JP6410730B2 - 臭気防止用組成物、エバポレータコア、無臭エバポレータコアの製造方法、空調装置の臭気防止方法、空調装置の臭気確認方法、メチロバクテリウム・コマガテhkmc−11(kccm11335p)、メチロバクテリウム・アクアチカムhkmc−1(kccm11325p)、メチロバクテリウム・プラタニhkmc−3(kccm11327p) - Google Patents
臭気防止用組成物、エバポレータコア、無臭エバポレータコアの製造方法、空調装置の臭気防止方法、空調装置の臭気確認方法、メチロバクテリウム・コマガテhkmc−11(kccm11335p)、メチロバクテリウム・アクアチカムhkmc−1(kccm11325p)、メチロバクテリウム・プラタニhkmc−3(kccm11327p) Download PDFInfo
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Description
上述した背景技術は、ただ本発明の背景に対する理解を助けるためのものであって、この技術分野で通常の知識を有する者にとって、既に知られた従来技術に該当するだけにとどまるものではない。
本発明の他の目的は、前記臭気防止用組成物がコーティングされたエバポレータコアを提供することにある。
本発明の又他の目的は、前記臭気防止用組成物をエバポレータコアにコーティングする段階を含む空調装置の臭気防止方法を提供することにある。
本発明の又他の目的は、前記空調装置の臭気防止のためのエバポレータコアのコーティング用途の無臭微生物を提供することにある。
本発明者らは、無臭微生物を用いて悪臭を誘発する微生物を効果的に制御する方法を求めて努力し、特に、空調装置で誘発される悪臭の原因を根本的に遮断しようと努力した。その結果、空調装置内で悪臭を誘発しない微生物13種を分離することに成功し、これら又はこれらの組合せを用いてバイオフィルムを形成した場合、悪臭を誘発する微生物の生育を阻止し、結果的に悪臭を防止する可能性を確認した。
前記微生物は、単独又は相異なる微生物間の組合せで、前記臭気防止用組成物に含まれることができる。
本発明の好ましい実施例によれば、本発明の組成物は空調装置で発生する臭気を防止するためのものである。
本発明の一実施例によれば、本発明の組成物をコーティングしたエバポレータコアが外部空気の条件で無臭微生物の群落を維持するか否か、及びその他悪臭誘発微生物の付着と生息を阻止できるか否かを、あたかも実際の車両に設置したように、自動車のルーフにジグを設置し、ここに前記エバポレータコアを装着して実験した。実験結果、60日経過した時点まで、初めに塗布された無臭微生物の群落を維持し、悪臭誘発の可能性のある外部微生物は検出されなかった(実施例14)。
本発明の又他の様態によれば、本発明は、前記臭気防止用組成物をエバポレータコアにコーティングする段階を含む空調装置の臭気確認方法を提供する。
(i)本発明は、無臭微生物又はその培養液を含む臭気防止用組成物を提供する。
(ii)また、本発明は、前記臭気防止用組成物がコーティングされたエバポレータコア及びその製造方法を提供する。
(iii)更に、本発明は、前記臭気防止用組成物をエバポレータコアにコーティングする段階を含む臭気防止方法を提供する。
(iv)本発明の臭気防止用組成物を用いて悪臭誘発微生物が生息可能な対象をコーティングしてバイオフィルムを形成する場合、悪臭誘発可能性のある外部微生物の流入及び生息を有意に阻止して臭気を効果的に防止することができる。
前記悪臭のする中古車A〜Eから確保したエバポレータコアからえたエバポレータコアのサンプルは、使用するまで4℃で冷蔵保管されるが、ポリエチレン袋(polyethylene bag)で密封して保管した。微生物を分離培養するために、それぞれのエバポレータコアの前面部及び後面部を含む任意の部位で、フィン試料を、滅菌されたラジオペンチ(long nose plier)を用いて各5gずつ採取し、混合して使用した。
下記過程によってエバポレータコアからの微生物の脱離手続き及び方法について記載する。
1)エバポレータコアから抽出した試料を混ぜて混合器に入れる。
2)滅菌された1×リン酸緩衝生理食塩水(PBS;Phosphate buffered saline)200mlを混合器に入れる。
3)混合した試料とPBSとを30秒間混合する。
4)混合器を氷に1分間置く。
5)3)〜4)ステップを2回更に繰り返す。
6)懸濁液を4℃で3分間13000rpmで遠心分離(centrifuge)する。
7)上澄液だけ採って、新しいチューブに移し入れる。
8)滅菌綿棒を上澄液に浸し、サンプルを採取したエバポレータコアの表面を複数回ふき取る。
9)ふき取った綿棒は、上澄液にその頭部(head)だけを入れてボルテックス(vortexing)する。
10)6)で獲得した沈殿物と9)の混合物を混ぜて接種原液として使用する。
前記1)〜10)の過程を車種Aから車種Eに装着されているエバポレータコアに対してそれぞれ物理的脱離を行って微生物を分離した。
エアコンの細菌の分離は、通常、一般細菌という好気性従属栄養細菌を、従属栄養平板培養を用いて分離する。一般細菌の分離に使用する複合栄養培地は、PTYG寒天培地(PTYG agar medium)、R2A寒天培地(R2A agar medium)の2種類を使用する。PTYG寒天培地は、ペプトン0.25g(Difco)、トリプトン0.25g(Difco)、酵母エキス0.5g(Difco)、グルコース0.5g(Difco)、MgSO430mg(Sigma)、CaCl23mg(Sigma)、バクト寒天(Bacto agar)15g(Difco)を蒸溜水980mlに入れてpH7.0で121℃、15分間高圧滅菌した。R2A寒天培地は、酵母エキス0.5g(Difco)、プロテオースペプトンNo.3 0.5g(Difco)、カザミノ酸0.5g(Difco)、デキストロース0.5g(Difco)、可溶性でんぷん0.5g(Difco)、ピルビン酸ナトリウム0.3g(Difco)、硫酸二カリウム0.3g(Difco)、硫酸マグネシウム0.05g(Difco)、バクト寒天15g(Difco)を蒸溜水980mlに入れてpH7.2で121℃、15分間高圧滅菌した。非優占の一般細菌を分離するために、3種類の抗生剤を使用するが(表2)、各抗生剤は100ppmの濃度でフィルタ滅菌した後、培地温度が約50℃程度になると、接種して抗生剤培地を製作した。
エアコン真菌(かび)の分離培養は、栄養培地で好気性平板培養を行って分離する。真菌(かび)の分離培養に使用する培地は、ポテトデキストロース寒天培地及び麦芽エキス寒天培地の2種類を使用した。ポテトデキストロース寒天培地は、ジャガイモでんぷん4g(Difco)、デキストロース20g(Difco)、バクト寒天15g(Difco)を蒸溜水980mlに入れてpH5.1で121℃、15分間高圧滅菌した。麦芽エキス寒天培地は、麦芽エキス20g(Difco)、バクト寒天15g(Difco)を蒸溜水980mlに入れてpH5.0で121℃、15分間高圧滅菌した。
真菌の分離培養のために90mm×15mmのペトリ皿を使用し、培養された真菌をそれぞれ分離培養するためには60mm×15mmのペトリ皿が使用した。
優占菌株を分離培養するためには、まず希釈比率とコロニーの色、大きさ、形状など形態学的なアプローチによって多様な優占菌株を選別しなければならないため、下記手続きにより優占菌株を分離培養する。
1)離培養された培地でかびとバクテリアとを分けて分離する。
2)形態学的に異なる複数の細菌を、ループを用いて複合培地に接種して純粋分離する。
3)接種された培地のうち、最も生育の良い培地を選択して継代培養する。
4)かびは菌糸の終端部を外科用メス(scalpel)を用いて分離した後、複合培地に接種する。
5)かび菌株も、接種された培地のうち、最も生育の良い培地を選択して継代培養する。
REP−PCRパターン分析によるフィンガープリント(Fingerprints)調査
REP−PCRは、細菌染色体の構造を分析する分子生物学的方法であって、各細菌菌株と他の細菌を分けて識別できるフィンガープリント方法である。REP−PCRを行うために下記の各手続きによって遺伝的特性を分析した。
1)Lyse−N−Go PCR試薬(Reagent)(Thermo)2.5μLをPCRチューブに入れる。
2)クリーンベンチでコロニーをピペットで採って該チューブに入れてピペット操作する。この際、採った量は溶液がぼやけるようにならないように注意する。
3)製造業者の提供する指示書に従ってPCR装置で培養する。
4)下記の表3に記載されている溶解(Lysis)プログラムによるサイクルを繰り返し、9サイクルで80℃になると、オフせずにそのまま置く。
下記表4に記載されているPCR反応に必要な成分を所定の量に合わせて混合することで反応混合物を製造し、これを用いて表5に記載されたように予備変性段階(pre−denaturation)94℃で7分、変性段階(denaturation)92℃で1分、冷却段階(annealing)51.5℃で1分、延長段階(extension)65℃で8分の変性、冷却、延長過程を33回繰り返してPCR増幅過程を行った。
それぞれのPCRによって増幅されたDNA断片を採って、EtBrを添加した1.2−1.5%のアガロース・ゲル(agarose gel)を使用し、6x色素(dye)とサンプルを1:5の比率で混合して、できるだけ多量をローディングした。大部分のPCR製品は100〜1000bpであるため、100bpのラダー(ladder)を共にローディングしてできるだけゆっくり(50V)ブロモフェノール・ブルー(bromophenol blue)とキシレンシアノール色素(xylene cyanol dye)の中間が全体ゲルの中間となるように電気泳動する。ゲル上のDNAパターンが同一の菌株は同じ菌株であると看做す。
16S rRNA(ribosomal Ribonucleic acid)遺伝子は、バクテリアの遺伝学的分類同定のために用いられ、REP−PCRにより分類されたバクテリアの属(genus)及び種(species)の水準での同定が可能である。16S rRNAは、多様な蛋白質と相互作用してリボソーム(Ribosome)を構成するRNAであって、その完全な序列やオリゴヌクレオチド(Oligonucleotide)の目録に対する塩基配列が2000種以上の細菌から明らかになったため、16S rRNAの遺伝子の類似性に基づいて細菌をいくつかの主要群に分けることができる。前記16S rRNA遺伝子の塩基配列の変化率が大部分のゲノムにある他の遺伝子の塩基配列よりも非常に少ないため、16S rRNA塩基配列の類似度の程度が生物間の系統学的距離を反映すると認められている。前記16S rRNA遺伝子の切片の塩基配列を分析し、その類似度によって微生物を同定する方法は、上述した脂肪酸分析及び炭水化物同化能分析法と共に微生物、特に産業的に効果的な微生物を同定する場合の代表的な同定方法として用いられてきた。
PCR条件(conditions)(総50μL):DNAとTaqを除いた残り溶液を下記表6のように必要量だけ混合して該溶解(lysis)溶液に44.5μLを加えた。次に、表7のように予備変性段階(pre−denaturation)94℃で5分、変性段階(denaturation)94℃で1分、冷却段階(annealing)55℃で1分、延長段階(extension)72℃で1分30秒を行い、変性、冷却及び延長段階を29回更に施してPCR増幅過程を行った。
16S−rRNA PCRを用いて増幅した産物をQiaquick PCR purifcation kitを用いて下記の方法きにより精製した。
1)PCR製品の5倍のPBバッファー(buffer)を入れる。
2)混合した液をQIAquickカラム(column)に分注する。
3)DNAを結合(binding)させるために1分間遠心分離し、通過した混合液を除去する。
4)洗浄のために750μLのPEバッファーをQIAquickカラムに入れて1分間遠心分離し、通過した混合液を除去する。
5)1分間再び遠心分離する。
6)QIAquickカラムを新たなチューブに移す。
7)DNAを抽出するために30μLのEBバッファーを入れて1分間置く。
8)1分間遠心分離してEBに溶けたDNAをチューブに集める。
<微生物1>
1.微生物の名称:HKMC−1
属名:Methylobacterium
種名:aquaticum
寄託番号:KCCM11325P(2012年11月14日)
2.復元条件
イ.復元剤
〈1〉組成:PTYG培地(1L当たりペプトン0.25g、トリプトン0.25g、酵母エキス0.5g、グルコース0.5g、MgSO430mg、CaCl23mg)又はR2A培地。
〈2〉pH:7.0
〈3〉殺菌条件:121℃で20分
ロ.温度(℃)28℃で7日間培養
3.培地
〈1〉組成:PTYG培地(1L当たりペプトン0.25g、トリプトン0.25g、酵母エキス0.5g、グルコース0.5g、MgSO430mg、CaCl23mg)又はR2A培地。
〈2〉pH:7.0
〈3〉殺菌条件:121℃で20分
4.培養条件
イ.好気性、嫌気性:好気性
ロ.温度(℃)28℃
ハ.振盪、静置(液体、固体)を問わず使用可能
5.保存条件
温度(℃)−70℃
1.微生物の名称:HKMC−2
属名:Methylobacterium
種名:brachiatum
寄託番号:KCCM11326P(2012年11月14日)
2.復元条件
イ.復元剤
〈1〉組成:PTYG培地(1L当たりペプトン0.25g、トリプトン0.25g、酵母エキス0.5g、グルコース0.5g、MgSO430mg、CaCl23mg)又はR2A培地。
〈2〉pH:7.0
〈3〉殺菌条件:121℃で20分
ロ.温度(℃)28℃で7日間培養
3.培地
〈1〉組成:PTYG培地(1L当たりペプトン0.25g、トリプトン0.25g、酵母エキス0.5g、グルコース0.5g、MgSO430mg、CaCl23mg)又はR2A培地。
〈2〉pH:7.0
(3)殺菌条件:121℃で20分
4.培養条件
イ.好気性、嫌気性:好気性
ロ.温度(℃)28℃
ハ.振盪、静置(液体、固体)を問わず使用可能
5.保存条件
温度(℃)−70℃
1.微生物の名称:HKMC−3
属名:Methylobacterium
種名:platani
寄託番号:KCCM11327P(2012年11月14日)
2.復元条件
イ.復元剤
〈1〉組成:PTYG培地(1L当たりペプトン0.25g、トリプトン0.25g、酵母エキス0.5g、グルコース0.5g、MgSO430mg、CaCl23mg)又はR2A培地。
〈2〉pH:7.0
〈3〉殺菌条件:121℃で20分
ロ.温度(℃)28℃で7日間培養
3.培地
〈1〉組成:PTYG培地(1L当たりペプトン0.25g、トリプトン0.25g、酵母エキス0.5g、グルコース0.5g、MgSO430mg、CaCl23mg)又はR2A培地。
〈2〉pH:7.0
〈3〉殺菌条件:121℃で20分
4.培養条件
イ.好気性、嫌気性:好気性
ロ.温度(℃)28℃
ハ.振盪、静置(液体、固体)を問わず使用可能
5.保存条件
温度(℃)−70℃
1.微生物の名称:HKMC−4
属名:Acinetobacter
種名:johnsonii
寄託番号:KCCM11328P(2012年11月14日)
2.復元条件
イ.復元剤
〈1〉組成:PTYG培地(1L当たりペプトン0.25g、トリプトン0.25g、酵母エキス0.5g、グルコース0.5g、MgSO430mg、CaCl23mg)又はR2A培地。
〈2〉pH:7.0
〈3〉殺菌条件:121℃で20分
ロ.温度(℃)28℃で7日間培養
3.培地
〈1〉組成:PTYG培地(1L当たりペプトン0.25g、トリプトン0.25g、酵母エキス0.5g、グルコース0.5g、MgSO430mg、CaCl23mg)又はR2A培地。
〈2〉pH:7.0
〈3〉殺菌条件:121℃で20分
4.培養条件
イ.好気性、嫌気性:好気性
ロ.温度(℃)28℃
ハ.振盪、静置(液体、固体)を問わず使用可能
5.保存条件
温度(℃)−70℃
1.微生物の名称:HKMC−5
属名:Bacillus
種名:vietnamensis
寄託番号:KCCM11329P(2012年11月14日)
2.復元条件
イ.復元剤
〈1〉組成:PTYG培地(1L当たりペプトン0.25g、トリプトン0.25g、酵母エキス0.5g、グルコース0.5g、MgSO430mg、CaCl23mg)又はR2A培地。
〈2〉pH:7.0
〈3〉殺菌条件:121℃で20分
ロ.温度(℃)28℃で7日間培養
3.培地
〈1〉組成:PTYG培地(1L当たりペプトン0.25g、トリプトン0.25g、酵母エキス0.5g、グルコース0.5g、MgSO430mg、CaCl23mg)又はR2A培地。
〈2〉pH:7.0
〈3〉殺菌条件:121℃で20分
4.培養条件
イ.好気性、嫌気性:好気性
ロ.温度(℃)28℃
ハ.振盪、静置(液体、固体)を問わず使用可能
5.保存条件
温度(℃)−70℃
1.微生物の名称:HKMC−6
属名:Brevibacillus
種名:invocatus
寄託番号:KCCM11330P(2012年11月14日)
2.復元条件
イ.復元剤
〈1〉組成:PTYG培地(1L当たりペプトン0.25g、トリプトン0.25g、酵母エキス0.5g、グルコース0.5g、MgSO430mg、CaCl23mg)又はR2A培地。
〈2〉pH:7.0
〈3〉殺菌条件:121℃で20分
ロ.温度(℃)28℃で7日間培養
3.培地
〈1〉組成:PTYG培地(1L当たりペプトン0.25g、トリプトン0.25g、酵母エキス0.5g、グルコース0.5g、MgSO430mg、CaCl23mg)又はR2A培地。
〈2〉pH:7.0
〈3〉殺菌条件:121℃で20分
4.培養条件
イ.好気性、嫌気性:好気性
ロ.温度(℃)28℃
ハ.振盪、静置(液体、固体)を問わず使用可能
5.保存条件
温度(℃)−70℃
1.微生物の名称:HKMC−7
属名:Deinococcus
種名:ficus
寄託番号:KCCM11331P(2012年11月14日)
2.復元条件
イ.復元剤
〈1〉組成:PTYG培地(1L当たりペプトン0.25g、トリプトン0.25g、酵母エキス0.5g、グルコース0.5g、MgSO430mg、CaCl23mg)又はR2A培地。
〈2〉pH:7.0
〈3〉殺菌条件:121℃で20分
ロ.温度(℃)28℃で7日間培養
3.培地
〈1〉組成:PTYG培地(1L当たりペプトン0.25g、トリプトン0.25g、酵母エキス0.5g、グルコース0.5g、MgSO430mg、CaCl23mg)又はR2A培地。
〈2〉pH:7.0
〈3〉殺菌条件:121℃で20分
4.培養条件
イ.好気性、嫌気性:好気性
ロ.温度(℃)28℃
ハ.振盪、静置(液体、固体)を問わず使用可能
5.保存条件
温度(℃)−70℃
1.微生物の名称:HKMC−8
属名:Leifsonia
種名:soli
寄託番号:KCCM11332P(2012年11月14日)
2.復元条件
イ.復元剤
(1)組成:PTYG培地(1L当たりペプトン0.25g、トリプトン0.25g、酵母エキス0.5g、グルコース0.5g、MgSO430mg、CaCl23mg)又はR2A培地。
(2)pH:7.0
(3)殺菌条件:121℃で20分
ロ.温度(℃)28℃で7日間培養
3.培地
(1)組成:PTYG培地(1L当たりペプトン0.25g、トリプトン0.25g、酵母エキス0.5g、グルコース0.5g、MgSO430mg、CaCl23mg)又はR2A培地。
(2)pH:7.0
(3)殺菌条件:121℃で20分
4.培養条件
イ.好気性、嫌気性:好気性
ロ.温度(℃)28℃
ハ.振盪、静置(液体、固体)を問わず使用可能
5.保存条件
温度(℃)−70℃
1.微生物の名称:HKMC−9
属名:Pseudomonas
種名:nitroreducens
寄託番号:KCCM11333P(2012年11月14日)
2.復元条件
イ.復元剤
〈1〉組成:PTYG培地(1L当たりペプトン0.25g、トリプトン0.25g、酵母エキス0.5g、グルコース0.5g、MgSO430mg、CaCl23mg)又はR2A培地。
〈2〉pH:7.0
〈3〉殺菌条件:121℃で20分
ロ.温度(℃)28℃で7日間培養
3.培地
〈1〉組成:PTYG培地(1L当たりペプトン0.25g、トリプトン0.25g、酵母エキス0.5g、グルコース0.5g、MgSO430mg、CaCl23mg)又はR2A培地。
〈2〉pH:7.0
〈3〉殺菌条件:121℃で20分
4.培養条件
イ.好気性、嫌気性:好気性
ロ.温度(℃)28℃
ハ.振盪、静置(液体、固体)を問わず使用可能
5.保存条件
温度(℃)−70℃
1.微生物の名称:HKMC−10
属名:Sphingomonas
種名:aquatilis
寄託番号:KCCM11334P(2012年11月14日)
2.復元条件
イ.復元剤
〈1〉組成:PTYG培地(1L当たりペプトン0.25g、トリプトン0.25g、酵母エキス0.5g、グルコース0.5g、MgSO430mg、CaCl23mg)又はR2A培地。
〈2〉pH:7.0
〈3〉殺菌条件:121℃で20分
ロ.温度(℃)28℃で7日間培養
3.培地
〈1〉組成:PTYG培地(1L当たりペプトン0.25g、トリプトン0.25g、酵母エキス0.5g、グルコース0.5g、MgSO430mg、CaCl23mg)又はR2A培地。
〈2〉pH:7.0
〈3〉殺菌条件:121℃で20分
4.培養条件
イ.好気性、嫌気性:好気性
ロ.温度(℃)28℃
ハ.振盪、静置(液体、固体)を問わず使用可能
5.保存条件
温度(℃)−70℃
1.微生物の名称:HKMC−11
属名:Methylobacterium
種名:komagatae
寄託番号:KCCM11335P(2012年11月14日)
2.復元条件
イ.復元剤
〈1〉組成:PTYG培地(1L当たりペプトン0.25g、トリプトン0.25g、酵母エキス0.5g、グルコース0.5g、MgSO430mg、CaCl23mg)又はR2A培地。
〈2〉pH:7.0
〈3〉殺菌条件:121℃で20分
ロ.温度(℃)28℃で7日間培養
3.培地
〈1〉組成:PTYG培地(1L当たりペプトン0.25g、トリプトン0.25g、酵母エキス0.5g、グルコース0.5g、MgSO430mg、CaCl23mg)又はR2A培地。
〈2〉pH:7.0
〈3〉殺菌条件:121℃で20分
4.培養条件
イ.好気性、嫌気性:好気性
ロ.温度(℃)28℃
ハ.振盪、静置(液体、固体)を問わず使用可能
5.保存条件
温度(℃)−70℃
1.微生物の名称:HKMC−12
属名:Deinococcus
種名:apachensis
寄託番号:KCCM11499P(2013年12月10日)
2.復元条件
イ.復元剤
〈1〉組成:PTYG培地(1L当たりペプトン0.25g、トリプトン0.25g、酵母エキス0.5g、グルコース0.5g、MgSO430mg、CaCl23mg)又はR2A培地。
〈2〉pH:7.0
〈3〉殺菌条件:121℃で20分
ロ.温度(℃)28℃で7日間培養
3.培地
〈1〉組成:PTYG培地(1L当たりペプトン0.25g、トリプトン0.25g、酵母エキス0.5g、グルコース0.5g、MgSO430mg、CaCl23mg)又はR2A培地。
〈2〉pH:7.0
〈3〉殺菌条件:121℃で20分
4.培養条件
イ.好気性、嫌気性:好気性
ロ.温度(℃)28℃
ハ.振盪、静置(液体、固体)を問わず使用可能
5.保存条件
温度(℃)−70℃
1.微生物の名称:HKMC−13
属名:Flavobacterium
種名:oceanosedimentum
寄託番号:KCCM11500P(2013年12月10日)
2.復元条件
イ.復元剤
〈1〉組成:PTYG培地(1L当たりペプトン0.25g、トリプトン0.25g、酵母エキス0.5g、グルコース0.5g、MgSO430mg、CaCl23mg)又はR2A培地。
〈2〉pH:7.0
〈3〉殺菌条件:121℃で20分
ロ.温度(℃)28℃で7日間培養
3.培地
(1)組成:PTYG培地(1L当たりペプトン0.25g、トリプトン0.25g、酵母エキス0.5g、グルコース0.5g、MgSO430mg、CaCl23mg)又はR2A培地。
(2)pH:7.0
(3)殺菌条件:121℃で20分
4.培養条件
イ.好気性、嫌気性:好気性
ロ.温度(℃)28℃
ハ.振盪、静置(液体、固体)を問わず使用可能
5.保存条件
温度(℃)−70℃
(1)栄養培地での培養
前記実施例7で同定した微生物のうちの11種の官能的特性を分析するために、微生物を分離した栄養培地で7日間28℃で培養して評価を実施した。下記に、バクテリアを栄養培地で培養する過程を記述する。
1)純粋分離培養された微生物を液体栄養培地に接種する。
2)接種された培地を28℃で5〜7日間培養する。
3)固体栄養培地に、液体培地で培養された菌体を100μL採って接種する。
4)接種した菌体をスプレッダー(spreader)を用いて均一に広げる。
5)ペトリ皿を密封して28℃で10日間培養する。
(2)アルミニウムフィン培地での官能評価
矩形のアルミニウムフィンを滅菌処理し、これをホコリ及び栄養培地に浸漬した。次に、バクテリアを接種して前記栄養培地での段階(2)−(4)に記載された条件と同様にして培養して評価し、これを下記表8に官能評価の結果を記載した。
1)抗菌剤が処理されたアルミニウムフィン:エバポレータコアの主な材料となるアルミニウム上に抗菌コーティングしたもので、市販品として購買可能なエバポレータコア製品のコーティングである。
2)抗菌剤が処理されていない、親水コーティング処理のみをしているアルミニウムフィン:エバポレータコアのコーティング工程のうち、親水工程のみ行ったアルミニウムフィンである。通常、親水工程と抗菌工程が同時に行われる。抗菌性コティングフィンと抗菌性のないコティングフィンを比較するために特別に製作したものである。エバポレータコアは、軽量化のためにアルミニウムフィンで製作されるが、銅材質、鋼鉄材質など多様な金属にしても製造可能である。
(1)無臭微生物のフィン付着の最適濃度分析
前記11種の無臭微生物のエバポレータコアのコーティングのために、2012年の研究結果(優先出願)のように106cfu/g水準で接種するための付着滴定濃度を確認した。濃度確認試験は、共通菌株の1つのMethylobacterium aquaticumを使用し、28℃で後期対数期(late log phase)まで培養した後、滅菌された0.85%の生理食塩水(saline)で洗浄し、4℃で18時間培養した。4℃で培養した後、O.D.(optical density)を0.749、0.588、0.55、0.5、0.45に滴定した後、2gのU字状のフィンを漬けて1時間室温で一定のrpmで振盪(shaking)しながら付着した。このようにそれぞれの濃度の微生物が付着されたフィンは混合器により脱離され、R2A寒天プレート(R2A agar plate)に連続希釈法(serial dilution)により平板塗抹した。
このような平板塗抹の結果、O.D.数値によってフィンに付着される微生物の濃度が変化することを確認することができた。O.D.0.749の場合は1.53×108± 1.52×107cfu/gのフィンの付着程度を示し、O.D.0.588と0.55はそれぞれ4.00×107±1.00×107cfu/gのフィン、1.03×107± 8.50×105cfu/gのフィンの付着程度を示した。更に、O.D.0.5とO.D.0.45の場合は6.00×106±7.00×105cfu/gのフィン、2.53×106±3.51×105cfu/gのフィンの付着程度を示すため、O.D.による付着程度は比例関係を示すことを確認することができた。これら付着濃度のうち、微生物が分離されたエバポレータコアが有する106cfu/g水準の微生物をコーティングするO.D.値の0.5を用いて他の10種の無臭微生物をコーティングした。
前記フィンの付着実験の結果、属(genus)にかかわらず、11種の無臭微生物は同一のO.D.で同じ付着程度を示すことを確認した。したがって、菌株の1つのMethylobacterium aquaticumを用いてフィンと同一のO.D.の培養液を使用してエバポレータコアに付着される微生物の量を確認した。
O.D.0.5で滴定されたMethylobacterium aquaticumは、エバポレータコアで8.95×106±5.51×105cfu/gのフィンの付着程度を示した。このように同じ培養液を用いて付着したエバポレータコアは、2.55×106±3.51×105cfu/gのフィンの付着程度を示した。このような結果から、同一のO.D.の培養液を使用すると、同じ水準の微生物が付着されることを確認することができた。
(1)11種の単一無臭微生物のエバポレータコアへの付着及び官能評価
前記実施例8で同定した微生物の官能的特性を分析するために、11種の無臭微生物をそれぞれエバポレータコアに付着して官能評価を実施した。
このような条件で各微生物に対する臭気評価実験により、各微生物の悪臭発生程度を分析した。微生物が付着したエバポレータコアは、15人以上の官能評価要員によって評価された。その結果、11種の微生物から1.78± 0.41の平均官能結果が得られた(5点評点法)(0:臭気なし;1:とても弱い臭気(感知しにくい臭気);2:弱い臭気(種類を区分しにくい臭気);3:臭い(種類を区分できる臭気);4:強い臭気及び5:非常に強い臭気)。これらの中、Methylobacterium sp.は1.625± 0.29の数値を示して平均よりも低い官能評価結果であり、共通菌株3種(Methylobacterium aquaticum、Methylobacterium brachiatum及びMethylobacterium platani)の場合は1.6± 0.35の数値を示した。官能評価の結果、最も高い点数を受けた単一菌株はDeinococcus ficusで2.8点を示し、その次はBacillus vietnamensisが2.1点で高い官能評価結果を示した(表8)。
これら官能評価結果に基づき、臭気の発生程度が比較的高い3種の微生物を組合せ菌株から排除した。排除された菌株はMethylobacterium brachiatum、Bacillus vietnamensis、Deinococcus ficusであった。
ステップ2:2時間の再現期を止めた後(温度:25℃、湿度:30%〜50%、風速:0CMH、再現期の入口を少し開いて臭気を評価)
前記単一微生物の官能評価から選別された8種の無臭微生物を2種の共通菌株(Methylobacterium aquaticum及びMethylobacterium platani)と組み合わせて最適の無臭組合せとして14組合せを確保した。選別された無臭組合せの、実際的な官能評価のために組合せ微生物を、同じ密度水準で混合した後、エバポレータコアに付着させて官能評価を行った。
臭気評価の結果、14組合せの平均官能評価の数値は1.89± 0.52(5点満点)であり、共通菌株と共にAcinetobacter johnsoniiとSphingomonas aquatilis、及びPseudomonas nitroreducensを含む14番目の組合せが1.25で最も低い官能評価点数を示し、共通菌株を含んだAcinetobacter johnsonii組合せが3.14で最も高い官能点数を示した(表10)。このような数値的評価と共に臭気の質に対する評価を考慮して、共通菌株と共にAcinetobacter johnsonii、Brevibacillus invocatusが単独で含まれた2種類の3菌株組合せとBrevibacillus invocatus、Sphingomonas aquatilis、Methylobacterium komagataeの3菌株が組み合わされた7番組合せとLeifsonia soli、Sphingomonas aquatilis、Pseudomonas nitroreducensが含まれた13番組合せを除いた10個の組合せが最終生存競争実験のために選ばれた。
前記実施例9−(2)の官能評価の結果、10個の微生物組合せが無臭組合せとして選別され、該当微生物を対象として30日間の生存評価を行った。コーティング組合せとして用いられた微生物の組合せ番号及び微生物リストは次の通りである(表11)。
1番組合せは、エバポレータコアで1.09×107±8.65×105cfu/gのフィンのコーティング水準を示し、表現型を見た時、赤色コロニーが8.70×106±2.35×106cfu/gのフィン、白色コロニーが2.50×105±7.07×104cfu/gのフィン、黄色コロニーが1.90×106±1.73×105cfu/gのフィンの水準として検出された。30日経過後は4.63×106±5.09×104cfu/gのフィンの水準の総細菌数を示し、赤色コロニーだけが4.63×106±1.53×105cfu/gのフィンの水準で確認された(図2)。これは比率を確認した時、赤色コロニーが80%以上を占め、30日経過後は100%を占めるということを確認することができる(図3)。前記表現型を見たとき、赤色コロニーはピンク色素沈着(pink pigmentation)を有するMethylobacteriumを含むと疑われる。REP−PCRによる組合せ微生物の比率を確認してみた結果、Time 0でMethylobacterium aquaticum、Sphingomonas aquatilis及びPseudomonas nitroreducensを除いたMethylobacterium platani及びBrevibacillus invocatusを確認できず、特に共通微生物として用いたMethylobacterium plataniが検出されなかった。1番組合せのtime 0では、総86個のREP−PCRサンプルのうち、Methylobacterium aquaticumが70個で最も多く検出され、Sphingomonas aquatilisが12個、Pseudomonas nitroreducensが4個でそれぞれ検出された。Time 30日には総32個のサンプルのうち、Methylobacterium aquaticumが32個サンプル全体に存在し、既存の微生物が死滅などの理由によって全く検出されないことを確認した(図4)。
30日生存評価で確認されたMethylobacterium plataniの弱い生存力を代える微生物としてMethylobacterium komagataeを選定し、これを共通菌株のMethylobacterium aquaticumと混合して使用する微生物組合せを6個更に選定した(表12)。更に選定された微生物は、官能的に無臭ではないとしても生存性に優れた微生物を少数含んでおり、これによって、更に堅固な微生物組合せを製作検出しようとした。
これによって、time 0ではSpirosoma panaciterraeは検出しにくい非常に少ない数が付着されて生存するか、ほとんど付着されていないことを確認し、Brevundimonas kwangchunensisは初期に比べて生存する微生物の比率が大きく減少することを確認することができた。
無臭微生物組合せの90日間の長期影響評価のために多様な組合せを構成したが、まず全組合せにおいて共通的に用いられるMethylobacterium aquaticumとMethylobacterium komagataeで構成される群落に対して90日間の長期評価を行った。
共通菌株Methylobacterium aquaticum及びMethylobacterium komagataeの組合せが外部条件でどれだけ成長するかを調べるために、2つの菌株を使用してエバポレータコアをコーティングした後、自動車のルーフに設置するジグにエバポレータコアを装着、運行して外部空気に露出されたコーティング菌株の変化を確認した。
エバポレータコアで分離培養された無臭微生物11種を形態学的特性により4種類に分け、分子生物学的同定方法の16S rDNA塩基配列決定法(sequencing)により再分類した結果、微生物11株がそれぞれ異なる種であることを再確認した。
16S rDNAで分類、同定した微生物は、REP−PCR方法で菌株の重複性を調べた結果、11種類の相異なるREP−PCR群が確認され、これら菌株はREP−PCR群方法で区分できる相異なる菌株であることが最終確認された。
Claims (20)
- メチロバクテリウム・コマガテ(Methylobacterium komagatae)、メチロバクテリウム・アクアチカム(Methylobacterium aquaticum)、及びメチロバクテリウム・プラタニ(Methylobacterium platani)からなる群より選択される1つ又は2つ以上の微生物又はその培養液を含むことを特徴とする臭気防止用組成物。
- 空調装置で発生する臭気を防止するためのものであることを特徴とする請求項1に記載の臭気防止用組成物。
- 前記微生物は、メチロバクテリウム・コマガテHKMC−11(KCCM11335P)、メチロバクテリウム・アクアチカムHKMC−1(KCCM11325P)、及びメチロバクテリウム・プラタニHKMC−3(KCCM11327P)からなる群より選択される1つ又は2つ以上であることを特徴とする請求項1に記載の臭気防止用組成物。
- 前記微生物は、メチロバクテリウム・アクアチカム及びメチロバクテリウム・プラタニの微生物2種の組み合わせ、又はメチロバクテリウム・アクアチカム、メチロバクテリウム・プラタニ、スフィンゴモナス・アクアティリス(Sphingomonas aquatilis)及びブレビバチルス・インボカタス(Brevibacillus invocatus)の微生物4種の組み合わせ、又はメチロバクテリウム・アクアチカム、メチロバクテリウム・プラタニ、レイフソニア・ソリ(Leifsonia soli)及びメチロバクテリウム・コマガテの微生物4種の組み合わせ、又はメチロバクテリウム・アクアチカム、メチロバクテリウム・プラタニ、アシネトバクター・ジョンソニー(Acinetobacter johnsonii)、スフィンゴモナス・アクアティリス及びメチロバクテリウム・コマガテの微生物5種の組み合わせ、又はメチロバクテリウム・アクアチカム、メチロバクテリウム・プラタニ、アシネトバクター・ジョンソニー及びシュードモナス・ニトロレデュッセンス(Pseudomonas nitroreducens)の微生物4種の組み合わせ、又はメチロバクテリウム・アクアチカム、メチロバクテリウム・プラタニ、アシネトバクター・ジョンソニー及びシュードモナス・ニトロレデュッセンスの微生物4種の組み合わせ、又はメチロバクテリウム・アクアチカム、メチロバクテリウム・プラタニ、レイフソニア・ソリ及びシュードモナス・ニトロレデュッセンスの微生物4種の組み合わせ、又はメチロバクテリウム・アクアチカム、メチロバクテリウム・プラタニ、ブレビバチルス・インボカタス、スフィンゴモナス・アクアティリス及びシュードモナス・ニトロレデュッセンスの微生物5種の組み合わせ、又はメチロバクテリウム・アクアチカム、メチロバクテリウム・プラタニ、アシネトバクター・ジョンソニー、スフィンゴモナス・アクアティリス及びシュードモナス・ニトロレデュッセンスの微生物5種の組み合わせであることを特徴とする請求項1に記載の臭気防止用組成物。
- 前記微生物の組み合わせに用いられるメチロバクテリウム・コマガテ、メチロバクテリウム・アクアチカム及びメチロバクテリウム・プラタニ以外の微生物は、アシネトバクター・ジョンソニーHKMC−4(KCCM11328P)、ブレビバチルス・インボカタスHKMC−6(KCCM11330P)、レイフソニア・ソリHKMC−8(KCCM11332P)、シュードモナス・ニトロレデュッセンスHKMC−9(KCCM11333P)、及びスフィンゴモナス・アクアティリスHKMC−10(KCCM11334P)からなる群より選択されることを特徴とする請求項4に記載の臭気防止用組成物。
- 請求項1に記載の臭気防止用組成物がコーティングされていることを特徴とするエバポレータコア(evaporator core)。
- 前記エバポレータコアには、請求項1から5のうち何れか1項に記載の臭気防止用組成物に含まれる微生物が104cfu/g乃至108cfu/gの濃度で付着されていることを特徴とする請求項6に記載のエバポレータコア。
- 前記微生物の付着は、O.D.(optical density)値が0.3乃至0.9の微生物培養液を用いて付着されることを特徴とする請求項7に記載のエバポレータコア。
- 前記微生物は、エバポレータコアの表面にバイオフィルムを形成することを特徴とする請求項6に記載のエバポレータコア。
- 請求項1から5のうち何れか一項に記載の臭気防止用組成物をエバポレータコアにコーティングする段階を含む、空調装置内の臭気を誘発しないことを特徴とする無臭エバポレータコアの製造方法。
- 前記コーティングする段階は、前記臭気防止用組成物に含まれた微生物を104cfu/g乃至108cfu/gの濃度でエバポレータコアに付着する過程を含むことを特徴とする請求項10に記載の無臭エバポレータコアの製造方法。
- コーティングされた臭気防止用組成物内の微生物を繁殖させてバイオフィルムを形成する段階を更に含むことを特徴とする請求項10に記載の無臭エバポレータコアの製造方法。
- 請求項1から5のうち何れか一項に記載の臭気防止用組成物をエバポレータコアにコーティングする段階を含むことを特徴とする空調装置の臭気防止方法。
- 前記コーティングする段階は、前記臭気防止用組成物に含まれた微生物を104cfu/g乃至108cfu/gの濃度でエバポレータコアに付着する過程を含むことを特徴とする請求項13に記載の空調装置の臭気防止方法。
- 前記臭気防止用組成物内に含まれた微生物を繁殖させてバイオフィルムを形成する段階を更に含むことを特徴とする請求項13に記載の空調装置の臭気防止方法。
- 請求項1から5のうち何れか一項に記載の臭気防止用組成物をエバポレータコアにコーティングする段階を含むことを特徴とする空調装置の臭気確認方法。
- 前記コーティングされた臭気防止用組成物内に含まれた微生物の栄養分となる石油類又は空気汚染物質を投入して臭気が発生するか否かを確認する段階を含むことを特徴とする請求項16に記載の空調装置の臭気確認方法。
- 請求項13に記載の空調装置の臭気防止方法のためのエバポレータコアのコーティング用途のメチロバクテリウム・コマガテHKMC−11(Methylobacterium komagatae HKMC−11)(KCCM11335P)。
- 請求項13に記載の空調装置の臭気防止方法のためのエバポレータコアのコーティング用途のメチロバクテリウム・アクアチカムHKMC−1(Methylobacterium aquaticum HKMC−1)(KCCM11325P)。
- 請求項13に記載の空調装置の臭気防止方法のためのエバポレータコアのコーティング用途のメチロバクテリウム・プラタニHKMC−3(Methylobacterium platani HKMC−3)(KCCM11327P)。
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