CN105264063A - 包含无气味微生物的用于防止气味的组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于防止气味的组合物，其包含无气味的微生物或其培养物。本发明还涉及一种用于防止气味的方法，包括涂覆用于防止气味的组合物。当通过对产生难闻气味的微生物所能栖居的物体涂覆本发明的用于防止气味的组合物而形成生物膜时，可以通过显著地防止可能产生难闻气味的外部微生物的流入和栖居来有效地防止气味。

Description

包含无气味微生物的用于防止气味的组合物
技术领域
本发明涉及包含无气味微生物或其培养物的用于防止气味的组合物以及使用其来防止气味的方法。
背景技术
洁净的空气被认为是人类健康和幸福的不可或缺的组成部分。难闻的味道或污染的空气严重地破坏美好的环境。例如，在密闭情况下的令人不满的室内空气质量由两个重要因素造成。一个是直接由构成密闭环境(例如，大楼、车辆等)的材料产生的空气污染物，另一个是由人类活动产生或由外部物质造成的气味。
空气调节系统是指设计成在建筑物、车辆、火车、船舶、飞机等中降低室内温度并优化室内环境以调节空气的温度、湿度、流量和清洁度的系统。随着生活标准的提高，空气调节系统的使用已经逐渐增加。尽管在空气调节系统的基本功能方面已有很大改善，在室内空气质量的环境方面，仍有很多问题留待解决。
已知空气调节系统尤其是空调的气味成因是由霉菌和细菌产生的代谢物。然而，还没有具体鉴别出哪些霉菌和细菌产生多少这样的代谢物。
在空气调节系统中，所有经过风机的空气要经过蒸发器芯。在制冷剂与空气之间的热交换过程中，由于温差而在蒸发器芯的表面上发生水的冷凝。当水的冷凝持续时，在蒸发器芯上建立起有利于霉菌和细菌栖居和繁殖的环境。如果霉菌和细菌在暴露于外部空气的蒸发器芯上繁殖时，由微生物产生作为代谢物的微生物挥发性有机化合物(mVOC)。因此，当经过蒸发器芯的空气被吹到室内时，室内可能在长期使用后暴露于由霉菌和细菌产生的挥发性有机化合物引起的难闻气味。
在长期使用后，蒸发器芯的表面覆有生物膜，该生物膜由细菌、细胞簇和胞外聚合物(EPS)构成。EPS包括多种组分例如蛋白质、多糖、聚糖醛酸、核酸、脂质等。在蒸发器芯的表面，多种细菌和霉菌以生物膜为营养物而繁殖并产生多种微生物挥发性有机化合物(mVOC)作为代谢物，而这些mVOC已知是空调恶臭的成因。
尽管有多种类型的芳香剂市售可得以用于去除这些难闻气味，它们无法从根本上去除在蒸发器芯上繁殖的霉菌和细菌，而仅是暂时地稀释不愉快的气味。同时，当前市售可得的抗菌剂没有开发成特异性地作用于在蒸发器芯上繁殖的特定霉菌或细菌，而是因为人们认为其对常见病菌具有抗菌效果而被使用。
本发明的发明者已经在韩国专利公开第10-2012-0020309中公开了一种制备蒸发器芯的方法，该蒸发器芯覆有由无气味或有香味的特定微生物所形成的生物膜以防止在蒸发器芯上造成难闻气味的细菌和霉菌的附着和生长。
然而，没有鉴别出哪些细菌是无气味的微生物。而且，没有清楚地证明它们在涂覆于蒸发器芯上后是否能在蒸发器芯上存活以及是否能够防止造成难闻气味的微生物的栖居并从而防止难闻气味。
以上背景技术描述仅意在提高对本发明背景的理解，而不应该解读为认为上述技术为本发明所属技术领域的普通技术人员所知。
发明内容
本发明的发明者已致力于找出一种使用无气味微生物来有效地控制造成难闻气味的微生物的方法。结果，他们已经成功地筛选出13种在空气调节系统中不造成难闻气味的微生物，且已经证实，当使用它们或其组合形成生物膜时，可以防止造成难闻气味的微生物的生长，因此可以防止难闻气味。
本发明意在提供一种用于防止气味的组合物，其包含无气味的微生物或其培养物。
本发明还意在提供一种覆有用于防止气味的组合物的蒸发器芯。
本发明还意在提供一种制造在空气调节系统中不造成气味的无气味蒸发器芯的方法，该方法包括在蒸发器芯上涂覆用于防止气味的组合物。
本发明还意在提供一种防止来自空气调节系统的气味的方法，该方法包括在蒸发器芯上涂覆用于防止气味的组合物。
本发明还意在提供一种用于检查来自空气调节系统的气味的方法，该方法包括在蒸发器芯上涂覆用于防止气味的组合物。
本发明还意在提供用于涂覆蒸发器芯以防止来自空气调节系统的气味的无气味微生物。
本发明的其他目的和益处将从以下具体说明、附图和权利要求中明显得出。
在一个方面，本发明提供用于防止气味的组合物，其包含无气味的微生物或其培养物。
本发明的发明者已经致力于找出一种使用无气味微生物来有效地控制造成难闻气味的微生物的方法。具体而言，他们已经尝试着从根本上根除来自空气调节系统的难闻气味的成因。结果，他们已经成功地筛选出13种在空气调节系统中不造成难闻气味的微生物，且已经证实，当使用它们或其组合形成生物膜时，可以防止造成难闻气味的微生物的生长，因而可以防止难闻气味。
在本发明中，术语“空气调节系统”是指在完全或部分地与外界环境隔离的空间内保持空气的温度、湿度、清洁度、流动等的系统。作为优选的实例，隔离的空间可以是完全或部分地与外部隔离的室内空间，例如在建筑物、车辆、火车、船只、飞机等内部。作为优选的实例，空气调节系统可以是空调。
在空气调节系统中，所有已经过风机的空气会通过蒸发器芯。在蒸发器芯的表面，随着由温差引起的水冷凝的持续，建立起有利于微生物生长的环境。结果，随时间推移形成生物膜。微生物代谢出多种浮在室内或室外空气中的物质以作为营养物并产生多种微生物挥发性有机化合物(mVOC)作为代谢物，这些营养物和代谢物散发出恶臭。
生物膜是包封在膜内的一群活微生物。膜保护微生物免受外界环境影响并供给营养物。膜由胞外聚合物(EPS)构成，其包括多种组分例如蛋白质、多糖、聚糖醛酸、核酸、脂质等。在蒸发器芯的表面上，多种微生物利用它们作为营养物进行繁殖，并产生散发出难闻气味的代谢物。
本发明的发明者已经筛选出不造成来自蒸发器芯的难闻气味的微生物，并且，经过培养，已经从这些微生物中分离出形成菌落的优势菌株。优势菌株可以根据现有技术中已知的多种方法进行分离和培养，且优势微生物可以例如基于稀释率或形态学特征例如菌落的颜色、大小、形状等进行筛选。
优势微生物包括甲基杆菌属(Methylobacterium)、不动杆菌属(Acinetobacter)、芽孢杆菌属(Bacillus)、短芽孢杆菌属(Brevibacillus)、异常球菌属(Deinococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、或黄杆菌属(Flavobacterium)，特别是Methylobacteriumaquaticum、Methylobacteriumbrachiatum、Methylobacteriumplatani、约氏不动杆菌(Acinetobacterjohnsonii)、越南芽孢杆菌(Bacillusvietnamensis)、污染短芽孢杆菌(Brevibacillusinvocatus)、Deinococcusficus、Leifsoniasoli、硝基还原假单胞菌(Pseudomonasnitroreducens)、Sphingomonasaquatilis、Methylobacteriumkomagatae、Deinococcusapachensis、或海泥黄杆菌(Flavobacteriumoceanosedimentum)。
这些微生物在2012年11月14日或2013年12月10日保藏在韩国微生物保藏中心(KoreanCultureCenterofMicroorganisms)并被给予以下保藏号：MethylobacteriumaquaticumHKMC-1(保藏号：KCCM11325P)、MethylobacteriumbrachiatumHKMC-2(保藏号：KCCM11326P)、MethylobacteriumplataniHKMC-3(保藏号：KCCM11327P)、约氏不动杆菌HKMC-4(保藏号：KCCM11328P)、越南芽孢杆菌HKMC-5(保藏号：KCCM11329P)、污染短芽孢杆菌HKMC-6(保藏号：KCCM11330P)、DeinococcusficusHKMC-7(保藏号：KCCM11331P)、LeifsoniasoliHKMC-8(保藏号：KCCM11332P)、硝基还原假单胞菌HKMC-9(保藏号：KCCM11333P)、SphingomonasaquatilisHKMC-10(保藏号：KCCM11334P)、MethylobacteriumkomagataeHKMC-11(保藏号：KCCM11335P)、DeinococcusapachensisHKMC-12(保藏号：KCCM11499P)和海泥黄杆菌HKMC-13(保藏号：KCCM11500P)。
微生物可以单独地或与其他微生物组合地包含在用于防止气味的组合物中。
本发明的用于防止气味的组合物可以用于防止产生难闻气味的微生物的栖居和/或由它们产生的难闻气味。换言之，本发明的组合物可以用于通过向产生难闻气味的装置(例如，空气调节系统、废水处理单元等)、物件(例如，废物篮、抽水马桶等)、动物(例如，污染的牲畜等)或人体(例如，嘴、糖尿病足等)的所有或特定部分涂覆或喷洒来防止产生难闻气味的微生物的栖居。
本发明的用于防止气味的组合物还可以包含现有技术已知的多种介质组分来加强不同物体上生物膜的形成。介质组分可以包括，例如，琼脂、明胶、藻酸盐、角叉胶(carageenan)或果胶。具体而言，PTYG培养基、R2A培养基或LB培养基可以用于空气调节系统中的蒸发器芯。
除无气味的微生物外，本发明的用于防止气味的组合物还可以包含芳香剂、消毒剂、抗菌剂等来防止难闻气味或防止或去除产生难闻气味的微生物。
在本发明的优选示例性实施方式中，本发明的组合物用于防止空气调节系统的气味。
本发明组合物适用的空气调节系统可以安装在建筑物、车辆、火车、船只、飞机等中，以用于调节空气的温度、湿度、流量或清洁度的目的。
本发明生物膜所涂覆的物体可以是空气调节系统。空气调节系统包含压缩机、风机、蒸发器芯等。具体而言，本发明生物膜所涂覆的物体可以是蒸发器芯。
具体而言，由于空气的热交换，在空气调节系统的蒸发器芯的表面上建立起有利于微生物栖居和繁殖的环境。随着时间推移，粘附于表面的微生物形成难以去除的稳定生物膜。换言之，无气味微生物可以提前繁殖，从而可以防止产生难闻气味的微生物的栖居。
本发明的发明者已经发现，可以通过将作为优势种或具有较好存活力的无气味微生物提前涂覆在空气调节系统的蒸发器芯上而在蒸发器芯上形成仅由其构成的生物膜，由此，可以显著地防止难闻气味以及其他产生难闻气味微生物的繁殖和栖居(实施例9～14)。
在另一方面，本发明提供涂覆有防止气味的组合物的蒸发器芯以及用于制造该蒸发器芯的方法。
蒸发器芯的翅片由铝或铝合金制成，且蒸发器芯使用经抗菌剂处理的铝或非抗菌剂处理的铝合金进行制备。然而，蒸发器芯的材料不限于铝或铝合金。通常而言，除铝或其合金外，蒸发器芯可以由任何具有良好导热性和优异防腐蚀性的金属例如铜制成。在电动车中，例如，热交换器可以与Peltier设备连接。类似于此，可以使用任何材料，只要结构可以允许简单的热交换。
包含无气味微生物或其培养物的用于防止气味的组合物可以按照现有技术中已知的多种方法(例如，喷洒、涂覆、浸渍)涂覆在蒸发器芯上。优选地，蒸发器芯可以浸在无气味微生物的培养物中，从而使无气味微生物可以均一地涂覆在蒸发器芯内部的翅片上。涂覆可以执行一次或多次。
无气味微生物的培养物可以具有0.3～0.9的光密度(O.D.)，更优选为0.4～0.8。
当使用O.D.值为0.3～0.9的微生物培养物时，微生物可以以104～108CFU/g的浓度进行涂覆。并且，当使用O.D.值为0.4～0.89的微生物培养物时，微生物可以以105～107CFU/g的浓度进行涂覆。考虑到在使用过的车辆的蒸发器芯上存在的微生物浓度为约106CFU/g，可以优选地使用O.D.值为0.4～0.8的微生物以105～107CFU/g的浓度进行微生物涂覆。
涂覆的无气味微生物可以通过均匀地分布在蒸发器芯表面并栖居在蒸发器芯表面而形成长时间稳定的生物膜(30天或更久、60天或更久、或者90天或更久)(实施例11～13)。
在另一个方面，本发明提供用于防止空气调节系统的气味的方法，包括：在蒸发器芯上涂覆用于防止气味的组合物。
本发明的发明者已经在将夹具安装在车顶、然后安装在其上涂覆有本发明组合物的蒸发器芯后进行了实验，来研究蒸发器芯是否能够在室外空气条件下保持无气味微生物的种群以及是否能够防止其他产生难闻气味的微生物的栖居。结果发现，初始涂覆的无气味微生物的群体保持60天，并且没有检测到会产生难闻气味的外来微生物(实施例14)。
因此，当通过涂覆本发明的含有无气味微生物的防止气味的组合物来形成生物膜时，可以显著地防止会产生难闻气味的外来微生物的流入和栖居，因此，可以有效地防止来自空气调节系统的难闻气味。
在另一方面，本发明提供用于检查来自空气调节系统的气味的方法，包括在蒸发器芯上涂覆用于防止气味的组合物。
包含在防止气味的组合物中的微生物是否实际上产生气味会取决于微生物所代谢的营养源组分。因此，重要的是，当提供相关工业领域的营养源时，微生物不产生气味。
在空气调节系统的情况中，微生物代谢浮在室内和室外空气中的多种物质作为营养物。即，室内或室外空气污染物或废气组分(石油燃料，例如汽油、柴油、LPG等)是微生物的营养源。因此，通过在涂覆有微生物的蒸发器芯上引入这些营养源，可以提前检查在实际的工业环境下是否会从空气调节系统产生气味。
在另一个方面，本发明提供MethylobacteriumaquaticumHKMC-1(保藏号：KCCM11325P)、MethylobacteriumbrachiatumHKMC-2(保藏号：KCCM11326P)、MethylobacteriumplataniHKMC-3(保藏号：KCCM11327P)、约氏不动杆菌HKMC-4(保藏号：KCCM11328P)、越南芽孢杆菌HKMC-5(保藏号：KCCM11329P)、污染短芽孢杆菌HKMC-6(保藏号：KCCM11330P)、DeinococcusficusHKMC-7(保藏号：KCCM11331P)、LeifsoniasoliHKMC-8(保藏号：KCCM11332P)、硝基还原假单胞菌HKMC-9(保藏号：KCCM11333P)、SphingomonasaquatilisHKMC-10(保藏号：KCCM11334P)、MethylobacteriumkomagataeHKMC-11(保藏号：KCCM11335P)、DeinococcusapachensisHKMC-12(保藏号：KCCM11499P)或海泥黄杆菌HKMC-13(保藏号：KCCM11500P)作为涂覆蒸发器芯以防止来自空气调节系统的气味的微生物。
这些微生物可以用于单独地或组合地涂覆蒸发器芯以防止来自空气调节系统的气味。
本公开的特征和优点可以总结如下：
(i)本发明提供用于防止气味的组合物，其包含无气味的微生物或其培养物。
(ii)本发明还提供涂覆有用于防止气味的组合物的蒸发器芯以及用于制备该蒸发器芯的方法。
(iii)此外，本发明提供用于防止气味的方法，其包括在蒸发器芯上涂覆用于防止气味的组合物。
(iv)当通过在产生难闻气味的微生物可能栖居的物体上涂覆本发明的用于防止气味的组合物来形成生物膜时，可以通过显著地防止产生难闻气味的外来微生物的流入和栖居而有效地防止难闻气味。
附图说明
图1示出陪替氏培养皿，在该陪替氏培养皿中，灭菌的铝翅片浸在营养培养基中以接种无气味微生物。
图2示出组合1在30天存活评估中不同颜色菌落的数量(population)。
图3示出组合1在30天存活评估中不同颜色菌落的比率。
图4示出经REP-PCR测量的组合1在30天存活评估中的菌株比率。
图5示出经REP-PCR测量的组合2在30天存活评估中的菌株比率。
图6示出经REP-PCR测量的组合3在30天存活评估中的菌株比率。
图7示出经REP-PCR测量的组合3在30天存活评估中的甲基杆菌菌株的比率。
图8示出经REP-PCR测量的组合4在30天存活评估中的菌株的比率。
图9示出经REP-PCR测量的组合5在30天存活评估中的菌株比率。
图10示出经REP-PCR测量的组合A在30天存活评估中的菌株比率。
图11示出经REP-PCR测量的组合B在30天存活评估中的菌株比率。
图12示出经REP-PCR测量的组合C在30天存活评估中的菌株比率。
图13示出经REP-PCR测量的组合D在30天存活评估中的菌株比率。
图14示出经REP-PCR测量的组合E在30天存活评估中的菌株比率。
图15示出经REP-PCR测量的组合F在30天存活评估中的菌株比率。
图16示出Methylobacteriumaquaticum和Methylobacteriumkomagatae组合在90天存活评估中的数量。
图17示出经REP-PCR测量的Methylobacteriumaquaticum和Methylobacteriumkomagatae组合在90天存活评估中的菌株比率。
图18示出夹具上Methylobacteriumaquaticum和Methylobacteriumkomagatae组合的数量。
图19示出经REP-PCR测量的夹具上的Methylobacteriumaquaticum和Methylobacteriumkomagatae组合的数量变化。
具体实施方式
在下文中，本发明将通过实施例进行更详细的说明。以下实施例仅用于示例性目的，对于相关领域普通技术人员而言明显的是，本发明的范围不限于实施例。
实施例
实施例1：散发难闻气味的使用过的车辆
表1
编号 车辆 样本类型
1 车辆A 蒸发器芯
2 车辆B 蒸发器芯
3 车辆C 蒸发器芯
4 车辆D 蒸发器芯
5 车辆E 蒸发器芯
蒸发器芯样本取自安装于5辆散发难闻气味的使用过的车辆(车辆A～E)的蒸发器芯。
实施例2：蒸发器芯样本的制备
将取自使用过的车辆A～E的蒸发器芯的蒸发器芯样本存储在4℃的密封聚乙烯袋中，直至使用。对于微生物的分离和培养，使用灭菌的尖嘴钳从各个蒸发器芯从包括前部和后部的多个部位取5g翅片样本，并在使用前混合。
实施例3：从蒸发器芯分离微生物
按照如下步骤从蒸发器芯分离微生物。
①将从蒸发器芯取得的样本混合并放入混合器中。
②将200mL灭菌的1x磷酸缓冲液(PBS)加入混合器。
③将混合的样本与PBS混合30秒。
④将混合器置于冰上1分钟。
⑤将步骤③和④再重复两遍。
⑥将所得的混悬液在4℃于13000rpm离心3分钟。
⑦仅将上清液取出并转移到新管中。
⑧将经过取样的蒸发器芯表面用经上清液浸泡过的灭菌棉拭子擦拭几遍。
⑨将棉拭子的头放入上清液中并使之涡旋。
⑩将在步骤⑥中得到的沉淀和⑨中得到的混合物进行混合并用作接种溶液。
经由步骤①～⑩将微生物从车辆A～E的蒸发器芯中物理分离。
实施例4：微生物的分离和培养
通过在异养平板上培养从空调中分离通常称为正常菌群的好氧异养细菌。将PTYG琼脂培养基和R2A琼脂培养基用作复合营养培养基来分离正常细菌。通过向980mL蒸馏水添加0.25g蛋白胨(Difco)、0.25g胰胨(Difco)、0.5g酵母提取物(Difco)、0.5g葡萄糖(Difco)、30mgMgSO4(Sigma)、3mgCaCl2(Sigma)和15gBacto琼脂(Difco)，并在pH调整到7.0后在高压下于121℃灭菌15分钟，从而制备PTYG琼脂培养基。通过向980mL蒸馏水添加0.5g酵母提取物(Difco)、0.5g□蛋白胨No.3(Difco)、0.5g酪蛋白氨基酸(Difco)、0.5g右旋糖(Difco)、0.5g可溶淀粉(Difco)、0.3g丙酮酸钠(Difco)、0.3g硫酸钾(Difco)、0.05g硫酸镁(Difco)和15gBacto琼脂(Difco)，并在pH调整到7.2后在高压下于121℃灭菌15分钟，由此来制备R2A琼脂培养基。将3种抗生素(表2)用于分离非优势的正常细菌。各抗生素在将培养基过滤灭菌到100ppm浓度后在约50℃接种。
表2
编号 抗生素 类型 制造商
1 卡那霉素 氨基糖苷类 Sigma
2 氨苄青霉素 β-内酰胺类 Sigma
3 氯霉素 氯霉素类 Sigma
实施例5：真菌(霉菌)的分离和培养
通过在使用营养培养基的好氧平板上培养而从空调中分离真菌(霉菌)。将马铃薯右旋糖琼脂培养基和麦芽提取物琼脂培养基用于分离真菌(霉菌)。通过向980mL蒸馏水中添加4g马铃薯淀粉(Difco)、20g右旋糖(Difco)和15gBacto琼脂(Difco)并在pH调整到5.1后在高压下于121℃灭菌15分钟，由此制备马铃薯右旋糖琼脂培养基。通过向980mL蒸馏水中添加20g麦芽提取物(Difco)和15gBacto琼脂(Difco)并在pH调整到5.0后在高压下于121℃灭菌15分钟，由此来制备麦芽提取物琼脂培养基。
将90mmx15mm陪替氏培养皿用来培养真菌，并使用60mmx15mm陪替氏培养皿来分离所培养的真菌。
实施例6：优势菌株的分离和培养
基于稀释率或形态学特征例如菌落的颜色、大小、形状等，按照如下步骤分离并培养优势菌株。
①从培养基中分离霉菌和细菌。
②通过使用接种环向复合培养基接种来分离表现出不同形态的细菌。
③从接种的培养基选择显示出最佳生长的细菌培养物并对其传代培养。
④在使用手术刀去除菌丝尾部后，向复合培养基接种霉菌。
⑤从接种的培养基中选择显示出最佳生长的真菌培养物并对其传代培养。
实施例7：优势细菌的遗传学表征(geneticcharacterization)
基于REP-PCR图样分析的指纹分析(fingerprinting)
REP-PCR是用于细菌染色体的结构分析的分子生物学指纹分析技术，其可以区分不同细菌菌株。遗传学表征通过REP-PCR如下进行。
(1)细胞裂解
①将2.5μL的Lyse-N-GoPCR试剂(Thermo)添加至PCR管。
②在干净的工作台上，将菌落用移液管移取到管上。在移液管移动期间，小心操作从而所得溶液不变浑浊。
③根据制造商的说明书，在PCR仪上进行培养。
④根据表3所示的裂解操作指南进行细胞裂解。在第9个循环时，将温度保持在80℃。
表3
循环 温度(℃) 时间(秒)
1 65 30
2 8 30
3 65 90
4 97 180
5 8 60
6 65 180
7 97 60
8 65 60
9 80 保持
(2)PCR反应
使用如表4所述制备的PCR试剂，通过在94℃进行7分钟预变性并重复33个92℃下1分钟变性、51.5℃下1分钟退火和65℃下8分钟延伸的循环来进行PCR扩增，如表5所述。
表4
表5
(3)凝胶电泳
在将6x染料与样本以1:5的比率混合后，将PCR扩增的DNA片段加载在补充有EtBr的1.2-1.5％琼脂糖凝胶上。由于大部分PCR产物在100-1000bp的范围内，它们与100bp的DNA梯状条带一起进行加载。之后，尽可能慢地(50V)进行电泳，从而使溴酚蓝和二甲苯蓝染料移动整块胶的半程。在胶上显示出相同DNA图样的菌株被认为是同一菌株。
(4)基于16SrRNA基因分析来分离优势细菌
将16S核糖体核糖核酸(rRNA)基因用于细菌的基因识别。由此，经REP-PCR区分的细菌可以在属和种的水平上进行鉴别。16SrRNA是通过与多种蛋白质相互作用而构成核糖体的RNA。由于已知多于2000种细菌物种的寡核苷酸的全序列或碱基序列，细菌可以基于16SrRNA基因的相似性来分组。因为16SrRNA基因的碱基序列差异远远小于基因组中其他基因的碱基序列差异，16SrRNA的碱基序列相似度被认为是生物体之间进化距离的衡量。基于16SrRNA基因片段的碱基序列相似性对微生物、尤其是工业上有用的微生物的鉴别已经与脂肪酸分析和碳源同化制谱(carbohydrateassimilationprofiling)用作典型的鉴别方法。
<16SrRNA>
PCR条件(共50μL)：将表6所示的除DNA和Taq以外的溶液的混合物(44.5μL)添加到上述的裂解液中。接下来，通过进行94℃下5分钟预变性并重复29个循环的94℃下1分钟变性、55℃下1分钟退火和72℃1分30秒延伸来进行PCR扩增，如表7所示。
表6
高压灭菌3°D.W. 22μL
10x缓冲液(Roche) 5μL
dNTP(Roche，2.5mM) 5μL
DMSO 5μL
BSA(10mg/mL) 2.5μL
27mf(20皮摩尔/μL) 2.5μL
1492r(20皮摩尔/μL) 2.5μL
DNA 5μL
Taq(Roche) 0.5μL
表7
(5)PCR纯化
使用QIAquickPCR纯化试剂盒来纯化16SrRNAPCR产物。
①将PCR产物加至5xPB缓冲液中。
②将所得的溶液转移到QIAquick柱。
③对于DNA结合，将溶液离心1分钟。
④对于洗涤，将750μLPE缓冲液加入QIAquick柱并进行1分钟离心。
⑤进行1分钟离心。
⑥将所得溶液转移到新的QIAquick柱中。
⑦对于DNA提取，加入30μLEB缓冲液，并使所得溶液静置1分钟。
⑧在进行1分钟离心后，在管中收集溶于EB中的DNA。
(6)分离的微生物及其特征
<微生物1>
1.微生物名：HKMC-1
属：甲基杆菌
种：aquaticum
保藏号：KCCM11325P(2012.11.14)
2.重构条件
a.重构试剂
(1)组成：PTYG培养基(相对于1L培养基，0.25g蛋白胨、0.25g胰胨、0.5g酵母提取物、0.5g葡萄糖、30mgMgSO4和3mgCaCl2)或R2A培养基。
(2)pH:7.0
(3)灭菌条件：121℃20分钟
b.于28℃培养7天
3.培养基
(1)组成：PTYG培养基(相对于1L培养基，0.25g蛋白胨、0.25g胰胨、0.5g酵母提取物、0.5g葡萄糖、30mgMgSO4和3mgCaCl2)或R2A培养基
(2)pH:7.0
(3)灭菌条件：121℃20分钟
4.培养条件
a.好氧/厌氧：好氧
b.温度：28℃
c.在搅拌下或不在搅拌下培养(液体或固体)
5.储存条件
温度：-70℃
<微生物2>
1.微生物名：HKMC-2
属：甲基杆菌
种：brachiatum
保藏号：KCCM11326P(2012.11.14)
2.重构条件
a.重构试剂
(1)组成：PTYG培养基(相对于1L培养基，0.25g蛋白胨、0.25g胰胨、0.5g酵母提取物、0.5g葡萄糖、30mgMgSO4和3mgCaCl2)或R2A培养基
(2)pH:7.0
(3)灭菌条件：121℃20分钟
b.28℃培养7天
3.培养基
(1)组成：PTYG培养基(相对于1L培养基，0.25g蛋白胨、0.25g胰胨、0.5g酵母提取物、0.5g葡萄糖、30mgMgSO4和3mgCaCl2)或R2A培养基
(2)pH:7.0
(3)灭菌条件：121℃20分钟
4.培养条件
a.好氧/厌氧：好氧
b.温度：28℃
c.在搅拌下或不在搅拌下培养(液体或固体)
5.储存条件
温度：-70℃
<微生物3>
1.微生物名：HKMC-3
属：甲基杆菌
种：platani
保藏号：KCCM11327P(2012.11.14)
2.重构条件
a.重构试剂
(1)组成：PTYG培养基(相对于1L培养基，0.25g蛋白胨、0.25g胰胨、0.5g酵母提取物、0.5g葡萄糖、30mgMgSO4和3mgCaCl2)或R2A培养基
(2)pH:7.0
(3)灭菌条件：121℃20分钟
b.28℃培养7天
3.培养基
(1)组成：PTYG培养基(相对于1L培养基，0.25g蛋白胨、0.25g胰胨、0.5g酵母提取物、0.5g葡萄糖、30mgMgSO4和3mgCaCl2)或R2A培养基
(2)pH:7.0
(3)灭菌条件：121℃20分钟
4.培养条件
a.好氧/厌氧：好氧
b.温度：28℃
c.在搅拌下或不在搅拌下培养(液体或固体)
5.储存条件
温度：-70℃
<微生物4>
1.微生物名：HKMC-4
属：不动杆菌
种：约氏(johnsonii)
保藏号：KCCM11328P(2012.11.14)
2.重构条件
a.重构试剂
(1)组成：PTYG培养基(相对于1L培养基，0.25g蛋白胨、0.25g胰胨、0.5g酵母提取物、0.5g葡萄糖、30mgMgSO4和3mgCaCl2)或R2A培养基
(2)pH:7.0
(3)灭菌条件：121℃20分钟
b.28℃培养7天
3.培养基
(1)组成：PTYG培养基(相对于1L培养基，0.25g蛋白胨、0.25g胰胨、0.5g酵母提取物、0.5g葡萄糖、30mgMgSO4和3mgCaCl2)或R2A培养基
(2)pH:7.0
(3)灭菌条件：121℃20分钟
4.培养条件
a.好氧/厌氧：好氧
b.温度：28℃
c.在搅拌下或不在搅拌下培养(液体或固体)
5.储存条件
温度：-70℃
<微生物5>
1.微生物名：HKMC-5
属：芽孢杆菌
种：越南(vietnamensis)
保藏号：KCCM11329P(2012.11.14)
2.重构条件
a.重构试剂
(1)组成：PTYG培养基(相对于1L培养基，0.25g蛋白胨、0.25g胰胨、0.5g酵母提取物、0.5g葡萄糖、30mgMgSO4和3mgCaCl2)或R2A培养基
(2)pH:7.0
(3)灭菌条件：121℃20分钟
b.28℃培养7天
3.培养基
(1)组成：PTYG培养基(相对于1L培养基，0.25g蛋白胨、0.25g胰胨、0.5g酵母提取物、0.5g葡萄糖、30mgMgSO4和3mgCaCl2)或R2A培养基
(2)pH:7.0
(3)灭菌条件：121℃20分钟
4.培养条件
a.好氧/厌氧：好氧
b.温度：28℃
c.在搅拌下或不在搅拌下培养(液体或固体)
5.储存条件
温度：-70℃
<微生物6>
1.微生物名：HKMC-6
属：短芽孢杆菌
种：污染(invocatus)
保藏号：KCCM11330P(2012.11.14)
2.重构条件
a.重构试剂
(1)组成：PTYG培养基(相对于1L培养基，0.25g蛋白胨、0.25g胰胨、0.5g酵母提取物、0.5g葡萄糖、30mgMgSO4和3mgCaCl2)或R2A培养基
(2)pH:7.0
(3)灭菌条件：121℃20分钟
b.28℃培养7天
3.培养基
(1)组成：PTYG培养基(相对于1L培养基，0.25g蛋白胨、0.25g胰胨、0.5g酵母提取物、0.5g葡萄糖、30mgMgSO4和3mgCaCl2)或R2A培养基
(2)pH:7.0
(3)灭菌条件：121℃20分钟
4.培养条件
a.好氧/厌氧：好氧
b.温度：28℃
c.在搅拌下或不在搅拌下培养(液体或固体)
5.储存条件
温度：-70℃
<微生物7>
1.微生物名：HKMC-7
属：异常球菌(Deinococcus)
种：ficus
保藏号：KCCM11331P(2012.11.14)
2.重构条件
a.重构试剂
(1)组成：PTYG培养基(相对于1L培养基，0.25g蛋白胨、0.25g胰胨、0.5g酵母提取物、0.5g葡萄糖、30mgMgSO4和3mgCaCl2)或R2A培养基
(2)pH:7.0
(3)灭菌条件：121℃20分钟
b.28℃培养7天
3.培养基
(1)组成：PTYG培养基(相对于1L培养基，0.25g蛋白胨、0.25g胰胨、0.5g酵母提取物、0.5g葡萄糖、30mgMgSO4和3mgCaCl2)或R2A培养基
(2)pH:7.0
(3)灭菌条件：121℃20分钟
4.培养条件
a.好氧/厌氧：好氧
b.温度：28℃
c.在搅拌下或不在搅拌下培养(液体或固体)
5.储存条件
温度：-70℃
<微生物8>
1.微生物名：HKMC-8
属：Leifsonia
种：soli
保藏号：KCCM11332P(2012.11.14)
2.重构条件
a.重构试剂
(1)组成：PTYG培养基(相对于1L培养基，0.25g蛋白胨、0.25g胰胨、0.5g酵母提取物、0.5g葡萄糖、30mgMgSO4和3mgCaCl2)或R2A培养基
(2)pH:7.0
(3)灭菌条件：121℃20分钟
b.28℃培养7天
3.培养基
(1)组成：PTYG培养基(相对于1L培养基，0.25g蛋白胨、0.25g胰胨、0.5g酵母提取物、0.5g葡萄糖、30mgMgSO4和3mgCaCl2)或R2A培养基
(2)pH:7.0
(3)灭菌条件：121℃20分钟
4.培养条件
a.好氧/厌氧：好氧
b.温度：28℃
c.在搅拌下或不在搅拌下培养(液体或固体)
5.储存条件
温度：-70℃
<微生物9>
1.微生物名：HKMC-9
属：假单胞菌
种：硝基还原(nitroreducens)
保藏号：KCCM11333P(2012.11.14)
2.重构条件
a.重构试剂
(1)组成：PTYG培养基(相对于1L培养基，0.25g蛋白胨、0.25g胰胨、0.5g酵母提取物、0.5g葡萄糖、30mgMgSO4和3mgCaCl2)或R2A培养基
(2)pH:7.0
(3)灭菌条件：121℃20分钟
b.28℃培养7天
3.培养基
(1)组成：PTYG培养基(相对于1L培养基，0.25g蛋白胨、0.25g胰胨、0.5g酵母提取物、0.5g葡萄糖、30mgMgSO4和3mgCaCl2)或R2A培养基
(2)pH:7.0
(3)灭菌条件：121℃20分钟
4.培养条件
a.好氧/厌氧：好氧
b.温度：28℃
c.在搅拌下或不在搅拌下培养(液体或固体)
5.储存条件
温度：-70℃
<微生物10>
1.微生物名：HKMC-10
属：鞘氨醇单胞菌
种：aquatilis
保藏号：KCCM11334P(2012.11.14)
2.重构条件
a.重构试剂
(1)组成：PTYG培养基(相对于1L培养基，0.25g蛋白胨、0.25g胰胨、0.5g酵母提取物、0.5g葡萄糖、30mgMgSO4和3mgCaCl2)或R2A培养基
(2)pH:7.0
(3)灭菌条件：121℃20分钟
b.28℃培养7天
3.培养基
(1)组成：PTYG培养基(相对于1L培养基，0.25g蛋白胨、0.25g胰胨、0.5g酵母提取物、0.5g葡萄糖、30mgMgSO4和3mgCaCl2)或R2A培养基
(2)pH:7.0
(3)灭菌条件：121℃20分钟
4.培养条件
a.好氧/厌氧：好氧
b.温度：28℃
c.在搅拌下或不在搅拌下培养(液体或固体)
5.储存条件
温度：-70℃
<微生物11>
1.微生物名：HKMC-11
属：甲基杆菌
种：komagatae
保藏号：KCCM11335P(2012.11.14)
2.重构条件
a.重构试剂
(1)组成：PTYG培养基(相对于1L培养基，0.25g蛋白胨、0.25g胰胨、0.5g酵母提取物、0.5g葡萄糖、30mgMgSO4和3mgCaCl2)或R2A培养基
(2)pH:7.0
(3)灭菌条件：121℃20分钟
b.28℃培养7天
3.培养基
(1)组成：PTYG培养基(相对于1L培养基，0.25g蛋白胨、0.25g胰胨、0.5g酵母提取物、0.5g葡萄糖、30mgMgSO4和3mgCaCl2)或R2A培养基
(2)pH:7.0
(3)灭菌条件：121℃20分钟
4.培养条件
a.好氧/厌氧：好氧
b.温度：28℃
c.在搅拌下或不在搅拌下培养(液体或固体)
5.储存条件
温度：-70℃
<微生物12>
1.微生物名：HKMC-12
属：异常球菌
种：apachensis
保藏号：KCCM11499P(2013.12.10)
2.重构条件
a.重构试剂
(1)组成：PTYG培养基(相对于1L培养基，0.25g蛋白胨、0.25g胰胨、0.5g酵母提取物、0.5g葡萄糖、30mgMgSO4和3mgCaCl2)或R2A培养基
(2)pH:7.0
(3)灭菌条件：121℃20分钟
b.28℃培养7天
3.培养基
(1)组成：PTYG培养基(相对于1L培养基，0.25g蛋白胨、0.25g胰胨、0.5g酵母提取物、0.5g葡萄糖、30mgMgSO4和3mgCaCl2)或R2A培养基
(2)pH:7.0
(3)灭菌条件：121℃20分钟
4.培养条件
a.好氧/厌氧：好氧
b.温度：28℃
c.在搅拌下或不在搅拌下培养(液体或固体)
5.储存条件
温度：-70℃
<微生物13>
1.微生物名：HKMC-13
属：黄杆菌
种：海泥(oceanosedimentum)
保藏号：KCCM11500P(2013.12.10)
2.重构条件
a.重构试剂
(1)组成：PTYG培养基(相对于1L培养基，0.25g蛋白胨、0.25g胰胨、0.5g酵母提取物、0.5g葡萄糖、30mgMgSO4和3mgCaCl2)或R2A培养基
(2)pH:7.0
(3)灭菌条件：121℃20分钟
b.28℃培养7天
3.培养基
(1)组成：PTYG培养基(相对于1L培养基，0.25g蛋白胨、0.25g胰胨、0.5g酵母提取物、0.5g葡萄糖、30mgMgSO4和3mgCaCl2)或R2A培养基
(2)pH:7.0
(3)灭菌条件：121℃20分钟
4.培养条件
a.好氧/厌氧：好氧
b.温度：28℃
c.在搅拌下或不在搅拌下培养(液体或固体)
5.储存条件
温度：-70℃
实施例8：铝翅片上的分离微生物的感官评估
(1)在营养培养基中培养
对于从实施例7识别的微生物中的11个种的感官评估，将微生物在营养培养基中于28℃培养7天。在营养培养基中培养细菌的程序如下所示。
①将分离的微生物接种到液体营养培养基。
②培养在28℃进行5～7天。
③将100μL在液体培养基中培养的细菌接种到固体营养培养基。
④使用涂布器将接种的细菌均匀铺开。
⑤将细菌在密封的陪替氏培养皿上于28℃培养10天。
(2)对铝翅片的感官评估
将矩形铝翅片灭菌并然后浸在营养培养基中。对于细菌接种，在步骤②～④的相同条件下在营养培养基中进行培养。感官评估结果在表8中给出。
①抗菌剂处理的铝翅片：使用市售可得的涂覆有抗菌剂的蒸发器芯产品。
②非抗菌剂处理的、亲水涂覆的铝翅片：为与抗菌剂涂覆的翅片进行比较而特地制备仅亲水涂覆而没有抗菌剂涂层的铝翅片。尽管蒸发器芯由铝制成以减轻重量，也可以用其他金属例如铜、不锈钢等制成。
表8
当在接种到抗菌剂处理的铝翅片以及非抗菌剂处理的翅片上之后进行培养时，对于所有11种微生物物种，没有可检测的气味。
实施例9：对于涂覆无气味微生物的最佳条件的评估
(1)对于在翅片上涂覆无气味微生物的最佳浓度的分析
对于11种无气味微生物物种在蒸发器芯上的涂覆，如2012年优先权申请中所述，研究了将微生物接种至约106CFU/g浓度的最佳涂覆浓度。在用灭菌的0.85％盐水清洗后，将Methylobacteriumaquaticum于28℃培养直至对数生长后期，然后于4℃培养18小时。在4℃培养后，光密度(O.D.)测量为0.749、0.588、0.55、0.5和0.45。通过在室温浸1小时并以恒定rpm摇晃，用培养物涂覆2gU形翅片。从混合器中移出涂覆有不同浓度微生物的翅片并在系列稀释后铺至R2A琼脂平板。
已发现，涂覆在翅片上的微生物浓度基于O.D.值而变化。当O.D.为0.749时，涂覆度为约1.53×108±1.52×107CFU/g翅片。并且，当O.D.为0.588和0.55时，涂覆度分别为约4.00×107±1.00×107CFU/g翅片和1.03×107±8.50×105CFU/g翅片。此外，当O.D.为0.5和0.45时，涂覆度分别为6.00×106±7.00×105CFU/g翅片和2.53×106±3.51×105CFU/g翅片。换言之，涂覆度与O.D.成比例。0.5的O.D.值(此时微生物以106CFU/g的浓度涂覆，该浓度与分离出微生物的蒸发器芯的水平相似)被选择用于其他10种无气味微生物种的涂覆。
(2)对无气味微生物对蒸发器芯和翅片的涂覆性(coatability)的评估
作为翅片涂覆测试的结果，11种无气味微生物物种在相同O.D.下显示出相同的涂覆度，而无论属是什么。因此，使用与翅片的O.D.值对应的培养物来测量涂覆在蒸发器芯上的Methylobacteriumaquaticum的量。
调整至O.D.0.5的Methylobacteriumaquaticum在蒸发器芯上显示出8.95×106±5.51×105CFU/g翅片的涂覆度。当将同一培养物涂覆在蒸发器芯上时，涂覆度为2.55×106±3.51×105CFU/g翅片。因此，已证实，当使用相同O.D.的培养物时，微生物以相同程度涂覆。
实施例10：蒸发器芯上涂覆的分离微生物的感官评估
(1)11种无气味微生物物种在蒸发器芯涂层上的涂覆和感官评估
对于在实施例8中鉴定的微生物的感官评估，将11种无气味微生物物种中的每一种均涂覆在蒸发器芯上。
经由嗅觉评估测试来分析由微生物产生的难闻气味。通过15人感官评估小组来评估涂覆有微生物的蒸发器芯。结果，11种微生物物种的得分为1.78±0.41(5分制，0：无气味；1：非常微弱的气味(几乎检测不到的气味)；2：微弱的气味(难以区分的气味)；3：明显的气味(可区分的气味)；4：强烈的气味；5：非常强烈的气味)。甲基杆菌菌株示出低于平均值的分数，1.625±0.29。3种通用菌株(commonstrain)，Methylobacteriumaquaticum、Methylobacteriumbrachiatum和Methylobacteriumplatani得分为1.6±0.35。Deinococcusficus得分最高，为2.8，之后为越南芽孢杆菌，为2.1(表8)。
基于感官评估结果，产生相对强烈气味的3种微生物物种，即Methylobacteriumbrachiatum、越南芽孢杆菌和Deinococcusficus，被排除在外。
表9.
涂覆在蒸发器芯上的微生物的感官评估
重构条件*：步骤1：在供给汽油(微生物的营养源)后，运行重构装置2小时(温度：25℃，湿度：50～90％，空气流速：170CMH，营养源：10ppm汽油)。
步骤2：在停止运行重构装置后(温度：25℃，湿度：30～50％，空气流速：0CMH)，在稍稍打开重构装置进口后评测气味。
(2)无气味微生物的组合的感官评估
将基于感官评估所选择的8种无气味微生物物种与Methylobacteriumaquaticum及Methylobacteriumplatani组合来获得14种优化的无气味微生物组合。对于无气味微生物组合的感官评估，将它们以相同密度混合并涂覆在蒸发器芯上。
作为嗅觉评估的结果，14种组合的平均感官评估得分为1.89±0.52(5分制)。包含通用菌株以及约氏不动杆菌、Sphingomonasaquatilis和硝基还原假单胞菌的组合14显示出1.25的最低感官评估得分，且包含通用菌株和约氏不动杆菌的组合显示出3.14的最高感官评估得分(表10)。基于此定量评估和气味质量评估测试，将除包含通用菌株与约氏不动杆菌和污染短芽孢杆菌之一的2种组合外的10种组合，包含污染短芽孢杆菌、Sphingomonasaquatilis和Methylobacteriumkomagatae的组合7，以及包含Leifsoniasoli、Sphingomonasaquatilis和硝基还原假单胞菌的组合13选择用于最终的存活测试。
表10.
无气味微生物的组合的感官评估
实施例11：10种组合30天的存活评估
对于基于实施例9-(2)的感官评估结果而选择的微生物组合，进行存活评估30天。组合的数量和微生物如下所示(表11)。
表11.
在30天存活评估中使用的微生物组合
按组合1到组合10的顺序进行微生物培养并涂覆在蒸发器芯上。涂覆度为106CFU/g翅片。
组合1在蒸发器芯上显示出1.09×107±8.65×105CFU/g翅片的涂覆度。红色菌落被检测为处于8.70×106±2.35×106CFU/g翅片，白色菌落为2.50×105±7.07×104CFU/g翅片，且黄色菌落为1.90×106±1.73×105CFU/g翅片。30天后，总的细菌计数为4.63×105±5.09×104CFU/g翅片，其中红色菌落为4.63×106±1.53×105CFU/g翅片(图2)。换言之，占到80％多的红色菌落的比例在30天后增加到100％(图3)。基于表型，怀疑红色菌落包含具有粉红色素的甲基杆菌。在REP-PCR分析中，在0时点未检测到Methylobacteriumplatani和污染短芽孢杆菌。具体而言，注意到未检测到作为通用菌株的Methylobacteriumplatani。对于组合1，在时点0，在总共86个REP-PCR样本中的70个中检测到Methylobacteriumaquaticum为最多。在12个样本中检测到Sphingomonasaquatilis，并在4个样本中检测到硝基还原假单胞菌。在30天后，在所有32个样本中检测到Methylobacteriumaquaticum，而未检测到其他微生物(图4)。
在组合2中，约氏不动杆菌、Sphingomonasaquatilis和硝基还原假单胞菌与通用菌株Methylobacteriumaquaticum和Methylobacteriumplatani一起使用。在时点0，蒸发器芯上的总细菌计数为1.52×107±5.42×105CFU/g翅片。30天后，在蒸发器芯上的总细菌计数为3.23×106±8.39×104CFU/g翅片。REP-PCR图样分析揭示出Methylobacteriumaquaticum、Sphingomonasaquatilis和硝基还原假单胞菌在时点0在蒸发器芯上存活。在105个REP-PCR样本中，在94个样本中检测到Methylobacteriumaquaticum，在7个样本中检测到Sphingomonasaquatilis，且在4个样本中检测到硝基还原假单胞菌。在30天后，在所有30个REP-PCR样本中检测到Methylobacteriumaquaticum(图5)。
对于组合3，在时点0的总细菌计数为1.83×107±3.89×105CFU/g翅片。30天后，总细菌计数为5.23×106±1.50×105CFU/g翅片。当微生物种群通过REP-PCR分析时，在包含于组合中的5种微生物中，除Methylobacteriumplatani外的4种微生物Methylobacteriumaquaticum、约氏不动杆菌、Sphingomonasaquatilis和Methylobacteriumkomagatae在时点0存活在蒸发器芯上。在30天后，Methylobacteriumkomagatae以及一种通用菌株Methylobacteriumaquaticum为存活的。在时点0，在101个样本中，在49个样本中检测到Methylobacteriumaquaticum，在1个样本中检测到约氏不动杆菌，在11个样本中检测到Sphingomonasaquatilis，并在40个样本中检测到Methylobacteriumkomagatae。30天后，在19个样本中检测出Methylobacteriumaquaticum，且在15个样本中检测出Methylobacteriumkomagatae(图6)。已发现，存活的2个甲基杆菌物种的比率在30天中恒定在1:1(图7)。
对于组合4，在涂覆时，5种菌株的总细菌计数为2.04×107±4.91×105CFU/g翅片。当微生物的种群通过REP-PCR分析时，在86个样本中，在80个样本中检测出Methylobacteriumaquaticum，在1个样本中检测出Methylobacteriumplatani，在3个样本中检测出污染短芽孢杆菌，并在2个样本中检测出硝基还原假单胞菌(图8)。
组合5由4个菌株Methylobacteriumaquaticum、Methylobacteriumplatani、约氏不动杆菌和硝基还原假单胞菌构成。在涂覆蒸发器芯时，总细菌计数为2.86×107±1.19×106CFU/g翅片。当微生物的种群通过REP-PCR分析时，在28个样本中，在24个样本中检测到Methylobacteriumaquaticum，并分别在2个样本中检测出约氏不动杆菌和硝基还原假单胞菌(图9)。
从微生物组合的存活评估中发现，用作通用菌株的Methylobacteriumplatani在与其他微生物一起涂覆于蒸发器芯时显示出低的存活力。因此，使用在30天中显示出可比较的存活力的其他通用菌株Methylobacteriumaquaticum和Methylobacteriumkomagatae来制备其他微生物组合，并评估30天的存活力。
实施例12：另外6个组合的30天存活评估
将Methylobacteriumkomagatae选为用于替换Methylobacteriumplatani的微生物，其中Methylobacteriumplatani在30天存活评估中显示出较差的存活力。Methylobacteriumkomagatae与通用菌株Methylobacteriumaquaticum组合来制备6个另外的微生物组合(表12)。另外制备的组合包含少量的显示出极佳存活力的微生物(尽管它们不是无气味的)，以制备更稳定的组合。
表12.
在30天存活评估中使用的其他微生物组合
对于组合A，在涂覆时，蒸发器芯上的总细菌计数为4.30×106±1.25×106CFU/g翅片。即使在30天后，微生物以4.30×106±1.25×106CFU/g翅片的量存活。当涂覆微生物的种群通过REP-PCR图样分析进行研究时，在45个样本中，在8个样本中检测出Methylobacteriumaquaticum，并在37个样本中检测出Methylobacteriumkomagatae。在30天后，在20个样本中，在5个样本中检测出Methylobacteriumaquaticum，并在15个样本中检测出Methylobacteriumkomagatae。尽管Methylobacteriumaquaticum的比例稍稍增加，变化不显著(图10)。
对于组合B，在时点0的总细菌计数为2.07×107±1.11×106CFU/g翅片。在30天后，总细菌计数为1.74×107±1.30×106CFU/g翅片。当微生物的种群通过REP-PCR研究时，在34个代表性样本中，在1个样本中检测出Methylobacteriumaquaticum，并在11个样本中检测出Methylobacteriumkomagatae。所有的其他22个样本被发现是Deinococcusapachensis。换言之，40％或更多的涂覆微生物为Deinococcusapachensis(图11)。在30天后，REP-PCR图样分析揭示出，存活的微生物为，11.1％的Methylobacteriumaquaticum、22.2％的Methylobacteriumkomagatae和66.6％的Deinococcusapachensis。即，尽管Methylobacteriumaquaticum的比例与时点0相比稍稍增加，所有3种微生物均为存活的。
对于组合C，使用Methylobacteriumaquaticum、Methylobacteriumkomagatae、舌螺状菌、Sphingomonasdokdonensis和Leifsoniasoli。当5个菌株的组合被涂覆在蒸发器芯上时，总的细菌计数为7.53×106±3.74×105CFU/g翅片。在30天后，总的细菌计数为3.70×106±1.37×105CFU/g翅片。
作为鉴定存活微生物的REP-PCR图样分析的结果，在51个代表性样本中，在时点0，在4个样本中检测出Methylobacteriumaquaticum，在30个样本中检测出Methylobacteriumkomagatae，在3个样本中检测出舌螺状菌，并在14个样本中检测出Sphingomonasdokdonensis。在30天后，Methylobacteriumaquaticum为29.6％且Methylobacteriumkomagatae为59.2％。即，Methylobacteriumaquaticum的比例稍稍增加。未检测出舌螺状菌，且Sphingomonasdokdonensis的比例与时点0相比稍稍降低至11.1％(图12)。
对于组合D，在时点0的总细菌计数为1.75×107±1.24×106CFU/g翅片。在30天后，总的细菌计数为6.03×106±1.01×106CFU/g翅片。当细菌的比例通过REP-PCR研究时，在时点0，Methylobacteriumaquaticum为16.3％，Methylobacteriumkomagatae为47.3％，且黄色微杆菌为36.4％。在30天后，Methylobacteriumaquaticum增加至34.3％且Methylobacteriumkomagatae稍稍增加至57.1％。相比之下，黄色微杆菌减少至8.6％(图13)。
对于组合E，在时点0的总细菌计数为8.53×106±3.21×105CFU/g翅片。在30天后，总的细菌计数为1.20×106±3.84×104CFU/g翅片。当种群通过REP-PCR分析时，在75个样本中，在时点0，在8个样本中检测出Methylobacteriumaquaticum，在21个样本中检测出Methylobacteriumkomagatae，在32个样本中检测出海泥黄杆菌，并在14个样本中检测出短波杆菌。30天后，在89个代表性样本中，分别在16个样本中检测出Methylobacteriumaquaticum，在32个样本中检测出Methylobacteriumkomagatae，在39个样本中检测出海泥黄杆菌，并在2个样本中检测出短波杆菌(图14)。
在时点0，Spirosomapanaciterrae几乎无法检测出，且在30天后，短波杆菌的比例显著降低。
对于组合F，使用包括两种甲基杆菌通用菌株的6种菌株。在时点0，总的细菌计数为1.60×107±1.15×106CFU/g翅片。在30天后，总的细菌计数为9.03×106±2.42×105CFU/g翅片。当菌株的种群通过REP-PCR分析时，在71个代表性样本中，在时点0，在54个样本中检测出Methylobacteriumaquaticum，并在17个样本中检测出Methylobacteriumkomagatae。30天后，在73个样本中，在50个样本中检测出Methylobacteriumaquaticum，并在23个样本中检测出Methylobacteriumkomagatae(图15)。
实施例13：通用菌株组合的90天存活评估
对于90天长期效果的评估，准备无气味微生物的多种组合。首先，对作为通用菌株包含在所有组合中的Methylobacteriumaquaticum和Methylobacteriumkomagatae进行90天测试。
当将两种甲基杆菌菌株涂覆在蒸发器芯上时，在时点0，总的细菌计数被测量为1.92×107±8.02×105CFU/g翅片。每30天取5g翅片并测量总细菌计数。存活细菌的数量在30天后为8.70×106±6.56×105CFU/g翅片，在60天后为4.10×106±3.00×105CFU/g翅片，且在90天后为3.13×106±5.51×105CFU/g翅片(图16)。将从各个取样部位取得的71、66、41和44个代表性样本进行REP-PCR图样分析。在时点0，在37个样本中检测出Methylobacteriumaquaticum，且在34个样本中检测出Methylobacteriumkomagatae。在30、60和90天后，样本数量分别为35和31、27和14、以及25和19(图17)。即，Methylobacteriumaquaticum的百分比例为52.1～65.8％且Methylobacteriumkomagatae的百分比例为34.1～47.9％。均一的比例表明，两个菌株在长时间段内共存。
实施例14：通用菌株组合在车辆夹具上的存活评估
为研究通用菌株Methylobacteriumaquaticum和Methylobacteriumkomagatae的组合在室外条件下的生长，将两个菌株涂覆在蒸发器芯上，并将蒸发器芯安装在夹具上，而该夹具进一步安装在车顶上。在操作后，研究暴露于室外空气的菌株的变化。
在涂覆有两种菌株的蒸发器芯上，总的细菌计数为3.20×107±6.56×106CFU/g翅片。在蒸发器芯上的总细菌计数在30天后为6.23×106±1.99×105CFU/g翅片且在60天后为1.08×106±4.36×104CFU/g翅片(图18)。尽管蒸发器芯被暴露于室外环境，在60天后没有检测到除甲基菌落以外的外来微生物。当所检测的微生物通过REP-PCR进行鉴定时，菌株在时点0的比率为1:1。在30天后，Methylobacteriumaquaticum降低到4.2％，且在60天后，仅检测到Methylobacteriumkomagatae(图19)。
结论
将从蒸发器芯分离的11种无气味微生物物种基于形态学特征分为4组。这11种微生物物种经由16SrDNA测序被鉴定为不同物种。
将经由16SrDNA测序而鉴定的微生物进行REP-PCR，并发现其为11个不同的REP-PCR组。
在将各个菌株涂覆在蒸发器芯上后进行感官评估之后，最终选择产生相对较少难闻气味的8种微生物，Methylobacteriumaquaticum、Methylobacteriumplatani、约氏不动杆菌、污染短芽孢杆菌、Leifsoniasoli、硝基还原假单胞菌、Sphingomonasaquatilis和Methylobacteriumkomagatae。
对于由所选择的8种微生物物种所制备的14个组合进行感官评估。结果，总共10个组合被选择进行最终的存活测试。在这些组合中，4个组合由5种菌株构成，4种组合由4种菌株构成，1种组合由3种组合构成，且1种组合由2种菌株构成，包含有2种通用菌株。因为发现Methylobacteriumplatani不合适，制备出6个另外的组合并使其进行30天存活评估。结果，将Methylobacteriumaquaticum和Methylobacteriumkomagatae选为通用种。将仅由两个通用菌株Methylobacteriumaquaticum和Methylobacteriumkomagatae构成的组合进行90天存活评估。作为在实验室条件下进行90天存活评估的结果，组合保持与涂覆时相似的种群。此外，将涂覆有微生物组合的蒸发器芯安装在车顶的夹具上，并在暴露于室外空气后评估存活力。结果，总的细菌计数保持在106CFU/g翅片，且没有检测到外源微生物。
本发明已经参考其具体实施方式进行了详细描述。然而，本领域技术人员将意识到，在不背离本发明原理和精神的情况下可以在这些实施方式中做出多种变化和修改，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
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Claims (31)

1.一种用于防止气味的组合物，其包含甲基杆菌(Methylobacterium)或其培养物。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物用于防止来自空气调节系统的气味。
3.根据权利要求1所述的组合物，其中所述甲基杆菌为选自Methylobacteriumkomagatae、Methylobacteriumaquaticum、Methylobacteriumbrachiatum和Methylobacteriumplatani的一种或多种甲基杆菌。
4.根据权利要求3所述的组合物，其中所述甲基杆菌为选自MethylobacteriumkomagataeHKMC-11(KCCM11335P)、MethylobacteriumaquaticumHKMC-1(KCCM11325P)、MethylobacteriumbrachiatumHKMC-2(KCCM11326P)和MethylobacteriumplataniHKMC-3(KCCM11327P)的一种或多种甲基杆菌。
5.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物包含一种或多种选自Acinetobacterjohnsonii、Bacillusvietnamensis、Brevibacillusinvocatus、Deinococcusficus、Leifsoniasoli、Pseudomonasnitroreducens、Sphingomonasaquatilis、Deinococcusapachensis和Flavobacteriumoceanosedimentum的微生物或其培养物。
6.根据权利要求5所述的组合物，其中所述组合物包含一种或多种选自AcinetobacterjohnsoniiHKMC-4(KCCM11328P)、BacillusvietnamensisHKMC-5(KCCM11329P)、BrevibacillusinvocatusHKMC-6(KCCM11330P)、DeinococcusficusHKMC-7(KCCM11331P)、LeifsoniasoliHKMC-8(KCCM11332P)、PseudomonasnitroreducensHKMC-9(KCCM11333P)、SphingomonasaquatilisHKMC-10(KCCM11334P)、DeinococcusapachensisHKMC-12(KCCM11499P)和FlavobacteriumoceanosedimentumHKMC-13(KCCM11500P)的微生物或其培养物。
7.一种蒸发器芯，其涂覆有根据权利要求1所述的用于防止气味的组合物。
8.根据权利要求7所述的蒸发器芯，其中根据权利要求1～6中任一项所述的微生物以104～108CFU/g的浓度涂覆在所述蒸发器芯上。
9.根据权利要求8所述的蒸发器芯，其中使用光密度(O.D.)为0.3～0.9的微生物培养物来进行微生物涂覆。
10.根据权利要求7所述的蒸发器芯，其中包含在所述组合物中的微生物在所述蒸发器芯上形成生物膜。
11.一种用于制造不产生来自空气调节系统的气味的无气味蒸发器芯的方法，包括在蒸发器芯上涂覆根据权利要求1～6中任一项所述的组合物。
12.根据权利要求11所述的制造方法，其中所述涂覆包括在所述蒸发器芯上以104～108CFU/g的浓度涂覆包含在所述组合物中的微生物。
13.根据权利要求11所述的制造方法，其中所述方法还包括通过使包含在所述组合物中的微生物繁殖来形成生物膜。
14.一种用于防止来自空气调节系统的气味的方法，包括在蒸发器芯上涂覆根据权利要求1～6中任一项所述的组合物。
15.根据权利要求14所述的防止气味的方法，其中所述涂覆包括在所述蒸发器芯上以104～108CFU/g的浓度涂覆包含在所述组合物中的微生物。
16.根据权利要求14所述的防止气味的方法，其中所述方法还包括通过使包含在所涂覆的组合物中的微生物繁殖来形成生物膜。
17.一种用于检查来自空气调节系统的气味的方法，包括在蒸发器芯上涂覆根据权利要求1～6中任一项所述的组合物。
18.根据权利要求17所述的检查气味的方法，其中所述方法包括引入汽油燃料或空气污染物作为包含在所述组合物中的微生物的营养物并检查是否产生气味。
19.MethylobacteriumkomagataeHKMC-11(KCCM11335P)，其根据权利要求14所述用于涂覆蒸发器芯以防止来自空气调节系统的气味。
20.MethylobacteriumaquaticumHKMC-1(KCCM11325P)，其根据权利要求14所述用于涂覆蒸发器芯以防止来自空气调节系统的气味。
21.MethylobacteriumbrachiatumHKMC-2(KCCM11326P)，其根据权利要求14所述用于涂覆蒸发器芯以防止来自空气调节系统的气味。
22.MethylobacteriumplataniHKMC-3(KCCM11327P)，其根据权利要求14所述用于涂覆蒸发器芯以防止来自空气调节系统的气味。
23.AcinetobacterjohnsoniiHKMC-4(KCCM11328P)，其根据权利要求14所述用于涂覆蒸发器芯以防止来自空气调节系统的气味。
24.BacillusvietnamensisHKMC-5(KCCM11329P)，其根据权利要求14所述用于涂覆蒸发器芯以防止来自空气调节系统的气味。
25.BrevibacillusinvocatusHKMC-6(KCCM11330P)，其根据权利要求14所述用于涂覆蒸发器芯以防止来自空气调节系统的气味。
26.DeinococcusficusHKMC-7(KCCM11331P)，其根据权利要求14所述用于涂覆蒸发器芯以防止来自空气调节系统的气味。
27.LeifsoniasoliHKMC-8(KCCM11332P)，其根据权利要求14所述用于涂覆蒸发器芯以防止来自空气调节系统的气味。
28.PseudomonasnitroreducensHKMC-9(KCCM11333P)，其根据权利要求14所述用于涂覆蒸发器芯以防止来自空气调节系统的气味。
29.SphingomonasaquatilisHKMC-10(KCCM11334P)，其根据权利要求14所述用于涂覆蒸发器芯以防止来自空气调节系统的气味。
30.DeinococcusapachensisHKMC-12(KCCM11499P)，其根据权利要求14所述用于涂覆蒸发器芯以防止来自空气调节系统的气味。
31.FlavobacteriumoceanosedimentumHKMC-13(KCCM11500P)，其根据权利要求14所述用于涂覆蒸发器芯以防止来自空气调节系统的气味。
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