JP7016803B2 - 無臭微生物を含む臭気防止用組成物 - Google Patents
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Description
しかしながら、上記の発明では、いかなる細菌が無臭微生物であるかを提示しておらず、また、それをコーティングした場合、エバポレータコアで生存できるか否か、及び実際に悪臭などの臭気を誘発する微生物の生息や臭気を防止できるか、に対する効果を十分に立証できていない。
本発明者らは無臭微生物を用いて悪臭を誘発する微生物を効果的に制御できる方法を見つけようと努力し、特に、空調装置から誘発される悪臭の原因を根本的に遮断しようと努力した。その結果、空調装置内で悪臭を誘発しない微生物4種を分離することに成功し、それら又はそれらの組合せを用いてバイオフィルムを形成する場合、悪臭を誘発する微生物の生育を阻止し、結果的に悪臭を防止できることを確認した。
上記無臭微生物の培養液は、O.D.(optical density)値が0.3~0.9である微生物培養液を用いることが好ましく、より好ましくは0.4~0.8の値が良い。
が、実車への適用面において最も好ましい。上記の方式でコーティングされた無臭微生物は、エバポレータコアの表面に均一に分布及び生息して、長期間(30日以上)安定化したバイオフィルムを形成することができる(実施例9)。
上記臭気防止用組成物に含まれた微生物が実際に臭気を発生するか否かは、それらの微生物が餌にして代謝する栄養供給源の成分によることもあるので、上記微生物が適用される実産業における栄養供給源を投与しても臭気が発生しないことが重要であろう。
空調装置の場合、微生物は空気中に存在する室内及び室外の様々な物質を営養分にして代謝し、室内及び室外の空気汚染物質や排気ガス成分(ガソリン、軽油、LPGなどの石油類)がそれらの微生物の栄養供給源になるので、それらの栄養供給源を上記微生物がコーティングされたエバポレータコアに投入し、実産業への適用時に空調装置の臭気発生の有無をあらかじめ確認することができる。
上記微生物は、単独で又は組合せで空調装置臭気防止のためのエバポレータコアコーティング用途に使用することができる。
本発明者は、悪臭のする5種の中古タクシー(表1)を確保し、それぞれ車種A~車種Eに装着されているエバポレータコアを引き離してエバポレータコア試片をサンプリングした。
上記悪臭のする中古タクシーA~Eから確保したエバポレータコアから得たエバポレータコアサンプルは、使用するまで4℃で冷蔵保管するが、ポリエチレン袋(polyethylene bag)で密封して保管した。微生物を分離培養するために、それぞれのエバポレータコアにおける前面部及び後面部を含む任意の部位からフィン試料を、滅菌したラジオペンチ(long nose plier)を用いて各5gずつ採取し、混合して使用した。
エバポレータコアからの微生物の脱離手順及び方法について述べると、下記のとおりである。
[1]エバポレータコアから抽出した試料を混ぜて混合器(mixer)に入れる。
[2]滅菌した1×リン酸緩衝生理食塩水(Phosphate buffed saline;PBS)を200ml混合器に入れる。
[3]混ぜた試料とPBSを30秒間混合する。
[4]混合器を氷に1分間置く。
[5][3]~[4]ステップを2回さらに繰り返す。
[6]懸濁液を4℃で3分間13000rpmで遠心分離(centrifuge)する。
[7]上澄液だけを採って新しいチューブに移し入れる。
[8]滅菌した綿棒を上澄液に濡らして、サンプルを採取したエバポレータコアの表面を数回ふき取る。
[9]ふき取った綿棒は、上澄液にヘッドだけを入れてボルテックス(votexing)する。
[10][6]ステップで得た沈殿物と[9]の混合物とを混ぜて接種原液として使用する。
エアコンの細菌の分離は、通常、一般細菌という好気性従属栄養細菌を、従属栄養平板培養を用いて分離する。一般細菌の分離に使用する複合栄養培地は、PTYG寒天培地(PTYG agar medium)、R2A寒天培地(R2A agar medium)の2種類を使用する。PTYG寒天培地は、ペプトン0.25g(Difco)、トリプトン0.25g(Difco)、酵母エキス0.5g(Difco)、グルコース0.5g(Difco)、MgSO4 30mg(Sigma)、CaCl2 3mg(Sigma)、バクト寒天15g(Difco)を蒸溜水980mlに入れてpH7.0にした後、121℃で15分間高圧滅菌した。寒天培地は、酵母エキス0.5g(Difco)、プロテオースペプトンNo.3 0.5g(Difco)、カザミノ酸0.5g(Difco)、デキストロース0.5g(Difco)、可溶性でんぷん0.5g(Difco)、ピルビン酸ナトリウム0.3g(Difco)、硫酸二カリウム0.3g(Difco)、硫酸マグネシウム0.05g(Difco)、バクト寒天15g(Difco)を蒸溜水980mlに入れてpH7.2にした後、121℃で15分間高圧滅菌した。非優占一般細菌の分離のために3種類の抗生剤を使用するが(表2)、各抗生剤は100ppmの濃度でフィルター滅菌後に培地温度が約50℃になった時に接種し、抗生剤培地を製作した。
優占菌株を分離培養するためにはまず、希釈比率とコロニー色、大きさ、形状などの形態学的なアプローチによって様々な優占菌株を選別しなければならず、下記の手順によって優占菌株を分離培養する。
分離培養された培地からバクテリアを分離する。
形態学的に異なる様々な細菌をループを用いて複合培地に接種して純粋分離する。
接種した培地のうち、最も生育のよい培地を選択して継代培養する。
REP-PCRパターン分析によるフィンガープリント(Fingerprints)の調査
REP-PCRは、細菌染色体の構造を分析する分子生物学的方法であり、各細菌菌株と他の細菌を分けて識別できるフィンガープリント方法である。REP-PCRを行うために下記の各手順によって遺伝的特性を分析した。
Lyse-N-Go PCR試薬(Thermo)2.5μLをPCRチューブに入れる。
クリーンベンチでコロニーをピペットで採って上記チューブに入れてピペット操作する。この時、採る量は、溶液がやや濁ることのないように注意する。
製造業者の指示に従ってPCR装置で培養する。
下記の表3に記載されている溶解(Lysis)プログラムによるサイクルを繰り返し、9サイクルで80℃になると、オフしないでそのまま置く。
下記表4に記載されているPCR反応に必要な成分を必要量で混合して反応混合物を製造し、これを用いて、表5に記載するように、予備変性段階(pre-denaturation)94℃で7分、変性段階(denaturation)92℃で1分、冷却段階(annealing)51.5℃で1分、延長(extension)段階65℃で8分行い、変性、冷却、延長過程を33回繰り返してPCR増幅過程を行った。
それぞれのPCRによって増幅されたDNA断片を採って、EtBrを添加した1.2%~1.5%アガロースゲル(agarose gel)を使用し、6x色素(dye)をサンプルと1:5の比率で混ぜてできるだけ多量をローディングした。大部分のPCR産物は100bp~1000bpであるので、100bpラダー(ladder)を共にローディングして、できるだけゆっくり(50V)ブロモフェノール・ブルー(bromophenol blue)とキシレンシアノール色素(xylene cyanol dye)の中間が全体ゲルの中間となるように電気泳動する。ゲル上のDNAパターンが同じ菌株は同一菌株と見なす。
16S rRNA(ribosomal Ribonucleic acid)遺伝子はバクテリアの遺伝学的分類同定のために用いられ、REP-PCRによって分類されたバクテリアの属(genus)及び種(species)レベルでの同定が可能である。16S rRNAは様々な蛋白質と相互作用してリボソーム(Ribosome)を構成するRNAであり、その完全な配列やオリゴヌクレオチド(Oligonucleotide)目録に対する塩基配列が2000種以上の細菌から明らかになったため、16S rRNAの遺伝子類似性に基づいて細菌をいくつかの主要群に分類することができる。上記16S rRNA遺伝子塩基配列の変化率が大部分のゲノムにある他の遺伝子塩基配列に比べて格段に少ないため、16S rRNA塩基配列類似度の程度が生物間の系統学的距離を反映するものと認識されている。上記16S rRNA遺伝子断片の塩基配列を分析し、その類似度によって微生物を同定する方法は、上述した脂肪酸分析及び炭水化物同化能分析法と共に微生物、特に産業的に有用な微生物を同定するための代表的な同定方法として用いられてきた。
PCR条件(condtions)(総50μL):DNA及びTaqを除いた残り溶液を、下記表6に記載するように必要量だけ混合して上記溶解(lysis)溶液に44.5μLを加えた。その後、表7に記載するように、予備変性段階(pre-denaturation)94℃で5分、変性段階(denaturation)94℃で1分、冷却段階(annealing)55℃で1分、延長段階(extension)72℃で1分30秒を行い、変性、冷却及び延長段階を29回施してPCR増幅過程を行った。
16S-r RNA PCRを用いて増幅した産物を、Qiaquick PCR purifcation kitを用いて下記の手順によって精製した。
PCR産物の5倍のPBバッファーを入れる。
混合した液をQIAquickカラムに分注する。
DNAを結合(binding)するために1分間遠心分離した後、上澄液を除去する。
洗浄のために750μLのPEバッファーをQIAquickカラムに入れて1分間遠心分離した後、上澄液を除去する。
1分間再び遠心分離する。
QIAquickカラムを新しいチューブに移す。
DNAを抽出するために30μLのEBバッファーを入れて1分間置く。
1分間遠心分離して、EBに溶けたDNAをチューブに集める。
1.微生物の名称:HKMC-14
属名:Caulobacter
種名:vibrioides
寄託番号:KCCM11685P(2015.04.17)
2.復元条件
イ.復元剤
(1)組成:PTYG培地(1L当たりペプトン0.25g、トリプトン0.25g、酵母エキス0.5g、グルコース0.5g、MgSO4 30mg、CaCl2 3mg)又はR2A培地。
(2)pH:7.0
(3)殺菌条件:121℃で20分
ロ.温度(℃):28℃で7日間培養
3.培地
(1)組成:PTYG培地(1L当たりペプトン0.25g、トリプトン0.25g、酵母エキス0.5g、グルコース0.5g、MgSO4 30mg、CaCl2 3mg)又はR2A培地。
(2)pH:7.0
(3)殺菌条件:121℃で20分
4.培養条件
イ.好気性、嫌気性:好気性
ロ.温度:28℃
ハ.振盪、静置(液体、固体)を問わず使用可能
5.保存条件
温度(℃):-70℃
1.微生物の名称:HKMC-15
属名:Bradyrhizobium
種名:diazoefficiens
寄託番号:KCCM11686P(2015.04.17)
2.復元条件
イ.復元剤
(1)組成:PTYG培地(1L当たりペプトン0.25g、トリプトン0.25g、酵母エキス0.5g、グルコース0.5g、MgSO4 30mg、CaCl2 3mg)又はR2A培地。
(2)pH:7.0
(3)殺菌条件:121℃で20分
ロ.温度(℃):28℃で7日間培養
3.培地
(1)組成:PTYG培地(1L当たりペプトン0.25g、トリプトン0.25g、酵母エキス0.5g、グルコース0.5g、MgSO4 30mg、CaCl2 3mg)又はR2A培地。
(2)pH:7.0
(3)殺菌条件:121℃で20分
4.培養条件
イ.好気性、嫌気性:好気性
ロ.温度:28℃
ハ.振盪、静置(液体、固体)を問わず使用可能
5.保存条件
温度(℃):-70℃
1.微生物の名称:HKMC-16
属名:Bradyrhizobium
種名:daqingense
寄託番号:KCCM11687P(2015.04.17)
2.復元条件
イ.復元剤
(1)組成:PTYG培地(1L当たりペプトン0.25g、トリプトン0.25g、酵母エキス0.5g、グルコース0.5g、MgSO4 30mg、CaCl2 3mg)又はR2A培地。
(2)pH:7.0
(3)殺菌条件:121℃で20分
ロ.温度(℃):28℃で7日間培養
3.培地
(1)組成:PTYG培地(1L当たりペプトン0.25g、トリプトン0.25g、酵母エキス0.5g、グルコース0.5g、MgSO4 30mg、CaCl2 3mg)又はR2A培地。
(2)pH:7.0
(3)殺菌条件:121℃で20分
4.培養条件
イ.好気性、嫌気性:好気性
ロ.温度:28℃
ハ.振盪、静置(液体、固体)を問わず使用可能
5.保存条件
温度(℃):-70℃
1.微生物の名称:HKMC-17
属名:Methylobacterium
種名:brachiatum
寄託番号:KCCM11688P(2015.04.17)
2.復元条件
イ.復元剤
(1)組成:PTYG培地(1L当たりペプトン0.25g、トリプトン0.25g、酵母エキス0.5g、グルコース0.5g、MgSO4 30mg、CaCl2 3mg)又はR2A培地。
(2)pH:7.0
(3)殺菌条件:121℃で20分
ロ.温度(℃):28℃で7日間培養
3.培地
(1)組成:PTYG培地(1L当たりペプトン0.25g、トリプトン0.25g、酵母エキス0.5g、グルコース0.5g、MgSO4 30mg、CaCl2 3mg)又はR2A培地。
(2)pH:7.0
(3)殺菌条件:121℃で20分
4.培養条件
イ.好気性、嫌気性:好気性
ロ.温度:28℃
ハ.振盪、静置(液体、固体)を問わず使用可能
5.保存条件
温度(℃):-70℃
(1)栄養培地での培養
上記実施例6から同定した微生物のうちの26種の官能的特性分析のために、微生物を分離した栄養培地で7日間28℃で培養して評価を実施した。下記に、バクテリアを栄養培地で培養する過程を述べる。
純粋分離培養した微生物を液体栄養培地に接種する。
接種した培地を28℃で5~7日間培養する。
固体栄養培地に、液体培地で培養した菌体を100μL採って接種する。
接種した菌体をスプレッダー(spreader)を用いて均一に広げる。
ペトリ皿を密封して28℃で10日間培養する。
矩形のアルミニウムフィンを滅菌処理し、これをホコリ及び栄養培地に浸漬した。その後、バクテリアを接種し、上記栄養培地での段階[2]~[4]に記載された条件と同様にして培養して評価し、その官能評価結果を下記表8(1次)、及び表9(2次)に記載した。微生物生長速度差によって1次、2次に分けて官能評価を行った。
- 抗菌剤が処理されたアルミニウムフィン:エバポレータコアの主材料であるアルミニウム上に坑菌コーティングまでしたものであり、市販されている量産品から十分に選択可能なエバポレータコア製品のコーティングである。
臭気評価に関連しては、現行法規に従って人間の嗅覚を用いた官能評価方式で評価するようになっている。嗅覚で評価する以外の臭気評価は全世界に存在しない現状である。上述した実施例にも示されているように、’無臭’は、官能評価方法によって人間が嗅覚で感じる基準によって決められるものである。
このような無臭の判断基準は、悪臭工程試験方法(告示第2007-17号、国立環境科学院)に記載されている。悪臭工程試験方法の65頁に記載の悪臭判定度には、’無臭’について’平素、嗅覚で何にも感知できない状態’と記載されている。
また、日本悪臭防止法第2章規制第4条規制基準の2頁からすれば、等級表において0に対応する部分に「無臭」と記載されていることが分かる。
このように、官能評価において「無臭」の基準は、上記の韓国及び日本の規定でも明確になっているように、「一定基準によって選ばれた人々の嗅覚で何にも感知できない状態」を意味する。
(1)無臭微生物のフィン付着最適濃度の分析
上記11種の無臭微生物のエバポレータコアコーティングのために、2012年の研究結果(優先出願)のように106cfu/gレベルで接種するための付着適正濃度を確認した。濃度確認試験は、共通菌株の一つであるMethylobacterium aquaticumを使用し、28℃で後期対数期(late log phase)まで培養後、滅菌した0.85%生理食塩水(saline)で洗浄して4℃で18時間培養した。4℃で培養後、O.D.(optical density)を0.749、0.588、0.55、0.5、0.45に滴定した後、2gのu字状フィンを漬けて1時間室温で一定rpmで振盪(shaking)しながら付着した。このようにそれぞれの濃度の微生物が付着したフィンは混合器(mixer)で脱離した後、R2A寒天プレート(R2A agar plate)に連続希釈(serial dilution)により平板塗抹した。
上記フィン付着実験の結果、属(genus)に関係なく11種の無臭微生物は同一のO.D.で同一の付着程度を示すことを確認した。したがって、菌株の一つであるMethylobacterium aquaticumを使用してフィンと同じO.D.の培養液を用いてエバポレータコアに付着する微生物の量を確認した。
O.D.0.5で滴定したMethylobacterium aquaticumは、エバポレータコアにおいて8.95×106±5.51×105cfu/gフィンの付着程度を示した。このように同一の培養液を使用して付着したエバポレータコアの場合、2.55×106±3.51×105cfu/gフィンの付着程度を示した。このような結果から、同一のO.D.の培養液を使用する場合、同一レベルの微生物が付着することが確認できる。
下記組合せで30日間の生存評価を行った。コーティング組合せとして使用された微生物の組合せ番号及び微生物リストは次のとおりである(表11)。
上記組合せの場合、Methylobacterium aquaticum PR1016A、Caulobacter vibrioides TX0632、Methylobacteriumbrachiatum TX0642、Bradyrhizobiumdiazoefficiens TX0618の4個の菌株からなる組合せであり、3.99×106±2.82×106cfu/gフィンレベルの総細菌がtime 0で確認され、赤色、白色コロニーがそれぞれ3.62×106±2.79×106cfu/gフィン、3.67×105±3.06×104cfu/gフィンレベルと検出された。30日経過後には白色コロニーは検出されなく、赤色コロニーが2.14×106±1.25×105cfu/gフィンレベルであって、総細菌と同一に検出された(図2)。
以上、本発明の特定の部分を詳しく記述してきたが、当業界における通常の知識を有する者にとって、このような具体的な記述は単なる好ましい具現例に過ぎないもので、それに本発明の範囲が制限されることはないという点は明らかである。したがって、本発明の実質的な範囲は添付の請求項及びその同等物によって定義されるべきであろう。
Claims (18)
- 空調装置から発生する臭気を防止するための組成物であって、
カウロバクター・ビブリオイデス(Caulobacter vibrioides)HKMC-14(寄託番号:KCCM11685P)、ブラジリゾビウム・ジアゾエフィシエンス(Bradyrhizobium diazoefficiens)HKMC-15(寄託番号:KCCM11686P)、ブラジリゾビウム・ダキンゲンス(Bradyrhizobium daqingense)HKMC-16(寄託番号:KCCM11687P)、及びメチロバクテリウム・ブラチアタム(Methylobacterium brachiatum)HKMC-17(寄託番号:KCCM11688P)からなる群から選ばれる1種以上の無臭微生物又はその培養液であることを特徴とする臭気防止用組成物。 - 請求項1に記載の臭気防止用組成物がコーティングされたことを特徴とするエバポレータコア。
- 前記エバポレータコアには請求項1に記載の微生物が10 4 cfu/g~10 8 cfu/gの濃度で付着されていることを特徴とする請求項2に記載のエバポレータコア。
- 上記微生物の付着は、O.D.(optical density)値が0.3~0.9である微生物培養液を用いて付着させたことを特徴とする請求項3に記載のエバポレータコア。
- 上記組成物内の微生物がエバポレータコアの表面にバイオフィルムを形成することを特徴とする請求項2に記載のエバポレータコア。
- 請求項2に記載のエバポレータコアを備えていることを特徴とする空調装置。
- 請求項1に記載の組成物をエバポレータコアにコーティングする段階を含むことを特徴とする空調装置内の臭気を誘発しない無臭エバポレータコアの製造方法。
- 前記コーティングする段階は、前記組成物に含まれた微生物を10 4 cfu/g~10 8 cfu/gの濃度でエバポレータコアに付着させる過程を含むことを特徴とする請求項7に記載の製造方法。
- 前記製造方法は、コーティングされた組成物中の微生物を繁殖させてバイオフィルムを形成する段階をさらに含むことを特徴とする請求項7に記載の製造方法。
- 請求項1に記載の組成物をエバポレータコアにコーティングする段階を含むことを特徴とする空調装置臭気防止方法。
- 前記コーティングする段階は、前記組成物に含まれた微生物を10 4 cfu/g~10 8 cfu/gの濃度でエバポレータコアに付着させる過程を含むことを特徴とする請求項10に記載の空調装置臭気防止方法。
- 前記臭気防止方法は、前記組成物内に含まれた微生物を繁殖させてバイオフィルムを形成する段階をさらに含むことを特徴とする請求項10に記載の空調装置臭気防止方法。
- 請求項1に記載の組成物をエバポレータコアにコーティングする段階を含むことを特徴とする空調装置臭気確認方法。
- 前記臭気確認方法は、前記コーティングされた組成物内に含まれた微生物の栄養分となる石油類又は空気汚染物質を投入し、臭気が発生するか否かを確認する段階を含むことを特徴とする請求項13に記載の空調装置臭気確認方法。
- 請求項10に記載の空調装置臭気防止のためのエバポレータコアコーティング用途のカウロバクター・ビブリオイデスHKMC-14(寄託番号:KCCM11685P)。
- 請求項10に記載の空調装置臭気防止のためのエバポレータコアコーティング用途のブラジリゾビウム・ジアゾエフィシエンスHKMC-15(寄託番号:KCCM11686P)。
- 請求項10に記載の空調装置臭気防止のためのエバポレータコアコーティング用途のブラジリゾビウム・ダキンゲンスHKMC-16(寄託番号:KCCM11687P)。
- 請求項10に記載の空調装置臭気防止のためのエバポレータコアコーティング用途のメチロバクテリウム・ブラチアタムHKMC-17(寄託番号:KCCM11688P)。
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