WO2019117427A1 - 플라보박테리아과 세균 trm1-10 또는 근연 균주를 함유하는 식물 병 방제 또는 생장 촉진용 조성물 - Google Patents

플라보박테리아과 세균 trm1-10 또는 근연 균주를 함유하는 식물 병 방제 또는 생장 촉진용 조성물 Download PDF

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WO2019117427A1
WO2019117427A1 PCT/KR2018/009757 KR2018009757W WO2019117427A1 WO 2019117427 A1 WO2019117427 A1 WO 2019117427A1 KR 2018009757 W KR2018009757 W KR 2018009757W WO 2019117427 A1 WO2019117427 A1 WO 2019117427A1
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trm1
tomato
strain
potato
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PCT/KR2018/009757
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English (en)
French (fr)
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김지현
이선우
곽민정
이지담
이평안
송주연
권순경
Original Assignee
연세대학교 산학협력단
동아대학교 산학협력단
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/20—Bacteria; Substances produced thereby or obtained therefrom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales

Definitions

  • the present invention relates to a plant disease control or plant growth promoting composition
  • a plant disease control or plant growth promoting composition comprising a newly isolated and identified Flavobacterium and a bacterium TRM1-10 ( Flavobacteriaceae bacterium TRM1-10) as an active ingredient.
  • Bacterial wilt one of the representative bacterial botanical bottles, is a disease caused by the green leaves and stems of plants. When leaf blight occurs, young leaves start to wilt in the early days.
  • the entire plant When the disease progresses rapidly according to the onset environment, the entire plant is wilted in a green state in 2-3 days, or if the plant is not worn out, it is brownish in the vascular system and a white streak is found.
  • the onset strain of foot blight, Ralstonia solanacearum is an aerobic bacterium with more than one flagella. Ralstonia Solanaceae rooms survive in soil for more than 4 years and enter plants through their roots.
  • the plants that are infected with Ralstonia Solanacea Room are more than 50 industrial crops, including potatoes, tomatoes, bananas, peanuts, branches, peppers, tobacco, and many other industrial crops. Because it is transmitted to crops, it is spread quickly in large areas in the rainy season, and the damage of crop loss is great.
  • Rootstock is a soil zone affected by the physiological action of plant roots, ranging from a few millimeters (mm) to a few centimeters (cm) from the root surface.
  • plant roots In rhizosphere soil, plant roots absorb carbon dioxide and various organic matter while absorbing moisture, inorganic nutrients, and oxygen.
  • rhizosphere soil is distinguished from non - rhizosphere soil by organic matter content, microorganism and microbial density, soil pH, etc. Microorganisms in the rhizosphere coexist with each other in symbiosis with each other, and Ralstonia solanaceae, an onset strain of foot rot, is also a microorganism of these rhizomes.
  • plant-specific genetic immune system affects plant disease outbreaks, but in addition to the inherent plant defense system, differences in rhizosphere environment that affect plant physiological activity may affect plant disease outbreaks.
  • Biological control using microorganism or microorganism extract instead of using chemical synthetic pesticide can prevent the loss of industrial losses and provide safe crops to consumers because it selectively treats the target disease without affecting the human body. have.
  • the present inventors have sought to provide new strains and compositions that can be used as a preventive against foot wilt disease that has been isolated from crops that have genetic resistance to foot wilt disease.
  • An object of the present invention is to isolate a new strain from the rhizosphere of a crop having genetic resistance to foot rot, and to provide a novel strain having a control effect against foot rot.
  • a strain comprising the 16S rDNA of SEQ ID NO: 1 and having a controlling effect against a plant disease.
  • the strain may be a Bacteroidetes door.
  • the strain may be a Flavobacteriaceae fruit.
  • the botanical bottle is selected from the group consisting of a plant wilt, a tomato bitter disease, a cabbage black disease, a red pepper bacterial spotty disease, a Chinese cabbage disease, a kiwi ulcer disease, a citrus ulcer disease, a peach bacterial peritonitis, a potato scab disease, A rot fungus, a potato broom bottle, a rice sheath blight, a tomato blight, a tomato wilt, a tomato root blight nematode, a rot fungus, a black rot fungus, a black rot fungus, an unloading bottle, One or more selected from the group consisting of cucumber root nematode, bean root nematode, red pepper pluck, lettuce sclerotin, ginseng spotted deciduous bottle, Chinese cabbage rootstock, vesicular disease, tobacco dressing disease, potato brown rot disease and ginseng root rot disease.
  • a fungicidal bacterium having a controlling effect against a plant disease and a bacterium TRM1-10 ( Flavobacteriaceae bacterium TRM1-10; KCTC 18646P).
  • a plant disease controlling composition comprising the strain or a culture thereof as an active ingredient.
  • the botanical bottle is selected from the group consisting of a plant wilt, a tomato bitter disease, a cabbage black disease, a red pepper bacterial spotty disease, a Chinese cabbage disease, a kiwi ulcer disease, a citrus ulcer disease, a peach bacterial peritonitis, a potato scab disease, A rot fungus, a rot fungus, a potato broom disease, a rice sheath blight, a rice blast, a tomato plague, a tomato, a rot fungus, a black rot fungus, an unloading bottle, an incoherent bottle, a scarlet rot disease, a sclerotinia wilt, One or more selected from the group consisting of wilt disease, tomato root nodule, wheat red rust, barley powdery mildew, red pepper anthracnose, pepper pluck, lettuce sclerotinia, ginseng spotted deciduous bottle, cabbage root rot
  • a plant growth promoting composition comprising the strain or a culture thereof as an active ingredient.
  • a method for controlling a plant disease comprising the step of treating the composition.
  • a method for promoting plant growth comprising treating the composition.
  • a method for preparing a plant disease controlling composition comprising culturing the strain.
  • the strain and composition for controlling foot wilt disease can effectively control foot wrinkling.
  • Figure 1 shows the Flavobacteriaceae ( Flavobacteriaceae) isolated from the rhizosphere of Hawaii 7996, a tomato variety resistant to foot rot, bacterium TRM1-10; KCTC 18646P).
  • A Colony grown at 30 °C for 4 days in marine agar medium.
  • B Scanning electron micrographs of Flavobacterium and Bacillus TRM1-10 grown on marine agar medium at 30 °C for 4 days.
  • FIG. 2 shows the results of identification of the 16S rRNA gene sequence 1 of the TRM1-10 strain as a phylogenetic position.
  • FIG. 3 is a graph showing the effect of controlling TRM1-10 strains against foot wilt disease.
  • Disease index of foot blight is 0, no disease symptoms; 1, 1-25% of leaves are wilted; 2, 26 ⁇ 50% of leaves are wilted; 3, 51 ⁇ 75% of leaves are wilted; 4, 76 ⁇ 100% of the leaves were wilted.
  • the experiment for evaluating the prevention of foot blight disease using TRM1-10 strain was repeated three times to display an error bar indicating the error range on the graph.
  • Fig. 4 is a graph showing the plant growth promoting effect of TRM1-10 strain.
  • &quot When an element is referred to as " comprising ", it means that it can include other elements, not excluding other elements unless specifically stated otherwise.
  • nucleic acids are written from left to right, 5 'to 3', respectively, and the amino acid sequence is written from left to right, from amino to carboxyl.
  • a strain comprising the 16S rDNA of SEQ ID NO: 1 and having a controlling effect against a plant disease.
  • the strain promotes resistance to plant diseases and inhibits the growth of microorganisms causing plant diseases, and thus can be usefully used as a microbial preparation for controlling plant diseases.
  • the plant diseases include plant diseases caused by a wide range of phytopathogenic bacteria, and include plant diseases such as foot rot, tomato ulcer disease, cabbage black disease, hot pepper bacterial spot disease, cabbage herpes disease, kiwi ulcer disease, citrus ulcer disease, peach bacterial pericarditis, Potato anthracnose, Scarab disease, Potato anthrax, Scarab disease, Perennial rot, Dry rot, Potato broom disease, Rice sheath blight, Tomato plague, Tomato blossom, Tomato rot, The group consisted of wilt disease, tomato root nematode, cucumber root nematode, soybean root nematode, red pepper pluck, lettuce sclerotin, ginseng spotted deciduous bottle, cabbage rootstock disease, wilt disease, tobacco dressing disease, potato brown rot disease and ginseng root rot disease More than one may be selected, but preferably it can be a foot blight.
  • plant diseases such as foot rot, tomato ulcer disease, cabbage black disease, hot pepper
  • the strain belongs to the family Flavobacteriaceae and can be inhabited in the marine environment and also in the rhizosphere of the crop.
  • a fungicidal bacterium having a controlling effect against a plant disease and a bacterium TRM1-10 ( Flavobacteriaceae bacterium TRM1-10; KCTC 18646P).
  • the Flavobacterium and the bacterium TRM1-10 (hereinafter " TRM1-10 ") were deposited on November 28, 2017 in the Korean Collection for Type Cultures (KCTC) (Accession No .: KCTC 18646P).
  • the Flavobacteriaceae bacterium TRM1-10 (KCTC 18646P) and the Flavobacterium bacterium TRM1-10 are new strains of Bacteroidetes gland, Flavobacterias River and Flavobacteriaceae .
  • the TRM1-10 strain is Gram-negative aerobic and is a bacterium, which does not form spores but performs sliding movement.
  • the size is between 0.3 and 0.5 ⁇ m in diameter and between 3 and 4 ⁇ m in length.
  • the TRM1-10 strain forms convex yellow colonies within 3 days in an oceanic agar medium at 30 ° C, and the diameter of the colonies formed is 0.5-2 mm.
  • the growth temperature range is 4 to 40 ° C, and the optimal growth temperature can be 30 ° C.
  • the optimum growth pH of the strain is 7.0 to 8.0 and the optimal growth NaCl concentration may be 5% (w / v).
  • the strain TRM1-10 is negative for nitrate reduction, H 2 S production, and oxidase activity, and is positive for catalase activity. Flexirubin type pigment was not detected, and enzyme analysis through API ZYM and 20NE was as follows.
  • Enzyme activity Positive ⁇ -galactosidase, phosphatase, ⁇ -galactosidase, ⁇ -glucosidase, esterase ( ⁇ -galactosidase, C4), esterase lipase (C8), leucine arylamidase, N-acetyl- ⁇ , naphthol-AS-BI- Naphtol-AS-BI-phosphohydrolase, and valine arylamidase.
  • Enzyme activity negative a-fucosidase,? -Glucosidase,? -Mannosidase,? -Chymotrypsin, arginine dihydro Arginine dihydrolase,? -Glucosidase,? -Glucuronidase, crystine arylamidase, lipase (C14), protease ), Trypsin, and urease.
  • Carbon sources such as D-cellobiose, D-mannose, D-raffinose, lactose, maltose, melibiose, succinate D-galactose, D-mannitol, D-ribose, L-arabinose, and the like were used. (L-arabinose), and L-rhamnose into carbon sources.
  • the antibiotic susceptibility and resistance of the Flavobacterium and the bacterium TRM1-10 are as follows.
  • Antibiotic susceptibility ampicillin, carbenicillin, lincomycin, novobiocin, rifampicin, and tetracycline.
  • Antibiotic sensitivity ampicillin, carbenicillin, lincomycin, novobiocin, rifampicin, and tetracycline.
  • Antibiotic resistance cephalothin, gentamicin, kanamycin, neomycin, penicillin, polymyxin, streptomycin, and cycloheximide. ).
  • the isoprenoid quinone of the Flavobacterium and the bacterium TRM1-10 is MK-6 (menaquinone-6) and the major fatty acids are iso-C 15: 0 , iso-C 17: 0 3-OH and iso-C 15: 0 G.
  • the polar lipids of the TRM1-10 strain are phosphatidylethanolamine, unidentified aminolipid and undetermined lipid.
  • the strain can be identified by analyzing the 16S rDNA of SEQ ID NO: 1.
  • 16S ribosomal DNA refers to DNA encoding 16S rRNA, and although there is almost no diversity in alleles, diversity among different species appears and is widely used for identification of a living organism. , Or to identify and classify organisms that have never been reported.
  • the 16S rDNA is also interpreted to include nucleotide sequences that exhibit substantial identity to the nucleotide sequences described above.
  • the 16S rRNA gene assay has excellent advantages in identifying phylogenetic relationships among bacteria or in identification of fungi.
  • the present inventors analyzed 16S rDNA to find novel Flavobacterium strains having excellent control activity against foot wilt disease Were identified.
  • the 16S rDNA of the strain can be identified by amplifying the 16S rDNA of the strain through a primer.
  • the primer may be a short nucleic acid sequence including a free 3 'hydroxyl group and form a base pair with a template of the complementary nucleic acid, and a strand copy of the nucleic acid template Can be used as a starting point.
  • the primer can initiate DNA synthesis in the presence of a reagent for polymerization and a different four nucleoside triphosphate at the appropriate buffer solution and temperature and hybridize with the nucleic acid present in the target microorganism to produce a specific gene of the target microorganism Can be used for amplification.
  • the primer may preferably be single-stranded or may be a deoxyribonucleotide.
  • the primers may include naturally occurring dNMPs (i.e., dAMP, dGMP, dCMP and dTMP), modified nucleotides or non-natural nucleotides.
  • the primers may also include ribonucleotides.
  • the primers include, but are not limited to, skeletal modified nucleotides such as peptide nucleic acid (PNA) (M. Egholm et al., Nature, 365: 566-568 (1993)), phosphorothioate DNA, phosphorodithioate DNA, DNA, amide-linked DNA, MMI-linked DNA, 2'-O-methyl RNA, alpha-DNA and methylphosphonate DNA, sugar modified nucleotides such as 2'-O-methyl RNA, 2'-fluoro 2'-O-alkyl DNA, 2'-O-allyl DNA, 2'-O-alkynyl DNA, hexose DNA, pyranosyl RNA and anhydrohexitol DNA, and a base Nucleotides with modifications such as C-5 substituted pyrimidines wherein the substituents are fluoro, bromo, chloro, iodo-, methyl-, ethyl-, vinyl-,
  • the primer may be an extension primer that is annealed to the target nucleic acid to form a sequence complementary to the target nucleic acid by the template-dependent nucleic acid polymerase and extends to a position where the immobilization probe is annealed to anneal the probe Can occupy the site.
  • the extension primer may comprise a hybridization nucleotide sequence complementary to a specific position of the target nucleic acid.
  • " complementary &quot means that under certain annealing or hybridization conditions the primer or probe is sufficiently complementary to hybridize selectively to the target nucleic acid sequence, and is substantially complementary and perfectly complementary ≪ / RTI >
  • the " substantially complementary sequence &quot may include not only a completely matched sequence but also sequences that partially overlap with the sequence to be compared, so long as the sequence can anneal to a specific sequence and serve as a primer.
  • nucleic acid molecule is meant to encompass DNA (gDNA and cDNA) and RNA molecules.
  • the nucleotide which is a basic constituent unit in the nucleic acid molecule, is a natural nucleotide, as well as an analogue in which the sugar or base region is modified. (Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York (1980); Uhlman and Peyman, Chemical Reviews, 90: 543-584 (1990)).
  • the specific sequence may be identified by various methods known in the art. For example, fluorescence nucleic acid hybridization (FISH), direct DNA sequencing, PFGE analysis, Southern blot analysis, (Finkelstein et al., Genomics, 7: 167 (1990)), datablot analysis, denaturation gradient (see, for example, SSCA, Orita et al., PNAS, USA 86: 2776 A method using a gel electrophoresis (DGGE, Wartell et al., Nucl. Acids Res., 18: 2699 (1990)), a protein recognizing a nucleotide mismatch (e.g., E. coli mutS protein) (Modrich, Ann. Rev. Genet., 25: 229-253 (1991)), and allele-specific PCR can be used.
  • FISH fluorescence nucleic acid hybridization
  • direct DNA sequencing PFGE analysis
  • Southern blot analysis (Finkelstein et al., Genomics, 7: 167 (1990
  • Sequence changes can result in differences in base-linkage within the single-stranded molecule, resulting in the formation of bands with different mobility, and the SSCA can detect the band.
  • the above DGGE analysis can detect a sequence showing different mobility from the wild type sequence using a modified gradient gel.
  • a plant disease control composition and a plant growth promoting composition comprising the strain or a culture solution thereof as an active ingredient.
  • the composition may be in the form of a wettable powder or a suspension concentrate.
  • the composition for preventing wilt blight disease may be prepared in the form of a liquid, and an extender may be added to the powder to be used in the form of a powder, or may be formulated into granules, but is not limited thereto.
  • composition may be uniformly diluted with water in sufficient amounts for plant disease control or promoting growth and then sprayed onto the arable land using a suitable spraying device such as a power sprayer.
  • the concentration of the wettable powder or the liquid wettable powder can be adjusted to about 10 5 to 10 10 CFU / mL, preferably about 10 8 CFU / mL so that the effective ingredient can be in a biologically effective range , But is not limited thereto.
  • the composition may comprise an agriculturally acceptable carrier and may contain one or more additives such as fillers, solvents, excipients, surfactants, suspending agents, spreaders, adhesives, , Dispersants, wetting agents, drift reducing agents, auxiliaries, adjuvants or mixtures thereof.
  • additives such as fillers, solvents, excipients, surfactants, suspending agents, spreaders, adhesives, , Dispersants, wetting agents, drift reducing agents, auxiliaries, adjuvants or mixtures thereof.
  • the formulation of the composition is not particularly limited and may be formulated into concentrate, solution, spray, aerosol, immersion baths, dips, emulsions, suspension concentrates, gels, can do.
  • composition may be used alone or in combination with other agricultural preparations, pesticides, insecticides, acaracides, fungicides, fungicides, herbicides, antibiotics, antimicrobials, nematicides, rodenticides Pheromones, attractants, plant growth regulators, plant hormones, insect growth regulators, chemosterilants, and the like), insect growth regulators, , Microbial pest control agents, repellents, viruses, phagostimulents, plant nutrients, plant fertilizers and biological control agents, or they may be used sequentially, but their use is particularly limited It is not.
  • the composition may be a culture obtained by culturing the new strain containing the 16S rDNA of SEQ ID NO: 1 or the Flavobacterium and the bacterium TRM1-10 in an oceanic agar medium and a marine liquid medium at 30 DEG C for 3 days.
  • the composition may be a fresh strain comprising the 16S rDNA of SEQ ID NO: 1, or a suspension of the Flavobacterium and the bacterium TRM1-10 in purified water, wherein the concentration of the strain suspension is 2 x 10 6 to 2 x 10 8 CFU / Soil can be g.
  • a plant disease control method comprising the step of treating the plant disease control composition.
  • the composition for controlling plant disease can be treated by mixing with the plant soil of the crop to be treated, and the liquid composition can be injected onto the soil of the crop to be treated, or the soil mixed with the composition by separating the crop from the pollen
  • the method of use is not particularly limited.
  • the amount of the plant disease controlling composition varies depending on the target disease, the target crop, the application method, the occurrence tendency, the degree of damage, the environmental condition, the formulations to be used, and the like.
  • a method for producing a plant disease controlling composition comprising culturing the strain.
  • the strains can be cultured by well-known methods in the art, and the cultured strains can be used for the preparation of compositions for controlling plant diseases.
  • Tomato varieties grown in the greenhouse of Dong - A University Test Package (N 35.239 °, E 128.978 °) were used to select strains for control of foot blight disease which can be used as a microbial agent to enhance resistance to foot rot.
  • Hawaii 7996 tomato varieties are tomato varieties resistant to foot rot, and were cultivated from October 14, 2011 to November 17, 2011.
  • the cultivated soil conditions of tomato varieties are as follows.
  • the strain TRM1-10 was isolated from the rhizosphere soil of the Hawaii 7996 tomato variety. Isolated TRM1-10 strains were cultured in marine agar medium and marine liquid medium at 30 °C and stored in 15% glycerol suspension at -80 °C for long term preservation.
  • TRM1-10 strains isolated from rhizosphere soil of tomato varieties of Hawaii 7996 were analyzed.
  • Gram staining kit (YD Diagnostics Inc., Korea) was used for Gram stain of TRM1-10 strain and morphology and motility of TRM1-10 strain were observed using optical microscope (Carl Zeiss, Axio Lab.A1).
  • TRM1-10 strains at temperatures ranging from 4 to 40 ⁇ ⁇ was observed in marine agar medium for 7 days.
  • TRM1-10 strain in the range of 2 to 10% NaCl and in the pH range of 4.5 to 9 was observed for 7 days in a marine liquid medium at 30 DEG C temperature condition.
  • the anaerobic growth test of TRM1-10 strain was carried out in an anaerobic chamber for 10 days in an oceanic agar medium at 25 ° C.
  • Enzyme activity of catalase and oxidase of TRM1-10 strain was tested using 3% H 2 O 2 and oxidase reagent (Becton, Dickinson and Company, USA).
  • API 20NE and API ZYM were used to investigate other enzyme activities and assimilation of TRM1-10 strains.
  • the starch, xanthine and hypoxanthine hydrolysis tests of strain TRM1-10 were carried out on marine agar medium containing 0.2% starch, 0.4% xanthine and 0.4% hyperxanthin.
  • the L-tyrosine hydrolysis test of the strain TRM1-10 was carried out for 7 days in a medium (0.5% peptone, 0.3% beef extract, 0.5% tyrosine and 2% NaCl) at 30 ° C.
  • Antimicrobial susceptibility testing of TRM1-10 strains was performed on marine agar medium in an antibiotic susceptibility test disc (Oxoid, Thermo Fisher Scientific Inc., USA): ampicillin (10 ⁇ g / disc), carbenicillin 100 ⁇ g / disc), cephalothin (30 ⁇ g / disc), chloramphenicol (50 ⁇ g / disc), gentamicin (30 ⁇ g / disc), kanamycin (Nemocin, 30 ⁇ g / disc), novobiocin (5 ⁇ g / disc), penicillin (10 ⁇ g / disc), polymyxin (300 ⁇ g / disc), rifampicin (5 ⁇ g / disc), streptomycin (25 ⁇ g / disc), sulphamethoxazole (25 ⁇ g / disc), tetracycline Cycloheximide (100 ⁇ g / mL).
  • Mariniflexile species were obtained from KCTC, and all strains were cultured in 30 °C oceanic agar medium and marine liquid medium.
  • strains TRM1-10 and Mariniflexile soesokkakense RSSK-9 were cultured in 30 ° C agar agar for 3 days.
  • Fatty acids were extracted according to Miller's method and identified by gas chromatography (Agilent 6890 gas chromatograph, KCCM, South Korea).
  • Polar lipids were extracted according to Miller's method and analyzed by 2-D thin-film chromatography (KCCM, South Korea).
  • Isoprenoid quinine was extracted with chloroform-methanol (2: 1, v / v) and identified by high performance liquid chromatography (KCCM, South Korea).
  • the TRM1-10 strain was a gram-negative aerobic bacterium and formed yellow colony 0.5-2 mm in size on marine agar medium for 3 days (FIG. 1A).
  • TRM1-10 The physiological and biochemical classification characteristics of TRM1-10 are shown in Table 1 below in comparison with M. soesokkakense RSSK-9.
  • 16S rRNA gene was amplified with the primer set of Table 2 for molecular biology identification. PCR conditions were annealing 55 ° C, 30 sec; extension at 72 ° C for 1.5 minutes and 30 cycles.
  • the amplified 16S rRNA gene sequence was analyzed by Sanger sequencing and identified on EzTaxon web server.
  • TRM1-10 DNA was extracted using Wizard Genomic DNA Purification Kit (Promega, USA) and analyzed using the PacBio RS II system of Illumina platforms (DNA Link, Inc., South Korea) The total length of 16S rRNA of TRM1-10 strain was 1,510 nt, and the similarity of nucleotide sequence with M. soesokkakense RSSK-9 was the highest (96.94%).
  • TRM1-10 strain can be classified as a new genus with Flavobacteriaceae . Therefore, the inventors of the present invention have found that TRM1-10 strain can be classified into Flavobacteriaceae bacterium gene. nov. sp. nov.
  • Tomato Moneymaker a susceptible crop of foot blight, was used to evaluate the efficacy of TRM1-10 for control of foot wilt disease.
  • the surface-sterilized tomato seeds were germinated for one week in sterilized water and cultivated for 2 weeks in a pot containing soil (Punong Co., Ltd, Korea) used in a commercial horticultural facility sterilized twice at 40C for 12 minutes .
  • the crops used in the experiment were cultivated in a culture room controlled at 28 °C temperature condition for 14 hours under light condition and 10 hours under dark condition.
  • the strain TRM1-10 was cultured in a marine agar culture medium at 30 ° C for 4 days, and the suspension was prepared with sterilized water and treated in the pot-grown pot.
  • the suspension of the strain was treated with various dilution waters and mixed into the soil, adjusted to 2 ⁇ 10 6 CFU / soil g, 2 ⁇ 10 7 CFU / soil g and 2 ⁇ 10 8 CFU / soil g per final soil.
  • Tomato crops without strain suspension were used as a negative control, and all experiments were repeated 3 times with 10 tomatoes each.
  • TRM1-10 The effects of TRM1-10 on the growth of tomato plants were investigated using natural farmland soil (Dae - dong University Donghae University Farm, Gimhae City, Gyeongsangnam - do).
  • the seeds were then harvested, thoroughly washed 5 times with sterile water, and dried to prepare sterile seeds.
  • the soil was cultivated by mixing natural farmland and Calcined clay (washed in tap water and sterilized for 2 minutes at 121 ° C for 40 minutes) in a volume ratio of 1: 1.
  • the sterilized tomato seeds were grown in sterilized filter paper (Advantec; Toyo Roshi Co., Ltd., Tokyo, Japan) for 7 days at 32 ° C for 14 hours and 28 ° C for 10 hours.
  • Tomato seedlings germinated were divided into 60g portions per pot of farmland soil prepared on the 7th day after denture.
  • the sterilized water or TRM1-10 suspension per pot was treated to control the number of bacteria per gram of soil to 10 7 CFU.
  • the tomato plants were grown at 28 ° C for 14 hours and 28 ° C for 10 hours.
  • the tomato plants were firstly quantified and fresh weight of the TRM1-10 strains was measured.
  • SEQ ID NO: 1 Flavobacterium and bacteria 16S rDNA

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Abstract

본 발명은 서열번호 1의 16S rDNA를 포함하고, 풋마름병을 비롯한 식물병에 대한 방제 효과 또는 식물 생장 촉진 효과를 가지는 플라보박테리아(Flavobacteriaceae) 과 균주가 제공된다.

Description

플라보박테리아과 세균 TRM1-10 또는 근연 균주를 함유하는 식물 병 방제 또는 생장 촉진용 조성물
본 발명은 새롭게 분리, 동정된 플라보박테리아과 세균 TRM1-10(Flavobacteriaceae bacterium TRM1-10)을 유효성분으로 포함하는 식물병 방제 또는 식물 생장 촉진용 조성물에 관한 것이다.
대표적인 세균성 식물병 중 하나인 풋마름병(bacterial wilt)은 식물체의 잎과 줄기가 녹색인 상태에서 시드는 병이다. 풋마름병이 발병되면 초기에는 어린 잎이 시들기 시작한다.
발병되는 환경에 따라 병이 급속히 진행되면 2 내지 3일만에 식물체 전체가 푸른 상태로 시들어 죽거나, 외형적으로 시들지 않아도 유관속에 갈색으로 썩고 흰색의 발병 균주 덩이가 발견된다.
풋마름병의 발병 균주인 랄스토니아 솔라나세아룸(Ralstonia solanacearum)은 1개 이상의 편모를 가진 호기성 세균이다. 랄스토니아 솔라나세아룸은 토양에서 4년 이상 생존하며, 뿌리를 통해 식물체로 침입한다.
랄스토니아 솔라나세아룸에 감염되는 식물은 감자, 토마토, 바나나, 땅콩, 가지, 고추, 담배 등 50과 450종 이상의 많은 산업용 작물이며, 방제가 힘들고 한 개체가 발병하면 토양을 통해 근처에 있는 작물에 전염되기 때문에 장마철에는 빠르게 넓은 지역에 전염되어서 작물 손실의 피해가 크다.
풋마름병의 발병 균주에 대한 각종 방제 방법이 개발되었으며, 발병 균주를 직접적으로 제거하는 화학 합성농약을 사용하는 방제 방법이 가장 널리 사용되고 있다. 그러나 화학 합성농약은 인체에 유해한 물질을 다량 함유하며, 상기 유해 물질은 토양 및 작물체 내에 잔류하는 문제가 있다.
따라서 인체에 해롭지 않으면서 효과적으로 풋마름병을 방제하는 방법에 대한 연구가 진행되고 있다.
한편, 식물은 근권(rhizosphere)에 존재하는 다양한 미생물과 공생관계를 이룬다. 근권은 식물 뿌리의 생리작용에 영향을 받는 토양권역으로 뿌리 표면으로부터 수 밀리미터(mm) 내지 수 센티미터(cm) 범위에 해당된다.
근권 토양에서 식물 뿌리는 수분과 무기양분, 산소를 흡수하면서 탄산가스나 다양한 형태의 유기물을 분비한다.
그에 따라 근권 토양은 유기물함량, 미생물상 및 미생물 밀도, 토양 pH 등이 비근권 토양과 구별되며, 이러한 근권의 환경 조건은 식물마다 차이가 있다. 근권에 있는 미생물을 식물 내부에 공생하면서 서로 상호작용 하는데, 풋마름병의 발병균주인 랄스토니아 솔라나세아룸도 이러한 근권 미생물이다.
그러나 같은 종류의 작물이라고 할지라도 품종에 따라서 같은 식물병 발병 균주에 감염되어도 식물병이 발병하는 작물과 그렇지 않은 작물이 존재한다. 일반적으로 식물 고유의 유전적 면역체계가 식물병 발병에 영향을 주지만, 선천적인 식물체의 방어 체계 이외에도 식물 생리활성에 영향을 주는 근권 환경의 차이가 식물병 발병에 영향을 줄 수 있다.
최근에는 식물병에 내성이 생긴 작물의 근권에서 분리된 미생물 균주를 생물학적 방제로 사용 가능한지에 대한 연구가 증대되고 있다.
균주를 이용한 생물학적 방제는 화학합성 농약을 사용하는 대신 미생물 또는 미생물의 추출물을 이용하기 때문에 인체에 영향을 미치지 않으면서 대상 병을 선택적으로 방제하기 때문에 산업적 손실을 줄이면서 소비자에게 안전한 작물을 제공할 수 있다.
따라서 본 발명자들은 풋마름병에 유전적 저항성이 있는 작물에서 분리된 풋마름병에 대한 방제로 이용 가능한 새로운 균주 및 조성물을 제공하고자 하였다.
본 발명의 목적은 풋마름병에 유전적 저항성이 있는 작물의 근권에서 새로운 균주를 분리하고, 이를 동정하여 풋마름병에 방제 효과가 있는 신규한 균주를 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 상기 풋마름병에 방제 효과가 있는 균주 또는 그의 배양액을 유효성분으로 포함하는 풋마름병 방제용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 상기 풋마름병 방제용 조성물을 이용한 풋마름병 방제 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 측면에 따르면, 서열번호 1의 16S rDNA를 포함하고, 식물병에 대한 방제 효과를 가지는 균주가 제공된다.
일 실시예에 있어서, 상기 균주는 박테로이데테스(Bacteroidetes) 문일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 균주는 플라보박테리아(Flavobacteriaceae) 과일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 식물병은 풋마름병, 토마토 궤양병, 양배추 흑부병, 고추 세균성점무늬병, 배추 무름병, 키위 궤양병, 감귤 궤양병, 복숭아 세균성 구멍병, 감자 더뎅이병, 감자 무름병, 감자역병, 검은무늬썩음병, 흑각병, 하역병, 절편부패병, 홍색부패병, 균핵병, 시들음병, 감자탄저병, 더뎅이병, 둘레썩음병, 마른썩음병, 감자빗자루병, 벼 잎집무늬마름병, 토마토 역병, 토마토 시들음병, 토마토 뿌리혹선충병, 오이 뿌리혹선충병, 콩 뿌리혹선충병, 고추 역병, 상추 균핵병, 인삼 점무늬낙엽병, 배추 뿌리혹병, 무 시들음병, 담배 입고병, 감자 갈색썩음병 및 인삼 뿌리썩음병으로 이루어진 군에서 하나 이상 선택될 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 식물병에 대한 방제 효과를 가지는 플라보박테리아과 세균 TRM1-10(Flavobacteriaceae bacterium TRM1-10; KCTC 18646P) 균주가 제공된다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기 균주 또는 그의 배양액을 유효성분으로 포함하는 식물병 방제용 조성물이 제공된다.
일 실시예에 있어서, 상기 식물병은 풋마름병, 토마토 궤양병, 양배추 흑부병, 고추 세균성점무늬병, 배추 무름병, 키위 궤양병, 감귤 궤양병, 복숭아 세균성 구멍병, 감자 더뎅이병, 감자 무름병, 감자역병, 검은무늬썩음병, 흑각병, 하역병, 절편부패병, 홍색부패병, 균핵병, 시들음병, 감자탄저병, 잿빛곰팡이병, 더뎅이병, 둘레썩음병, 마른썩음병, 감자빗자루병, 벼 잎집무늬마름병, 벼 도열병, 토마토 역병, 토마토 시들음병, 토마토 뿌리혹선충병, 밀 붉은녹병, 보리 흰가루병, 고추 탄저병, 고추 역병, 상추 균핵병, 인삼 점무늬낙엽병, 배추 뿌리혹병, 무 시들음병 및 오이 뿌리혹선충병으로 이루어진 군에서 하나 이상 선택될 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기 균주 또는 그의 배양액을 유효성분으로 포함하는 식물 생장 촉진용 조성물이 제공된다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기 조성물을 처리하는 단계;를 포함하는 식물병 방제 방법이 제공된다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기 조성물을 처리하는 단계;를 포함하는 식물 생장 촉진방법이 제공된다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기 균주를 배양하는 단계;를 포함하는 식물병 방제용 조성물의 제조방법이 제공된다.
본 발명에 따르면, 상기 풋마름병 방제용 균주 및 조성물은 효과적으로 풋마름병을 방제할 수 있다.
본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정한 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
도 1은 풋마름병에 저항성이 있는 토마토 품종인 Hawaii 7996의 근권에서 분리된 플라보박테리아과 세균 TRM1-10(Flavobacteriaceae bacterium TRM1-10; KCTC 18646P) 균주의 형태학이다. (A) 해양 한천 배지에서 30℃ 4일간 자란 콜로니의 모습. (B) 해양 한천 배지에서 30℃ 4일간 자란 플라보박테리아과 세균 TRM1-10 균주의 주사 전자현미경 사진.
도 2는 TRM1-10 균주의 16S rRNA 유전자 염기서열 1을 분석하여 동정한 결과를 계통학적 위치로 나타낸 것이다.
도 3은 TRM1-10 균주를 이용한 풋마름병 방제 효과를 나타낸 그래프이다. 풋마름병의 질병 지수는 0, 질병 증상 없음; 1, 잎의 1-25%는 시들음; 2, 잎의 26~50%는 시들음; 3, 잎의 51~75%는 시들음; 4, 잎의 76~100%는 시들음;을 기준으로 평가하였다. 상기 TRM1-10 균주를 이용한 풋마름병 방제 평가 실험은 3회 반복하여 오차 범위를 표시하는 오차 막대를 그래프 상에 표시하였다.
도 4는 TRM1-10 균주의 식물 생육 촉진효과를 나타낸 그래프이다.
이하에서는 첨부한 도면을 참조하여 본 발명을 설명하기로 한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며, 따라서 여기에서 설명하는 실시예로 한정되는 것은 아니다. 그리고 도면에서 본 발명을 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략하였으며, 명세서 전체를 통하여 유사한 부분에 대해서는 유사한 도면 부호를 붙였다.
어떤 부분이 어떤 구성요소를 “포함”한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 구비할 수 있다는 것을 의미한다.
달리 정의되지 않는 한, 분자 생물학, 미생물학, 단백질 정제, 단백질 공학, 및 DNA 서열 분석 및 당업자의 능력 범위 안에서 재조합 DNA 분야에서 흔히 사용되는 통상적인 기술에 의해 수행될 수 있다. 상기 기술들은 당 업자에게 알려져 있고, 많은 표준화된 교재 및 참고서에 기술되어 있다.
본 명세서에 달리 정의되어 있지 않으면, 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 당 업계에 통상의 기술자가 통상적으로 이해하는 바와 같은 의미를 가진다.
본 명세서에 포함되는 용어를 포함하는 다양한 과학적 사전이 잘 알려져 있고, 당 업계에서 이용 가능하다. 본 명세서에 설명된 것과 유사 또는 등가인 임의의 방법 및 물질이 본원의 실행 또는 시험에 사용되는 것으로 발견되나, 몇몇 방법 및 물질이 설명되어 있다. 당 업자가 사용하는 맥락에 따라, 다양하게 사용될 수 있기 때문에, 특정 방법학, 프로토콜 및 시약으로 본 발명이 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 단수형은 문맥이 명확하게 달리 지시하지 않으면 복수의 대상을 포함한다. 또한, 달리 지시된 바가 없으면, 핵산은 각각 왼쪽에서 오른쪽, 5'에서 3' 방향으로 쓰여지고, 아미노산 서열은 왼쪽에서 오른쪽, 아미노에서 카르복실 방향으로 쓰여진다.
이하, 첨부된 도면을 참고하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
본 발명의 일 측면에 따르면, 서열번호 1의 16S rDNA를 포함하고, 식물병에 대한 방제 효과를 가지는 균주가 제공된다.
상기 균주는 식물병에 대한 저항성을 증진시키고, 식물병을 유발하는 미생물의 생장을 억제하므로 식물병 방제를 위한 미생물 제제로 유용하게 사용될 수 있다.
상기 식물병은 광범위한 식물 병원성 세균에 의한 식물병해를 포함하는 것으로, 풋마름병, 토마토 궤양병, 양배추 흑부병, 고추 세균성점무늬병, 배추 무름병, 키위 궤양병, 감귤 궤양병, 복숭아 세균성 구멍병, 감자 더뎅이병, 감자 무름병, 감자역병, 검은무늬썩음병, 흑각병, 하역병, 절편부패병, 홍색부패병, 균핵병, 시들음병, 감자탄저병, 더뎅이병, 둘레썩음병, 마른썩음병, 감자빗자루병, 벼 잎집무늬마름병, 토마토 역병, 토마토 시들음병, 토마토 뿌리혹선충병, 오이 뿌리혹선충병, 콩 뿌리혹선충병, 고추 역병, 상추 균핵병, 인삼 점무늬낙엽병, 배추 뿌리혹병, 무 시들음병, 담배 입고병, 감자 갈색썩음병 및 인삼 뿌리썩음병으로 이루어진 군에서 하나 이상 선택될 수 있으나, 바람직하게는 풋마름병일 수 있다.
상기 풋마름병은 랄스토니아 솔라나세아룸(Ralstonia solanacearum)에 의해 발생할 수 있으며, 예컨대, 풋마름병, 고추 풋마름병, 가지 풋마름병, 감자 풋마름병, 파프리카 풋마름병 또는 땅콩 풋마름병일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 균주는 플라보박테리아(Flavobacteriaceae) 과에 속하며 해양 환경에서 서식할 수 있으며, 작물 근권에서도 서식할 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 식물병에 대한 방제 효과를 가지는 플라보박테리아과 세균 TRM1-10(Flavobacteriaceae bacterium TRM1-10; KCTC 18646P) 균주가 제공된다.
상기 플라보박테리아과 세균 TRM1-10(이하 “TRM1-10”) 균주는 미생물자원센터(Korean Collection for Type Cultures, KCTC)에 2017년 11월 28일자로 기탁되었다(기탁번호: KCTC 18646P).
상기 플라보박테리아과 세균 TRM1-10(Flavobacteriaceae bacterium TRM1-10; KCTC 18646P)는 박테로이데테스(Bacteroidetes) 문, 플라보박테리아(Flavobacteriia) 강, 플라보박테리아(Flavobacteriaceae) 과의 신규 균주이다.
상기 TRM1-10 균주는 그람 음성의 호기성이며, 간균으로, 포자를 형성하지 않고, 활주 운동을 한다. 크기는 0.3 내지 0.5 μm의 직경에 길이는 3 내지 4μm이다.
상기 TRM1-10 균주는 30℃ 온도 조건의 해양 한천 배지에서 3일 이내의 볼록하고 노란 콜로니를 형성하며 형성되는 콜로니의 직경은 0.5-2 mm이다.
혐기성 조건의 해양한천배지에서 10일 동안 발생하지 않으며, 성장 온도 범위는 4 내지 40℃이고, 최적의 성장 온도는 30℃일 수 있다. 상기 균주의 최적의 성장 pH는 7.0 내지 8.0이고 최적의 성장 NaCl 농도는 5%(w/v)일 수 있다.
상기 TRM1-10 균주는 질산염 환원, H2S 생성 및 산화 효소 활성이 음성이고, 카탈라아제 활성이 양성이다. Flexirubin형 안료는 검출되지 않았으며, API ZYM 및 20NE를 통한 효소 분석은 다음과 같다.
효소 활성 양성: α-갈락토시다아제(α-galactosidase), 포스파타아제(phosphatase), β갈락토시다아제(β-galactosidase), β글루코시다아제(β-glucosidase), 에스테라제(esterase (C4)), 에스테라제 리파아제(esterase Lipase (C8)), 류신 아릴아미다아제(leucine arylamidase), N-아세틸-β-글루코사미니다아제(N-acetyl-β), 나프톨-AS-BI-포스포하이드로라아제(naphtol-AS-BI-phosphohydrolase), 및 발린 아릴아미다아제(valine arylamidase).
효소 활성 음성: α-푸코시다아제(α-fucosidase), α-글루코시다아제(α-glucosidase), α-만노시다아제(α-mannosidase), α-키모스립신(α-chymotrypsin), 아르기닌 디하이드로라아제 (arginine dihydrolase), β글루코시다아제(β-glucosidase), β글루쿠로니다아제(β-glucuronidase), 크리스틴 아릴아미다아제(crystine arylamidase), 리파아제(lipase (C14)), 프로테아제(protease), 트립신(trypsin), 및 우레아제(urease).
탄소원으로 D-셀로비오스(D-cellobiose), D-만노스(D-mannose), D-라피노스(D-raffinose), 락토오스(lactose), 말토오스(maltose), 멜리비오스(melibiose), 석신산(succinate), 및 설탕(sucrose)을 이용하였지만, 벤조산염(benzoate), D-갈락토오스(D-galactose), D-마니톨(D-mannitol), D-리보오스(D-ribose), L-아라비노오스(L-arabinose), 및 L-람노오스(L-rhamnose)를 탄소원으로 분해하지 못한다.
상기 플라보박테리아과 세균 TRM1-10의 항생제 감수성 및 내성은 다음과 같다.
항생제 감수성 : 암피실린(ampicillin), 카르베니실린(carbenicillin), 린코마이신(lincomycin), 노보비오신(novobiocin), 리팜피신(rifampicin), 및 테트라사이클린(tetracycline).
항생제 내성 : 세파로신(cephalothin), 겐타마이신(gentamicin), 카나마이신(kanamycin), 네오마이신(neomycin), 페니실린(penicillin), 폴리믹신(polymyxin), 스트렙토마이신(streptomycin) 및 사이클로헥시미드(cycloheximide).
상기 플라보박테리아과 세균 TRM1-10의 isoprenoid quinone은 MK-6(menaquinone-6)이며, 주요 지방산은 iso-C15:0, iso-C17:0 3-OH 및 iso-C15:0 G이다.
상기 TRM1-10 균주의 극성 지질은 포스파티딜 에탄올 아민(phosphatidylethanolamine), 미확인 아미노 지질 및 미확인 지질이 존재한다.
상기 균주는 서열번호 1의 16S rDNA를 분석함으로써 동정할 수 있다.
상기 “rDNA(16S ribosomal DNA)"는 16S rRNA를 코딩하는 DNA를 의미하며, 동종 간에는 거의 다양성이 나타나지 않지만 타종 간에 다양성이 나타나 생물 동정에 널리 활용된다. 특히 상기 16S rDNA는 배양이 불가능하거나 어려운 생물, 또는 보고된 적 없는 생물의 동정 및 분류에 유용하게 사용된다. 상기 16S rDNA는 상기한 뉴클레오타이드 서열에 대하여 실질적인 동일성을 나타내는 뉴클레오타이드 서열도 포함하는 것으로 해석된다.
상기 16S rRNA 유전자 분석법은 세균간의 계통학적 관계를 밝히는 데에 있어서 혹은 균종을 동정하는 데에 있어서 탁월한 장점을 가지며, 본 발명자는 16S rDNA를 분석함으로써 풋마름병에 대한 우수한 방제 활성을 가지는 신규 플라보박테리아과에 속하는 균주를 동정하였다.
구체적으로, 상기 균주의 16S rDNA를 프라이머(primer)를 통해 증폭시킴으로써 동정할 수 있다.
상기 프라이머(primer)는 자유 3' 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 포함하는 짧은 핵산 서열로 상보적인 핵산의 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 핵산 주형의 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능할 수 있다.
상기 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있으며, 표적 미생물에 존재하는 핵산과 혼성화되어 상기 표적 미생물의 특정 유전자를 증폭하는데 사용될 수 있다.
상기 프라이머는 증폭의 효율을 고려하여 바람직하게는 단쇄일 수 있으며, 디옥시리보뉴클레오타이드(deoxyribonucleotide)일 수 있다.
상기 프라이머는 자연(naturally occurring) dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 변형 뉴클레오타이드 또는 비-자연 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 또한, 상기 프라이머는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다.
상기 프라이머는 골격 변형된 뉴클레오타이드 예컨대, 펩타이드 핵산(PNA)(M. Egholm et al., Nature, 365:566-568(1993)), 포스포로티오에이트 DNA, 포스포로디티오에이트 DNA, 포스포로아미데이트 DNA, 아마이드-연결된 DNA, MMI-연결된 DNA, 2'-O-메틸 RNA, 알파-DNA 및 메틸포스포네이트 DNA, 당 변형된 뉴클레오타이드 예컨대, 2'-O-메틸 RNA, 2'-플루오로 RNA, 2'-아미노 RNA, 2'-O-알킬 DNA, 2'-O-알릴 DNA, 2'-O-알카이닐 DNA, 헥소스 DNA, 피라노실 RNA 및 안히드로헥시톨 DNA, 및 염기 변형을 갖는 뉴클레오타이드 예컨대, C-5 치환된 피리미딘(치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 에티틸-, 프로피닐-, 알카이닐-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜- 포함), C-7 치환기를 갖는 7-데아자퓨린(치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 알카이닐-, 알켄일-, 티아조 릴-, 이미다조릴-, 피리딜-), 이노신 및 디아미노퓨린을 포함할 수 있다.
상기 프라이머는 타겟 핵산에 어닐링 되어 주형-의존성 핵산 중합효소에 의해 타겟 핵산에 상보적인 서열을 형성하는 연장 프라이머(extension primer)일 수 있으며, 고정화 프로브가 어닐링 되어 있는 위치까지 연장되어 프로브가 어닐링 되어 있는 부위를 차지할 수 있다.
상기 연장 프라이머는 타겟 핵산의 특정 위치에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다.
상기 “상보적”은 소정의 어닐링 또는 혼성화 조건하에서 프라이머 또는 프로브가 타겟 핵산 서열에 선택적으로 혼성화할 정도로 충분히 상보적인 것을 의미하며, 실질적으로 상보적(substantially complementary) 및 완전히 상보적(perfectly complementary)인 것을 모두 포함할 수 있다. 상기 “실질적으로 상보적인 서열”은 완전히 일치되는 서열뿐만 아니라, 특정 서열에 어닐링하여 프라이머 역할을 할 수 있는 범위 내에서, 비교 대상의 서열과 부분적으로 불일치되는 서열도 포함할 수 있다.
상기 프라이머의 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화 되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 상기 “핵산 분자”는 DNA(gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 가지며, 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함할 수 있다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).
상기 특정 서열을 규명하는 것은 당 업계에 공지된 다양한 방법을 응용하여 실시될 수 있으며, 예컨대, 특정 서열을 규명하는 방법으로서 형광 핵산 혼성화(FISH), 직접적 DNA 서열결정, PFGE 분석, 서던 블롯 분석, 단일-가닥 컨퍼메이션 분석(SSCA, Orita et al., PNAS, USA 86:2776(1989)), RNase 보호 분석(Finkelstein et al., Genomics, 7:167(1990)), 닷트 블롯 분석, 변성 구배 젤 전기영동(DGGE, Wartell et al., Nucl. Acids Res., 18:2699(1990)), 뉴클레오타이드 미스매치를 인식하는 단백질(예: E. coli의 mutS 단백질)을 이용하는 방법(Modrich, Ann. Rev. Genet., 25:229-253(1991)), 및 대립형-특이 PCR이 사용될 수 있다.
서열 변화가 단일-가닥 분자 내 염기 결합의 차이를 초래하여 이동성이 다른 밴드가 형성될 수 있으며, 상기 SSCA는 상기 밴드를 검출할 수 있다. 상기 DGGE 분석은 변성 구배 젤을 이용하여, 야생형 서열과 상이한 이동성을 나타내는 서열을 검출할 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기 균주 또는 그의 배양액을 유효성분으로 포함하는 식물병 방제용 조성물 및 식물 생장 촉진용 조성물이 제공된다.
상기 조성물은 수화제(wettable powder) 또는 액상 수화제(suspension concentrate) 형태의 제형일 수 있다. 상기 풋마름병 방제용 조성물은 액상 형태로 제조될 수 있으며, 이에 증량제를 첨가하여 가루분말의 형태로 이용하거나 이를 제형화하여 과립화시킬 수도 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 조성물은 식물병 방제 또는 생장 촉진을 위한 충분한 양으로, 물로 균일하게 희석한 후 동력살포기와 같은 적절한 살포장치를 이용하여 경작지에 살포할 수 있다.
상기 수화제 또는 액상 수화제를 물에 희석하는 경우 수화제 또는 액상수화제의 농도는 유효성분이 생물학적으로 유효한 범위가 될 수 있도록 105 내지 1010 CFU/mL, 바람직하게는 108 CFU/mL 내외로 조절할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 조성물은 농업적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있으며, 충전제(fillers), 용매, 부형제, 계면활성제(surfactants), 현탁제(suspending agents), 스프래더(spreaders), 부착제(adhesives), 소포제, 분산제, 습윤제, 드리프트 감소제(drift reducing agents), 보조제(auxiliaries), 보강제(adjuvants) 또는 이의 혼합물을 포함할 수 있다.
상기 조성물의 제형은 특별히 제한되지 않으며, 농축물, 용액, 스프레이, 에어로졸, 침수용(immersion baths), 침지(dips), 에멀젼(emulsions), 현탁 농축액, 겔, 과립(granules) 등의 타입으로 제제화 할 수 있다.
상기 조성물은 단독으로 또는 다른 농업용 제제, 농약(pesticides), 살충제(insecticides), 살응애제(acaracides), 살진균제, 살박테리아제, 제초제, 항생제, 항균제, 살선충제(nematicides), 쥐약(rodenticides), 곤충병원체(entomopathogens), 페로몬(pheromones), 유인제(attractants), 식물성장조절제(plant growth regulators), 식물 호르몬(plant hormones), 곤충성장 조절제(insect growth regulators), 화학불임제(chemosterilants), 미생물 작물보호제(microbial pest control agents), 방충제(repellents), 바이러스, 식자극제(phagostimulents), 식물 영양제, 식물비료 및 생물학적 방제제와 함께 배합하거나, 순차적으로 사용될 수 있으나, 사용 방법이 특별히 제한되는 것은 아니다.
상기 조성물은 상기 서열번호 1의 16S rDNA를 포함하는 신규 균주 또는 플라보박테리아과 세균 TRM1-10 균주를 해양 한천 배지 및 해양 액상 배지에 30℃ 온도 조건에서 3일간 배양한 배양액일 수 있다.
상기 조성물은 상기 서열번호 1의 16S rDNA를 포함하는 신규 균주 또는 플라보박테리아과 세균 TRM1-10 균주를 정제수에 희석한 현탁액일 수 있으며, 상기 균주 현탁액의 농도는 2×106 내지 2×108 CFU/토양 g일 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기 식물병 방제용 조성물을 처리하는 단계를 포함하는 식물병 방제 방법이 제공된다.
상기 식물병 방제용 조성물은 처리하고자 하는 작물의 화분 토양에 혼합하는 형식으로 처리할 수 있으며, 액상의 조성물을 처리하고자 하는 작물의 토양 위에 주사하거나, 작물을 화분에서 분리하여 조성물과 혼합한 토양이 있는 화분에 재배치하는 분갈이 방법으로 사용될 수도 있으나, 사용방법은 특별히 제한되지 않는다.
상기 식물병 방제용 조성물의 사용량은 대상병해, 대상작물, 시용방법, 발생경향, 피해의 정도, 환경조건, 사용하는 제형 등에 따라서 변동하기 때문에, 적절하게 제어할 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기 균주를 배양하는 단계를 포함하는 식물병 방제용 조성물의 제조방법이 제공된다. 상기 균주는 당해 기술분야의 널리 알려진 방법에 의해 배양될 수 있으며, 배양된 균주는 식물병 방제용 조성물의 제조에 사용될 수 있다.
이하, 실시예를 통해 본 발명을 더욱 상세히 기술한다.
실험방법
실험예 1 : 풋마름병 저항성 작물의 근권에서 방제용 균주 분리
풋마름병에 대한 저항성을 증진시켜 미생물 제제로 사용할 수 있는 풋마름병 방제용 균주를 선발하기 위해 동아대학교 시험포장(N 35.239°, E 128.978°)의 그린하우스에서 재배되는 토마토 품종을 사용하였다.
Hawaii 7996 토마토 품종은 풋마름병에 저항성이 있는 토마토 품종이고, 2011년 10월 14일부터 11월 17일까지 재배되었다. 토마토 품종의 재배 토양 조건은 다음과 같다.
pH 7.0; EC 39.50 ds/m; 염분 2.53 %; 유기물 2.62 %; 총 N 0.15 mg/kg; 총 P 1,037.00 mg/kg; P2O2 545.26 mg/kg; Ca 1,688.00 kg/mg; Mg 216.50 mg/kg; K 106.90 mg/kg; Na 289.80 mg/kg; 총 미생물 4.3×107 CFU/g 건조 토양.
상기 Hawaii 7996 토마토 품종의 근권 토양으로부터 TRM1-10 균주를 분리하였다. 분리된 TRM1-10 균주는 30℃ 온도 조건에서 해양 한천 배지 및 해양 액상 배지에 배양되었고, 장기 보존을 위해 -80℃ 온도 조건에서 15% 글리세롤 현탁액에 보관하였다.
실험예 2 : TRM1 -10 균주의 형태학적 분석 및 생화학적 분석
Hawaii 7996 토마토 품종의 근권 토양으로부터 분리된 TRM1-10 균주를 형태학 및 생화학 특성을 분석하였다.
TRM1-10 균주의 그람 염색 시험은 Gram straining kit(YD Diagnostics Inc., Korea)를 이용하였고, 광학 현미경(Carl Zeiss, Axio Lab.A1)을 사용하여 TRM1-10 균주의 형태와 운동성을 관찰하였다.
또한 TRM1-10 균주의 형태와 크기를 관찰하기 위해 주사 전자현미경(한국생명공학연구원에 설치된 FEI Quanta 250 FEG)을 사용하였다(도 1B).
TRM1-10 균주의 4 내지 40℃ 범위의 온도에 대한 성장은 해양 한천 배지에서 7일 동안 관찰하였다.
TRM1-10 균주의 2 내지 10% NaCl 범위 및 4.5~9 pH 범위에 대한 성장은 30℃ 온도 조건의 해양 액상 배지에서 7일 동안 관찰하였다.
TRM1-10 균주의 혐기성 성장 시험은 혐기성 챔버에서 25℃ 온도 조건의 해양 한천 배지에서 10일 동안 관찰하였다.
TRM1-10 균주의 Flexirubin 형 안료의 유무는 KOH 시험으로 판단하였고, H2S의 생산 여부는 SIM 배지와 Kovacs 시약(Becton, Dickinson and Company, USA)으로 시험하였다.
3% H2O2 및 산화효소 시약(Becton, Dickinson and Company, USA)을 사용하여 TRM1-10 균주의 카탈라아제 및 산화효소에 대한 효소 활성을 시험하였다.
API 20NE 및 API ZYM(bioMerieux, France)으로 TRM1-10 균주의 다른 효소 활성 및 기질의 동화 작용을 조사하였다.
TRM1-10 균주의 카제인(casein) 가수분해 시험은 2% NaCl이 함유된 30°C 온도 조건의 skim milk 한천 배지에서 7일간 측정하였다.
TRM1-10 균주의 전분(starch), 크산틴(xanthine) 및 하이퍼크산틴(hypoxanthine) 가수분해 시험은 0.2% 전분, 0.4% 크산틴 및 0.4% 하이퍼크산틴을 함유하는 해양 한천 배지에서 측정하였다.
TRM1-10 균주의 L-타이로신 가수분해 시험은 0.5% 펩톤, 0.3% beef extract, 0.5% 타이로신 및 2% NaCl 조성의 배지(30℃)에서 7일 동안 측정하였다.
TRM1-10 균주의 95 종의 탄소원 동화 시험은 Biolog GN2 microplates를 이용하여 30℃ 3일간 측정하였다.
TRM1-10 균주의 항생물질 감수성 테스트는 항생물질 감수성 테스트 디스크(Oxoid, Thermo Fisher Scientific Inc., USA)에서 해양 한천 배지로 수행되었다: 암피실린(ampicillin, 10 μg/disc), 카르베니실린(carbenicillin, 100 μg/disc), 세파로신(cephalothin, 30 μg/disc), 클로람페니콜(chloramphenicol, 50 μg/disc), 겐타마이신(gentamicin, 30 μg/disc), 카나마이신(kanamycin, 30 μg/disc), 린코마이신(lincomycin, 15 μg/disc), 네오마이신(neomycin, 30 μg/disc), 노보비오신(novobiocin, 5 μg/disc), 페니실린(penicillin, 10U μg/disc), 폴리믹신(polymyxin, 300U μg/disc), 리팜피신(rifampicin, 5 μg/disc), 스트렙토마이신(streptomycin, 25 μg/disc), 설파메톡사졸(sulphamethoxazole, 25 μg/disc), 테트라사이클린(tetracycline, 30 μg/disc), 사이클로헥시미드(cycloheximide, 100 μg/mL).
화학적 분류의 특징을 비교하기 위해 Mariniflexile 종을 미생물자원센터(Korean Collection for Type Cultures, KCTC)에서 얻었고, 모든 균주는 30℃ 해양 한천 배지 및 해양 액상 배지에서 배양되었다.
지방산 및 극성 지질을 분석하기 위해, TRM1-10 및 Mariniflexile soesokkakense RSSK-9 (KCTC 32427) 균주를 30℃ 해양 한천 배지에서 3일간 배양하였다.
지방산 분석은 Miller's 방법에 따라 지방산을 추출하고 가스 크로마토그래피(Agilent 6890 gas chromatograph, KCCM, South Korea)를 이용하여 동정하였다.
극성 지질 분석을 위해 동결 건조된 TRM1-10 및 M. soesokkakense RSSK-9의 세포 50 mg을 준비하였다.
Miller's 방법에 따라 극성 지질을 추출하고, 2차원 박막 크로마토그래피(KCCM, South Korea)로 분석 하였다.
Isoprenoid quinine 분석을 위해 동결 건조된 TRM1-10 및 M. soesokkakense RSSK-9의 세포 100 mg을 준비하였다.
Isoprenoid quinine 은 chloroform-methanol(2:1, v/v)로 추출하고, 고성능 액체 크로마토그래피(KCCM, South Korea)로 동정하였다.
TRM1-10 균주는 그람 음성 호기성 간균이며, 해양 한천 배지에서 3일 동안 0.5-2mm 크기의 노란색 콜로니를 형성하였다(도 1A).
TRM1-10의 생리학 및 생화학적 분류의 특성을 M. soesokkakense RSSK-9와 비교하여 하기 표 1에 나타내었다.
특징 TRM1 -10 M. soesokkakense RSSK -9
생육 온도 범위 (℃) 4-40 4-35
질산 환원 - +
산화 효소 활성 - +
가수분해 활성
Casein - -
Hypoxanthine - -
Starch + +
l-tyrosine - +
Esculin + +
Gelatin - -
Tween 80 - -
이용 탄소원
Benzoate - -
d-Cellobiose + -
d-Galactose - +
d-Mannose + +
d-trehalose + -
l-Arabinose - +
l-glutamate + -
Maltose + +
Succinate + -
Sucrose + +
항생물질 감수성
Ampicillin + +
Carbenicillin + +
Cephalothin - +
Gentamicin - -
Kanamycin - -
Lincomycin + +
Neomycin - -
Novobiocin + +
Polymyxin B - -
Streptomycin - -
Tetracycline + -
DNA G+C 비율
G+C(%) 34.56 34.6
실험예 3 : TRM1 -10 균주의 분자생물학적 분석
분자생물학적 동정을 위해 16S rRNA 유전자를 하기 표 2의 프라이머 세트로 증폭하였다. PCR 조건은 annealing 55°C, 30초; extension 72°C, 1.5분, 30 cycles로 하였다.
증폭된 16S rRNA 유전자 서열은 생어 염기서열 분석법(Sanger sequencing)을 이용하여 염기서열을 분석하였고, EzTaxon 웹 서버에서 동정하였다.
16S rRNA 유전자를 이용한 계통 분석은 ARB(Ludwing, W. et al., Nucleic Acids Res 32, 1363-1371, 2004) 및 MEGA5(Tamura, K. et al., Mol Biol Evol 28, 2731-2739, 2011)를 참고하였다.
구분 프라이머 서열
27F 5'-GTG CTG CAG AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3'
1492R 5'-CAC GGA TCC TAC GGG TAC CTT GTT ACG ACT T-3'
DNA의 G+C 비율을 분석하기 위해 Wizard Genomic DNA Purification Kit (Promega, USA)를 사용하여 TRM1-10의 DNA를 추출하고, Illumina platforms(DNA Link, Inc., South Korea)의 PacBio RS II system 및 HiSeq 2000 sequencer를 사용하여 염기서열을 분석하였다.TRM1-10 균주의 16S rRNA 전체 길이는 1,510 nt 이고, M. soesokkakense RSSK-9와 염기 서열의 유사성이 가장 높았다(96.94 %).
16S rRNA에 기초한 계통수에서 TRM1-10은 Mariniflexile속의 여러 종과 Siansivirga zeaxanthinifaciens 사이에 위치하였고, Mariniflexile속의 여러 종과 가장 가까운 공통조상을 공유하였다(도 2).
계통 발생 위치 및 Flavobacteriaceae에 속하는 다른 세균 종과의 미생물학, 유전학 및 생화학적 특성을 비교한 결과 TRM1-10 균주가 Flavobacteriaceae 과의 새로운 속으로 분류될 수 있으며, 따라서 본 발명자들은 TRM1-10 균주를 Flavobacteriaceae bacterium gen. nov. sp. nov.로 판단하였다.
실험예 4 : TRM1 -10 균주의 풋마름병 방제 시험
TRM1-10 균주의 풋마름병 방제 효과를 평가하기 위해 풋마름병 감수성 작물인 토마토 Moneymaker를 이용하였다.
표면이 살균된 토마토 씨앗을 멸균수에서 1주일간 발아시키고, 12℃에서 40분 2회 멸균한 상업용 원예시설에서 이용하는 토양(Punong Co., Ltd, Korea)이 담긴 포트로 이식하여 2주 동안 재배하였다.
실험에 사용되는 작물은 28℃ 온도조건에서 14시간은 빛 조건, 10시간은 어둠 조건으로 통제된 배양실에서 재배하였다.
TRM1-10 균주는 30℃ 온도조건인 해양 한천 배지에서 4일간 배양하고, 멸균수로현탁액을 제조하여 토마토가 재배되고 있는 포트에 처리하였다.
균주 현탁액을 다양한 희석배수로 처리하여 토양에 혼합하되 최종 토양당2×106 CFU/토양 g, 2×107 CFU/토양 g 및 2×108 CFU/토양 g이 되도록 조정하였다.
균주 현탁액을 포함하지 않은 토마토 작물을 음성 대조군으로 사용하였고, 모든 실험은 토마토 10개체씩3번 반복하였다.
TRM1-10을 처리하거나 처리하지 않은 모든 작물은 28℃ 온도조건에서 14시간은 빛 조건, 10시간은 어둠 조건에서 7일간 배양하고, 풋마름병 발병 균주인 R. solanacearum SL341를 토양 g 당 107 CFU 이 처리되도록 토양에 혼합하여 접종하였다. 접종 후 2주 동안 풋마름병의 질병 경과를 관찰하였다.
고농도(2×108 CFU/토양 g)의 TRM1-10 균주 희석액을 처리한 토마토 작물은 TRM1-10 균주 희석액을 처리하지 않은 토마토 작물(control)에 비해 풋마름병에 대해 높은 방제 효과를 나타내었다(도 3).
실험예 5 : TRM1 -10 균주의 식물 생장 촉진 시험
TRM1-10 균주를 대상으로 자연농지 토양(경상남도 김해시 대동면 동아대학교 농장)을 이용하여 토마토 식물체의 생육에 미치는 효과를 분석하였다.
토마토 품종은 Hawaii 7996 종자를 0.1% Triton X-100이 첨가된 70% 에탄올에서 1분간 강하게 흔들어 주고 다시 토마토 종자를 0.1% Triton X-100이 첨가된 10% bleach(chlorox)에서 강하게 흔들며 15분간 유지하였다.
이후 종자를 회수하여 충분한 멸균수로 5회 철저히 행구고 건조하여 멸균종자로 준비하였다. 토양은 물빠짐을 위해 자연 농지와 Calcined clay(수돗물에 씻고 121℃에서 40분 2회 멸균 후 건조한)를 부피비율 1:1로 혼합하여 토마토를 재배하였다.
멸균한 토마토 종자는 멸균수로 적셔진 멸균 여과지(Advantec; Toyo Roshi Co. Ltd., Tokyo, Japan)에 치상 후 7일간 광주기 32℃에서 14 시간, 암주기 28℃에서 10 시간으로 생육하였다.
치상 후 7 일째에 준비한 농지토양을 한 포트 당 60g씩 나누어 담고 발아한 토마토 유묘를 정식하였다. 각 포트 당 살균수 또는 TRM1-10 현탁액을 처리하여 토양 g당 세균 수를 107 CFU로 조절하였다.
정식 후 토마토 식물을 생육상 내에서 광주기 28℃에서 14 시간, 암주기 28℃에서 10 시간으로 생육하면서 생육촉진을 검정하였다.
정식 후 40일이 경과한 후 토마토 식물의 생육을 1차 정량하였으며, TRM1-10 균주 처리구와 무처리 간의 생중량(fresh weight)을 각각 측정하여 비교하였다.
각 처리 당 반복은 5개의 식물체로 반복하였고, T-test 통계처리 방법을 통하여 각 처리구 당 유의차를 검정하였다.
Hawaii 7996의 생중량의 경우 TRM1-10 미생물 처리구에서 평균 2.418 g으로 1.86 g의 미생물 무처리구에 비해 생중량이 1.3 배 증가하였으며 통계적으로 유의한 증가를 보였다(p=0.0039795)(도 4).
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.
본 발명의 범위는 후술하는 청구범위에 의하여 나타내어지며, 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
기탁기관명 : 한국생명공학연구원
수탁번호 : KCTC18646P
수탁일자 : 20171128
서열번호 1 : 플라보박테리아과 세균의 16S rDNA
Figure PCTKR2018009757-appb-I000001

Claims (11)

  1. 서열번호 1의 16S rDNA를 포함하고, 식물병에 대한 방제 효과를 가지는 균주.
  2. 제1항에 있어서,
    박테로이데테스(Bacteroidetes) 문인 균주.
  3. 제2항에 있어서,
    플라보박테리아(Flavobacteriaceae) 과인 균주.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 식물병은 풋마름병, 토마토 궤양병, 양배추 흑부병, 고추 세균성점무늬병, 배추 무름병, 키위 궤양병, 감귤 궤양병, 복숭아 세균성 구멍병, 감자 더뎅이병, 감자 무름병, 감자역병, 검은무늬썩음병, 흑각병, 하역병, 절편부패병, 홍색부패병, 균핵병, 시들음병, 감자탄저병, 더뎅이병, 둘레썩음병, 마른썩음병, 감자빗자루병, 벼 잎집무늬마름병, 토마토 역병, 토마토 시들음병, 토마토 뿌리혹선충병, 오이 뿌리혹선충병, 콩 뿌리혹선충병, 고추 역병, 상추 균핵병, 인삼 점무늬낙엽병, 배추 뿌리혹병, 무 시들음병, 담배 입고병, 감자 갈색썩음병 및 인삼 뿌리썩음병으로 이루어진 군에서 하나 이상 선택된 균주.
  5. 식물병에 대한 방제 효과를 가지는 플라보박테리아과 세균 TRM1-10(Flavobacteriaceae bacterium TRM1-10; KCTC 18646P) 균주.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 균주 또는 그의 배양액을 유효성분으로 포함하는 식물병 방제용 조성물.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 식물병은 풋마름병, 토마토 궤양병, 양배추 흑부병, 고추 세균성점무늬병, 배추 무름병, 키위 궤양병, 감귤 궤양병, 복숭아 세균성 구멍병, 감자 더뎅이병, 감자 무름병, 감자역병, 검은무늬썩음병, 흑각병, 하역병, 절편부패병, 홍색부패병, 균핵병, 시들음병, 감자탄저병, 더뎅이병, 둘레썩음병, 마른썩음병, 감자빗자루병, 벼 잎집무늬마름병, 토마토 역병, 토마토 시들음병, 토마토 뿌리혹선충병, 오이 뿌리혹선충병, 콩 뿌리혹선충병, 고추 역병, 상추 균핵병, 인삼 점무늬낙엽병, 배추 뿌리혹병, 무 시들음병, 담배 입고병, 감자 갈색썩음병 및 인삼 뿌리썩음병으로 이루어진 군에서 하나 이상 선택된 식물병 방제용 조성물.
  8. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 균주 또는 그의 배양액을 유효성분으로 포함하는 식물 생장 촉진용 조성물.
  9. 제6항의 조성물을 처리하는 단계;를 포함하는 식물병 방제 방법.
  10. 제8항의 조성물을 처리하는 단계;를 포함하는 식물 생장 촉진방법.
  11. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 균주를 배양하는 단계;를 포함하는 식물 병 방제 또는 생장 촉진용 조성물의 제조방법.
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Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111575321B (zh) * 2020-05-19 2022-07-19 云南中烟工业有限责任公司 一种根际假河杆菌烟草发酵物、其制备方法及用途
KR102691533B1 (ko) * 2021-09-03 2024-08-05 대한민국 신종 리조스파에라(Rhizosphaera) sp. JAF-11 효모로부터 분리된 생물학적 계면활성제

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20050034000A (ko) * 2003-10-07 2005-04-14 (주) 엠솔 병원성 진균에 길항력을 가지는 신규의 식물 내생 세균인버크홀더리아 비에나멘시스 엠씨1404 및 이를 함유하는항진균성 미생물 살균제
KR20050034001A (ko) * 2003-10-07 2005-04-14 (주) 엠솔 신규 식물 내생 길항 미생물인 슈도모나스 플루오레슨스엠씨3101 및 이를 함유하는 항진균성 미생물 살균제
KR20100052797A (ko) * 2008-11-11 2010-05-20 한국화학연구원 바실러스 벨레젠시스 ｐｂ3 균주 및 이를 이용한 식물병 방제방법
KR20100116562A (ko) * 2009-04-22 2010-11-01 한국화학연구원 바실러스 벨레젠시스 ｇ341 균주 및 이를 이용한 식물병 방제방법

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20050034000A (ko) * 2003-10-07 2005-04-14 (주) 엠솔 병원성 진균에 길항력을 가지는 신규의 식물 내생 세균인버크홀더리아 비에나멘시스 엠씨1404 및 이를 함유하는항진균성 미생물 살균제
KR20050034001A (ko) * 2003-10-07 2005-04-14 (주) 엠솔 신규 식물 내생 길항 미생물인 슈도모나스 플루오레슨스엠씨3101 및 이를 함유하는 항진균성 미생물 살균제
KR20100052797A (ko) * 2008-11-11 2010-05-20 한국화학연구원 바실러스 벨레젠시스 ｐｂ3 균주 및 이를 이용한 식물병 방제방법
KR20100116562A (ko) * 2009-04-22 2010-11-01 한국화학연구원 바실러스 벨레젠시스 ｇ341 균주 및 이를 이용한 식물병 방제방법

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ACHARI, G. A. ET AL.: "Diversity, Biocontrol, and Plant Growth Promoting Abilities of Xylem Residing Bacteria from Solanaceous Crops", INTERNATIONAL JOURNAL OF MICROBIOLOGY, vol. 2014, no. 296521, 2014, pages 1 - 14, XP055617211 *

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