WO2017116161A1 - 무취 미생물을 포함하는 냄새 방지용 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 카울로박터비브리오이데스(Caulobacter vibrioides), 브라디리조비움 디아조에피션스(Bradyrhizobium diazoefficiens), 브라디리조비움 다퀸젠스 (Bradyrhizobium daqingense), 및메틸로박테리움브라키아툼(Methylobacterium brachiatum)로이루어진군에서선택되는 1종 이상의 무취 미생물 또는 이의 배양액을 포함하는 냄새 방지용 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 냄새 방지용 조성물을 코팅하는 단계를 포함하는 냄새 방지방법에 관한 것이다. 본 발명의 냄새 방지용 조성물로 악취 유발 미생물이 서식 가능한 대상에 코팅을 하여 바이오필름을 형성시킬 경우, 악취 유발 가능성이 있는 외부 미생물의 유입 및 서식을 유의적으로 차단하여 냄새를 효과적으로 방지할 수 있다.

Description

무취 미생물을 포함하는 냄새 방지용 조성물
본 발명은 카울로박터비브리오이데스(Caulobacter vibrioides), 브라디리조비움 디아조에피션스(Bradyrhizobium diazoefficiens), 브라디리조비움 다퀸젠스 (Bradyrhizobium daqingense), 및메틸로박테리움브라키아툼 (Methylobacterium brachiatum )로이루어진군에서선택되는 1종 이상의 무취 미생물 또는 이의 배양액을 포함하는 냄새 방지용 조성물 및 이를 이용한 냄새 방지방법에 관한 것이다.
깨끗한 공기는 인간의 건강과 웰빙에 기본으로 인식되고 있으며, 불쾌한 냄새를 유발하거나 오염된 공기는 쾌적한 환경을 방해하는 주된 요소로 작용한다. 예를 들면, 밀폐된 조건에서 불만족스러운 실내 공기질은 다음의 두 가지 중요한 요인에 의해서 야기된다. 하나는 밀폐된 환경을 구성하는 구성 물질 자체(건물, 차량 등)으로부터 직접 발생되는 실내공기 오염물질과, 다른 한 요인은 인간 활동에 의해 발생되거나 외부로부터 유입된 물질이 원인이 되어 발생된 냄새이다.
공조 시스템은 건물, 차량, 철도, 선박, 항공기 등에 있어 공기의 온도, 습도, 기류 및 청정도를 조화시키는 공기 조화에 목적을 두어 실내의 온도를 낮추고 실내 환경을 최적화시키는 시스템이다. 이러한 공조 시스템은 생활수준의 향상으로 인해 보급률이 점점 증가하고 있다. 공조 시스템의 보급률의 증가로 기본적인 기능은 많은 발전이 있어 왔으나, 실내 공기의 질을 위한 환경적 측면으로는 아직 해결해야 할 문제가 많이 남아있다.
공조 시스템 중에 특히, 에어컨 냄새의 원인은 곰팡이와 세균의 대사 물질에 기한 것으로 알려져 있으나, 해당 곰팡이와 세균의 종류 및 상기 미생물들이 구체적으로 어떠한 대사 물질을 얼마나 분비하는지에 대한 구체적인 자료는 아직까지 밝혀지지 않은 상태에 있다.
공조 장치의 구조상, 블로워를 통과한 모든 공기는 에바코어를 통과하게 되는데, 차가운 냉매와 공기의 열교환시, 에바코어 표면에는 온도차에 따른 응축수 응결 현상이 발생되고, 이 응축수 응결이 지속되면 에바코어 표면에는 곰팡이 및 세균이 서식, 번식하기 좋은 환경이 제공된다. 외부 공기에 노출된 에바코어에 곰팡이 및 세균이 증식한 상태에서, 에바코아 표면에 증식한 세균의 대사 물질로 미생물의 휘발성유기화합물(mVOCs)이 발생하며, 에바코어를 통과한 공기가 실내로 송풍되면, 이때 미생물에 의해 발생한 휘발성유기화합물에 의해서, 장기간 사용시에 실내는 곰팡이 및 세균에 의한 악취에 노출될 수 있다.
악취가 발생하는 에바코어 표면은 장기간의 사용에 따라 바이오 필름으로 덮여 있고, 이들은 박테리아, 셀클러스터, EPS로 구성되는데, EPS는 단백질(Protein), 폴리사카라이드, 폴리우론산(Polyuronic acid), 핵산(Nucletic), 지질(Lipid) 등의 다양한 성분을 포함하는 바, 에바코어 표면에서는 다양한 세균, 곰팡이가 바이오 필름을 양분 삼아 증식하며 대사물질로 미생물에 의한 유기화합물(mVOCs)를 배출하게 되며 이것이 에어컨 악취의 여러 요인 중에 부패취로 알려져 있다.
상기 악취를 제거하기 위하여 다양한 종류의 방향제들이 시판되고 있으나, 이는 상기 에바코어에 서식하는 곰팡이 및 세균을 근본적으로 제거하지 못하고 단지 일시적으로 불쾌한 냄새를 희석하는 역할에 지나지 않는 경우가 많으며, 현재 시판 중인 항균제들 역시도 에바코어에 서식하는 특정 곰팡이 또는 세균에 특이적으로 작용하도록 개발된 사례는 전무한 실정이며, 단지 통상적인 병원균에 대한 항균력이 있다는 이유로 판매되고 있는 상황이다.
이에 본 발명자는 대한민국 공개특허 제10-2012-0020309호에서 에바코어 표면에 악취의 원인을 제공하는 세균, 곰팡이의 증착 및 번식이 방지될 수 있도록 에바코어 표면에 무취 혹은 향기나는 특정 미생물로 형성된 바이오필름을 코팅시키는 에바코어의 제조방법을 개시한 바 있다.
하지만, 상기 발명에서는 어떠한 세균이 무취 미생물인지를 제시하지 못하였으며, 또한 이를 코팅하면 에바코어에서 생존할 수 있는지 여부 및 실제 악취 등의 냄새를 유발하는 미생물의 서식이나 냄새를 방지할 수 있는지에 대한 효과 입증에 미흡함이 있었다.
본 발명자들은 무취 미생물을 이용하여 악취를 유발하는 미생물들을 효과적으로 제어할 수 있는 방법을 찾고자 노력하였다. 그 결과, 공조장치 내에서 악취를 유발하지 않는 미생물 4종을 분리하는데 성공하고 이들 또는 이들의 조합을 이용하여 바이오 필름을 형성시킬 경우 악취를 유발하는 미생물들의 생육을 차단하여 결과적으로 악취를 방지할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 카울로박터비브리오이데스 ( Caulobacter vibrioides ), 브라디리조비움 디아조에피션스 (Bradyrhizobium diazoefficiens ), 브라디리조비움 다퀸젠스 ( Bradyrhizobium daqingense ), 및메틸로박테리움브라키아툼 (Methylobacterium brachiatum )로이루어진군에서선택되는 1종 이상의 무취 미생물 또는 이의 배양액을 포함하는 냄새 방지용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 냄새 방지용 조성물이 코팅된 에바코어를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 냄새 방지용 조성물을 에바코어에 코팅하는 단계를 포함하는 공조장치 내 냄새를 유발시키지 않는 무취 에바코어 제조방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 냄새 방지용 조성물을 에바코어에 코팅하는 단계를 포함하는 공조장치 냄새 방지방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 냄새 방지용 조성물을 에바코어에 코팅하는 단계를 포함하는 공조장치 냄새 확인방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 공조장치 냄새 방지를 위한 에바코어 코팅 용도의 무취 미생물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 무취 미생물 또는 이의 배양액을 포함하는 냄새 방지용 조성물을 제공한다.
본 발명자들은 무취 미생물을 이용하여 악취를 유발하는 미생물들을 효과적으로 제어할 수 있는 방법을 찾고자 노력하였으며, 특히 공조장치에서 유발되는 악취의 원인을 근본적으로 차단하고자 노력하였다. 그 결과, 공조장치 내에서 악취를 유발하지 않는 미생물 4종을 분리하는데 성공하고 이들 또는 이들의 조합을 이용하여 바이오 필름을 형성시킬 경우 악취를 유발하는 미생물들의 생육을 차단하여 결과적으로 악취를 방지할 수 있음을 확인하였다.
본 명세서에서, 용어 “공조장치” 라 함은 외부 환경으로부터 일부 또는 전부가 분리된 공간에서 온도, 습도, 공기의 청정도, 흐름 등을 쾌적하게 유지하는 시스템을 총칭하는 의미로 사용된다. 상기 분리된 공간의 바람직한 예로는 건물 내부 또는 차량, 철도, 선박, 항공기 등의 내부와 같이 외부로부터 부분적 또는 전체적으로 분리된 내부의 공간이 될 수 있다. 상기 공조장치의 바람직한 예로는 에어컨을 들 수 있다.
공조장치는 그 구조상 블로워를 통과한 모든 공기가 에바코어를 통과하게 되며, 상기 에바코어 표면에는 온도차에 따른 응축수 응결 현상이 지속되어 미생물이 생육하기 좋은 환경이 되어, 장기간의 시간이 지날 경우 바이오 필름(biofilm)이 형성된다. 이때, 미생물들은 공기 중에 존재하는 실내 및 실외의 다양한 물질들을 영양분으로 대사하며, 대사결과 발생된 휘발성유기화합물(mVOCs)에 의해 악취가 발생되게 된다.
바이오 필름은 미생물들이 군집되어 살아가는 군집 형태로서, 하나의 막으로 둘러싸인 층의 구조이며, 상기 막은 미생물을 외부 환경으로부터 보호하고 영양분을 공급하는 역할을 한다. 막을 구성하는 성분으로 EPS(exopolymeric substances)가 있으며, 이는 단백질, 폴리사카라이드, 폴리우론산, 핵산, 지질 등의 다양한 성분을 포함하는 바, 에바코어 표면에서는 다양한 미생물이 이를 양분 삼아 증식하며 대사물질로 악취를 배출하게 된다.
본 발명자들은 상기 에바코어로부터 악취를 유발하지 않는 미생물을 분리하였으며, 이들을 배양한 결과 콜로니를 형성하는 미생물들 중에서 우점 균주를 분리 배양하였다. 우점 균주를 분리 및 배양하는 방법은 당업계에 공지된 다양한 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들어, 희석비율, 콜로니의 색, 크기, 모양 등의 morphology적인 접근을 통하여 우점 미생물을 선발할 수 있다.
상기 우점 미생물은 카울로박터, 브라디리조비움, 또는 메틸로박테리움 미생물을 포함하며, 바람직하게는 카울로박터비브리오이데스 ( Caulobacter vibrioides ), 브라디리조비움 디아조에피션스 ( Bradyrhizobium diazoefficiens), 브라디리조비움 다퀸젠스 ( Bradyrhizobium daqingense ), 또는 메틸로박테리움브라키아툼 (Methylobacterium brachiatum) 을 포함한다.
상기 미생물들은 한국미생물보존센터에 2015년 4월 17일자로 기탁되어 다음의 기탁번호를 부여받았다: 카울로박터비브리오이데스 ( Caulobacter vibrioides ) HKMC-14(기탁번호:KCCM 11685P), 브라디리조비움디아조에피션스 ( Bradyrhizobium diazoefficiens ) HKMC-15(기탁번호: KCCM 11686P), 브라디리조비움다퀸젠스 (Bradyrhizobium daqingense ) HKMC-16(기탁번호: KCCM 11687P), 및 메틸로박테리움브라키아툼 (Methylobacterium brachiatum) HKMC-17(기탁번호: KCCM 11688P).
상기 미생물들은 단독으로 또는 서로 다른 미생물 간의 조합으로 상기 냄새 방지용 조성물에 포함될 수 있다.
본 발명의 냄새 방지용 조성물은 악취 유발 미생물의 서식 및/또는 이들에 의한 악취를 차단하는 목적으로 사용될 수 있다. 즉, 본 발명의 조성물은 악취가 발생하는 장치(예를 들어, 공조장치, 폐수처리장치 등), 물건(예를 들어, 쓰레기통, 변기 등), 동물(예를 들어, 오염된 가축 등), 인체(예를 들어, 구강 내, 당뇨 발 등)의 전체 또는 특정 부분에 코팅 또는 분사되어 악취를 발생하는 원인 미생물의 서식을 차단하기 위한 용도로 사용될 수 있다.
본 발명의 냄새 방지용 조성물은 상기 코팅 대상의 차이에 따른 바이오 필름 형성능을 향상시키기 위해 당업계에 공지된 다양한 배지 성분을 추가로 포함할 수 있다. 상기 포함 가능한 배지는 예를 들어, 아가, 젤라틴, 알기네이트, 카라기난 또는 펙틴 배지 일 수 있으며, 공조장치 내 에바코어에 적용 시 바람직하게는 PTYG 배지, R2A 배지 또는 LB 배지일 수 있다.
또한, 본 발명의 냄새 방지용 조성물은 악취를 차단하거나 악취 원인균을 예방 또는 제거하기 위해 상기 무취 미생물 외에도 방향제, 살균제, 항균제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 공조장치에서 발생하는 냄새를 방지하기 위한 것이다.
본 발명의 조성물을 적용 가능한 공조장치는 건물, 차량, 철도, 선박, 항공기 등에 설치될 수 있는 것으로, 공기의 온도, 습도, 기류 또는 청정도를 조화시키는 목적으로 사용되는 것을 포함한다.
본 발명의 바이오필름을 코팅할 수 있는 대상은 공조장치이며, 공조장치는 압축기, 블로워, 에바코어 등을 포함하는데, 특히 본원 발명의 바이오 필름을 코팅시킬 수 있는 바람직한 대상은 에바코어(evaporator core)이다.
구체적으로, 상기 공조장치 내 에바코어(evaporator core) 표면은 공기의 열교환에 따른 응축수 응결 현상에 의해 세균이 서식, 번식하기 좋은 환경이 되며, 부착된 세균은 일정 시간이 지날 경우 바이오 필름을 형성하여 제거하기 어려운 안정된 군집으로 생존하게 된다. 즉, 악취 미생물의 번식을 억제할 수 있도록 미리 무취 미생물을 번식시키는 것이다.
상기의 특성을 이용하여, 본 발명은 상기 공조장치 또는 에바코어에 우점종 또는 생존력이 우수한 무취 미생물을 미리 코팅하면 이들만의 군집으로 에바코어 내에 바이오필름을 형성할 수 있으며, 악취 및 악취를 유발할 수 있는 다른 미생물의 증착 및 번식을 유의적으로 억제할 수 있다는 것을 발견하였다(실시예 8, 9).
한편, 본 명세서에서, 무취 미생물 등의 용어에서 사용되는 "무취" 라 함은 관능평가 방법으로 측정시 평가자가 '후각으로 아무것도 감지하지 못하는 상태'를 의미하는 것으로 사용된다. 이러한 무취 여부의 판단 기준은 '악취공정시험방법(고시 제2007-17호,국립환경과학원)'에도 나타나 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 냄새 방지용 조성물이 코팅된 에바코어(evaporator core) 및 이의 제조방법을 제공한다.
에바코어의 핀(fin)은 알루미늄 또는 알루미늄 합금인 것을 특징으로 하며, 에바코어에 항균처리를 한 알루미늄 또는 항균처리를 하지 않은 합급 재질을 이용하여 에바코어를 제조한다. 에바코어의 재질은 알루미늄 또는 알루미늄 합금에 한정되지 않으며, 일반적으로 에바코어는 알루미늄 이외에도 구리(동) 등 열전도율이 좋고 내부식성 뛰어난 금속은 모두 재질로 이용 가능하며 합금 제조로도 이용 가능하다. 전기차 등에는 펠티어(PELTIER) 소자에 열 교환기를 연결하여 사용할 수 있으며, 이처럼 열교환을 용이하게 하는 동일 유사한 구조라면 모두 재질로 이용할 수 있다.
상기 무취 미생물 또는 이의 배양액을 포함하는 냄새 방지용 조성물을 이용하여 에바코어를 코팅하는 방법은 당업계에 공지된 다양한 방법(예를 들어, 분사, 도포, 침지)을 이용할 수 있으며, 바람직하게는 에바코어 전체에 골고루 코팅이 될 수 있도록 에바코어를 무취 미생물의 배양액에 침지시켜서 에바코어 내 fin 들에 골고루 코팅이 될 수 있도록 하는 것이 좋다. 상기 코팅은 1회 내지 수회에 걸쳐 수행될 수 있다.
상기 무취 미생물의 배양액은 O.D.(optical density) 값이 0.3 내지 0.9인 미생물 배양액을 이용하는 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 0.4 내지 0.8의 값이 좋다.
O.D. 값이 0.3 내지 0.9인 미생물 배양액을 이용할 경우 부착될 수 있는 미생물의 농도는 104cfu/g내지 108cfu/g이며, O.D. 값이 0.4 내지 0.8인 미생물 배양액을 이용할 경우 부착될 수 있는 미생물의 농도는 105cfu/g내지 107cfu/g이다. 실제 중고차에 포함된 에바코어에 존재하는 미생물의 농도가 106cfu/g정도임을 고려할 때, O.D. 값이 0.4 내지 0.8인 미생물 배양액을 이용하여, 105cfu/g내지 107cfu/g의 농도로 미생물을 부착시키는 것이 실차 적용 측면에서 가장 바람직하다.
상기 방식으로 코팅된 무취 미생물은 에바코어 표면에 균일하게 분포 및 서식하여 장기간(30일 이상) 안정화된 바이오필름을 형성할 수 있다(실시예 9).
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 냄새 방지용 조성물을 에바코어에 코팅하는 단계를 포함하는 공조장치 냄새 방지방법을 제공한다.
따라서, 본 발명의 무취 미생물 또는 이들의 조합을 포함하는 냄새 방지용 조성물로 코팅을 하여 바이오필름을 형성시킬 경우 악취 유발 가능성이 있는 외부 미생물의 유입 및 서식을 유의적으로 차단하여, 공조장치의 냄새를 효과적으로 방지할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 냄새 방지용 조성물을 에바코어에 코팅하는 단계를 포함하는 공조장치 냄새 확인방법을 제공한다.
상기 냄새 방지용 조성물에 포함된 미생물이 실제 냄새를 발생하는 지 여부는 이들 미생물이 먹이로 하여 대사하는 영양 공급원의 성분에 따라 달라질 수도 있는 바, 상기 미생물이 적용되는 실 산업에서의 영양 공급원을 투여 시에도 냄새가 발생되지 않는 것이 중요할 수 있다.
공조장치의 경우 미생물들은 공기 중에 존재하는 실내 및 실외의 다양한 물질들을 영양분으로 대사하며, 실내 및 실외의 공기 오염물질이나 배기가스 성분 (휘발유, 경유, LPG 등의 석유류) 들이 이들 미생물의 영양 공급원이 되는 바, 이들 영양 공급원을 상기 미생물이 코팅된 에바코어에 투입하여 실제 산업에 적용 시 공조장치의 냄새 발생 여부를 미리 확인할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 공조장치 냄새 방지를 위한 에바코어 코팅 용도의 미생물인 카울로박터비브리오이데스 ( Caulobacter vibrioides ) HKMC-14(기탁번호:KCCM 11685P), 브라디리조비움디아조에피션스 ( Bradyrhizobium diazoefficiens ) HKMC-15(기탁번호: KCCM 11686P). 브라디리조비움다퀸젠스 (Bradyrhizobium daqingense ) HKMC-16(기탁번호: KCCM 11687P), 및 메틸로박테리움브라키아툼 (Methylobacterium brachiatum) HKMC-17(기탁번호: KCCM 11688P)을 제공한다.
상기 미생물은 단독으로 또는 조합하여 공조장치 냄새 방지를 위한 에바코어 코팅 용도로 사용할 수 있다.
본 발명은 카울로박터비브리오이데스(Caulobacter vibrioides), 브라디리조비움 디아조에피션스(Bradyrhizobium diazoefficiens), 브라디리조비움 다퀸젠스 (Bradyrhizobium daqingense), 및메틸로박테리움브라키아툼 (Methylobacterium brachiatum )로이루어진군에서선택되는 1종 이상의 무취 미생물 또는 이의 배양액을 포함하는 냄새 방지용 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 냄새 방지용 조성물이 코팅된 에바코어 및 이의 제조방법을 제공한다. 추가적으로, 본 발명은 상기 냄새 방지용 조성물을 에바코어에 코팅하는 단계를 포함하는 냄새 방지방법을 제공한다.
아울러, 본 발명의 냄새 방지용 조성물로 악취 유발 미생물이 서식 가능한 대상에 코팅을 하여 바이오필름을 형성시킬 경우, 악취 유발 가능성이 있는 외부 미생물의 유입 및 서식을 유의적으로 차단하여 냄새를 효과적으로 방지할 수 있다.
도 1은 알루미늄 핀을 멸균시키고 영양 배지에 dipping하고 이후 무취 미생물을 접종시키기 위한 패트리디쉬를 나타낸다.
도 2는 택시분리 미생물의 30일 생존평가 조합(실시예 9)의 colony 색상별 개체수를 나타낸다.
도 3은 택시분리 미생물의 30일 생존평가 조합(실시예 9)의 REP-PCR에 따른 균주 비율을 나타낸다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1 : 악취 냄새 장거리 주행 택시 확보
본 발명자는 악취가 나는 장거리 주행 택시 5대(표 1)를 확보하여 각각 차종 A 내지 차종 E에 장착되어 있는 에바코어를 떼어내어 에바코어 시편을 샘플링하고자 하였다.
NO. 장거리 차량 주행 거리(KM)
1 차종A 753,300
2 차종B 760,000
3 차종C 770,000
4 차종D 857600
5 차종E 482800
실시예 2 : 에바코어 시편 샘플링
상기 악취 장거리 주행 택시 A 내지 E로부터 확보한 에바코어로부터 에바코어 sample을 사용하기 전까지 4℃에서 냉장 보관되었으며, polyethylene bag으로 밀봉하여 보관하였다. 미생물을 분리 배양하기 위해 각각의 에바코어에서 전면부 및 후면부를 포함한 임의의 부위에서 fin 시료를 멸균된 롱 노즈 플라이어를 사용하여 각 5 g씩 채취한 후 혼합하여 사용하였다.
실시예 3 : 에바코어로부터 미생물의 탈리 과정
하기 과정을 통해 에바코어로부터 미생물의 탈리 절차 및 방법에 대하여 서술하였다.
① 에바코어에서 추출한 시료를 섞어 mixer에 넣는다.
② 멸균된 1× Phosphate buffed saline(PBS)를 200 ml mixer에 넣는다.
③ 혼합된 시료와 PBS를 30초간 mixing 한다.
④ mixer를 ice에 1분간 둔다.
⑤ ③-④ step을 2회 추가 반복한다.
⑥ 현탁액을 4℃에서 3분간 13000 rpm으로 centrifuge한다.
⑦ 상등액만을 취해서 새 tube에 옮겨 담는다.
⑧ 멸균된 면봉을 상등액에 적셔 샘플을 채취한 에바코어의 표면을 수회 닦아낸다.
⑨ 닦아낸 면봉은 상등액에 head만을 넣고 votexing 한다.
⑩ ⑥번 step에서 획득한 침전물과 ⑨번 혼합물을 섞어 접종원액으로 사용한다.
상기 ① 내지 ⑩의 과정을 차종 A 내지 차종 E에 장착되어 있는 에바코어에 대하여 각각 물리적 탈리를 시행하여 미생물을 분리하였다.
실시예 4 : 미생물의 분리 배양
에어컨의 세균의 분리는 일반적으로 일반세균이라 하는 호기성 종속영양 세균을 종속영양 평판 배양을 통하여 분리한다. 일반세균의 분리에 사용하는 복합영양배지는 PTYG agar medium, R2A agar medium 2가지를 사용한다. PTYG agar medium은 Peptone 0.25 g (Difco), Triptone 0.25 g (Difco), Yeast extract 0.5 g (Difco), Glucose 0.5 g (Difco), MgSO430mg(Sigma),CaCl23mg(Sigma),Bactoagar15g(Difco)을 증류수 980 ml에 넣고 pH 7.0으로 맞춘 후 121℃에서 15분간 고압멸균 하였다. R2A arar medium은 Yeast extract 0.5 g (Difco), Proteose peptone No.3 0.5 g (Difco), Casamino acids 0.5 g (Difco), Dextrose 0.5 g (Difco), Soluble starch 0.5 g (Difco), Sodium pyruvate 0.3 g (Difco), Dipotassium sulfate 0.3 g (Difco), Magnesium sulfate 0.05 g (Difco), Bacto agar 15 g (Difco)을 증류수 980 ml에 넣고 pH 7.2를 맞춘 뒤 121℃에서 15분간 고압멸균 하였다. 비우점 일반세균의 분리를 위하여 3가지 종류의 항생제를 사용하며 (표 2), 각 항생제는 100 ppm의 농도로 필터멸균 후 배지온도가 50℃ 정도 되었을 때 접종하여 항생제 medium을 제작하였다.
No. 항생제 계열 제조사
1 Kanamycin Aminoglycoside Sigma
2 Ampicillin beta-lactam Sigma
3 Chloramphenicol Chloramphenicol Sigma
실시예 5 : 에바코어 미생물이 배양된 전체 배지에서 우점 균주의 분리 배양
우점 균주를 분리배양하기 위해서는 우선 희석비율과 콜로니 색, 크기, 모양 등 morphology적인 접근을 통하여 여러 가지 우점 균주를 선별하여야 하므로, 하기 절차에 따라 우점 균주를 분리 배양한다.
① 분리배양된 배지에서 박테리아를 분리한다.
② morphology가 다른 여러 가지 세균을 loop를 사용하여 복합배지에 접종 순수 분리한다.
③ 접종된 배지 중 가장 생육이 좋은 배지를 선택하여 계대 배양한다.
실시예 6 : 에바코어 우점 박테리아의 유전적 특성의 분석
REP-PCR 패턴 분석을 통한 핑거프린트(Fingerprints)조사
REP-PCR은 세균 염색체의 구조를 분석하는 분자생물학적 방법으로서 각 세균 균주를 다른 세균과 구별하여 식별할 수 있는 fingerprinting 방법이다. REP-PCR을 수행하기 위해 하기의 각 절차에 따라 유전적 특성을 분석하였다.
(1) Cell lysis 절차
① Lyse-N-Go PCR Reagent (Thermo) 2.5 ㎕를 PCR tube에 담는다.
② 클린벤치에서 콜로니를 피펫으로 따서 위 tube에 넣고 pipetting한다. 이 때 따는 양은 용액이 약간 뿌옇게 될 정도로 되지 않도록 주의한다.
③ Manufacturer의 지시에 따라 PCR machine에서 배양한다.
④ 하기의 표 3에 기재되어 있는 Lysis 프로그램에 의한 사이클을 반복하고, 9 사이클에서 80℃가 되었을 때 끄지 말고 그대로 둔다.
Cycle Temperature(℃) Time(seconds)
1 65 30
2 8 30
3 65 90
4 97 180
5 8 60
6 65 180
7 97 60
8 65 60
9 80 hold
(2) PCR reaction
하기 표 4에 기재되어 있는 PCR 반응에 필요한 성분들을 필요한 양에 맞게 혼합하여 반응 혼합물을 제조하였고 이를 이용하여 표 5에 기재된 바와 같이 예비 변성 단계(pre-denaturation) 94℃에서 7 분, 변성 단계(denaturation) 92℃에서 1분, 냉각 단계(annealing)에서 51.5℃에서 1분, 연장(extension) 단계에서 65℃에서 8분간 변성, 냉각, 연장 과정을 33회 반복하여 PCR 증폭 과정을 수행하였다.
① dNTP (2.5 mM each) 12.5 ㎕
② Gitschier buffer 5.0 ㎕
③ DMSO (100%) 2.5 ㎕
④ Autoclaved 3oD.W. 0.3 ㎕
⑤ BOXA1R primer(50 pmole/㎕) 1.0 ㎕
5'CTACGGCAAGGCGACGCTGACG
⑥ BSA (10㎎/㎖) 0.4 ㎕
⑦ Bacterial DNA 2.5㎕
⑧ Taq polymerase(Roche) (5 U/㎕) 0.8 ㎕
step 1 93℃ 7min
step 2 92℃ 1min
step 3 51.5℃ 1min
step 4 65℃ 8min
step 2,3,4 : additional 33 cycles
step 6 65℃ 16min
step 7 4℃
(3) Gel electrophoresis
각각의 PCR에 의해 증폭된 DNA 단편을 취하여 EtBr을 첨가한 1.2-1.5% agarose gel을 사용하며, 6x dye를 sample과 1:5 비율로 섞어 가능한 많은 양을 loading하였다. 대부분의 PCR product들은 100~1000 bp 사이에 있으므로 100 bp ladder를 함께 loading하여, 가능한 한 천천히 (50 V) bromophenol blue와 xylene cyanol dye의 중간이 전체 gel의 중간까지 가도록 전기 영동한다. gel상의 DNA pattern이 같은 균주는 동일한 균주로 간주한다.
(4) 에어컨 우점 박테리아의 16S rRNA 유전자 분석을 통한 동정
16S rRNA(ribosomal Ribonucleic acid) 유전자는 박테리아의 유전학적 분류 동정을 위해 사용되며, REP-PCR을 통하여 분류된 박테리아의 genus 및 species 수준에서의 동정이 가능하다. 16S rRNA는 다양한 단백질들과 상호작용하여 리보솜(Ribosome)을 구성하는 RNA로서, 그 완전한 서열이나 올리고뉴클레오티드(Oligonucleotide) 목록에 대한 염기서열이 2000 종 이상의 세균에서 밝혀졌기 때문에 16S rRNA의 유전자 유사성에 근거하여 세균을 몇 가지 주요 군으로 나눌 수 있다. 상기 16S rRNA 유전자 염기서열의 변화율이 대부분의 게놈에 있는 다른 유전자 염기서열보다 월등히 적기 때문에 16S rRNA 염기서열 유사도의 정도가 생물간의 계통학적 거리를 반영하는 것으로 인식되고 있다. 상기 16S rRNA 유전자 절편의 염기서열을 분석하여 그 유사도에 따라 미생물을 동정하는 방법은 상술한 지방산 분석 및 탄수화물 자화능 분석법과 함께 미생물, 특히 산업적으로 유용한 미생물을 동정하는데 대표적인 동정방법으로 이용되어 왔다.
<16S rRNA PCR>
PCR condtions (Total 50㎕): DNA와 Taq를 제외한 나머지 용액을 하기 표 6에 기재되어 있는 것과 같이 필요량만큼 혼합하여 위 lysis 용액에 44.5㎕를 가하였다. 이 후 표 7에 기재되어 있는 바와 같이 예비 변성 단계(pre-denaturation) 94℃에서 5분, 변성 단계(denaturation) 94℃에서 1분, 냉각 단계(annealing) 55℃에서 1분, 연장 단계(extension) 72℃에서 1분 30초를 수행하고, 변성, 냉각 및 연장 단계를 29회 수행하여 PCR 증폭 과정을 수행하였다.
Autoclaved 3oD.W. 22㎕
10xbuffer (Roche) 5㎕
dNTP (Roche, 2.5 mM) 5㎕
DMSO 5㎕
BSA (10 mg/ml) 2.5㎕
27mf (20 pmole/㎕) 2.5㎕
1492r (20 pmole/㎕) 2.5㎕
DNA 5㎕
Taq (Roche) 0.5㎕
step 1 94℃ 5min
step 2 94℃ 1min
step 3 55℃ 1min
step 4 72℃ 1min 30sec
Go to step 2 : additional 29 cycles
step 6 72℃ 10min
step 7 4℃ hold
(5) PCR purification
16S-rRNA PCR을 통해 증폭한 산물을 Qiaquick PCR purifcation kit를 이용하여 하기의 절차에 따라 Purification하였다.　
① PCR product의 5배의 PB buffer를 넣는다.
② 혼합된 액을 QIAquick column에 분주한다.
③ DNA를 binding하기 위하여 1분간 centrifuge 한 후 통과된 혼합액을 제거한다.
④ wash를 위하여 750㎕의 PE buffer를 QIAquick column에 넣고 1분간 centrifuge한 뒤 통과된 혼합액을 제거한다.
⑤ 1분간 다시 centrifuge한다.
⑥ QIAquick column 새 tube에 옮긴다.
⑦ DNA를 추출하기 위하여 30㎕의 EB buffer를 넣고 1분간 둔다.
⑧ 1분간 centrifuge하여 EB에 녹은 DNA를 tube에 모이게 한다.
(6) 분리한 각 미생물의 명칭 및 미생물의 특성
<미생물 1>
1. 미생물의 명칭 :HKMC-14
속명: Caulobacter
종명 : vibrioides
기탁번호: KCCM 11685P (2015.04.17)
2. 복원조건
가. 복원제
(1) 조성 : PTYG media (1L 당 Peptone 0.25g, Triptome 0.25g, Yeast extract 0.5g, Glucose 0.5g, MgSO430mg,CaCl23mg)또는 R2A medium.
(2) pH : 7.0
(3) 살균조건 : 121℃에서 20분
나. 온도(℃): 28℃에서 7일간 배양
3. 배지
(1) 조성 : PTYG media (1L 당 Peptone 0.25g, Triptome 0.25g, Yeast extract 0.5g, Glucose 0.5g, MgSO430mg,CaCl23mg)또는 R2A medium.
(2) pH : 7.0
(3) 살균조건 : 121℃에서 20분
4. 배양조건
가. 호기성, 혐기성 : 호기성
나. 온도 : 28℃
다. 진탕,정치(액체,고체) 구분없이 사용가능
5. 보존 조건
온도(℃) : -70 ℃
<미생물 2>
1. 미생물의 명칭 :HKMC-15
속명: Bradyrhizobium
종명 : diazoefficiens
기탁번호: KCCM 11686P (2015.04.17)
2. 복원조건
가. 복원제
(1) 조성 : PTYG media (1L 당 Peptone 0.25g, Triptome 0.25g, Yeast extract 0.5g, Glucose 0.5g, MgSO430mg,CaCl23mg)또는 R2A medium.
(2) pH : 7.0
(3) 살균조건 : 121℃에서 20분
나. 온도(℃): 28℃에서 7일간 배양
3. 배지
(1) 조성 : PTYG media (1L 당 Peptone 0.25g, Triptome 0.25g, Yeast extract 0.5g, Glucose 0.5g, MgSO430mg,CaCl23mg)또는 R2A medium.
(2) pH : 7.0
(3) 살균조건 : 121℃에서 20분
4. 배양조건
가. 호기성, 혐기성 : 호기성
나. 온도 : 28℃
다. 진탕,정치(액체,고체) 구분없이 사용가능
5. 보존 조건
온도(℃) : -70 ℃
<미생물 3>
1. 미생물의 명칭 : HKMC-16
속명: Bradyrhizobium
종명 : daqingense
기탁번호: KCCM 11687P (2015.04.17)
2. 복원조건
가. 복원제
(1) 조성 : PTYG media (1L 당 Peptone 0.25g, Triptome 0.25g, Yeast extract 0.5g, Glucose 0.5g, MgSO430mg,CaCl23mg)또는 R2A medium.
(2) pH : 7.0
(3) 살균조건 : 121℃에서 20분
나. 온도(℃): 28℃에서 7일간 배양
3. 배지
(1) 조성 : PTYG media (1L 당 Peptone 0.25g, Triptome 0.25g, Yeast extract 0.5g, Glucose 0.5g, MgSO430mg,CaCl23mg)또는 R2A medium.
(2) pH : 7.0
(3) 살균조건 : 121℃에서 20분
4. 배양조건
가. 호기성, 혐기성 : 호기성
나. 온도 : 28℃
다. 진탕,정치(액체,고체) 구분없이 사용가능
5. 보존 조건
온도(℃) : -70 ℃
<미생물 4>
1. 미생물의 명칭 : HKMC-17
속명: Methylobacterium
종명 : brachiatum
기탁번호: KCCM 11688P (2015.04.17)
2. 복원조건
가. 복원제
(1) 조성 : PTYG media (1L 당 Peptone 0.25g, Triptome 0.25g, Yeast extract 0.5g, Glucose 0.5g, MgSO430mg,CaCl23mg)또는 R2A medium.
(2) pH : 7.0
(3) 살균조건 : 121℃에서 20분
나. 온도(℃): 28℃에서 7일간 배양
3. 배지
(1) 조성 : PTYG media (1L 당 Peptone 0.25g, Triptome 0.25g, Yeast extract 0.5g, Glucose 0.5g, MgSO430mg,CaCl23mg)또는 R2A medium.
(2) pH : 7.0
(3) 살균조건 : 121℃에서 20분
4. 배양조건
가. 호기성, 혐기성 : 호기성
나. 온도 : 28℃
다. 진탕,정치(액체,고체) 구분없이 사용가능
5. 보존 조건
온도(℃) : -70 ℃
실시예 7 : 분리한 미생물의 알루미늄 핀에서의 관능 평가
(1) 영양배지에서의 배양
상기 실시예 6으로부터 동정한 미생물 중 26종의 관능적 특성분석을 위하여 미생물을 분리한 영양배지에서 7일간 28℃에서 배양한 후 평가를 실시하였다. 하기에 박테리아를 영양배지에서 배양하는 과정을 기술하였다.
① 순수 분리배양된 미생물을 액체 영양 배지에 접종한다.
② 접종된 배지를 28℃ 에서 5-7일간 배양한다.
③ 고체영양배지에 액체배지에서 배양된 균체를 100 ㎕ 취하여 접종한다.
④ 접종한 균체를 spreader를 이용하여 골고루 퍼지게 한다.
⑤ 패트리디쉬를 밀봉하여 28℃ 에서 10일간 배양한다.
(2) 장거리 주행 택시 미생물에서 분리한 우점 미생물 26종 중 알루미늄 핀에서의 관능평가
사각형 크기의 알루미늄 핀을 멸균 처리하였고, 이를 먼지 및 영양 배지에 Dipping 시켰다. 이 후 박테리아를 접종하여 상기 영양배지에서의 단계 ② - ④에 기재된 조건과 동일하게 하여 배양시킨 후 평가를 실시하였고, 이를 하기 표 8 (1차), 및 표 9(2차)에 관능 평가 결과를 기재하였다. 미생물 생장 속도 차이에 따라 1차, 2차로 관능 평가를 행하였다.
-항균제가 처리된 알루미늄 핀: 에바코어의 주재료인 알루미늄위에 항균 코팅까지 한 것으로 양산되는 시중에서 구매가 충분히 가능한 에바코어 완제품의 코팅이다.
No. 종명 패널 1 냄새강도 패널 2 냄새강도 패널 3 냄새강도 무취미생물선정
Control 알루미늄 판 무취 0 무취 0 무취 0
1 Chryseobacterium geocarposphaerae 짠내 3.5 짠내 3 짠내, 구린내 2.9 X
2 Spirosoma panaciterrae 짠내 2 물냄새 1 쇠냄새 2 X
3 Spirosoma linguale 짠내 3 배추, 짠내 2.5 구린내, 짠내 3.5 X
4 Sphingomonas asaccharolytica 비린내 1 물냄새 1 짠내, 구린내 2.3 X
5 Bradyrhizobium diazoefficiens 비린내 1.5 무취 0.5 무취 0 O
6 Methylobacterium brachiatum 무취 0 약한 짠내 1.5 쇠냄새 1.2 O
7 Methylobacterium longum 쉰내 0.5 짠내, 비린내 2.5 알코올, 구린내 3.2 X
8 Bradyrhizobium daqingense 무취 0 물냄새 1 쇠냄새 1 O
9 radyrhizobium liaoningense 플라스틱 1.5 흙냄새 1.5 쇠냄새 1.3 X
10 Methylobacterium radiotolerans 찌린내 2 식초냄새 2 단내 1 X
11 Methylobacterium variabile 약품냄새 2 짠내, 비린내 2 닭장 1.5 X
12 Caulobacter vibrioides 무취 1 무취 0 무취 0 O
No. 종명 패널 1 냄새강도 패널 2 냄새강도 패널 3 냄새강도 패널 4 냄새강도 무취미생물 선정
Ｃontrol 알루미늄 판 무취 0 무취 0 무취 0 무취 0
1 Sphingomonas glacialis 무취 1 무취 0 무취 0 무취 0 O
2 Sphingomonas aquatilis 텁텁 2.5 닭똥느낌 1.5 먼지 1 닭비린내, 짠내 0.5 X
3 Sphingomonas mucosissima 닭비린내 2 계란냄새 1.8 비린내 1.5 닭털 0.6 X
4 Methylobacterium tarhaniae 닭비린내 2.3 약품냄새 2.5 비린내 2.5 닭털 0.6 X
5 Sphingomonas melonis 닭비린내 2.1 약품냄새 2 물냄새, 비린내 2 닭비린내 0.8 X
6 Acidovorax avenae 무취 0.3 쓰레기통 냄새 1.5 거의없음 0.5 배지, 쓴내 1.2 X
7 Acidovorax oryzae 초기 냄새있음 2 계란냄새 2 비린내 1 거위털 1.3 X
8 Sphingomonas ginsenosidimutans 닭비린내 2.6 플라스틱 냄새 2.5 비린내, 오래된 책 2.5 구린내 1.5 X
9 Sphingomonas dokdonensis 배지 2.3 비린내 1.5 비린내 1.5 지린내, 비린내 1.8 X
10 Pelomonas puraquae 변내 3 찌린내 2 썩은 음식물 3.2 찌린내 2.2 X
11 Methylobacterium platani 텁텁, 싸한 냄새 2.5 시큼, 오래된 플라스틱 2.5 시큼, 공장냄새 2.8 시큼 2.5 X
12 Methylobacterium tardum 변내 2.5 찌린내 3 비린내,물냄새 3 쉰내 3 X
13 Spirosoma radiotolerans 배지,닭똥 3 찌린내,쉰내 3 비린내, 젖은수건 3.5 구린내 3.2 X
14 Fibrella aestuarina 변내 3.5 찌린내,쉰내 4 화장실냄새 4 쉰내,구린내 4 X
알루미늄 항균제핀에서 모두 상기 26종의 미생물을 접종하여 배양한 결과 하기와 같이 4 종이 무취인 결과가 나타났다.
NO. 항균제 핀 종 명
1 무취 Bradyrhizobium diazoefficiens
2 무취 Methylobacterium brachiatum
3 무취 Bradyrhizobium daqingense
4 무취 Caulobacter vibrioides
본 발명에서 '무취'로 평가된 것은, "일정 기준으로 선정된 사람들의 후각으로 아무것도 감지하지 못하는 상태"를 의미한다.
냄새 평가와 관련해서는 현행 법규정에 따라 인간의 후각을 이용한 관능평가 방식으로 평가를 하게 되어 있다. 후각으로 평가하는 것 이외의 냄새 평가는 전 세계적으로　존재하지 아니하는 상태이다. 상술한 실시예에서도 나타나듯이 '무취'의 기준은 관능평가 방법에 의해 인간이 후각으로 느끼는 기준에 따라 정해지는 것이다.
이러한 무취 여부의 판단 기준은 악취공정시험방법(고시 제2007-17호, 국립환경과학원)에 기재되어 있다. 악취공정시험방법의 65 페이지 악취판정도에는 '무취'에 대하여 '평상시 후각으로 아무것도 감지하지 못하는 상태'라고 기재되어 있다.
아울러, 냄새를 맡아 평가를 할 수 있는 사람들의 선정기준까지 규정이 되어 있는 악취공정시험방법의 65, 66페이지 내용을 보면 상기 기준은 더욱 명확한 기준임을 알 수 있다.
또한, 일본 악취방지법 제2장 규제 제4조 규제기준의 2 페이지에서 보실 수 있듯이, 등급표에서 0 에 대응되는 부분에 '무취'라고 기재가 되어 있는 것을 알 수 있다.
이와 같이, 관능평가에서 '무취'의 기준은 상기 국내 및 일본의 규정에서도 명확히 규정되어 있듯이 "일정 기준으로 선정된 사람들의 후각으로 아무것도 감지하지 못하는 상태"를 의미하는 것이다.
실시예 8 : 무취 미생물의 최적 부착조건 평가
(1) 무취 미생물의 fin 부착 최적농도 분석
상기 11종의 무취 미생물의 에바코어 코팅을 위하여 2012년 연구결과(우선출원)와 같이 106cfu/g수준으로 접종하기 위한 부착 적정농도를 확인하였다. 농도확인 시험은 공통 균주 중 하나인 Methylobacterium aquaticum을 사용하였으며, 28℃에서 late log phase까지 배양 후 멸균된 0.85% saline으로 wash 후 4℃에서 18시간 배양하였다. 4℃에서 배양 후 O.D.(optical density)를 0.749, 0.588, 0.55, 0.5, 0.45로 적정한 후 2g의 u자형 fin을 담궈 1시간 동안 실온에서 일정 rpm으로 shaking하며 부착하였다. 이렇게 각각의 농도의 미생물이 부착된 fin은 mixer를 통해 탈리 된 후 R2A agar plate에 serial dilution 되어 평판 도말하였다.
이러한 평판 도말 결과, O.D. 수치에 따라서 fin에 부착되는 미생물의 농도가 변화 함을 확인 할 수 있었다. O.D. 0.749의 경우 1.53×108±1.52×107cfu/g fin의 부착 정도를 나타내었으며, O.D. 0.588과 0.55는 각각 4.00×107±1.00×107cfu/g fin,1.03×107±8.50×105cfu/g fin의 부착 정도를 나타내었다. 추가적으로 O.D. 0.5와 O.D 0.45의 경우 6.00×106±7.00×105cfu/g fin,2.53×106±3.51×105cfu/g fin의 부착도를 나타내며 O.D.에 따른 부착 정도는 비례관계를 나타냄을 확인할 수 있었다. 이들 부착농도 중 미생물이 분리된 에바코어가 가지고 있던 106cfu/g수준의 미생물을 코팅하는 O.D.값인 0.5를 사용하여 다른 10종의 무취 미생물을 코팅하였다.
(2) 무취 미생물의 에바코어 및 fin 부착성 확인
상기 fin 부착실험 결과 genus와 상관없이 11종의 무취 미생물은 동일 O.D.에서 동일한 부착 정도는 나타냄을 확인하였다. 따라서, 균주 중 하나인 Methylobacterium aquaticum을 사용하여 fin과 동일한 O.D.의 배양액을 사용하여 에바코어에 부착되는 미생물의 양을 확인하였다.
O.D. 0.5로 적정된 Methylobacterium aquaticum은 에바코어에서 8.95×106±5.51×105cfu/g fin의 부착 정도를 나타내었다. 이와 같이 동일한 배양액을 사용하여 부착한 에바코어의 경우 2.55×106±3.51×105cfu/g fin의 부착 정도를 나타내었다. 이 같은 결과를 통하여 동일한 O.D. 의 배양액을 사용할 경우 같은 수준의 미생물이 부착됨을 확인할 수 있다.
실시예 9 : 4개 조합의 30일 생존평가
하기 조합으로 30일간의 생존평가를 수행하였다. 코팅조합으로 사용된 미생물의 조합번호 및 미생물 리스트는 다음과 같다 (표 11).
조합
1 Methylobacterium aquaticum PR1016A
2 Caulobacter vibrioides TX0632
3 Methylobacterium brachiatum TX0642
4 Bradyrhizobium diazoefficiens TX0618
택시에서 분리된 무취 미생물 조합의 30일간의 단기 영향 평가를 위하여 상기 조합을 구성하였으며, 이 군집에 대하여 30일간의 단기 평가를 수행하였다.
상기 조합의 경우 Methylobacterium aquaticum PR1016A, CaulobactervibrioidesTX0632,MethylobacteriumbrachiatumTX0642,BradyrhizobiumdiazoefficiensTX06184개의 균주로 이루어진 조합으로, 3.99Ⅹ106±2.82Ⅹ106cfu/g fin수준의 총세균이 time 0에서 확인되었으며, 붉은색, 흰색 colony가 각각 3.62Ⅹ106±2.79Ⅹ106cfu/g fin,3.67Ⅹ105±3.06Ⅹ104cfu/g fin수준으로 검출되었다. 30일 경과 후에는 흰색 colony는 검출되지 않았으며, 붉은색 colony가 2.14Ⅹ106±1.25Ⅹ105cfu/g fin수준으로 총세균과 동일하게 검출되었다(도 2).
REP-PCR을 통한 개체수 확인 결과 time 0의 조합은 111개의 대표샘플 중 43개가 Methylobacterium aquaticum PR1016A으로 확인되었으며,CaulobactervibrioidesTX0632는 6개의 샘플, MethylobacteriumbrachiatumTX0642은 52개, BradyrhizobiumdiazoefficiensTX0618은 10개의 비율로 존재함을 확인되었다. 이들 결과에 따르면 Methylobacterium sp. 2종이 전체 조합의 85.6%를 차지함을 확인할 수 있었다(도 3).
30일 경과 후 REP-PCR 패턴의 분석결과 89점의 대표 미생물 중 Methylobacterium aquaticum PR1016A 이 26점, MethylobacteriumbrachiatumTX0642는 63점의 비율로 생존하는 것을 확인하였으며, 이는 Methylobacterium sp. 가 시간의 진행과 상관없이 에바코어 환경에서 우점하며 생존함을 나타낸다. 또한, 외부 미생물의 서식은 확인할 수 없었다.
결론적으로, 장거리 주행 택시에서 분리된 무취 미생물 조합의 30일간의 단기 영향 평가를 위하여 상기 조합을 구성하였으며, MethylobacteriumaquaticumPR1016A와 Methylobacterium brachiatum TX0642의 경우 30일 결과 후 역시 생존하였음을 확인하였다. 이 두 종이 형성한 바이오필름은 냄새가 없는 무취 상태를 유지하고 있었으며, 외부 미생물의 서식 억제를 확인할 수 있었다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
Figure PCTKR2016015473-appb-I000001
Figure PCTKR2016015473-appb-I000002
Figure PCTKR2016015473-appb-I000003
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Figure PCTKR2016015473-appb-I000007
Figure PCTKR2016015473-appb-I000008

Claims (20)

  1. 카울로박터 비브리오이데스(Caulobacter vibrioides), 브라디리조비움 디아조에피션스(Bradyrhizobium diazoefficiens), 브라디리조비움 다퀸젠스 (Bradyrhizobium daqingense), 및 메틸로박테리움브라키아툼(Methylobacterium brachiatum)로이루어진군에서선택되는 1종 이상의 무취 미생물 또는 이의 배양액을 포함하는 냄새 방지용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 공조장치에서 발생하는 냄새를 방지하기 위한 것을 특징으로 하는 냄새 방지용 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 카울로박터비브리오이데스 ( Caulobacter vibrioides )는카울로박터비브리오이데스HKMC-14(기탁번호: KCCM 11685P), 상기 브라디리조비움디아조에피션스 ( Bradyrhizobium diazoefficiens)는브라디리조비움디아조에피션스HKMC-15(기탁번호: KCCM 11686P), 상기 브라디리조비움다퀸젠스 ( Bradyrhizobium daqingense )는브라디리조비움다퀸젠스HKMC-16(기탁번호:KCCM 11687P), 상기 메틸로박테리움브라키아툼 (Methylobacterium brachiatum )은메틸로박테리움브라키아툼HKMC-17(기탁번호: KCCM 11688P) 인 냄새 방지용 조성물.
  4. 제1항의 냄새 방지용 조성물이 코팅된 에바코어(evaporator core).
  5. 제4항에 있어서, 상기 에바코어에는 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 미생물이 104cfu/g내지 108cfu/g의 농도로 부착된 것을 특징으로 하는 에바코어.
  6. 제5항에 있어서, 상기 미생물의 부착은 O.D.(optical density) 값이 0.3 내지 0.9인 미생물 배양액을 이용하여 부착된 것을 특징으로 하는 에바코어.
  7. 제4항에 있어서, 상기 조성물 내 미생물은 에바코어 표면에 바이오필름을 형성하는 것을 특징으로 하는 에바코어.
  8. 제4항의 에바코어를 포함하는 공조장치.
  9. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 조성물을 에바코어에 코팅하는 단계를 포함하는 공조장치 내 냄새를 유발시키지 않는 무취 에바코어 제조방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 코팅하는 단계는 상기 조성물에 포함된 미생물을 104cfu/g내지 108cfu/g의 농도로 에바코어에 부착시키는 과정을 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  11. 제9항에 있어서, 상기 제조방법은 코팅된 조성물 내 미생물을 번식시켜 바이오필름을 형성하는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  12. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 조성물을 에바코어에 코팅하는 단계를 포함하는 공조장치 냄새 방지방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 코팅하는 단계는 상기 조성물에 포함된 미생물을 104cfu/g내지 108cfu/g의 농도로 에바코어에 부착시키는 과정을 포함하는 것을 특징으로 하는 냄새 방지방법.
  14. 제12항에 있어서, 상기 냄새 방지방법은 상기 조성물 내에 포함된 미생물을 번식시켜 바이오필름을 형성하는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 냄새 방지방법.
  15. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 조성물을 에바코어에 코팅하는 단계를 포함하는 공조장치 냄새 확인방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 냄새 확인방법은 상기 코팅된 조성물 내에 포함된 미생물의 영양분이 되는 석유류 또는 공기 오염 물질을 투입하여 냄새가 발생되는 지 여부를 확인하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 냄새 확인 방법.
  17. 제12항의 공조장치 냄새 방지를 위한 에바코어 코팅 용도의 카울로박터비브리오이데스HKMC-14(기탁번호: KCCM 11685P).
  18. 제12항의 공조장치 냄새 방지를 위한 에바코어 코팅 용도의브라디리조비움디아조에피션스 HKMC-15(기탁번호: KCCM 11686P).
  19. 제12항의 공조장치 냄새 방지를 위한 에바코어 코팅 용도의 브라디리조비움다퀸젠스HKMC-16(기탁번호:KCCM 11687P).
  20. 제12항의 공조장치 냄새 방지를 위한 에바코어 코팅 용도의 메틸로박테리움브라키아툼HKMC-17(기탁번호: KCCM 11688P).
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