KR101776441B1 - 항-피브렐라 에어스투아리나 항균제 스크리닝 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 공조장치 내 악취를 유발하는 미생물을 제어할 수 있는 항균제의 스크리닝 방법 및 공조장치 내 악취를 제거하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 공조장치 내 악취 유발 미생물은 신규 항균제 개발 또는 상기 미생물의 대사산물의 화학적 성질을 규명하여 악취를 차단하기 위한 방향제의 개발에 이용될 수 있다. 또한, 공조장치에서 상기 미생물이 서식할 수 없는 환경을 미리 조성하여 근본적으로 악취의 원인을 제거하기 위한 용도로 이용될 수 있는 등 다양한 산업상 유용성을 갖는다.

Description

항-피브렐라 에어스투아리나 항균제 스크리닝 방법 {Methods for Screening Antimicrobial Agents against Fibrella aestuarina}

본 발명은 공조장치 내 악취를 유발하는 미생물을 제어할 수 있는 항균제의 스크리닝 방법 및 공조장치 내 악취를 제거하는 방법에 관한 것이다.

깨끗한 공기는 인간의 건강과 웰빙에 기본으로 인식되고 있으며, 불쾌한 냄새를 유발하거나 오염된 공기는 쾌적한 환경을 방해하는 주된 요소로 작용한다. 예를 들면, 밀폐된 조건에서 불만족스러운 실내 공기질은 다음의 두 가지 중요한 요인에 의해서 야기된다. 하나는 밀폐된 환경을 구성하는 구성 물질 자체(건물 또는 차량)으로부터 직접 발생되는 실내공기오염물질과, 다른 한 요인은 인간 활동에 의해 발생되거나 외부로부터 유입된 물질이 원인이 되어 발생된 냄새이다.

공조 시스템은 건물, 차량, 철도, 선박, 항공기 등에 있어 공기의 온도, 습도, 기류 및 청정도를 조화시키는 공기 조화에 목적을 두어 실내의 온도를 낮추고 실내 환경을 최적화시키는 시스템이다. 이러한 공조 시스템은 생활수준의 향상으로 인해 보급률이 점점 증가하고 있다. 공조 시스템의 보급률의 증가로 기본적인 기능은 많은 발전이 있어왔으나, 실내 공기의 질을 위한 환경적 측면으로는 아직 해결해야 할 문제가 많이 남아있다.

공조 시스템 중에 특히, 에어컨 냄새의 원인은 곰팡이와 세균의 대사 물질에 기한 것으로 알려져 있으나, 해당 곰팡이와 세균의 종류 및 상기 미생물들이 구체적으로 어떠한 대사 물질을 얼마나 분비하는지에 대한 구체적인 자료는 아직까지 밝혀지지 않은 상태에 있다.

공조 장치의 구조상, 블로워를 통과한 모든 공기는 에바코어를 통과하게 되는데, 차가운 냉매와 공기의 열교환 시, 에바코어 표면에는 온도차에 따른 응축수 응결 현상이 발생되고, 이 응축수 응결이 지속되면 에바코어 표면에는 곰팡이 및 세균이 서식, 번식하기 좋은 환경이 제공된다. 외부 공기에 노출된 에바코어에 곰팡이 및 세균이 증식한 상태에서, 에바코아 표면에 증식한 세균의 대사 물질로 미생물의 휘발성유기화합물(mVOCs)이 발생하며, 에바코어를 통과한 공기가 실내로 송풍되면, 이때 미생물에 의해 발생한 휘발성유기화합물에 의해서, 장기간 사용시에 실내는 곰팡이 및 세균에 의한 악취에 노출될 수 있다.

악취가 발생하는 에바코어 표면은 장기간의 사용에 따라 바이오 필름으로 덮여 있고, 이들은 박테리아, 셀클러스터, EPS로 구성되는데, EPS는 단백질(Protein), 폴리사카라이드, 폴리우론산(Polyuronic acid), 핵산(Nucletic), 지질(Lipid) 등의 다양한 성분을 포함하는 바, 에바코어 표면에서는 다양한 세균, 곰팡이가 바이오 필름을 양분 삼아 증식하며 대사물질로 미생물에 의한 유기화합물(mVOCs)를 배출하게 되며 이것이 에어컨 악취의 여러 요인 중에 부패취로 알려져 있다.

상기 악취를 제거하기 위하여 다양한 종류의 방향제들이 시판되고 있으나, 이는 상기 에바코어에 서식하는 곰팡이 및 세균을 근본적으로 제거하지 못하고 단지 일시적으로 불쾌한 냄새를 희석하는 역할에 지나지 않는 경우가 많으며, 현재 시판 중인 항균제들 역시도 에바코어에 서식하는 특정 곰팡이 또는 세균에 특이적으로 작용하도록 개발된 사례는 전무한 실정이며, 단지 통상적인 병원균에 대한 항균력이 있다는 이유로 판매되고 있는 상황이다.

따라서, 상기 에바코어에 서식하는 곰팡이 및 세균의 종류에 대한 명확한 규명과 이의 번식을 특이적으로 차단 또는 예방함으로써 쾌적한 실내 공기 환경 조성이 가능한 항균제 및 이를 이용하여 불쾌한 냄새를 제거할 수 있는 기술의 개발이 절실한 상황이다.

상기한 배경기술로서 설명된 사항들은 본 발명의 배경에 대한 이해 증진을 위한 것일 뿐, 이 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 이미 알려진 종래기술에 해당함을 인정하는 것으로 받아들여져서는 안 될 것이다.

본 발명자들은 공조장치 내에 서식하며 악취를 유발하는 미생물을 규명하고 이들을 효과적으로 제어할 수 있는 방법을 찾고자 노력하였다. 그 결과, 상기 공조장치 내에서 바이오필름을 형성하고 생육하는 악취 미생물 6종을 분리하는데 성공하고 이들을 제어할 경우 공조장치에서 유발되는 악취를 유의적으로 차단할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 공조장치 내 악취를 유발하는 미생물인 피브렐라 에어스투아리나(Fibrella aestuarina)에 대한 항균제 스크리닝 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 공조장치 내 악취 유발 미생물을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 항균제를 공조장치 내에 도포 또는 분사하는 단계를 포함하는 공조장치 내 악취 유발 미생물의 생육 억제 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 공조장치로부터 악취 유발 미생물을 분리 또는 사멸시키는 단계를 포함하는 공조장치 내 악취 제거 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 공조장치 내에서 악취 유발 미생물의 생육을 억제시키는 단계를 포함하는 공조장치 내 악취 제거 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 공조장치 내 악취를 유발하는 미생물에 대한 항균제 스크리닝 방법을 제공한다:

(a)상기 피브렐라 에어스투아리나 또는 이의 배양물을 준비하는 단계;

(b)상기 피브렐라 에어스투아리나 또는 이의 배양물에 시료를 접촉시키는 단계;

(c)상기 피브렐라 에어스투아리나 의 생육 억제를 측정하는 단계; 및

(d)상기 피브렐라 에어스투아리나 의 생육이 억제되었을 때, 상기 시료가 상기 피브렐라 에어스투아리나 가 발생시키는 공조장치 내 악취를 저감 시키는 항균활성을 갖는 것으로 판별하는 단계.

본 발명자들은 공조장치 내에 서식하며 악취를 유발하는 미생물을 규명하고 이들을 효과적으로 제어할 수 있는 방법을 찾고자 노력하였다. 그 결과, 상기 공조장치 내에서 바이오필름을 형성하고 생육하는 악취 미생물 6종을 분리하는데 성공하고 이들을 제어할 경우 공조장치에서 유발되는 악취를 유의적으로 차단할 수 있음을 확인하였다.

본 명세서에서, 용어 "공조장치"라 함은 외부 환경으로부터 일부 또는 전부가 분리된 공간에서 온도, 습도, 공기의 청정도, 흐름 등을 쾌적하게 유지하는 시스템을 총칭하는 의미로 사용된다. 상기 분리된 공간의 바람직한 예로는 건물 내부 또는 차량, 철도, 선박, 항공기 등의 내부와 같이 외부로부터 부분적 또는 전체적으로 분리된 내부의 공간이 될 수 있다. 상기 공조장치의 바람직한 예로는 에어컨을 들 수 있다.

공조장치는 그 구조상 블로워를 통과한 모든 공기가 에바코어를 통과하게 되며, 상기 에바코어 표면에는 온도차에 따른 응축수 응결 현상이 지속되어 미생물이 생육하기 좋은 환경이 되어, 장기간의 시간이 지날 경우 바이오 필름(biofilm)이 형성된다. 이때, 미생물들은 공기 중에 존재하는 실내 및 실외의 다양한 물질들을 영양분으로 대사하며, 대사결과 발생된 휘발성유기화합물(mVOCs)에 의해 악취가 발생되게 된다.

바이오 필름은 미생물들이 군집되어 살아가는 군집형태로서, 하나의 막으로 둘러싸인 층의 구조이며, 상기 막은 미생물을 외부 환경으로부터 보호하고 영양분을 공급하는 역할을 한다. 막을 구성하는 성분으로 EPS(exopolymeric substances)가 있으며, 이는 단백질, 폴리사카라이드, 폴리우론산, 핵산, 지질 등의 다양한 성분을 포함하는 바, 에바코어 표면에서는 다양한 미생물이 이를 양분 삼아 증식하며 대사물질로 악취를 배출하게 된다.

본 발명자들은 상기 에바코어로부터 악취를 유발하는 미생물을 분리하였으며, 이들을 배양한 결과 콜로니를 형성하는 미생물들 중에서 우점 균주를 분리 배양하였다. 우점 균주를 분리 및 배양하는 방법은 당업계에 공지된 다양한 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들어, 희석비율, 콜로니의 색, 크기, 모양 등의 morphology적인 접근을 통하여 우점 미생물을 선발할 수 있다.

상기 우점 미생물은 피브렐라 속 미생물, 크리세오박테리움 속 미생물, 스피로소마 속 미생물, 지오바실러스 속 미생물, 또는 페로모나스 속 미생물을 포함하며, 바람직하게는 피브렐라 에어스투아리나 ( Fibrella aestuarina ), 크리세오박테리움 지오카포스페레 ( Chryseobacterium geocarposphaerae ), 스피로소마 링구얼( Spirosoma linguale ), 스피로소마 라디오톨러런스( Spirosoma radiotolerans), 지오바실러스 퇴비( Geobacillus toebii ), 또는 페로모나스 푸라퀘( Pelomonas puraquae ) 를 포함한다.

상기 미생물들은 한국미생물보존센터에 2015년 4월 17일자로 기탁되어 다음의 기탁번호를 부여받았다: 피브렐라 에어스투아리나 ( Fibrella aestuarina ) HKMC-115(기탁번호:KCCM 11691P), 크리세오박테리움 지오카포스페레 (Chryseobacterium geocarposphaerae ) HKMC-116(기탁번호:KCCM 11692P), 스피로소마 링구얼 ( Spirosoma linguale ) HKMC-117(기탁번호:KCCM 11693P), 스피로소마 라디오톨러런스( Spirosoma radiotolerans ) HKMC-114(기탁번호:KCCM 11690P), 지오바실러스 퇴비( Geobacillus toebii ) HKMC-118(기탁번호:KCCM 11694P), 페로모나스 푸라퀘( Pelomonas puraquae ) HKMC-113(기탁번호:KCCM 11689P).

상기 악취 유발 미생물들은 다양한 산업적 유용성을 보유한다. 예를 들어, 상기 미생물의 생육을 억제할 수 있는 신규 항균제 개발, 상기 미생물의 대사산물의 화학적 성질을 규명하여 악취를 차단하기 위한 방향제의 개발에 이용될 수 있다. 또한, 공조장치에서 상기 미생물이 서식할 수 없는 환경을 미리 조성하여 근본적으로 악취의 원인을 제거하기 위한 용도로 이용될 수 있다.

본 발명의 항생제 스크리닝 방법에서 이용하는 시료는 상기 미생물들에 대한 항균 활성 보유 여부를 확인하기 위한 것이다. 예를 들어, 특정 시료가 피브렐라 에어스투아리나 에 항균 활성을 보유하면, 상기 시료는 피브렐라 에어스투아리나 에 대한 항균제로 스크리닝될 수 있다.

본 발명의 스크리닝 방법으로 판별된 항균제는 바람직하게는 피브렐라 에어스투아리나 에 항균활성을 보유하며, 보다 바람직하게는 상기 미생물과 더불어 다른 종류의 미생물들에 대하여도 항균활성을 보유할 수 있다.

예를 들어, 어떤 항균제는 상기 6종의 미생물 모두에 대해 항균활성을 보유할 수 있으며, 다른 항균제는 하나 또는 일부의 종에 대해 항균활성이 전혀 없을 수도 있다. 또한, 상기 6종의 미생물 모두에 대해 항균활성을 보유하는 항균제들에 있어서도 각 미생물의 종류에 따라 항균활성이 다를 수 있다(표 8).

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 스크리닝 방법으로 판별된 항균제는 피브렐라 에어스투아리나 ( Fibrella aestuarina ) HKMC-115(기탁번호:KCCM 11691P) 에 항균활성을 갖는 것이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 스크리닝 하고자 하는 시료는 단일 화합물 및 화합물의 혼합물, 동식물의 추출물, 뉴클레오타이드, 폴리펩타이드 등 유전정보를 담고 있는 생물학적 제제, 화합물 및 생물학적 제제의 혼합물을 포함한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 공조장치 내 악취 유발 미생물을 제공한다.

상기 악취 유발 미생물은 바람직하게는 피브렐라 에어스투아리나 인 것이며, 보다 바람직하게는 피브렐라 에어스투아리나 ( Fibrella aestuarina ) HKMC-115(기탁번호:KCCM 11691P)인 것이다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 항균제를 공조장치 내에 도포 또는 분사하는 단계를 포함하는 공조장치 내 악취 유발 미생물의 생육 억제 방법을 제공한다.

본 발명에서 이용 가능한 항균제는 피브렐라 에어스투아리나 또는 이를 포함하는 미생물들에 대한 항균활성을 보유하는 것으로 판별되거나 될 수 있는 모든 항균제가 적용될 수 있다. 상기 항균제는 공조장치 내에 도포 또는 분사되어 악취 유발 피브렐라 에어스투아리나 또는 이를 포함하는 미생물들의 생육을 억제하며, 상기 도포 또는 분사는 기체상, 액체상, 겔(gel)상 또는 고체 형태를 현탁시킨 현탁액 등 당업계에 공지된 다양한 형태로 이루어질 수 있다.

또한, 상기 도포 또는 분사는 공조장치 내부 표면 또는 내부 구성들 중 일부 또는 전체에 걸쳐 행하여질 수 있으며, 바람직하게는 공조장치 내 에바코어에 도포 또는 분사된다. 상기 생육의 억제는 이미 피브렐라 에어스투아리나 또는 이를 포함하는 미생물들이 바이오 필름을 형성한 상태에 도포 또는 분사되거나, 피브렐라 에어스투아리나 또는 이를 포함하는 미생물들이 바이오 필름을 형성하기 전 생육 예방차원에서 도포 또는 분사될 수도 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 항균제를 공조장치 내에 도포 또는 분사하는 단계를 포함하는 공조장치 내 악취 제거 방법을 제공한다.

본 발명의 악취 제거는 악취의 전부 또는 일부의 제거를 포함하며, 악취의 예방차원에서 악취발생 전 도포 또는 분사하는 것도 포함한다.

공조장치 내에는 다양한 미생물들이 생육하고 있으며, 이러한 미생물들은 크게 악취를 유발하는 미생물과 악취를 유발하지 않는 미생물로 구분할 수 있다. 따라서, 상기 항균제가 악취를 유발하는 미생물에 특이적으로 작용하거나, 악취를 유발하는 미생물 중 우점종의 전부 또는 일부에 생육 억제 활성을 가질 경우, 상기 공조장치의 악취는 전부 또는 일부가 제거 또는 개선될 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 공조장치 내에서 악취 유발 미생물인 피브렐라 에어스투아리나를 상기 공조장치로부터 분리 또는 사멸시키는 단계를 포함하는 공조장치 내 악취 제거 방법을 제공한다.

본 발명의 분리 또는 사멸은 상기 미생물 또는 이를 포함하는 미생물의 전부 또는 일부를 물리적, 화학적 및 생물학적 방법에 의하여 수행할 수 있다. 물리적 방법으로는 인위적으로 상기 미생물 또는 이를 포함하는 미생물들을 물리적 장치를 이용하여 인위적으로 분리 또는 사멸할 수 있으며, 화학적 방법으로는 상기 미생물 또는 이를 포함하는 미생물들에 대한 항균제 또는 살균제를 이용하여 공조장치로부터 분리되도록 하거나 사멸시킬 수 있으며, 생물학적 방법으로는 상기 미생물에 독성이 있는 생물학적 제제 또는 상기 미생물과 생존 경쟁관계에 있는 다른 미생물을 이용하여 분리 또는 사멸시킬 수 있으나, 상기 예들에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 공조장치 내에서 악취 유발 미생물인 피브렐라 에어스투아리나의 생육을 억제시키는 단계를 포함하는 공조장치 내 악취 제거 방법을 제공한다.

본 발명은 공조장치 내 악취를 유발하는 미생물을 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 미생물을 제어할 수 있는 항균제의 스크리닝 방법을 제공한다. 추가적으로, 본 발명은 상기 미생물을 제어하여 공조장치 내 악취를 제거하는 방법을 제공한다.

본 발명의 공조장치 내 악취 유발 미생물은 신규 항균제 개발 또는 상기 미생물의 대사산물의 화학적 성질을 규명하여 악취를 차단하기 위한 방향제의 개발에 이용될 수 있다. 또한, 공조장치에서 상기 미생물이 서식할 수 없는 환경을 미리 조성하여 근본적으로 악취의 원인을 제거하기 위한 용도로 이용될 수 있는 등 다양한 산업상 유용성을 갖는다.

도 1은 악취발생 중고차의 에바코어로부터 샘플링한 시편을 나타낸 사진이다.
도 2는 본 발명에 따른 항균도 테스트 방법을 나타낸 그림이다.
도 3은 우점 무취 미생물들의 조합을 에바코어의 재질인 알루미늄 핀을 이용하여 배양하는 모습을 나타낸 그림이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 악취 유발 우점 미생물의 선별

1. 악취 차종의 확보 및 공조장치의 분리

본 발명자들은 차량 내부와 같은 밀폐된 환경에서 발생되는 악취의 원인을 규명하기 위해, 계절별(동절기: 2-3월, 하절기: 6-7월)로 악취 냄새가 발생하는 중고차 10종을 확보하여 각각의 차량에 장착되어 있는 공조장치를 분리하고, 공조장치 내 악취유발 미생물들에 의한 바이오필름이 형성되어 있을 것으로 예상되는 에바코어를 떼어내어 시편을 샘플링하고자 하였다(표 1).

No.	차량 주행거리	계절
1	89,000 ㎞	동절기 (2-3월)
2	70,000 ㎞
3	10,300 ㎞
4	37,100 ㎞
5	149,970 ㎞
6	35,000 ㎞	하절기 (6-7월)
7	28,000 ㎞
8	42,000 ㎞
9	110,000 ㎞
10	90,000 ㎞

2. 에바코어 시편 샘플링

상기 악취 중고차 1 내지 10으로부터 확보한 에바코어로부터 에바코어 샘플을 사용하기 전까지 4℃에서 냉장 보관되었으며, 폴리에틸렌 백으로 밀봉하여 보관하였다. 미생물을 분리 배양하기 위해 각각의 에바코어의 전면부 및 후면부를 포함한 임의의 부위에서 멸균된 롱 노즈 플라이어를 사용하여 각 5 g씩 시료를 채취한 후 혼합하여 사용하였다(도 1).

3. 미생물의 탈리

상기 에바코어로부터 채취된 시료로부터의 미생물의 탈리는 다음의 과정을 통하여 진행되었다:

① 에바코어에서 추출한 시료를 섞어 교반기에 넣는다.

② 멸균된 1 X PBS(Phosphate Buffed Saline) 200ml를 상기 교반기에 넣는다.

③ 혼합된 시료와 PBS를 30초간 교반한다.

④ 교반기를 아이스(ice)에 1분간 둔다.

⑤ 상기 ③ 내지 ④ 과정을 2회 추가 반복한다.

⑥ 현탁액을 4℃에서 3분간 13,000 rpm으로 원심분리한다.

⑦ 상등액만을 취해서 새 튜브에 옮겨 담는다.

⑧ 멸균된 면봉을 상등액에 적셔 샘플을 채취한 에바코어의 표면을 수회 닦아낸다.

⑨ 닦아낸 면봉은 상등액에 헤드부분 만을 넣고 볼텍싱(vortexing) 한다.

⑩ 상기 ⑥번 과정에서 획득한 침전물과 ⑨번 혼합물을 섞어 접종원액으로 사용한다.

상기 ① 내지 ⑩의 과정을 차종 1 내지 10에 장착되어 있는 에바코어에 대하여 각각 물리적 탈리를 시행하여 미생물을 분리하였다.

4. 악취 유발 미생물의 분리 및 우점종 선별

에어컨의 세균의 분리는 일반적으로 일반세균이라 하는 호기성 종속영양 세균을 종속영양 평판 배양을 통하여 분리한다. 일반세균의 분리는 PTYG agar medium 및 R2A agar medium의 복합영양배지를 이용하여 28-30℃에서 14 일간 배양(PTYG agar medium은 Peptone 0.25 g(Difco), Triptone 0.25 g(Difco), Yeast extract 0.5 g(Difco), Glucose 0.5 g(Difco), MgSO4 30 ㎎(Sigma), CaCl2 3 ㎎(Sigma), Bacto agar 15 ㎎(Difco)을 증류수 980 ㎖에 넣고 pH 7.0으로 맞춘 후 121℃에서 15분간 고압멸균하여 사용하였으며, R2A agar medium은 Yeast extract 0.5 g(Difco), Proteose peptone No.3 0.5 g(Difco), Casamino acids 0.5 g(Difco), Dextrose 0.5 g(Difco), Soluble starch 0.5 g(Difco), Sodium pyruvate 0.3 g(Difco), Dipotassium sulfate 0.3 g(Difco), Magnesium sulfate 0.05 g(Difco), Bacto agar 15 g(Difco)을 증류수 980 ㎖에 넣고 pH 7.2를 맞춘 뒤(최종 1000 ㎖) 121℃에서 15분간 고압멸균하여 사용)하였으며, 비우점 세균의 분리를 위해 Kanamycin, Ampicillin 및 Chloramphenicol을 100 ppm 농도로 필터멸균 후 배지온도가 50℃가 되었을 때 접종하여 항생제 배지를 제작하였다.

우점균주를 분리배양하기 위해서는 우선 희석비율과 콜로니 색, 크기, 모양 등 morphology적인 접근을 통하여 여러 가지 우점 균주를 선별하였다.

① 분리배양된 배지에서 곰팡이와 박테리아를 구분하여 분리한다.

② morphology가 다른 여러 가지 세균을 loop를 사용하여 복합배지에 접종 순수 분리한다.

③ 접종된 배지 중 가장 생육이 좋은 배지를 선택하여 계대 배양한다.

④ 곰팡이는 균사의 끝부분을 scalpel을 사용하여 분리한 뒤 복합배지에 접종한다.

⑤ 곰팡이 균주도 접종된 배지 중 가장 생육이 좋은 배지를 선택하여 계대 배양한다.

5. 우점 미생물의 동정

상기 분리 미생물의 정확한 동정을 위해, 다음의 단계를 포함하는 16s rRNA 동정을 시행하였다.

a) REP- PCR 패턴 분석을 통한 핑거프린트 (Fingerprints) 조사

REP-PCR은 세균 염색체의 구조를 분석하는 분자생물학적 방법으로서 각 세균 균주를 다른 세균과 구별하여 식별할 수 있는 fingerprinting 방법이다. REP-PCR을 수행하기 위해 하기의 각 절차에 따라 유전적 특성을 분석하였다.

(1) Cell lysis 절차

① Lyse-N-Go PCR Reagent(Thermo) 2.5 ㎕를 PCR tube에 담는다.

② 클린벤치에서 콜로니를 피펫으로 따서 위 tube에 넣고 pipetting한다. 이 때 따는 양은 용액이 약간 뿌옇게 될 정도로 되지 않도록 주의한다.

③ Manufacturer의 지시에 따라 PCR machine에서 배양한다.

(2) PCR reaction

하기 표 2에 기재된 성분을 이용하여 하기 표 3에 기재된 바와 같이, 예비 변성 단계(pre-denaturation) 93℃에서 7 분, 변성 단계(denaturation) 92℃에서 1분, 냉각 단계(annealing)에서 51.5℃에서 1분, 연장(extension) 단계에서 65℃에서 8분간 변성, 냉각, 연장 과정을 33회 반복하여 PCR 증폭 과정을 수행하였다.

① dNTP (2.5 mM each)	12.5 ㎕
② Gitschier buffer	5.0 ㎕
③ DMSO (100%)	2.5 ㎕
④ Autoclaved 3oD.W.	0.3 ㎕
⑤ BOXA1R primer(50 pmole/㎕) 5'CTACGGCAAGGCGACGCTGACG	1.0 ㎕
⑥ BSA (10 ㎎/㎖)	0.4 ㎕
⑦ Bacterial DNA	2.5 ㎕
⑧ Taq polymerase(Roche) (5 U/㎕)	0.8 ㎕

step 1	93℃	7 min
step 2	92℃	1 min
step 3	51.5℃	1 min
step 4	65℃	8 min
step 2,3,4 : additional 33 cycles
step 6	65℃	16 min
step 7	4℃

(3) Gel electrophoresis

각각의 PCR에 의해 증폭된 DNA 단편을 취하여 EtBr을 첨가한 1.2-1.5% agarose gel을 사용하며, 6 x dye를 sample과 1:5 비율로 섞어 가능한 많은 양을 loading하였다. 대부분의 PCR product들은 100-1000 bp 사이에 있으므로 100 bp ladder를 함께 loading하여, 가능한 한 천천히(50 V) bromophenol blue와 xylene cyanol dye의 중간이 전체 gel의 중간까지 가도록 전기영동하였다. gel상의 DNA pattern이 같은 균주는 동일한 균주로 간주하였다.

b) 에어컨 우점 박테리아의 16S rRNA 유전자 분석을 통한 동정

16S rRNA(ribosomal Ribonucleic acid) 유전자는 박테리아의 유전학적 분류 동정을 위해 사용되며, REP-PCR을 통하여 분류된 박테리아의 속(genus) 및 종(species) 수준에서의 동정이 가능하다.

(1) Cell lysis 절차

①Lyse-N-Go PCR Reagent(Thermo) 5 ㎕를 PCR tube에 담는다.

②클린벤치에서 콜로니를 피펫으로 따서 위 tube에 넣고 pipetting한다. 이 때 따는 양은 용액이 약간 뿌옇게 될 정도로 한다.

③Manufacturer의 지시에 따라 PCR machine에서 lysis한다(표 4).

Cycle	Temperature(℃)	Time(seconds)
1	65	30
2	8	30
3	65	90
4	97	180
5	8	60
6	65	180

(2) 16S rRNA 유전자 PCR

PCR 조건(Total 50 ㎕): DNA와 Taq를 제외한 나머지 용액을 하기 표 5에 기재되어 있는 것과 같이 필요량만큼 혼합하여 위 lysis 용액에 44.5 ㎕를 가하였다. 이 후 표 6에 기재되어 있는 바와 같이 예비 변성 단계(pre-denaturation) 94℃에서 5분, 변성 단계(denaturation) 94℃에서 1분, 냉각 단계(annealing) 55℃에서 1분, 연장 단계(extension) 72℃에서 1분 30초를 수행하고, 변성, 냉각 및 연장 단계를 29회 수행하여 PCR 증폭 과정을 수행하였다.

Autoclaved 3oD.W.	22 ㎕
10xbuffer (Roche)	5 ㎕
dNTP (Roche, 2.5 mM)	5 ㎕
DMSO	5 ㎕
BSA (10 ㎎/㎖)	2.5 ㎕
27mf (20 pmole/㎕)	2.5 ㎕
1492r (20 pmole/㎕)	2.5 ㎕
DNA	5 ㎕
Taq (Roche)	0.5 ㎕

step 1	94℃	5 min
step 2	94℃	1 min
step 3	55℃	1 min
step 4	72℃	1 min 30 sec
Go to step 2 : additional 29 cycles
step 6	72℃	10 min
step 7	4℃	hold

(3) PCR purification

16S rRNA 유전자 PCR을 통해 증폭한 산물을 Qiaquick PCR purifcation kit를 이용하여 하기의 절차에 따라 Purification하였다.

① PCR product의 5배의 PB buffer를 넣는다.

② 혼합된 액을 QIAquick column에 분주한다.

③ DNA를 binding하기 위하여 1분간 centrifuge 한 후 통과된 혼합액을 제거한다.

④ wash를 위하여 750 ㎕의 PE buffer를 QIAquick column에 넣고 1분간 centrifuge한 뒤 통과된 혼합액을 제거한다.

⑤ 1분간 다시 centrifuge한다.

⑥ QIAquick column 새 tube에 옮긴다.

⑦ DNA를 추출하기 위하여 30 ㎕의 EB buffer를 넣고 1분간 둔다.

⑧ 1분간 centrifuge하여 EB에 녹은 DNA를 tube에 모이게 한다.

상기 실험 수행 결과, 순수 분리된 미생물의 악취 발생여부를 확인하기 위해 다음과 같은 방법으로 배양하여 관능평가를 실시하였다:

① 순수분리배양된 미생물을 액체영양배지에 접종한다.

② 접종된 배지를 28℃에서 5-7일간 배양한다.

③ 고체영양배지에 액체배지에서 배양된 균체를 100 ㎕ 취하여 접종한다.

④ 접종한 균체를 spreader를 이용하여 골고루 퍼지게 한다.

⑤ 패트리디쉬를 밀봉하여 28℃에서 10일간 배양한다.

관능평가는 총 7명의 패널을 이용하여 5점 척도법을 이용하여 냄새 강도 평가 후 평균치를 이용하여 악취유발 우점 미생물을 선별하였고, 상기 16S rRNA 유전자 분석을 통한 동정을 통해 하기 표 7과 같은 총 6가지 우점종을 동정하였으며, 이들을 한국미생물보존센터에 2015년 4월 17일자로 기탁하였다.

No.	식별번호	미생물 명	기탁번호
1	HKMC-113	페로모나스 푸라퀘 ( Pelomonas puraquae )	KCCM 11689P
2	HKMC-114	스피로소마 라디오톨러런스 ( Spirosoma radiotolerans )	KCCM 11690P
3	HKMC-115	피브렐라 에어스투아리나 ( Fibrella aestuarina )	KCCM 11691P
4	HKMC-116	크리세오박테리움 지오카포스페레 ( Chryseobacterium geocarposphaerae )	KCCM 11692P
5	HKMC-117	스피로소마 링구얼 ( Spirosoma linguale )	KCCM 11693P
6	HKMC-118	지오바실러스 퇴비 ( Geobacillus toebii )	KCCM 11694P

실시예 2: 선별된 악취 유발 미생물에 대한 항균제별 항균도 평가

1. 실험과정

본 발명자들은 현재 시판 중인 다양한 항균제를 이용하여 상기 실시예 1에서 선별된 우점 미생물에 대한 항균도를 평가하였다. 본 발명에서 이용된 항균제들은 다음과 같다:

A 항균제: 킴케어 (유한킴벌리사)

B 항균제: 페브리즈 (P&G 사)

C 항균제: 메틸알콜 45~50%, 황산크롬(CAS 10101-53-8) 1~5%, 브롬계 1~5% 및 물을 포함하는 양산 항균제

항균도 평가는 다음의 단계를 통하여 수행되었다:

① 멸균된 여과지 준비

② 3가지 종류의 항균제 준비(대조군: 항균제 무처리군, 실험군: 항균제 A, 항균제 B, 항균제 C)

③ 항균제에 여과지 투입

④ 각각의 악취 유발 미생물을 영양배지에 도포

⑤ 악취 유발 미생물이 도포된 영양배지에 각각의 항균제가 포함된 여과지 올리기

⑥ 28 내지 30℃에서 5일간 배양

⑦ 생육억제 구역의 측정

상기 생육억제 구역의 측정은 버니어 캘리퍼를 이용하여 생육억제 구역의 지름을 측정하였으며, 구체적인 방법은 도 2에 도시된 바와 같다.

2. 실험결과

악취 유발 미생물 6종에 대해 각각 3번씩 상기 방법을 통해 실험하여 생육억제 구역의 지름을 측정한 것들의 평균값을 표 8에 나타내었다.

No.	미생물명( 기탁명 )	향균제 無	A	B	C
1	Pelomonas puraquae HKMC-113	0	1.17	2.07	3.93
2	Spirosoma radiotolerans HKMC-114	0	2.03	2.17	4.57
3	Fibrella aestuarina HKMC-115	0	2.13	2.63	4.30
4	Chryseobacterium geocarposphaerae HKMC-116	0	0.97	1.57	2.70
5	Spirosoma linguale HKMC-117	0	1.83	2.10	4.83
6	Geobacillus toebii strain R-35642 HKMC-118	0	1.73	1.93	2.20

(단위: cm)

표 8에서와 같이, 항균제 A의 경우 크리세오박테리움 지오카포스페레 에 대하여는 항균력이 상대적으로 약하였으며, 항균제 B의 경우 피브렐라 에어스투아리나에 대하여는 항균력이 강한 편이나, 크리세오박테리움 지오카포스페레 에 대하여는 항균력을 약하게 발휘됨을 알 수 있었다.

또한, 항균제 C의 경우에는 지오바실러스 퇴비에 대하여 상대적으로 항균력이 약하나, 6종의 미생물 모두에 대해 전반적으로 항균제 A, B에 비하여 높은 항균력을 발휘함을 확인하였다.

실시예 3: 악취 유발 미생물이 제거된 에바코어에 대한 냄새 평가

본 발명자들은 악취 미생물이 제거 또는 분리된 상태의 에바코어를 재현하기 위해 상기 에바코어에 서식하는 우점 미생물 중 실시예 1의 악취 미생물이 제외된 무취 미생물들의 조합을 에바코어의 재질인 알루미늄 핀을 이용하여 배양하였다(표 9, 도 3).

무취 미생물은 상기 에바코어에 서식하는 미생물들 중 배양시 콜로니를 형성하는 미생물 중 악취를 유발하지 않는 우점종들로 선정하였으며, 배양방법은 하기와 같이 하였다.

① 순수분리 배양된 무취 미생물을 R2A 약체 배지에 접종한다.

② 접종된 배지를 28℃에서 5-7일간 배양한다.

③ 121℃에서 20분간 고압 멸균한 알루미늄 핀(fin)을 준비한다.

④ 각 각의 항균제에 담궈 표면을 골고루 코팅 되도록 한다.

⑤ 코팅된 알루미늄 핀(fin)을 패트리디쉬에 올려 놓는다.

⑥ 배양된 무취 미생물 접종액 1 ㎖를 원심분리하여 상등액을 버린다.

⑦ 멸균된 1 x PBS를 1 ㎖ 넣어 또다시 원심분리 한다.

⑧ 상기 ⑦ 방법을 2번 반복한다.

⑨ PBS로 워싱(washing)한 무취 미생물을 100 ㎕ 씩 알루미늄 핀 중간에 떨어뜨린다.

⑩ 준비된 알루미늄 핀(fin)위에 접종 후 실온에서 말린다.

⑪ 패트리디쉬를 밀봉하여 28℃에서 1달간 배양한다.

그 결과, 1달 뒤 하기 표 9(악취 미생물이 제거된 에바코어 서식 미생물의 배양 시 냄새 결과)의 조합에서 모두 악취가 나지 않는 것으로 판명되었다.

조합	미생물	1개월 후 냄새평가
1	Methylobacterium brachiatum	무취
2	Methylobacterium platani	무취
3	Methylobacterium aquaticum + Methylobacterium platani	무취
4	Methylobacterium platani + Methylobacterium brachiatum	무취
5	Methylobacterium aquaticum + Methylobacterium platani + Methylobacterium brachiatum	무취
6	Methylobacterium aquaticum + Methylobacterium platani + Methylobacterium brachiatum + Acinetobacter johnsonii	무취
7	Methylobacterium aquaticum + Methylobacterium platani + Methylobacterium brachiatum + Bacillus vietnamensis	무취
8	Methylobacterium aquaticum + Methylobacterium platani + Methylobacterium brachiatum + Brevibacillus invocatus	무취
9	Methylobacterium aquaticum + Methylobacterium platani + Methylobacterium brachiatum + Deinococcus ficus	무취
10	Methylobacterium aquaticum + Methylobacterium platani + Methylobacterium brachiatum + Leifsonia soli	무취
11	Methylobacterium aquaticum + Methylobacterium platani + Methylobacterium brachiatum + Methylobacterium komagatae	무취
12	Methylobacterium aquaticum + Methylobacterium platani + Methylobacterium brachiatum + Pseudomonas nitroreducens	무취
13	Methylobacterium aquaticum + Methylobacterium platani + Methylobacterium brachiatum + Sphingomonas aquatilis	무취
14	Sphingomonas aquatilis + Brevibacillus invocatus	무취
15	Leifsonia soli + Methylobacterium komagatae	무취
16	Acinetobacter johnsonii + Sphingomonas aquatilis + Methylobacterium komagatae	무취
17	Pseudomonas nitroreducens	무취
18	Acinetobacter johnsonii + Pseudomonas nitroreducens	무취
19	Brevibacillus invocatus + Acinetobacter johnsonii + Pseudomonas nitroreducens	무취
20	Leifsonia soli + Pseudomonas nitroreducens	무취
21	Brevibacillus invocatus + Sphingomonas aquatilis + Pseudomonas nitroreducens	무취
22	Acinetobacter johnsonii + Sphingomonas aquatilis + Pseudomonas nitroreducens	무취
23	Methylobacterium aquaticum + Methylobacterium komagatae + Bacillus vietnamensis + Deinococcus ficus	무취
24	Methylobacterium aquaticum + Methylobacterium komagatae + Curtobacterium flaccumfaciens + Deinococcus apachensis + Bacillus subtilis subsp . subtilis	무취
25	Methylobacterium aquaticum + Methylobacterium komagatae + Spirosoma linguale + Sphingomonas dokdonensis + Leifsonia soli	무취

상기 실험결과와 같이, 공조장치 내에 서식하고 있는 미생물 중 악취 유발 미생물을 화학적 또는 물리적 방법 등을 이용하여 제거하여 악취를 유발하지 않는 미생물들로만 조합을 형성할 경우, 공조장치에서 발생되는 악취를 유의적으로 제거할 수 있다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

한국미생물보존센터 KCCM11689P 20150417 한국미생물보존센터 KCCM11690P 20150417 한국미생물보존센터 KCCM11691P 20150417 한국미생물보존센터 KCCM11692P 20150417 한국미생물보존센터 KCCM11693P 20150417 한국미생물보존센터 KCCM11694P 20150417

<110> Hyundai Motor Company <120> Method for Screening Antimicrobial Agents against Pelomonas puraquae <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1460 <212> DNA <213> Pelomonas puraquae HKMC-113 <220> <221> rRNA <222> (1)..(1460) <223> 16s rRNA <400> 1 tggctcagat tgaacgctgg cggcatgcct tacacatgca agtcgaacgg taacaggtta 60 agctgacgag tggcgaacgg gtgagtaata tatcggaacg tgcccagtcg tgggggataa 120 ctgctcgaaa gagcagctaa taccgcatac gacctgaggg tgaaagcggg ggatcgcaag 180 acctcgcgcg attggagcgg ccgatatcag attaggtagt tggtggggta aaagcctacc 240 aagccaacga tctgtagctg gtctgagagg acgaccagcc acactgggac tgagacacgg 300 cccagactcc tacgggaggc agcagtgggg aattttggac aatggacgca agtctgatcc 360 agccatgccg cgtgcgggaa gaaggccttc gggttgtaaa ccgcttttgt cagggaagaa 420 aaggttctgg ttaatacctg gaactcatga cggtacctga agaataagca ccggctaact 480 acgtgccagc agccgcggta atacgtaggg tgcaagcgtt aatcggaatt actgggcgta 540 aagcgtgcgc aggcggttat gcaagacaga tgtgaaatcc ccgggctcaa cctgggaact 600 gcatttgtga ctgcatggct agagtgcggc agagggggat 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cagctcgtgc cgtgaggtgt taggttaagt cctgcaacga gcgcaacccc 1080 tgtcactagt tgccatcatt aagttgggga ctctagtgag actgcctacg caagtagaga 1140 ggaaggtggg gatgacgtca aatcatcacg gcccttacgc cttgggccac acacgtaata 1200 caatggccgg tacagagggc agctacacag cgatgtgatg caaatctcga aagccggtct 1260 cagttcggat tggagtctgc aactcgactc tatgaagctg gaatcgctag taatcgcgca 1320 tcagccatgg cgcggtgaat acgttcccgg gccttgtaca caccgcccgt caagccatgg 1380 aagtctgggg tacctgaagt cggtgaccgt aaaaggagct gcctagggta aaacaggtaa 1440 ctagggctaa gtcgtaa 1457 <210> 5 <211> 1443 <212> DNA <213> Spirosoma linguale HKMC-117 <220> <221> rRNA <222> (1)..(1443) <223> 16s rRNA <400> 5 tggctcagga tgaacgctag cggcaggcct aatacatgca agtcgaacgg gccgcaaggt 60 cagtggcaaa cgggtgcgta acgcgtaagc aacctgccct caactggggg atagcccggc 120 gaaagctggg gtaaacccgc acggtcccac ggaatcacct ggttttttgg gtaaacattt 180 atgggttgag gaggggcttg cgtctgatta gctagttggc ggggtaacgg cccaccaagg 240 cgatgatcag taggggttct gagaggattg gcccccacat gggtactgag atacggaccc 300 aactcctacg ggaggcagca gtagggaata ttgggcaatg ggcgcaagcc tgacccagcc 360 atgccgcgtg caggatgaag gcgctcagcg ttgtaaactg cttttatcgg tgaagaacgg 420 cagtcctgcg ggattgtgtg acggtagccg aggaataagc accggctaac tccgtgccag 480 cagccgcggt aatacggagg gtgcaagcgt tgtccggatt tattgggttt aaagggtgcg 540 taggtggtcg tctaagtctg gttttaaagt tggctgctta acagtcaaag gtggctggaa 600 actggacgac ttgaatggga tggcggtagc cggaatgggt catgtagcgg tgaaatgcat 660 agatatgacc cggaacaccg attgcgaagg caggctacta cgtcccgatt gacactgagg 720 cacgagagca tgggtagcga acaggattag ataccctggt agtccatgcc gtaaacgatg 780 attactggct gtgtggtctt tgggctgcgt ggctgagcga aagcgttaag taatccacct 840 ggggagtacg ctggcaacag tgaaactcaa aggaattgac gggggtccgc acaagcggtg 900 gagcatgtgg tttaattcga tgatacgcga ggaaccttac ctgggctaga atgtgaagga 960 agttatcaga aatggtagcg tgtagcaata cacctgaaac aaggtgctgc atggctgtcg 1020 tcagctcgtg ccgtgaggtg ttgggttaag tcccgcaacg agcgcaaccc ctatgatttg 1080 ttgccagcat gtaatgatgg ggactcaagt cagactgcct gcgcaagcag agaggaagga 1140 ggggacgacg tcaagtcatc 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gggcggtacg gtgacgta 478

Claims (17)

1. 피브렐라 에어스투아리나(Fibrella aestuarina)가 공조장치 내에서 발생시키는 악취를 저감시키기 위한 공조장치 내 악취저감용 항균제의 스크리닝 방법으로서,
   (a)상기 피브렐라 에어스투아리나 또는 이의 배양물을 준비하는 단계;
   (b)상기 피브렐라 에어스투아리나 또는 이의 배양물에 시료를 접촉시키는 단계;
   (c)상기 피브렐라 에어스투아리나의 생육 억제를 측정하는 단계; 및
   (d)상기 피브렐라 에어스투아리나의 생육이 억제되었을 때, 상기 시료가 상기 피브렐라 에어스투아리나가 발생시키는 공조장치 내 악취를 저감 시키는 항균활성을 갖는 것으로 판별하는 단계;
   를 포함하는 공조장치 내 악취저감용 항균제의 스크리닝 방법.
   
2. 제 1 항에 있어서, 상기 공조장치는 에어컨인 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
   
3. 제 1 항에 있어서, 상기 피브렐라 에어스투아리나는 공조장치 내 에바코어에 바이오필름을 형성하여 악취를 유발하는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
   
4. 제 3 항에 있어서, 상기 에바코어는 재질이 알루미늄, 알루미늄 합금, 동 또는 동 합금인 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
   
5. 제 1 항에 있어서, 상기 피브렐라 에어스투아리나는 피브렐라 에어스투아리나( Fibrella aestuarina ) HKMC-115(기탁번호:KCCM11691P)인 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
   
6. 제 1 항에 있어서, 상기 항균제는 크리세오박테리움 지오카포스페레( Chryseobacterium geocarposphaerae )에 대한 항균활성을 추가적으로 보유하는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
   
7. 제 6 항에 있어서, 상기 크리세오박테리움 지오카포스페레는 크리세오박테리움 지오카포스페레 ( Chryseobacterium geocarposphaerae ) HKMC-116(기탁번호: KCCM 11692P)인 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
   
8. 제 1 항에 있어서, 상기 항균제는 스피로소마 링구얼 ( Spirosoma linguale ), 및 스피로소마 라디오톨러런스( Spirosoma radiotolerans )로 구성된 군으로부터 선택되는 1 이상의 스피로소마 속 미생물에 대한 항균활성을 추가적으로 보유하는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
   
9. 제 8 항에 있어서, 상기 스피로소마 속 미생물은 스피로소마 링구얼( Spirosoma linguale ) HKMC-117(기탁번호: KCCM11693P), 및 스피로소마 라디오톨러런스( Spirosoma radiotolerans ) HKMC-114(기탁번호: KCCM11690P)로 구성된 군으로부터 선택되는 1 이상인 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
   
10. 제 1 항에 있어서, 상기 항균제는 지오바실러스 퇴비( Geobacillus toebii ) 에 대한 항균활성을 추가적으로 보유하는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
    
11. 제 10 항에 있어서, 상기 지오바실러스 퇴비는 지오바실러스 퇴비( Geobacillus toebii ) HKMC-118(기탁번호: KCCM11694P) 인 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
    
12. 제 1 항에 있어서, 상기 항균제는 페로모나스 푸라퀘 ( Pelomonas puraquae ) 에 대한 항균활성을 추가적으로 보유하는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
    
13. 제 12 항에 있어서, 상기 페로모나스 푸라퀘는 페로모나스 푸라퀘( Pelomonas puraquae) HKMC-113(기탁번호: KCCM11689P)인 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
    
14. 삭제
15. 삭제
16. 공조장치 내에서 악취 유발 미생물인 피브렐라 에어스투아리나( Fibrella aestuarina)를 상기 공조장치로부터 분리 또는 사멸시키는 단계를 포함하는 공조장치 내 악취 제거 방법.
    
17. 공조장치 내에서 악취 유발 미생물인 피브렐라 에어스투아리나( Fibrella aestuarina)의 생육을 억제시키는 단계를 포함하는 공조장치 내 악취 제거 방법.
    
    
    
    

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