)의 효능을 알아보기 위하여, 블레오마이신에 의해 유도된 특발성 폐섬유증 동물모델을 제작하고, 상기 동물모델에 TDCA의 소듐염인 소듐 타우로데옥시콜레이트(sodium taurodeoxycholate, 이하 "HY209"라 함)를 투여하였다.
구체적으로, 9주령 C57B/L6 마우스를 구매하여 1주일간의 적응 기간을 거친 뒤 실험을 진행하였다. 실험동물은 온도 22±2℃, 상대습도 55±10%, 명암 주기가 12시간인 상태 아래 사육하였다. 물은 자유롭게 섭취할 수 있도록 하였으며, 사료는 멸균 사료를 이용하여 자유롭게 섭취하게 하였다.
그 다음, 도 1의 모식도와 같이 블레오마이신(bleomycin, BLM, Enzo Life Sciences, Inc., Cas. No. 9041-93-4) 1 mg/mL를 마우스의 비강내(intranasal) 일회 투여한 다음, 하기 [표 1]에 나타낸 바와 같이 7 그룹으로 나누고, 염증 기간(inflammation phase: Day 0~Day 7) 이후 섬유증 기간(fibrosis phase: Day 7~Day 21)에 시료를 투여하였다. 폐섬유화군은 시료로 비히클(0.5% CMC (carboxmethylcellulose) 용액) 10 mL/kg을 매일 2회 경구투여하였고, 실험군은 시료로 0.5% CMC 용액에서 최종 농도가 각각 10, 30, 60 mg/kg이 되도록 제형화한 HY209를 매일 2회 경구 투여하였다. 비교군(닌테다닙 투여군)은 시료로 비히클(0.1% 나트로솔(Natrosol; Hydroxyethylcellulose) 용액)에서 최종 농도가 60 mg/kg이 되도록 제형화한 닌테다닙(Nintedanib)를 매일 2회 경구투여하였다. 상기 닌테다닙 투여군과의 비교를 위한 폐섬유화군(나트로솔 투여군)은 0.1% 나트로솔 용액 10 mL/kg을 매일 2회 경구투여하였다. 대조군은 블레오마이신 대신 생리식염수를 투여하였고, 시료로 비히클(0.5% CMC (carboxmethylcellulose) 용액) 10 mL/kg을 매일 2회 경구투여하였다.
그룹 마리/그룹 Challenge IN D0 투여
(Day7-Day21)		 투여
방법		 투여
용량 		투여
횟수
대조군 5 생리
식염수
(saline)		 0.5% CMC






경구
투여		 10 mL/kg BID
폐섬유화군 15 블레오
마이신
(bleomycin)
1 mg/kg		 0.5% CMC 10 mL/kg BID
HY209 10 mg/kg 투여군 15 HY209 10 mg/kg BID
HY209 30 mg/kg 투여군 15 HY209 30 mg/kg BID
HY209 60 mg/kg 투여군 15 HY209 60 mg/kg BID
닌테다닙
투여군		 15 닌테다닙
(Nintedanib)		 60 mg/kg BID
나트로솔
투여군		 15 0.1% 나트로솔
(Natrosol)		 10 mL/kg BID
<실시예 2> 블레오마이신-유도된 특발성 폐섬유증 동물모델에서 HY209 투여에 따른 체중 변화 확인
상기 <실시예 1>의 마우스 각각의 체중 변화를 확인하였다.
구체적으로, 상기 <실시예>의 각 그룹 마우스의 실험이 진행되는 동안 매일 체중을 측정하였다.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이 HY209 투여군과 대조군 간 체중 변화는 크게 나타나지 않았다.
<실시예 3> 블레오마이신-유도된 특발성 폐섬유증 동물모델에서 HY209 투여에 따른 폐 무게 변화 확인
상기 <실시예 1>의 마우스 각각의 폐 무게 변화를 확인하였다.
구체적으로, 상기 <실시예>의 각 그룹 마우스를 실험 완료 후 희생시키고, 폐를 적출하였다. 적출한 폐의 무게를 측정하였다.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 폐섬유화군 및 나트로솔 투여군에서는 대조군과 비교해 보았을 때 블레오마이신에 의하여 유도된 특발성 폐섬유증으로 폐의 중량이 현저히 증가하였다. 반면, 닌테다닙 투여군은 나트로솔 투여군에 비하여 폐 중량이 현저히 감소하였다. 또한, 폐섬유화군과 비교해 보았을 때, HY209 10 mg/kg 투여군 및 HY209 60 mg/kg 투여군에서 폐 중량이 통계적으로 유의미하게 감소하였다.
<실시예 4> 블레오마이신-유도된 특발성 폐섬유증 동물모델에서 HY209 투여에 따른 조직병리학적 변화 확인
상기 <실시예 1>의 마우스 각각의 폐섬유화를 평가하였다.
구체적으로, 상기 <실시예>의 각 그룹 마우스를 실험 완료 후 희생시키고, 폐를 적출하였다. 적출한 폐는 조직병리학적 평가를 위해 파라핀에 포매하고 Crossman's Trichrome 방법(Gray P. The Microtomist's Formulary and Guide. Published by Robert E. Krieger Publishing Co.)에 따라 염색하였다. 폐 조직학적 변화는 하기 [표 2]의 Ashcroft score의 Matsuse 변형을 사용하여 평가하였다(Ashcroft H et al. J Clin Pathol (1988) 41:467-70; Matsuse T et al. Eur Respir J (1999) 13:71-77).
Ashcroft score 점수
Normal lung (no fibrosis) 1
Minimal fibrotic thickening of alveolar or bronchial walls (network of fine collagen fibrils) 2
Moderate fibrotic thickening of walls without obvious damage to lung architecture 3
fibrosis with damage of pulmonary structrue(coarse fibrous bands or small fibrous masses, intra-alveolar collagen fibrils) 4
Large fibrous area with severe distortion of lung structure 5
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 폐섬유화군 및 나트로솔 투여군에서는 대조군과 비교해 보았을 때 폐섬유화가 현저히 증가하였다. 반면, 닌테다닙 투여군은 나트로솔 투여군에 비하여 폐섬유화가 현저히 감소하였다. 또한, 폐섬유화군과 비교해 보았을 때, HY209 10 mg/kg 투여군 및 HY209 60 mg/kg 투여군에서 폐섬유화가 통계적으로 유의미하게 감소하였다.
<실시예 5> 블레오마이신-유도된 특발성 폐섬유증 동물모델에서 HY209 투여에 따른 폐 섬유화 관련 인자 발현 변화 확인
상기 <실시예 1>의 마우스 각각의 폐 조직 내 섬유화 관련 인자 발현 분포를 확인하였다.
구체적으로, 상기 <실시예 1>의 각 그룹 마우스를 실험 완료 후 희생시키고, 폐를 적출하였다. 적출한 폐는 조직병리학적 평가를 위해 파라핀에 포매하고 절편을 획득한 후, 슬라이드에 부착하였다. 그 후, 각각의 폐 조직 내 섬유화 관련 인자로 α-SMA의 발현 분포를 평가하였다.
항-α-SMA 항체를 사용하여 α-SMA에 대한 면역조직화학 분석을 수행하였다. 항원 검색은 Target retrieval solution pH 6(PT Link modul, DAKO)을 사용하여 수행하였다. 슬라이드를 1차 토끼 다클론 항-α-SMA 항체와 함께 반응한 후 ImmPRESS 검출 키트(Autostainer Link48, DAKO)와 반응하였다. de novo α-SMA 축적 수준은 디지털 이미지 분석 소프트웨어(Visiopharm®)를 사용하여 평가하였다. 결과는 α-SMA area를 백분율(%)로 나타내었다.
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 폐섬유화군 및 나트로솔 투여군에서는 대조군과 비교해 보았을 때 α-SMA area가 현저히 증가하였다. 폐섬유화군 및 나트로솔 투여군 사이에 현저한 차이는 나타나지 않았다.
반면, 닌테다닙 투여군은 폐섬유화군 및 나트로솔 투여군에 비하여 α-SMA area가 현저히 감소하였다. 또한, 폐섬유화군 및 나트로솔 투여군과 비교해 보았을 때, HY209 10 mg/kg 투여군 및 HY209 60 mg/kg 투여군에서 α-SMA area가 현저히 감소하였다.
<실시예 6> HY209와 TUDCA의 섬유화 관련 인자 발현 억제능 비교
폐섬유증에서 HY209와 TUDCA(tauroursodeoxycholic acid)의 섬유화 억제능을 비교하기 위하여, 인간 폐섬유세포인 MRC5 세포주에 TGF-β를 이용하여 섬유화 유도와 동시에 처리된 HY209와 TUDCA에 의한 섬유화 관련 인자 발현 억제능을 qPCR로 측정하였다.
구체적으로, 인간 폐섬유세포인 MRC5 세포주를 6-웰 플레이트에 웰당 2x10^5개의 세포로 분주한 후 밤새 배양하여 세포가 부착되도록 하였다. 그 다음, 배지를 제거하고 TGF-β1 5 ng/mL과 함께 HY209 또는 TUDCA 0, 0.1, 1, 10 μM을 처리하고 48시간 동안 배양한 후 세포를 수집하였다. 그 다음, RNeasy Mini Kit (QIAGEN)를 이용하여 세포에서 RNA를 추출하고, Maxime™ RT PreMix(LiliF Diagnostic)을 사용하여 cDNA를 합성하였다. qPCR 측정은 Power SYBR™ Green PCR Master Mix(Thermo Scientific)를 사용하여 제조사의 절차에 따라 확인하였다. 또한, Col1α1, α-SMA 및 PAI-1에 대한 프라이머를 이용하여 이들 발현을 확인하였고, 내부표준(Internal standard)으로 GAPDH를 확인하였다.
그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, HY209는 0.1, 1, 10 μM에서 α-SMA와 PAI-1의 발현 억제를 하였으나, TUDCA는 0.1 및 1 μM의 농도에서는 억제능이 나타나지 않았고 10 μM에서만 억제능이 나타났다. 또한, HY209는 0.1, 1, 10 μM에서 Col1α1 발현이 감소하는 반면, TUDCA는 0.1 및 1 μM의 농도에서 오히려 발현이 증가하였다.
상기의 결과를 통해 HY209의 섬유화 관련 인자 발현 억제능이 TUDCA에 비해 현저히 우수함을 알 수 있다.
<실시예 7> HY209와 TUDCA의 염증 억제 효능 평가
HY209와 TUDCA의 항염증 효능을 평가하기 위해, 인간 단핵구 세포(human monocytic cell)인 U937 세포주에 PMA(phobol 12-myristate 13-acetate)를 처리하여 대식세포로 분화하고, BzATP(2'(3')-O-(4-Benzoylbenzoyl)adenosine 5'-triphosphate) 또는 Pam2CSK4(Pam2CysSerLys4)로 염증반응을 유도한 후, HY209 또는 TUDCA의 염증성 사이토카인 IL-1β 및 TNF-α 생성 억제 효능을 측정하였다.
구체적으로, 인간 단핵구 세포인 U937 세포를 웰당 70,000개의 세포로 96-웰 플레이트에 50 nM PMA(phobol 12-myristate 13-acetate)를 포함하는 RPMI1640 배지로 24시간 동안 배양하여 대식세포로 분화하였다. 각 웰에서 배지를 제거하고 HY209 또는 TUDCA를 농도별로 (HY209: 1, 0.5, 0.25, 0.125, 0.0625, 0.0312, 0.0156, 0.0078 μM, TUDCA: 1000, 316, 100, 31.6, 10, 3.16, 0.316, 0.1, 0.0316, 0.01, 0.00316 μM) 12시간 동안 처리한 후 BzATP(2'(3')-O-(4-Benzoylbenzoyl)adenosine 5'-triphosphate)를 최종 농도가 300 μM이 되도록 추가한 후 추가적으로 12시간 동안 배양하였다. 그 다음, 상층액을 수집하여 IL-1β ELISA 키트(R&D systems)를 이용하여 제조사의 절차에 따라 IL-1β를 측정하였다(도 7a).
또한, 인간 단핵구 세포인 U937 세포를 5x10^6개의 세포로 100파이 디쉬에 4 nM PMA(phobol 12-myristate 13-acetate)를 포함하는 RPMI1640 배지로 5시간 동안 배양하여 대식세포로 분화하였다. 분화된 대식세포는 96-웰 플레이트에 웰당 50,000개의 세포로 분주한 후 24시간 동안 배양하여 휴식기를 주었다. 그 다음, 배지를 무혈청배지로 바꾸어 주고 12시간 동안 배양하였다. 각 웰에서 배지를 제거하고 50 ng/mL의 Pam2CSK4(Pam2CysSerLys4)와 함께 HY209 또는 TUDCA를 농도별로 (HY209: 10, 4, 2, 1, 0.5, 0.25, 0.125, 0.0625, 0.03125 μM, TUDCA: 100, 50, 25, 12.5, 6.25, 3.125, 1.562, 0.76 μM) 4시간 동안 처리하고 상층액을 수집하였다. 수집한 상층액은 TNF-α ELISA 키트(R&D systems)를 이용하여 제조사의 절차에 따라 TNF-α를 측정하였다(도 7b).
그 결과, 도 7a 및 도 7b에 나타낸 바와 같이, HY209와 TUDCA는 IL-1β 생성 억제에 대해 각각 0.044, 1.496 μM의 IC50 값을 나타내고(도 7a), TNF-α에 대해 각각 0.36, 13.1 μM의 IC50 값을 나타내었다(도 7b).
상기 결과를 통해 HY209가 TUDCA보다 IL-1β IC50은 34배, TNF-α IC50은 36배 낮은 값을 나타냄을 확인함으로써, HY209의 염증 억제 효능이 TUDCA에 비해 현저히 우수함을 알 수 있다.

Claims (9)

  1. 타우로데옥시콜린산(taurodeoxycholic acid) 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 함유하는 폐섬유증(Pulmonary Fibrosis) 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 타우로데옥시콜린산은 하기 [화학식 2]로 기재되는 화합물인, 폐섬유증 예방 또는 치료용 약학 조성물:
    [화학식 2]

  3. 제 1항에 있어서, 상기 약학적으로 허용가능한 염은 소듐염인, 폐섬유증 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 조성물은 폐 섬유증 관련 인자의 발현을 감소시키는 것인, 폐섬유증 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 폐 섬유증 관련 인자는 COL1α1, α-SMA 또는 PAI-1인, 폐섬유증 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  6. 제 1항에 있어서, 상기 폐섬유증은 특발성 폐섬유증(Idiopathic Pulmonary Fibrosis), 비특이성 간질성 폐렴(Nonspecific Interstitial Pneumonia), 급성간질성 폐렴 (Acute Interstitial Pneumonia), 특발성 기질화 폐렴(Cryptogenic Organizing Pneumonia), 호흡계기관지염 관련성 간질설 폐질환(Respiratory Bronchiolitisassociated Interstitial Lung), 박리성 간질성 폐렴 (Desquamative Interstitial Pneumonia), 임파구성 간질성 폐렴(Lymphoid Interstitial Pneumonia), 간질성 폐섬유증 및 미만성 폐섬유증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 폐섬유증 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  7. 제 1항에 있어서, 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함하는, 폐섬유증 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  8. 타우로데옥시콜린산 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 함유하는 폐섬유증 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
  9. 타우로데옥시콜린산 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 함유하는 폐섬유증 예방 또는 개선용 식품 조성물.
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