JP6504537B2 - ヤブレツボカビ類を用いたタンナーゼ活性を有するタンパク質の製造方法 - Google Patents
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Description
本発明においてタンナーゼ活性とは、タンニン酸等の加水分解性のタンニンに存在するエステル結合及びデプシド結合を加水分解する活性をいい、特にタンニン酸分解活性を意味する。本明細書では、タンナーゼ活性は、タンパク質1mgが30℃、1分間で1mgのタンニン酸を分解する酵素活性を1単位とする。
本発明のタンナーゼ活性を有するタンパク質の製造方法は、ヤブレツボカビ類に分類される微生物の少なくとも1種を培養し、該微生物にタンナーゼ活性を有するタンパク質を生産させる培養工程を含むことを特徴とする。
本発明の方法は、前記微生物を培養し、微生物にタンナーゼ活性を有するタンパク質を生産させる培養工程を含むことを特徴とする。
培養された微生物が生産するタンナーゼ活性を有するタンパク質は、前記微生物の体内にも蓄積し得るが、主に前記微生物の体外に分泌される。
タンナーゼ産生の有無はプレートアッセイ法を用いて判定した。すなわち、B1寒天培地(酵母エキス0.2g, ポリペプトン 0.2g, グルコース0.5g, ビタミン混合溶液0.1ml, 寒天 1.5g, 50%人工海水(ASW) 100ml [pH 6.8])上で生育(28℃、4−7日間)させたヤブレツボカビ類21株の各コロニーを白金線で採取し、タンニン酸0.5%を含む寒天平板培地(0.5gタンニン酸、酵母エキス0.2g、ポリペプトン0.2g,ビタミン混合混液0.1ml、寒天 1.5g, 50%ASW100ml [pH 6.8])上で28℃、5日間生育させ、生育したコロニー周辺上に透明帯(タンニン分解帯)が確認できたものをタンナーゼ陽性株と判定した。また、明瞭な透明帯が認められたものについては、その大きさを計測した。
プレートアッセイにおいて顕著なタンナーゼ活性が認められたA. limacinum mh0186株を、タンニン酸を含有するTY液体培地(タンニン酸0.5g、酵母エキス0.2g、ポリペプトン 0.2g、50%濃度ASW 100 ml [pH 7.0])で振とう培養(28℃、110rpm、120 hrs)し、以下の方法に従って、培養液中のタンニン酸濃度及び培養上清中のタンナーゼ活性を測定した。
A. limacinum mh0186株をTY液体培地で振とう培養後(28℃、110rpm、24hrs)、培養液を遠心分離(3000rpm, 30min, 4℃)し、培養上清を回収した。培養上清に対して硫酸アンモニウムを90%飽和濃度になるように添加し、塩析を行った。塩析により沈殿したタンパク質を5.0mLの50mMクエン酸緩衝液(pH5.5)に溶解し、セルロース透析膜を用いて50mMクエン酸緩衝液(pH5.5)に対して透析を行った。一晩氷冷下で透析した後、セルロース膜中に残存するタンナーゼ活性を示すタンパク質を5.0mLの同緩衝液に溶解した。未処理の培養上清、塩析処理(及び透析処理)した培養上清について、実施例2と同様の方法でタンナーゼ活性を測定した。
タンニン酸を0%、0.1%、0.5%、1.0% (w/v)含むGY液体培地(グルコース 0.5g, 酵母エキス 0.2g、ポリペプトン 0.2g、100ml 50%濃度ASW)にて、mh0186株を培養し、細胞の増殖性、培地中のグルコース含量、乾燥バイオマス量、菌体中脂肪酸含量・脂肪酸組成、及び培地上清中のタンナーゼ活性を分析した。
細胞数は、光学顕微鏡下でトーマス血球版を用いて直接計数した。グルコース濃度は、グルコース分析キット(テストワコーC-II、和光純薬)を用いて測定した。
乾燥菌体重量の測定では、事前に乾燥機で105℃で一晩乾燥し恒量化済みの1.5mlマイクロチューブを使用した。上記のマイクロチューブに培養液を1.0ml回収し、150rpm、5分、室温で遠心分離後上清を取り除き、沈殿物を蒸留水にて2回遠心洗浄した。洗浄後、乾燥機で105℃で一晩乾燥し、精密電子天秤を用いて重量を測定した。沈殿物を含むマイクロチューブの重量から、事前に恒量化したマイクロチューブの重量を差し引いた値を乾燥菌体重量とした。
培養上清のタンナーゼ活性は、タンニン酸含有プレートを用いて、プレートアッセイ法によって測定した。すなわち、0.5%タンニン酸含有寒天プレート(0.5gタンニン酸、100mlクエン酸バッファー(50mM, pH5.5)、寒天末 1.5g)を調製し、コルクボーラーで寒天培地にウェル(穴, 5mm径)を開け、ウェルに培養上清液40μlを加え、28℃で4時間インキュベートし、活性の有無をウェル周辺の透明帯により判断した。
Claims (7)
- ヤブレツボカビ類に分類される微生物の少なくとも1種を培養し、該微生物にタンナーゼ活性を有するタンパク質を生産させる培養工程を含む、タンナーゼ活性を有するタンパク質の製造方法であって、
前記微生物が、アウランチオキトリウム・リマシナム(Aurantiochytrium limacinum)に属する微生物から選択される少なくとも1種である、前記方法。 - 前記微生物が、アウランチオキトリウム・リマシナム SR21 ATCC MYA-1381(Aurantiochytrium limacinum SR21 ATCC MYA-1381)株、及びアウランチオキトリウム・リマシナム mh0186(Aurantiochytrium limacinum mh0186)株(FERM BP-11311)から選択される少なくとも1種である、請求項1の方法。
- ヤブレツボカビ類に分類される微生物の少なくとも1種を培養し、該微生物にタンニン酸酸化活性を有するタンパク質を生産させる培養工程を含む、タンニン酸酸化活性を有するタンパク質の製造方法であって、
前記微生物が、アウランチオキトリウム・マングロベイ(Aurantiochytrium mangrovei)に属する微生物、及びアウランチオキトリウム sp. ATCC26185(Aurantiochytrium sp. ATCC26185)株から選択される少なくとも1種である、前記方法。 - 前記微生物が、アウランチオキトリウム・マングロベイ SEK218(Aurantiochytrium mangrovei SEK218)株、アウランチオキトリウム・マングロベイ SEK243(Aurantiochytrium mangrovei SEK243)株、及びアウランチオキトリウム sp. ATCC26185(Aurantiochytrium sp. ATCC26185)株から選択される少なくとも1種である、請求項3の方法。
- 前記培養工程が、タンニン酸を含有する培地を用いて前記微生物を培養する工程である、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- さらに、前記タンパク質を塩析する工程を含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- さらに、塩析された前記タンパク質を含む溶液を、緩衝液に対して透析する工程を含む、請求項6の方法。
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