JP6306201B2 - インターロイキン−２融合タンパク質及びその使用 - Google Patents

インターロイキン−２融合タンパク質及びその使用 Download PDF

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Description

本発明は、一般的に、免疫グロブリン及びインターロイキン−２（ＩＬ−２）の融合タンパク質に関する。より具体的には、本発明は、例えば、自己免疫疾患及び免疫介在炎症性疾患の処置において治療剤として使用するための改善された特性を示す免疫グロブリン及び変異体ＩＬ−２の融合タンパク質に関する。更に、本発明は、このような融合タンパク質をコードしているポリヌクレオチド、並びにこのようなポリヌクレオチドを含むベクター及び宿主細胞に関する。本発明は、更に、本発明の融合タンパク質を産生する方法、及び疾患の処置において該融合タンパク質を使用する方法に関する。
制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）は、自己寛容の維持に不可欠なＴリンパ球の特定のサブセットを表す。これらサプレッサ機能を有するＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉ細胞は、転写因子ＦＯＸＰ３の細胞内発現、並びにＣＤ１２７ｌｏｗ、ＣＴＬＡ−４＋、ＬＡＰ、ＣＤ３９＋、ＰＤ−１＋、ＧＡＲＰ等の他の細胞マーカーによってエフェクターＴ細胞と区別することができる。ＦＯＸＰ３は、Ｔｒｅｇの分化及び機能に不可欠であり、そして、ＦＯＸＰ３遺伝子の欠損及び変異は、ふけ症マウス及びＸ連鎖免疫調節異常・多発性内分泌障害腸症候群（ＩＰＥＸ）患者の両方において、Ｔｒｅｇの欠損又は機能不全に起因する、自己寛容の崩壊及び自己免疫疾患の発現をもたらす。
１型糖尿病、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、多発性硬化症、及びその他多くの疾患における自己免疫応答は、Ｔｒｅｇ又はＴｒｅｇ機能の欠損と相関している。動物モデルから得られたデータは、自己免疫応答が、主に自己反応性ＣＤ４＋メモリーＴエフェクター細胞の作用に起因して、Ｔｒｅｇが自身に対する破壊的免疫応答を制御できないことによって促進されるという仮説を支持している。１型糖尿病は、膵臓におけるインスリン産生β細胞の大部分が破壊された後に生じる自己免疫疾患である。１型糖尿病の発生頻度は、米国において人口の約０．３％であり、そして、その発生率は、米国、欧州、特に北欧（ほぼ１％）で増加し続けており、そして、次の２０年以内に二倍になると予測されている。
サイトカインＩＬ−２は、Ｔｒｅｇ及びエフェクターＴ細胞（Ｔｅｆｆ）の活性化及び機能において主要な役割を果たしている。ＩＬ−２産生の欠損又は応答性の欠如は、優先的に、Ｔｒｅｇ機能を喪失させ、そして、自己免疫の可能性を増大させる。Ｔｒｅｇは、Ｔｅｆｆよりも高レベルで高親和性ＩＬ−２受容体を構成的に発現するので、低用量のＩＬ−２は、Ｔｅｆｆ細胞に比べて、Ｔｒｅｇの維持を優先的に支援する。
インビトロ及びインビボにおいてＴｒｅｇを活性化させるためのＩＬ−２の優先的効果により、低用量の長寿命ＩＬ−２療法の可能性は、自己免疫疾患において成功する見込みが高いと思われる。ＩＬ−２（Proleukin（登録商標）、組み換えヒトＩＬ−２）を用いた患者２００人に対する二重盲検プラセボ対照１型糖尿病治験は、２０１３年後半に開始する準備が整っている。毎日低用量のProleukinを用いる最近の治験では、慢性移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）及びＣ型肝炎ウイルス誘発性血管炎の徴候及び症状の一部が寛解した（Koreth et al., New Engl J Med 365, 2055-2066 (2011)、Saadoun et al., New Engl J Med 365, 2067-2077 (2011)）。両研究において、低用量Proleukin（登録商標）は、Ｔｒｅｇを誘導し、そして、Ｔｒｅｇ：Ｔｅｆｆ比を増大させた。しかし、Proleukin（登録商標）は、ＰＫ特性に劣るので、ヒトにおいてＩＬ−２を一定の低レベルに維持するには準最適である。治験で試験されている他の方法は、エクスビボにおいてＴｒｅｇを個別に拡大させ、次いで、再注入する方法であるが、このアプローチは、決して理想的ではなく、そして、困難な一連の品質管理の問題を示す。
したがって、天然制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）介在優性免疫寛容を再建し、そして、ＣＤ４＋メモリーＴエフェクター細胞に対する任意の刺激作用の可能性を厳密に最小化する新規治療アプローチは、自己免疫疾患（例えば、１型糖尿病、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、クローン病）並びに他の自己免疫疾患及び免疫に基づく炎症促進性疾患（例えば、慢性移植片対宿主病、喘息、肺線維症、慢性閉塞性肺疾患、アテローム性動脈硬化症及び急性冠症候群等の心血管疾患、並びに移植拒絶反応）（実質臓器及び骨髄の両方）の患者を処置する能力を大きく強化するであろう。
国際公開第２００９／１３５６１５号には、自己免疫疾患の治療又は予防のために、既知のＩＬ−２ムテイン（ＩＬ−２ Ｎ８８Ｒ、ＢＡＹ５０−４７９８、国際公開第１９９９／６０１２８号に記載）を使用することが記載されている。ＩＬ−２ムテインは、野性型ＩＬ−２に比べてＴｒｅｇ細胞に対する活性は高いが、ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＮＫ細胞に対する効果は小さいと記載されている。ＩＬ−２ムテインの融合タンパク質については記載されていない。
国際公開第２０１０／８５４９５号には、炎症性障害を処置するための、非制御性Ｔ細胞に対してＴｒｅｇ細胞における活性を選択的に促進するＩＬ−２バリアントが記載されている。記載されているＩＬ−２バリアントは、ＩＬ−２受容体の様々なサブユニットへの結合に影響を与える８個以上のアミノ酸置換の組み合わせを含む。
本発明のＩＬ−２融合タンパク質は、ヒトＣＤ４＋メモリーＴエフェクター細胞に対してほとんど又は全く効果を有さずに、ヒト及び非ヒトのＴｒｅｇを優先的に活性化し、より高いＴｒｅｇ：Ｔｅｆｆ比の方に平衡を傾かせ、そして、自己免疫応答を低減する。該ＩＬ−２融合タンパク質は、長寿命であるので、便利な投与スケジュールが可能になり、そして、エフェクター機能を有しないので、副作用の可能性及び有効性の低下を低減する。
１つの態様では、本発明は、（ｉ）免疫グロブリン分子と、（ｉｉ）野性型ＩＬ−２分子と比べたとき、中親和性ＩＬ−２受容体に対する変異体ＩＬ−２分子の親和性を低減するアミノ酸変異を含む２つの変異体インターロイキン−２（ＩＬ−２）分子とを含む融合タンパク質を提供する。
１つの実施態様では、前記免疫グロブリン分子は、ＩｇＧクラスの免疫グロブリン分子、特に、ＩｇＧ１サブクラスの免疫グロブリン分子である。１つの実施態様では、前記免疫グロブリン分子は、ヒト免疫グロブリン分子である。１つの実施態様では、前記免疫グロブリン分子は、抗原に特異的に結合することができる。１つの実施態様では、前記免疫グロブリン分子は、モノクローナル抗体である。１つの実施態様では、前記免疫グロブリン分子は、抗原に特異的に結合することができない。１つの実施態様では、前記免疫グロブリン分子は、ヒトＶｈ３−２３生殖系列配列に基づく重鎖可変領域配列を含む。具体的な実施態様では、前記免疫グロブリン分子は、配列番号９の重鎖可変領域配列を含む。１つの実施態様では、前記免疫グロブリン分子は、ヒトＶｋ３−２０生殖系列配列に基づく軽鎖可変領域配列を含む。具体的な実施態様では、前記免疫グロブリン分子は、配列番号１１の軽鎖可変領域配列を含む。更により具体的な実施態様では、前記免疫グロブリン分子は、配列番号９の重鎖可変領域配列及び配列番号１１の軽鎖可変領域配列を含む。１つの実施態様では、前記免疫グロブリン分子は、抗原に特異的に結合することができず、そして、ヒトＶｈ３−２３生殖系列配列に基づく重鎖可変領域配列及びヒトＶｋ３−２０生殖系列配列に基づく軽鎖可変領域配列を含む。
１つの実施態様では、前記免疫グロブリン分子は、下記改変を含まない対応する免疫グロブリン分子と比べたとき、Ｆｃ受容体に対する免疫グロブリン分子の結合親和性を低減する改変を含む。１つの実施態様では、前記Ｆｃ受容体は、Ｆｃγ受容体、特に、ヒトＦｃγ受容体である。１つの実施態様では、前記Ｆｃ受容体は、活性化Ｆｃ受容体である。１つの実施態様では、前記Ｆｃ受容体は、ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２）、及びＦｃαＲＩ（ＣＤ８９）の群から選択される。具体的な実施態様では、前記Ｆｃ受容体は、ＦｃγＲＩＩＩａ、特に、ヒトＦｃγＲＩＩＩａである。１つの実施態様では、前記改変は、免疫グロブリン分子のエフェクター機能を低減する。具体的な実施態様では、前記エフェクター機能は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）である。１つの実施態様では、前記改変は、前記免疫グロブリン分子のＦｃ領域、特に、ＣＨ２領域に存在する。１つの実施態様では、前記免疫グロブリン分子は、免疫グロブリン重鎖の３２９位（ＥＵ付番）にアミノ酸置換を含む。具体的な実施態様では、前記アミノ酸置換は、Ｐ３２９Ｇである。１つの実施態様では、前記免疫グロブリン分子は、免疫グロブリン重鎖の２３４位及び２３５位（ＥＵ付番）にアミノ酸置換を含む。具体的な実施態様では、前記アミノ酸置換は、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ（ＬＡＬＡ）である。１つの実施態様では、前記免疫グロブリン分子は、免疫グロブリン重鎖の２３４位、２３５位、及び３２９位（ＥＵ付番）にアミノ酸置換を含む。特定の実施態様では、前記免疫グロブリン分子は、免疫グロブリン重鎖にアミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｇ（ＥＵ付番）を含む。
１つの実施態様では、前記変異体ＩＬ−２分子は、ヒトＩＬ−２（配列番号１）の残基８８に対応する位置にアミノ酸変異を含む。１つの実施態様では、前記アミノ酸変異は、アミノ酸置換である。特定の実施態様では、前記アミノ酸置換は、Ｎ８８Ｄである。１つの実施態様では、前記ＩＬ−２分子は、天然のネイティブＩＬ−２と比べたとき、ＩＬ−２受容体に対する前記ＩＬ−２分子の結合親和性を変化させないアミノ酸変異を更に含む。１つの実施態様では、前記ＩＬ−２分子は、ヒトＩＬ−２の残基１２５に対応する位置にアミノ酸変異を含む。より具体的な実施態様では、前記アミノ酸変異は、アミノ酸置換Ｃ１２５Ａである。１つの実施態様では、前記変異体ＩＬ−２分子は、ヒトＩＬ−２の残基３に対応する位置に、ＩＬ−２のＯ−グリコシル化部位を削除するアミノ酸変異を更に含む。１つの実施態様では、前記ヒトＩＬ−２の残基３に対応する位置における、ＩＬ−２のＯ−グリコシル化部位を削除するアミノ酸変異は、Ｔ３Ａ、Ｔ３Ｇ、Ｔ３Ｑ、Ｔ３Ｅ、Ｔ３Ｎ、Ｔ３Ｄ、Ｔ３Ｒ、Ｔ３Ｋ、及びＴ３Ｐの群から選択されるアミノ酸置換である。具体的な実施態様では、前記ヒトＩＬ−２の残基３に対応する位置における、ＩＬ−２のＯ−グリコシル化部位を削除するアミノ酸変異は、Ｔ３Ａである。１つの実施態様では、前記変異体ＩＬ−２分子は、ヒトＩＬ−２分子である。具体的な実施態様では、前記変異体ＩＬ−２分子は、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、及び配列番号６４の群から選択される配列、特に、配列番号５８の配列を含む。１つの実施態様では、前記変異体ＩＬ−２分子は、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、及び配列番号６４の群から選択される配列、特に、配列番号５８の配列を有する。１つの実施態様では、前記変異体ＩＬ−２分子は、それぞれ、Ｎ末端アミノ酸において、場合によりペプチドリンカーを介して、前記免疫グロブリン分子の免疫グロブリン重鎖のうちの１本のＣ末端アミノ酸に融合する。１つの実施態様では、前記変異体ＩＬ−２分子は、それぞれ、ペプチドリンカーを介して前記免疫グロブリン分子に融合する。１つの実施態様では、前記ペプチドリンカーは、少なくとも１０個、特に、少なくとも１５個のアミノ酸を含む。１つの実施態様では、前記ペプチドリンカーは、アミノ酸配列（Ｇ４Ｓ）３（配列番号６６）を含む。
具体的な実施態様では、前記融合タンパク質は、配列番号１９及び配列番号５０のポリペプチド配列を含む。具体的な実施態様では、前記融合タンパク質は、配列番号１９の免疫グロブリン軽鎖と、配列番号５０の免疫グロブリン重鎖−ＩＬ−２融合ポリペプチドとを含む。１つの実施態様では、前記融合タンパク質は、免疫グロブリン分子と、野性型ＩＬ−２分子と比べたとき、中親和性ＩＬ−２受容体に対する変異体ＩＬ−２分子の親和性を低減するアミノ酸変異を含む２つの変異体インターロイキン−２（ＩＬ−２）分子と、場合により１つ以上のペプチドリンカーとから本質的になる。１つの実施態様では、前記融合タンパク質は、配列番号１９の２本の免疫グロブリン軽鎖と、配列番号５０の２本の免疫グロブリン重鎖−ＩＬ−２融合ポリペプチドとから本質的になる。
１つの実施態様では、前記融合タンパク質は、制御性Ｔ細胞を選択的に活性化する。１つの実施態様では、前記融合タンパク質は、エフェクターＴ細胞に対して、特に、従来型ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞に対して、制御性Ｔ細胞を選択的に活性化する。１つの実施態様では、前記融合タンパク質は、従来型ＣＤ４＋メモリーＴ細胞に対して、制御性Ｔ細胞を選択的に活性化する。１つの実施態様では、前記融合タンパク質は、従来型ＣＤ４＋メモリーＴ細胞よりも少なくとも１０倍、少なくとも１００倍、又は少なくとも１０００倍高く、制御性Ｔ細胞を活性化する。１つの実施態様では、前記活性化は、細胞内のＳＴＡＴ、特に、ＳＴＡＴ５のリン酸化レベルを測定することによって求められる。１つの実施態様では、前記細胞内のＳＴＡＴのリン酸化レベルの測定は、フローサイトメトリー分析によって行われる。
本発明は、更に、本発明の融合タンパク質をコードしているポリヌクレオチドを提供する。更に、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、特に、発現ベクターを提供する。別の態様では、本発明は、本発明のポリヌクレオチド又はベクターを含む宿主細胞を提供する。また、本発明は、本発明の融合タンパク質を産生する方法であって、（ｉ）前記融合タンパク質を発現させるのに好適な条件下で本発明の宿主細胞を培養する工程と、（ｉｉ）前記融合タンパク質を回収する工程とを含む方法を提供する。また、前記方法によって産生される、（ｉ）免疫グロブリン分子と、（ｉｉ）野性型ＩＬ−２分子と比べたとき、中親和性ＩＬ−２受容体に対する変異体ＩＬ−２分子の親和性を低減するアミノ酸変異を含む２つのインターロイキン−２（ＩＬ−２）分子とを含む融合タンパク質を提供する。
１つの態様では、本発明は、本発明の融合タンパク質と薬学的に許容し得る担体とを含む医薬組成物を提供する。また、本発明の融合タンパク質又は医薬組成物は、医薬として使用するために、及び自己免疫疾患、具体的には、１型糖尿病、多発性硬化症（ＭＳ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、炎症性腸疾患、クローン病、又は潰瘍性大腸炎、最も具体的には、１型糖尿病、又は移植片対宿主病若しくは移植拒絶反応の処置又は予防において使用するために提供される。更に、それを必要としている個体における疾患を処置するための医薬を製造するための本発明の融合タンパク質の使用、及び個体における疾患を処置する方法であって、薬学的に許容し得る形態の本発明の融合タンパク質を含む組成物を治療上有効な量で前記個体に投与することを含む方法を提供する。１つの実施態様では、前記疾患は、自己免疫疾患である。より具体的な実施態様では、前記自己免疫疾患は、１型糖尿病、多発性硬化症（ＭＳ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、炎症性腸疾患、クローン病、又は潰瘍性大腸炎である。更により具体的な実施態様では、前記自己免疫疾患は、１型糖尿病である。別の実施態様では、前記疾患は、移植拒絶反応又は移植片対宿主病である。１つの実施態様では、前記個体は、哺乳類、特に、ヒトである。
更に、インビトロ又はインビボにおける制御性Ｔ細胞の選択的活性化において使用するための本発明の融合タンパク質を提供する。１つの実施態様では、前記活性化は、制御性Ｔ細胞の増殖の誘導及び／又は制御性Ｔ細胞におけるＩＬ−２受容体シグナル伝達、特に、ＳＴＡＴ５のリン酸化の誘導を含む。１つの実施態様では、前記使用は、インビトロにおける使用であり、そして、前記融合タンパク質は、約１０ng/mL以下、具体的には、約１ng/mL以下の濃度で使用される。別の実施態様では、前記使用は、インビボにおける使用であり、そして、前記融合タンパク質は、約１００μg/kg（体重）以下、具体的には、約２５μg/kg（体重）以下、より具体的には、約１０μg/kg（体重）以下の用量で使用される。
また、本発明は、インビトロ又はインビボにおいて制御性Ｔ細胞を選択的に活性化する方法であって、前記制御性Ｔ細胞を本発明の融合タンパク質と接触させることを含む方法を提供する。１つの実施態様では、前記活性化は、制御性Ｔ細胞の増殖の誘導及び／又は制御性Ｔ細胞におけるＩＬ−２受容体シグナル伝達、特に、ＳＴＡＴ５のリン酸化の誘導を含む。１つの実施態様では、前記方法は、インビトロにおける方法であり、そして、前記融合タンパク質は、約１０ng/mL以下、具体的には、約１ng/mL以下の濃度で使用される。別の実施態様では、前記方法は、インビボにおける方法であり、そして、前記融合タンパク質は、約１００μg/kg（体重）以下、具体的には、約２５μg/kg（体重）以下、より具体的には、約１０μg/kg（体重）以下の用量で使用される。
DP47GS IgG-IL-2融合タンパク質の精製（配列番号１３、１５、１９を参照）。（Ａ）プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー工程の溶出プロファイル。（Ｂ）サイズ排除クロマトグラフィー工程の溶出プロファイル。収量４mg/L。（Ｃ）最終生成物の分析キャピラリー電気泳動ＳＤＳ（Caliper）。以下のバンドが観察された：非還元−１１１kDaにおける面積率７．５％、１７４kDaにおける面積率９２．５％；還元−２９kDaにおける面積率２３．６％、６７kDaにおける面積率２３．５％、８２kDaにおける面積率５２．９％。前記生成物は、約７．５％の「半ＩｇＧ」を含有する。（Ｄ）TSKgel G3000 SW XLカラムにおける最終生成物の分析サイズ排除クロマトグラフィー（モノマー含有率９１％）。 DP47GS IgG-(IL-2)2融合タンパク質の精製（配列番号１７、１９を参照）。（Ａ）プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー工程の溶出プロファイル。（Ｂ）サイズ排除クロマトグラフィー工程の溶出プロファイル。収量１３mg/L。（Ｃ）最終生成物の分析キャピラリー電気泳動ＳＤＳ（Caliper）。以下のバンドが観察された：非還元−１７２．５kDaにおける面積率２．３％、１８５kDaにおける面積率９７．７％；還元−２７．３kDaにおける面積率１８．３％、２９．２kDaにおける面積率０．６％、７８．３kDaにおける面積率８１．１％。（Ｄ）Superdex 200カラムにおける最終生成物の分析サイズ排除クロマトグラフィー（モノマー含有率１００％）。 DP47GS IgG-IL-2 N88D融合タンパク質の精製（配列番号１５、１９、４８を参照）。（Ａ）プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー工程の溶出プロファイル。（Ｂ）サイズ排除クロマトグラフィー工程の溶出プロファイル。収量２３．７mg/L。回収した画分を四角で囲む。（Ｃ）最終生成物の分析キャピラリー電気泳動ＳＤＳ（Caliper）。以下の主なバンドが観察された：非還元−１６７．０kDaにおける面積率１００％；還元−２８．６kDaにおける面積率３１．５％、６３．５kDaにおける面積率３１．７％、７７．５kDaにおける面積率３５．３％。（Ｄ）TSKgel G3000 SW XLカラムにおける最終生成物の分析サイズ排除クロマトグラフィー（モノマー含有率９７．３％）。 DP47GS IgG-(IL-2 N88D)2融合タンパク質の精製（配列番号１９及び５０を参照）。（Ａ）プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー工程の溶出プロファイル。（Ｂ）サイズ排除クロマトグラフィー工程の溶出プロファイル。収量３２．９mg/L。回収した画分を四角で囲む。（Ｃ）最終生成物の分析キャピラリー電気泳動ＳＤＳ（Caliper）。以下の主なバンドが観察された：非還元−１８０．４kDaにおける面積率２０．７％、１８４．０kDaにおける面積率７８．０％；還元−２７．３kDaにおける面積率１６．２％、７６．０kDaにおける面積率８２．７％。（Ｄ）TSKgel G3000 SW XLカラムにおける最終生成物の分析サイズ排除クロマトグラフィー（モノマー含有率９８．３％）。 DP47GS IgG-(IL-2 E95A)2融合タンパク質の精製（配列番号１９及び５２を参照）。（Ａ）プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー工程の溶出プロファイル。（Ｂ）サイズ排除クロマトグラフィー工程の溶出プロファイル。収量８．０mg/L。回収した画分を四角で囲む。（Ｃ）最終生成物の分析キャピラリー電気泳動ＳＤＳ（Caliper）。以下の主なバンドが観察された：非還元−１６６．０kDaにおける面積率１０．３％、１７５．５kDaにおける面積率６１．４％、１８１．２kDaにおける面積率２８．２％；還元−２６．１kDaにおける面積率１６．０％、７５．０kDaにおける面積率８３．１％。（Ｄ）TSKgel G3000 SW XLカラムにおける最終生成物の分析サイズ排除クロマトグラフィー（モノマー含有率１００％）。 ＣＤ４＋Ｔｒｅｇサブセット、ＮＫ細胞サブセット、及びＮＫＴ細胞におけるＣＤ２５（ＩＬ−２ＲＡ）及びＣＤ１２２（ＩＬ−２ＲＢ）の発現。細胞表面マーカーを用いて、ＣＤ４＋Ｔｒｅｇサブセット、ＮＫＴ細胞、及びＮＫ細胞を定義した。ＣＤ２５及びＣＤ１２２に対する染色を最適化するために、細胞内ＦＯＸＰ３染色は実施しなかった。（Ａ、Ｂ）３つの制御性ＣＤ４＋Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）集団：ナイーブ（ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ２５＋；点線）、メモリー（ＣＤ４５ＲＡ−、ＣＤ２５＋；実線）、及び活性化（ＣＤ４５ＲＡ−、ＣＤ２５ｈｉ；破線）。（Ｃ、Ｄ）ＮＫＴ（点線）、ＣＤ５６brightＮＫ細胞（破線）、ＣＤ５６intermediateＮＫ細胞（実線）。灰色：アイソタイプ対照（ＩＣ）。 ＣＤ４＋及びＣＤ８＋従来型Ｔ細胞サブセットにおけるＣＤ２５（ＩＬ−２ＲＡ）及びＣＤ１２２（ＩＬ−２ＲＢ）の発現。細胞表面マーカーを用いて、ナイーブ（ＣＤ４５ＲＡ＋；点線）及びメモリー（ＣＤ４５ＲＡ−；実線）従来型ＣＤ４＋Ｔ細胞（Ａ、Ｂ）、メモリー従来型ＣＤ８＋Ｔ細胞（ＣＤ４５ＲＡ−；実線）及びＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ８Ｔ細胞（ナイーブ及びＴＥＭＲＡサブセットの組み合わせ；ＴＥＭＲＡとは、ＣＤ４５ＲＡを発現するように復帰したエフェクターメモリー細胞を指す；点線）（Ｃ、Ｄ）を定義した。灰色：アイソタイプ対照（ＩＣ）。 DP47GS IgG-IL-2に応答するヒト末梢血細胞サブセットにおけるｐＳＴＡＴ５ａの誘導。ＳＴＡＴ５ａリン酸化の誘導に対する様々な用量のDP47GS IgG-IL-2の効果について、３人の異なるヒトドナー（Ｃ４〜Ｃ６）を別々の時点において評価した。ＣＤ４＋Ｔｒｅｇサブセットについての結果を示す：活性化、メモリー、及びナイーブＴｒｅｇ；従来型ＣＤ４＋メモリーＴエフェクター細胞；ＣＤ５６brightＮＫ細胞；ＣＤ８＋メモリーＴエフェクター細胞；ＣＤ４＋ナイーブＴエフェクター細胞；ＮＫ細胞；ＮＫＴ細胞；及びＣＤ８＋ナイーブＴエフェクター＋ＣＤ４５ＲＡ＋メモリー細胞。 DP47GS IgG-(IL-2)2に応答するヒト末梢血細胞サブセットにおけるｐＳＴＡＴ５ａの誘導。ＳＴＡＴ５ａリン酸化の誘導に対する様々な用量のDP47GS IgG-(IL-2)2免疫コンジュゲートの効果について、５人の異なるヒトドナー（Ｎ１、Ｎ２、Ｃ４〜Ｃ６）を別々の時点において評価した。ＣＤ４＋Ｔｒｅｇサブセットについての結果を示す：活性化、メモリー、及びナイーブＴｒｅｇ；従来型ＣＤ４＋メモリーＴエフェクター細胞；ＣＤ５６brightＮＫ細胞；ＣＤ８＋メモリーＴエフェクター細胞；ＣＤ４＋ナイーブＴエフェクター細胞；ＮＫ細胞；ＮＫＴ細胞；及びＣＤ８＋ナイーブＴエフェクター＋ＣＤ４５ＲＡ＋メモリー細胞。 DP47GS IgG-(IL-2)2に応答するヒト末梢血細胞サブセットにおけるｐＳＴＡＴ５ａの誘導。ＳＴＡＴ５ａリン酸化の誘導に対する様々な用量のDP47GS IgG-(IL-2)2免疫コンジュゲートの効果について、５人の異なるヒトドナー（Ｎ１、Ｎ２、Ｃ４〜Ｃ６）を別々の時点において評価した。ＣＤ４＋Ｔｒｅｇサブセットについての結果を示す：活性化、メモリー、及びナイーブＴｒｅｇ；従来型ＣＤ４＋メモリーＴエフェクター細胞；ＣＤ５６brightＮＫ細胞；ＣＤ８＋メモリーＴエフェクター細胞；ＣＤ４＋ナイーブＴエフェクター細胞；ＮＫ細胞；ＮＫＴ細胞；及びＣＤ８＋ナイーブＴエフェクター＋ＣＤ４５ＲＡ＋メモリー細胞。 ヒト末梢血細胞サブセットにおけるｐＳＴＡＴ５ａの誘導：DP47GS IgG-IL-2及びDP47GS IgG-(IL-2)2の比較。各細胞サブセットについての結果を、各サブセットの最高観測効果に対して正規化し、そして、ＴｒｅｇのおおよそのＥＣ５０を表２に示す。（Ａ）DP47GS IgG-IL-2についての正規化結果、（Ｂ）DP47GS IgG-(IL-2)2についての正規化結果。 DP47GS IgG-IL-2及びDP47GS IgG-(IL-2)2を比較する、３人のドナーにおけるＴｒｅｇサブセット感受性の詳細な試験。グラフは、３人のドナーについてのｐＳＴＡＴ５ａ ＭＦＩの平均±ＳＤを表す。（Ａ）合計ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇ。（Ｂ）活性化Ｔｒｅｇ。（Ｃ）メモリーＴｒｅｇ。（Ｄ）ナイーブＴｒｅｇ。 DP47GS IgG-(IL-2E95A)2に応答するヒト末梢血細胞サブセットにおけるｐＳＴＡＴ５ａの誘導。ＳＴＡＴ５ａリン酸化の誘導に対する様々な用量のDP47GS IgG-(IL-2E95A)2の効果について、３人の異なるヒトドナー（Ｃ４〜Ｃ６）を別々の時点において評価した。ＣＤ４＋Ｔｒｅｇサブセットについての結果を示す：活性化、メモリー、及びナイーブＴｒｅｇ；従来型ＣＤ４＋メモリーＴエフェクター細胞；ＣＤ５６brightＮＫ細胞；ＣＤ８＋メモリーＴエフェクター細胞；ＣＤ４＋ナイーブＴエフェクター細胞；ＮＫ細胞；ＮＫＴ細胞；及びＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＡ＋ナイーブＴエフェクター細胞。 DP47GS IgG-(IL-2N88D)2に応答するヒト末梢血細胞サブセットにおけるｐＳＴＡＴ５ａの誘導。ＳＴＡＴ５ａリン酸化の誘導に対する様々な用量のDP47GS IgG-(IL-2N88D)2の効果について、５人の異なるヒトドナー（Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｎ１、Ｎ２）を別々の時点において評価した。ＣＤ４＋Ｔｒｅｇサブセットについての結果を示す：活性化、メモリー、及びナイーブＴｒｅｇ；従来型ＣＤ４＋メモリーＴエフェクター細胞；ＣＤ５６brightＮＫ細胞；ＣＤ８＋メモリーＴエフェクター細胞；ＣＤ４＋ナイーブＴエフェクター細胞；ＮＫ細胞；ＮＫＴ細胞；及びＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＡ＋ナイーブＴエフェクター細胞。 DP47GS IgG-(IL-2N88D)2に応答するヒト末梢血細胞サブセットにおけるｐＳＴＡＴ５ａの誘導。ＳＴＡＴ５ａリン酸化の誘導に対する様々な用量のDP47GS IgG-(IL-2N88D)2の効果について、５人の異なるヒトドナー（Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｎ１、Ｎ２）を別々の時点において評価した。ＣＤ４＋Ｔｒｅｇサブセットについての結果を示す：活性化、メモリー、及びナイーブＴｒｅｇ；従来型ＣＤ４＋メモリーＴエフェクター細胞；ＣＤ５６brightＮＫ細胞；ＣＤ８＋メモリーＴエフェクター細胞；ＣＤ４＋ナイーブＴエフェクター細胞；ＮＫ細胞；ＮＫＴ細胞；及びＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＡ＋ナイーブＴエフェクター細胞。 ヒト末梢血細胞サブセットにおけるｐＳＴＡＴ５ａの誘導：DP47GS IgG-IL-2、DP47GS IgG-(IL-2)2、DP47GS IgG-(IL-2E95A)2、DP47GS IgG-(IL-2N88D)2、及びDP47GS IgG-IL-2N88Dの比較。ＣＤ４＋Ｔｒｅｇサブセットについての結果を示す（Ａ〜Ｃ）：活性化（Ａ）、メモリー（Ｃ）、及びナイーブ（Ｂ）Ｔｒｅｇ；従来型ＣＤ４＋メモリーＴエフェクター細胞（Ｄ）；ＣＤ５６brightＮＫ細胞（Ｅ）。 DP47GS IgG-(IL-2N88D)2及びDP47GS IgG-(IL-2)2の両方に応答するヒト末梢血細胞サブセットにおけるｐＳＴＡＴ５ａの誘導。ＳＴＡＴ５ａリン酸化の誘導に対する広い（６log以上）用量範囲のDP47GS IgG-(IL-2N88D)2及びDP47GS IgG-(IL-2)2の効果について、１０人の異なるヒトドナーを別々の日に評価した。以下の細胞サブセットについての結果を示す：（Ａ）メモリーＴｒｅｇ、（Ｂ）ナイーブＴｒｅｇ、（Ｃ）ＣＤ５６bright ＮＫ細胞、（Ｄ）全ＮＫ細胞、（Ｅ）セントラルメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞、（Ｆ）エフェクターメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞、（Ｇ）ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞、（Ｈ）セントラルメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞、（Ｉ）エフェクターメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞、（Ｊ）ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞、（Ｋ）Ｔｅｍｒａ［ＴｅｆｆメモリーＲＡ＋] ＣＤ８＋Ｔ細胞、（Ｌ）ＮＫＴ細胞、及び(Ｍ）ＣＤ３＋ＣＤ４−ＣＤ８−ＣＤ５６−Ｔ細胞。全ての結果を平均±ＳＥＭ（ｎ＝１０人のドナー）として示す。 ヒトＮＫ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞に対するDP47GS IgG-(IL-2N88D)2及びDP47GS IgG-(IL-2)2のインビトロにおける効果の比較。正常ヒトドナー（ｎ＝１０）由来のＰＢＭＣを、５０ng/mL DP47GS IgG-(IL-2N88D)2（白抜き記号）又はDP47GS IgG-(IL-2)2 （灰色網かけ記号）と共に、５×１０６細胞／Ｕ底ウェルで６日間培養し、その時点で、フローサイトメトリーによって細胞数を定量した。ＣＤ５６ｄｉｍ及びＣＤ５６brightＮＫ細胞に対するＮＫ細胞に対する効果を定量した（Ａ）。ＣＤ８＋Ｔ細胞に対する効果を（Ｂ）に示す。結果をメジアン±四分位範囲として示し、マンホイットニーＵ検定を用いて統計的差を求めた。 ＣＤ３４＋幹細胞ヒト化マウスに対するDP47GS IgG-(IL-2N88D)2 及びDP47GS IgG-(IL-2)2のインビボにおける効果の比較。ＣＤ３４＋幹細胞生着の１０〜１２週間後、ビヒクル（DP47GS IgG、ＩＬ−２なし）、DP47GS IgG-(IL-2N88D)2 、又はDP47GS IgG-(IL-2)2で週２回マウスを処置した。血液中のヒトＴｒｅｇ及びＮＫ細胞の最高増加は、３回の処置後に見られ、Ｔｒｅｇについての結果を（Ａ）に、そして、ＮＫ細胞についての結果を（Ｂ）に示す。結果は、メジアン±四分位範囲として示す；ビヒクル（ｎ＝２１）、IgG-(IL-2N88D)2(ｎ＝２２）、及びIgG-(IL-2)2(ｎ＝２４）。 ＣＤ３４＋幹細胞ヒト化マウスの生存に対するDP47GS IgG-(IL-2N88D)2 及びDP47GS IgG-(IL-2)2のインビボにおける効果の比較。ＣＤ３４＋幹細胞生着の１０〜１２週間後、ヒト異種移植片対宿主反応の重篤度が、試験から取り除く必要のある所定の段階（１５％以上の体重減少）に達するまで、ビヒクル（DP47GS IgG、ＩＬ−２なし）、DP47GS IgG-(IL-2N88D)2 、又はDP47GS IgG-(IL-2)2で週２回マウスを処置した。ビヒクル（ｎ＝7）、DP47GS IgG-(IL-2N88D)2(ｎ＝1２）、及びDP47GS IgG-(IL-2)2(ｎ＝１３）について、GraphPad Prismで得られたカプラン・マイヤー生存曲線として結果をプロットする。 ＣＤ３４＋幹細胞ヒト化マウスにおけるＴｒｅｇ、ＮＫ細胞、及びＣＤ８＋Ｔ細胞に対するDP47GS IgG-(IL-2N88D)2 及びDP47GS IgG-(IL-2)2のインビボにおける効果の比較。ＣＤ３４＋幹細胞生着の１０〜１２週間後、ヒト異種移植片対宿主反応の重篤度が、試験から取り除く必要のある所定の段階（１５％以上の体重減少）に達するまで、ビヒクル（DP47GS IgG、ＩＬ−２なし）、DP47GS IgG-(IL-2N88D)2 、又はDP47GS IgG-(IL-2)2のいずれかで週２回マウスを処置し、その時点で個々のヒト細胞サブセットについて血液を評価した。血液中のヒトＴｒｅｇ、ＮＫ細胞、及びＣＤ８＋細胞を、ヒトＣＤ４５＋細胞％として示す。ビヒクル（ｎ＝６）、DP47GS IgG-(IL-2N88D)2(ｎ＝９）、又はDP47GS IgG-(IL-2)2(ｎ＝９）についての結果を平均±ＳＥＭとして示す。 DP47GS IgG-(IL-2)2及びDP47GS IgG-(IL-2N88D)2に応答するカニクイザル血液におけるＴｒｅｇ ｐＳＴＡＴ５ａの誘導。ＴｒｅｇにおけるＳＴＡＴ５ａリン酸化の誘導に対する、最高用量（２０ng/mL）のDP47GS IgG-(IL-2)2及びDP47GS IgG-(IL-2N88D)2の効果について、３匹の正常健常ドナー（Ｃ１〜Ｃ３）を同時に評価した。（Ａ）ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇサブセット：ナイーブＴｒｅｇ（ＣＤ４５ＲＡ＋ ＦＯＸＰ３＋）、メモリーＴｒｅｇ（ＣＤ４５ＲＡ−ＦＯＸＰ３＋）、及び活性化（ＣＤ４５ＲＡ−ＦＯＸＰ３ｈｉ）を同定するために用いた、ＦＯＸＰ３（ｙ軸）及びＣＤ４５ＲＡ（ｘ軸）を用いるフローサイトメトリーゲーティングストラテジー。（Ｂ）刺激前のＴｒｅｇサブセットにおけるＣＤ２５＋細胞表面染色の発現。 （Ｃ）３匹のカニクイザル（Ｃ１〜Ｃ３）のそれぞれについての、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇサブセット：活性化、メモリー、及びナイーブについてのｐＳＴＡＴ５ａ応答。 DP47GS IgG-(IL-2)2又はDP47GS IgG-(IL-2N88D)2に応答するカニクイザル血液における従来型ＣＤ４＋メモリーＴエフェクター細胞のｐＳＴＡＴ５ａの活性化。図１１に記載した３匹のサルドナー由来の同じ２０ng/mL 刺激血液サンプルを用いて、従来型ＣＤ４＋メモリーＴエフェクター細胞におけるｐＳＴＡＴ５ａの誘導について調べた。（Ａ）ｙ軸にＣＤ４５ＲＡ及びｘ軸にＣＤ２５を用いて、従来型ＣＤ４＋ＦＯＸＰ３−ＣＤ４５ＲＡ−メモリーＴエフェクター細胞を同定するために用いたフローサイトメトリーゲーティングストラテジー。（Ｂ）全ＣＤ４＋ＦＯＸＰ３−ＣＤ４５ＲＡ−メモリーＴエフェクター細胞についてのｐＳＴＡＴ５ａ応答。（Ｃ）ＣＤ２５−でもあるメモリーＴエフェクター細胞についてのｐＳＴＡＴ５ａ応答。（Ｄ）ＣＤ２５＋でもあるメモリーＴエフェクター細胞についてのｐＳＴＡＴ５ａ応答。 DP47GS IgG-(IL-2)2及びDP47GS IgG-(IL-2N88D)2に応答するカニクイザル末梢血Ｔ細胞サブセットにおけるｐＳＴＡＴ５ａの誘導。ＳＴＡＴ５ａリン酸化の誘導に対する、様々な用量（０．０３〜３００ng/mL）のDP47GS IgG-(IL-2)2及びDP47GS IgG-(IL-2N88D)2の効果について、２匹の健常成体ドナーを評価した。ＣＤ４＋Ｔｒｅｇサブセット（Ａ〜Ｃ）：活性化（Ａ）、メモリー（Ｃ）、及びナイーブ（Ｂ）Ｔｒｅｇ、並びに従来型ＣＤ４＋メモリーＴエフェクター細胞（Ｄ）についての結果を示す。両サルについて同様の結果が得られ、DP47GS IgG-(IL-2)2及びDP47GS IgG-(IL-2N88D)2の効果を例示するために１匹のドナーの結果を示す。 マウスでは、DP47GS IgG-IL-2は、DP47GS IgG-(IL-2)2に比べて優れた薬物動態（ＰＫ）特性を有しているが、DP47GS IgG-(IL-2N88D)2は、中間である。（Ａ）ＮＯＤ及びNOD.scidマウスに、０．３mg/kg DP47GS IgG-IL-2又は０．３mg/kg DP47GS IgG-(IL-2)2を静脈内（i.v.）注射した。（Ｂ）NOD.scid.IL2Rα-/-マウスに、０．１mg/kg DP47GS IgG-IL-2、０．３mg/kg DP47GS IgG-(IL-2)2、又は０．１mg/kg DP47GS IgG-(IL-2N88D)2をi.v.注射した。ｍＡｂに基づく捕捉アッセイによって、指定の時点における血清サンプル中のヒトＩＬ−２を評価した。 Proleukin（登録商標）、DP47GS IgG-IL-2、DP47GS IgG-(IL-2)2、及びDP47GS IgG-(IL-2N88D)2による処置後、マウスＴｒｅｇにおいてＣＤ２５及びＦｏｘＰ３がいずれも増加する。ＢＡＬＢ／ｃマウスを、Proleukin（登録商標）(２０，０００及び１００，０００IU/マウス、ｎ＝３）、DP47GS IgG-IL-2、DP47GS IgG-(IL-2)2、又はDP47GS IgG-(IL-2N88D)2（６０、３００、又は１，５００IU/マウス、ｎ＝３）で処置し、ビヒクル処置マウスを非刺激対照として含めた（ｎ＝４）。処置の２４時間後、脾臓のＴｒｅｇをＣＤ２５及びＦＯＸＰ３のレベルについて評価した。（Ａ）細胞表面ＣＤ２５の用量依存的変化及び（Ｂ）細胞内ＦｏｘＰ３の用量依存的変化を、４種のＩＬ２分子全てについて観察した。データは平均±ＳＤとして表し、黒棒は用いた最高用量を表し、そして、薄灰色棒は最低用量を表す。 DP47GS IgG-IL-2 及びDP47GS IgG-(IL-2)2のＰＫ特性を、正常健常成体生物学的ナイーブカニクイザルにおいて評価した。（Ａ）DP47GS IgG-IL-2を、用量１０、２５、及び１００μg/kgでショートボーラスとして静脈内（i.v.）注射した（ｎ＝２／用量）。（Ｂ）DP47GS IgG-(IL-2)2を、用量１０及び２５μg/kgでショートボーラスとしてi.v.注射した（ｎ＝２／用量）。ｍＡｂに基づく捕捉アッセイによって、指定の時点における血清サンプル中のヒトＩＬ−２を評価した。 DP47GS IgG-IL2は、カニクイザルにおいて制御性Ｔ細胞を増加させる用量依存的効果を有する。処置後７日目における全血ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の変化を、（Ａ）全血１mm3当たりのＴｒｅｇの絶対細胞数、及び（Ｂ）Ｔｒｅｇの倍数変化として示す。全てのデータを、平均±ＳＤとして表す。白抜き棒：DP47GS IgG-IL-2(ｎ＝６）；網かけ棒：ビヒクル（ｎ＝３）。 カニクイザルにおけるＴｒｅｇに対するDP47GS IgG-IL-2の時間及び低用量効果。（Ａ）２又は６μg/kg DP47GS IgG-IL-2 (それぞれ、ｎ＝４及び６）の投与後のＴｒｅｇの倍数増加の時間依存的変化。（Ｂ）２又は６μg/kg DP47GS IgG-IL-2 (それぞれ、ｎ＝４及び６）の投与後の血液中のＴｒｅｇの絶対数の時間依存的変化。全てのデータを平均±ＳＤとして示す。 単一用量のProleukinは、カニクイザルにおいて一時的用量依存的Ｔｒｅｇ応答を刺激する。（Ａ）３×１０4〜３×１０5IU/kg Proleukinで単一用量処置した後の末梢血Ｔｒｅｇ数の変化。（Ｂ）３×１０4〜３×１０5IU/kg Proleukinで単一用量処置した後のＴｒｅｇ ｐＳＴＡＴ５ａの変化。データを平均±ＳＤとして示す。 低用量DP47GS IgG-IL-2は、カニクイザルにおけるＴｒｅｇ誘導において高用量Proleukin（登録商標）よりも有効である。正常健常カニクイザル（ｎ＝５の群）を低用量DP47GS IgG-IL-2又は高用量Proleukinで処置し、そして、１０日目に制御性Ｔ細胞の変化を試験した。０及び７日目に、DP47GS IgG-IL-2を１６，８００IU/kg（１２μg/kg）の用量でＳＣ投与した。Proleukin処置(２００，０００IU/kg）は、合計５用量について、１週間当たり３回（ＭＷＦ）ＳＣ投与した。（Ａ）血液１mm3当たりの全Ｔｒｅｇの変化、（Ｂ）Ｔｒｅｇの倍数増加、及び（Ｃ）Ｔｒｅｇの従来型ＣＤ４＋ＦＯＸＰ３−細胞に対する比の変化について、結果を平均±ＳＤとして示す。白抜き棒はＩＬ−２処置を表し、そして、網かけ棒はビヒクル対照を表す。 インビボにおけるDP47GS IgG-IL-2のＴｒｅｇ活性化の感受性バイオマーカーとしての、エクスビボにおける全血リン酸化ＳＴＡＴ５。単一低用量のDP47GS IgG-IL-2（１２μg/kg）を健常カニクイザル（ｎ＝５）にインビボ投与した１及び３日後、全血を回収し、そして、リン酸化ＳＴＡＴ５（ｐＳＴＡＴ５ａ）についての刺激なしで直ちに試験した。処置前の０日目に各サルを失血させ、そして、ｐＳＴＡＴ５ａの量を測定し（網かけ棒）、そして、処置後の倍数変化を評価するために個々に用いた（白抜き棒）。（Ａ）１及び３日目におけるＴｒｅｇ ｐＳＴＡＴ５ａの倍数変化、（Ｂ）従来型ＣＤ４＋ＣＤ４５−メモリーＴ細胞におけるｐＳＴＡＴ５ａの倍数変化、及び（Ｃ）ナイーブＴ細胞ｐＳＴＡＴ５ａの倍数変化を示す。データを平均±ＳＤとして示す。 インビボにおける低用量DP47GS IgG-IL-2のＴｒｅｇ活性化の感受性バイオマーカーとしてのエクスビボにおける全血ｐＳＴＡＴ５ａ。単一低用量のDP47GS IgG-IL-2を健常カニクイザルにインビボ投与した１〜７日後、全血を回収し、そして、ｐＳＴＡＴ５についての刺激なしで直ちに試験した。非刺激レベルのｐＳＴＡＴ５ａについては処置前の０日目に各サルを失血させ、そして、処置後のｐＳＴＡＴ５ａの変化と比較した。（Ａ）２μg/kg DP47GS IgG-IL-2による処置前及び処置後のＴｒｅｇ ｐＳＴＡＴ５ａ(ｎ＝４）。（Ｂ）６μg/kg DP47GS IgG-IL-2による処置前及び処置後のＴｒｅｇ ｐＳＴＡＴ５ａ（ｎ＝６）。データを平均±ＳＤとして示す。 エクスビボにおけるカニクイザル全血Ｋｉ−６７は、インビボにおけるDP47GS IgG-IL-2誘導Ｔ細胞増殖のマーカーとして機能する。図１４に記載した通り、２及び６μg/kg DP47GS IgG-IL-2で処置したカニクイザルを、細胞内マーカーＫｉ−６７の変化についてエクスビボでもモニターして、インビボにおける増殖の程度を評価した。細胞周期における細胞の正常定常状態の割合（Ｋｉ−６７＋）を処置前の０日目に定量し、次いで、次の７〜１１日間毎日モニターした。（Ａ）ＴｒｅｇについてのＫｉ−６７＋（％）、（Ｂ）従来型ＣＤ４＋ＣＤ４５−メモリー／エフェクターＴ細胞についてのＫｉ−６７＋（％）、及び（Ｃ）ナイーブＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ＋Ｔ細胞についてのＫｉ−６７＋（％）を示す。データを平均±ＳＤとして示す。 ナイーブ健常カニクイザルにおけるＴｒｅｇに対するDP47GS IgG-(IL-2)2の時間及び低用量効果。（Ａ）６μg/kg DP47 IgG-(IL-2)2後のＴｒｅｇの絶対数の時間依存的変化。（Ｂ）処置後のＴｒｅｇ ｐＳＴＡＴ５ａの時間依存的変化、（Ｃ）Ｔｒｅｇの倍数増加の時間依存的変化、及び（Ｄ）DP47GS IgG-IL-2処置サル（白抜き棒、２〜３６μg/kg）対DP47GS IgG-(IL-2)2処置サル（網かけ棒、６μg/kg）由来のＴｒｅｇの倍数変化の比較。全てのデータを平均±ＳＤとして示す（ｎ＝４〜６）。 ナイーブ健常カニクイザルにおけるＴｒｅｇに対する超低用量のDP47GS IgG-(IL-2)2の時間及び用量依存的効果。（Ａ）０．７及び２μg/kg DP47GS IgG-(IL-2)2投与後のＴｒｅｇの倍数増加の時間依存的変化。（Ｂ）処置前の０日目及び処置後１〜４日目に測定したＴｒｅｇ ｐＳＴＡＴ５ａの時間依存的変化、（Ｃ）Ｔｅｆｆ／ｍｅｍ細胞ｐＳＴＡＴ５ａの時間依存的変化。全てのデータを平均±ＳＤとして示す（０．７μg/kgではｎ＝３、及び２μg/kgではｎ＝８）。 DP47GS IgG-IL-2対DP47GS IgG-(IL-2)2、及びこれらの全血カニクイザルＴｒｅｇを増加させる能力の用量依存的比較。全てのデータを、平均±ＳＤとして示す（ｎ＝３〜６）。 次世代シーケンス（ＮＧＳ）を用いて、転写因子ＦＯＸＰ３及び免疫抑制分子ＣＴＬＡ−４についてのＴ細胞サブセット特異的ＤＮＡ脱メチル化を分析した。最適用量のDP47GS IgG-IL-2（２５μg/kg、ｎ＝４）、及びDP47GS IgG-(IL-2)2（６μg/kg、ｎ＝４）による処置前及び処置後に、成体生物学的ナイーブカニクイザル由来の血液を分析した。BD FACSAria（商標）を用いて全血ＰＢＭＣからＣＤ４＋Ｔ細胞サブセットを選別し、そして、遺伝子特異的ＤＮＡ脱メチル化のために、サブセット当たり１００，０００細胞を用いた。両処置において同様の結果が見られ、そして、上図にはＦＯＸＰ３、そして、下図にはＣＴＬＡ−４について、DP47GS IgG-(IL-2)2で処置したサルから得られたデータを示す（ｎ＝４、平均±ＳＤ）。 DP47GS IgG-(IL-2N88D)2のＰＫ特性を、正常健常生物学的ナイーブカニクイザルにおいて評価した。（Ａ）DP47GS IgG-(IL-2N88D)2を、３０及び１００μg/kg（ｎ＝２／用量）の用量でショートボーラスとして静脈内（iv）注射した。（Ｂ）DP47GS IgG-(IL-2N88D)2を、３０及び１００μg/kg（ｎ＝２／用量）の用量で外側足背に０．２mL皮下（sc）注射した。モノクローナル抗体に基づく捕捉アッセイによって指定の時点における血漿サンプル中のヒトＩＬ−２を評価した。（Ｃ）ＩＬ−２曝露のバイオマーカーとして、用量３０及び１００μg/kgのIgG-(IL-2N88D)2を注射した後に血漿中の可溶性ＣＤ２５を測定し；カニクイザルｓＣＤ２５と交差反応することが知られているヒトｓＣＤ２５ｍＡｂに基づく捕捉アッセイでカニクイザルｓＣＤ２５を測定した。結果を平均±ＳＥＭ（ｎ＝４）として示す。 ナイーブ健常カニクイザルにおけるＴｒｅｇに対するDP47GS IgG-(IL-2N88D)2のインビボにおける時間及び用量依存的効果。（Ａ）１００μg/kg DP47 IgG-(IL-2N88D)2又は（Ｂ）３０μg/kg DP47 IgG-(IL-2N88D)2を注射した後の全Ｔｒｅｇ、ＣＤ４＋メモリーＴｒｅｇ、ＣＤ４＋ナイーブＴｒｅｇ、及びＣＤ８＋ＦＯＸＰ３＋Ｔｒｅｇの絶対数（×１０６/mL（血液））の時間依存的変化。 １００μg/kg DP47 IgG-(IL-2N88D)2（Ｃ）又は３０μg/kg DP47 IgG-(IL-2N88D)2（Ｄ）を注射した後の全Ｔｒｅｇ、ＣＤ４＋メモリーＴｒｅｇ、ＣＤ４＋ナイーブＴｒｅｇ、及びＣＤ８＋ＦＯＸＰ３＋ＴｒｅｇのＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞の％としてのＴｒｅｇの時間依存的変化。結果を平均±ＳＥＭ（ｎ＝４）として示す。 ナイーブ健常カニクイザルにおけるリンパ球に対するDP47GS IgG-(IL-2N88D)2のインビボにおける時間及び用量依存的効果。１００μg/kg DP47 IgG-(IL-2N88D)2又は３０μg/kg DP47 IgG-(IL-2N88D)2を注射した後の全ＣＤ４＋Ｔ細胞の％として、ＣＤ４＋メモリーＴエフェクターの時間依存的変化を示す（Ａ）。１００μg/kg DP47 IgG-(IL-2N88D)2又は３０μg/kg DP47 IgG-(IL-2N88D)2を注射した後のＣＤ４＋メモリーＴエフェクターの％として、ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉメモリーＴエフェクターの時間依存的変化を示す（Ｂ）。結果を平均±ＳＥＭ（ｎ＝４）として示す。 エクスビボにおける全血ｐＳＴＡＴ５ａは、インビボにおけるＩＬ−２活性化の感受性バイオマーカーである。単一用量のDP47GS IgG-(IL-2N88D)2をカニクイザルにインビボ投与した１〜１１日後、全血を回収し、そして、ｐＳＴＡＴ５ａについての刺激なしで直ちに試験した。非刺激レベルのｐＳＴＡＴ５ａについては処置前の０日目に各サルを失血させ、そして、処置後のｐＳＴＡＴ５ａの変化と比較した。（Ａ）１００μg/kg DP47GS IgG-(IL-2N88D)2による処置前及び処置後のｐＳＴＡＴ５ａ（ＭＦＩ、最高平均蛍光強度）、ｎ＝４。（Ｂ）３０μg/kg DP47GS IgG-(IL-2N88D)2による処置前及び処置後のｐＳＴＡＴ５ａ、ｎ＝４。指定の細胞サブセットについてのデータを平均±ＳＥＭとして示す。 エクスビボにおける全血細胞表面ＣＤ２５染色は、インビボにおけるＩＬ−２活性化の感受性バイオマーカーである。単一用量のDP47GS IgG-(IL-2N88D)2をカニクイザルにインビボ投与した１〜１４日後、全血を回収し、そして、指定の細胞型に対する表面ＣＤ２５についての刺激なしで直ちに試験した。非刺激レベルのＣＤ２５については処置前の０日目に各サルを失血させ、そして、処置後のＣＤ２５の変化と比較した。（Ａ）１００μg/kg DP47GS IgG-(IL-2N88D)2による処置前及び処置後のＣＤ２５染色（最高ＭＦＩ、平均蛍光強度）、ｎ＝４。（Ｂ）３０μg/kg DP47GS IgG-(IL-2N88D)2による処置前及び処置後のＣＤ２５染色、ｎ＝４。指定の細胞サブセットについてのデータを平均±ＳＥＭとして示す。 エクスビボにおける全血細胞内Ｋｉ−６７染色は、インビボにおけるＩＬ−２活性化後の細胞増殖の感受性バイオマーカーである。単一用量のDP47GS IgG-(IL-2N88D)2をカニクイザルにインビボ投与した１〜１４日後、全血を回収し、そして、指定の細胞型に対する細胞内Ｋｉ−６７についての刺激なしで直ちに試験した。非刺激レベルのＫｉ−６７＋細胞については処置前の０日目に各サルを失血させ、そして、処置後のＫｉ−６７＋細胞％の変化と比較した。（Ａ）１００μg/kg DP47GS IgG-(IL-2N88D)2による処置前及び処置後のＫｉ−６７染色（Ｋｉ−６７＋細胞の％）、ｎ＝４。（Ｂ）３０μg/kg DP47GS IgG-(IL-2N88D)2による処置前及び処置後のＫｉ−６７（Ｋｉ−６７＋細胞の％）染色、ｎ＝４。指定の細胞サブセットについての結果を平均±ＳＥＭとして示す。 カニクイザルＴｒｅｇに対するＩＬ−２のインビボにおける効果の比較要約。Proleukin、IgG-IL-2、IgG-(IL-2)2、及びIgG-(IL-2N88D)2について、全Ｔｒｅｇにおける最高増加をＣＤ４＋Ｔ細胞の％として示し；比較のために、全てのインビボ用量をpmol/kgに変換した。Proleukinは、２週間にわたって週３回（ＭＷＦ）投与し、そして、ＩＬ−２融合タンパク質は、単回注射として投与した。結果を平均±ＳＥＭとして示す；Proleukin（ｎ＝５）、IgG-IL-2（ｎ＝６）、IgG-(IL-2)2（ｎ＝６）、及びIgG-(IL-2N88D)2（ｎ＝４）。 高用量ＩＬ−２は、カニクイザルにおいて好酸球増多を誘導する。Proleukin又はＩＬ−２の免疫コンジュゲートを用いる全ての試験において、血中好酸球数の変化をモニターした。高用量Proleukin（２×１０５IU/kg、２週間にわたって週３回）又はより高用量のDP47GS IgG-IL-2で処置した７〜１４日後には好酸球増多が検出されたが、DP47GS IgG-(IL-2)2又はDP47GS IgG-(IL-2N88D)2では検出されなかった。ベースライン好酸球数は、ＩＬ−２の用量について「０」として示される白抜き丸であり、そして、野性型ＩＬ−２分子試験について１回、DP47GS IgG-(IL-2N88D)2試験について１回の２回行った。データを平均±ＳＤとして示す。 DP47GS IgG-IL-2によるインビボ処置は、マウスヒツジ赤血球の遅延型過敏（ＤＴＨ）を抑制する。ビヒクル（１００％応答）、IgG-IL-2（４，０００IU/マウス）、又はポジティブ対照としてのマウスＣＴＬＡ−４−Ｉｇ（２００μg/マウス）で処置した個々のマウスについての全データを示す。（Ａ）ＮＯＤマウス及び（Ｂ）Ｃ５７ＢＬ／６マウスの結果。４日目におけるＤＴＨ応答の規模を、非免疫付与マウスと比較した肢重量の変化（Δ肢重量）として示す。データを平均±ＳＤとして示す。 DP47GS IgG-IL-2（４，０００IU/マウス）によるインビボ処置は、（Ａ）免疫付与後２１日目のＣ５７ＢＬ／６マウス及び（Ｂ）免疫付与後７日目のＮＯＤマウスにおいて、ＫＬＨに対するマウスＩｇＧ抗体応答を抑制する。データを平均±ＳＤとして示す。
発明の詳細な説明
定義
以下では特に定義しない限り、用語は、当技術分野において一般的に用いられている通り、本明細書で用いられる。
本明細書で使用するとき、用語「融合タンパク質」とは、免疫グロブリン分子とＩＬ−２分子とを含む融合ポリペプチド分子であって、該融合タンパク質の構成要素が、直接又はペプチドリンカーを介して、ペプチド結合によって互いに結合している融合ポリペプチド分子を指す。明確にするために、融合タンパク質の免疫グロブリン構成要素の個々のペプチド鎖は、例えば、ジスルフィド結合によって、非共有結合的に結合し得る。
「融合」とは、直接又は１つ以上のペプチドリンカーを介して、ペプチド結合によって結合している構成要素を指す。
「特異的結合」とは、結合が、抗原に対して選択的であり、そして、不所望の又は非特異的な相互作用とは識別できることを意味する。特定の抗原に結合する免疫グロブリンの能力は、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）又は当業者によく知られている他の技術、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術（BIAcore装置で分析）（Liljeblad et al., Glyco J 17, 323-329 (2000)）及び従来の結合アッセイ（Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002)）を通して測定することができる。１つの実施態様では、無関係のタンパク質に対する免疫グロブリンの結合の程度は、例えば、ＳＰＲによって測定したとき、抗原に対する免疫グロブリンの結合の約１０％未満である。特定の実施態様では、抗原に結合する免疫グロブリンは、≦１μM、≦１００nM、≦１０nM、≦１nM、≦０．１nM、≦０．０１nM、又は≦０．００１nM（例えば、１０−８M以下、例えば、１０−８M〜１０−１３M、例えば、１０−９M〜１０−１３M）の解離定数（ＫＤ）を有する。
「親和性」又は「結合親和性」とは、分子の単一結合部位（例えば、抗体）とその結合パートナー（例えば、抗原）との非共有結合的相互作用の合計の強度を指す。特に指定しない限り、本明細書で使用するとき、「結合親和性」とは、結合ペア（例えば、抗体及び抗原）のメンバー間の１：１の相互作用を反映する、固有結合親和性を指す。分子ＸのそのパートナーＹについての親和性は、一般的に、解離定数（ＫＤ）によって表すことができ、該解離定数は、解離速度定数と会合速度定数（それぞれ、ｋｏｆｆ及びｋｏｎ）との比である。したがって、等価親和性は、速度定数の比が同じである限り、異なる速度定数を含み得る。親和性は、本明細書に記載するものを含む、当技術分野において公知の一般的な方法によって測定することができる。親和性を測定するための具体的な方法は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）である。
「結合の低減」、例えば、Ｆｃ受容体又はＩＬ−２受容体に対する結合の低減とは、例えば、ＳＰＲによって測定したとき、それぞれの相互作用についての親和性の減少を指す。明確にするために、この用語は、親和性のゼロ（又は分析方法の検出限界未満）への低減、すなわち、相互作用が完全になくなることも含む。逆に、「結合の増加」とは、それぞれの相互作用についての結合親和性の増加を指す。
本明細書で使用するとき、用語「抗原決定基」は、「抗原」と同義であり、そして、抗体が結合して抗体−抗原複合体を形成する、ポリペプチド巨大分子における部位（例えば、アミノ酸の連続伸長、又は非連続アミノ酸の様々な領域で構成される立体構造）を指す。有用な抗原決定基は、例えば、細胞の表面に見出すことができ、血清及び／又は細胞外マトリクス（ＥＣＭ）には見られない。
本明細書で使用するとき、用語「単鎖」とは、ペプチド結合によって直鎖状に結合されているアミノ酸モノマーを含む分子を指す。
用語「抗体」は、本明細書では最も広い意味で用いられ、そして、所望の抗原結合活性を示す限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異的抗体（例えば、二重特異的抗体）、及び抗体フラグメントを含むがこれらに限定されない様々な抗体構造を含む。
「抗体フラグメント」とは、インタクトな抗体が結合する抗原に結合する前記インタクトな抗体の一部を含む、インタクトな抗体以外の分子を指す。抗体フラグメントの例は、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、ダイアボディ、直鎖状抗体、単鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）、及び単一ドメイン抗体を含むが、これらに限定されない。
用語「免疫グロブリン分子」とは、天然抗体の構造を有するタンパク質を指す。例えば、ＩｇＧクラスの免疫グロブリンは、ジスルフィド結合している２本の軽鎖及び２本の重鎖で構成される、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端に向かって、各免疫グロブリン重鎖は、可変重ドメイン又は重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＨ）に続いて、重鎖定常領域とも呼ばれる３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３）を有する。同様に、Ｎ末端からＣ末端に向かって、各免疫グロブリン軽鎖は、可変軽ドメイン又は軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＬ）に続いて、軽鎖定常領域とも呼ばれる定常軽（ＣＬ）ドメインを有する。免疫グロブリンの重鎖は、α（ＩｇＡ）、δ（ＩｇＤ）、ε（ＩｇＥ）、γ（ＩｇＧ）、又はμ（ＩｇＭ）と呼ばれる５つのクラスのうちの１つに割り当てられ得、そのうちの一部は、例えば、γ１（ＩｇＧ１）、γ２（ＩｇＧ２）、γ３（ＩｇＧ３）、γ４（ＩｇＧ４）、α１（ＩｇＡ１）、及びα２（ＩｇＡ２）等のサブクラスに更に分類され得る。免疫グロブリンの軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる２種類のうちの１つに割り当てられ得る。免疫グロブリンは、免疫グロブリンヒンジ領域を介して結合されている２つのＦａｂ分子及びＦｃドメインから本質的になる。
本明細書で使用するとき、「Ｆａｂフラグメント」とは、軽鎖のＶＬドメイン及び定常ドメイン（ＣＬ）と、重鎖のＶＨドメイン及び第１の定常ドメイン（ＣＨ１）とを含む免疫グロブリンフラグメントを指す。
抗体又は免疫グロブリンの「クラス」とは、その重鎖が有している定常ドメイン又は定常領域の種類を指す。ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭの５つの主なクラスの免疫グロブリンが存在し、そして、これらのうちの幾つかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２に更に分類することができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、α、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。
用語「可変領域」又は「可変ドメイン」とは、一般的に免疫グロブリン又は抗体の抗原への結合に関与する、免疫グロブリン又は抗体の重鎖若しくは軽鎖のドメインを指す。しかし、本発明の融合タンパク質に含まれる免疫グロブリンは、抗原結合特異性を付与しない可変領域を含み得る。免疫グロブリン又は抗体の重鎖及び軽鎖（それぞれ、ＶＨ及びＶＬ）の可変ドメインは、一般的に、類似の構造を有し、各ドメインが、４つの保存フレームワーク領域（ＦＲ）及び３つの超可変領域（ＨＶＲ）を含む。例えば、Kindt et al., Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007)を参照。単一のＶＨ又はＶＬドメインは、抗原結合特異性を付与するのに十分であり得る。
用語「超可変領域」又は「ＨＶＲ」は、本明細書で使用するとき、配列が超可変性である及び／又は構造的に画定されるループ（「超可変ループ」）を形成する、免疫グロブリン又は抗体の可変ドメインの各領域を指す。一般的に、ネイティブの４本鎖抗体は、６つのＨＶＲ；ＶＨに３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）及びＶＬに３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）を含む。ＨＶＲは、一般的に、超可変ループ及び／又は相補性決定領域（ＣＤＲ）由来のアミノ酸残基を含み、後者は、配列可変性が最も高い及び／又は抗原認識に関与する。例示的な超可変ループは、アミノ酸残基２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）、９１〜９６（Ｌ３）、２６〜３２（Ｈ１）、５３〜５５（Ｈ２）、及び９６〜１０１（Ｈ３）に存在する（Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196, 901-917(1987)）。例示的なＣＤＲ（ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３）は、Ｌ１の２４〜３４、Ｌ２の５０〜５６、Ｌ３の８９〜９７、Ｈ１の３１〜３５Ｂ、Ｈ２の５０〜６５、及びＨ３の９５〜１０２のアミノ酸残基に存在する（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)）。ＶＨにおけるＣＤＲ１を除いて、ＣＤＲは、一般的に、超可変ループを形成するアミノ酸残基を含む。また、ＣＤＲは、「特異性決定残基」又は「ＳＤＲ」を含み、これは、抗原に接触する残基である。ＳＤＲは、短縮型（abbreviated）−ＣＤＲ又はａ−ＣＤＲと呼ばれるＣＤＲの領域内に含まれる。例示的なａ−ＣＤＲ（ａ−ＣＤＲ−Ｌ１、ａ−ＣＤＲ−Ｌ２、ａ−ＣＤＲ−Ｌ３、ａ−ＣＤＲ−Ｈ１、ａ−ＣＤＲ−Ｈ２、及びａ−ＣＤＲ−Ｈ３）は、Ｌ１の３１〜３４、Ｌ２の５０〜５５、Ｌ３の８９〜９６、Ｈ１の３１〜３５Ｂ、Ｈ２の５０〜５８、及びＨ３の９５〜１０２のアミノ酸残基に存在する（Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13, 1619-1633 (2008)を参照）。特に指定しない限り、可変ドメインにおけるＨＶＲ残基及び他の残基（例えば、ＦＲ残基）は、本明細書ではKabat et al.（上記）に従って付番される（「Kabat付番」と呼ばれる）。
「フレームワーク」又は「ＦＲ」とは、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、一般的に、４つのＦＲドメイン：ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４からなる。したがって、ＨＶＲ及びＦＲ配列は、一般的に、ＶＨ（又はＶＬ）における以下の配列にみられる：ＦＲ１−Ｈ１（Ｌ１）−ＦＲ２−Ｈ２（Ｌ２）−ＦＲ３−Ｈ３（Ｌ３）−ＦＲ４。
「ヒト免疫グロブリン」は、ヒト若しくはヒト細胞によって産生されるか、又はヒト免疫グロブリンレパートリー若しくは他のヒト免疫グロブリンコード配列を利用する非ヒト起源由来の免疫グロブリンのアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有するものである。このヒト免疫グロブリンの定義は、具体的には、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化免疫グロブリンを除外する。
用語「モノクローナル抗体」とは、本明細書で使用するとき、例えば、天然の変異を含有するか又はモノクローナル抗体調製物の産生中に生じる、可能性のあるバリアント抗体（このようなバリアントは、一般的に、微量存在する）を除いて、実質的に均質な抗体の集団、すなわち、集団に含まれる個々の抗体が同一である及び／又は同じエピトープに結合する集団から得られる抗体を指す。ポリクローナル抗体調製物（典型的に、様々な決定基（エピトープ）に対する様々な抗体を含む）とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原における単一の決定基に対する。したがって、修飾語「モノクローナル」とは、実質的に均質な抗体の集団から得られるという抗体の特徴を示し、そして、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とすると解釈すべきではない。例えば、本発明に従って用いられるモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、組み換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、及びヒト免疫グロブリン遺伝子座の全て又は一部を含有するトランスジェニック動物を利用する方法を含むがこれらに限定されない様々な技術によって作製することができ、このような方法及びモノクローナル抗体を作製する他の例示的な方法は、本明細書に記載される。
用語「Ｆｃドメイン」又は「Ｆｃ領域」は、本明細書では、定常領域の少なくとも一部を含有する免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために用いられる。この用語は、ネイティブ配列Ｆｃ領域及びバリアントＦｃ領域を含む。ＩｇＧ Ｆｃ領域は、ＩｇＧ ＣＨ２及びＩｇＧ ＣＨ３ドメインを含む。ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域の「ＣＨ２ドメイン」は、通常、約２３１位のアミノ酸残基から約３４０位のアミノ酸残基まで延在する。１つの実施態様では、炭水化物鎖は、ＣＨ２ドメインに結合する。本明細書におけるＣＨ２ドメインは、ネイティブ配列ＣＨ２ドメインであってもバリアントＣＨ２ドメインであってもよい。「ＣＨ３ドメイン」は、Ｆｃ領域におけるＣ末端からＣＨ２ドメインまでの残基の伸長（すなわち、ＩｇＧの約３４１位のアミノ酸残基から約４４７位のアミノ酸残基まで）を含む。本明細書におけるＣＨ３領域は、ネイティブ配列ＣＨ３ドメインであってもバリアントＣＨ３ドメイン（例えば、その一方の鎖に「隆起」（「ノブ」）が導入され、そして、他方の鎖に、対応する「くぼみ」（「ホール」）が導入されたＣＨ３ドメイン；明示的に参照により本明細書に組み入れられる米国特許第５，８２１，３３３号を参照）であってもよい。このようなバリアントＣＨ３ドメインは、本明細書に記載する通り、２本の非同一免疫グロブリン重鎖のヘテロ二量体化を促進するために用いることができる。１つの実施態様では、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、Ｃｙｓ２２６又はＰｒｏ２３０から重鎖のカルボキシル末端まで延在する。しかし、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）は、存在していてもよく、していなくてもよい。本明細書において特に指定しない限り、Ｆｃ領域又は定常領域におけるアミノ酸残基の付番は、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991に記載されている通り、ＥＵインデックスとも呼ばれる、ＥＵ付番方式に従う。
用語「エフェクター機能」とは、免疫グロブリンのＦｃ領域に起因する生物活性を指し、これは、免疫グロブリンのアイソタイプによって変化する。免疫グロブリンのエフェクター機能の例は、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）、サイトカイン分泌、抗原提示細胞による免疫複合体介在性抗原取り込み、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）のダウンレギュレーション、及びＢ細胞の活性化を含む。
「活性化Ｆｃ受容体」は、免疫グロブリンのＦｃ領域による会合に続いて、受容体担持細胞を刺激するシグナル伝達事象を誘発して、エフェクター機能を実行するＦｃ受容体である。活性化Ｆｃ受容体は、ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２）、及びＦｃαＲＩ（ＣＤ８９）を含む。具体的な活性化Ｆｃ受容体は、ヒトＦｃγＲＩＩＩａである（UniProtアクセッション番号P08637（バージョン１４１）を参照）。
用語「インターロイキン−２」又は「ＩＬ−２」は、本明細書で使用するとき、特に指定しない限り、霊長類（例えば、ヒト）及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）等の哺乳類を含む、任意の脊椎動物起源由来の任意のネイティブＩＬ−２を指す。この用語は、プロセシングされていないＩＬ−２に加えて、細胞内でプロセシングにより生じる任意の形態のＩＬ−２も含む。また、この用語は、ＩＬ−２の天然バリアント、例えば、スプライシングバリアント又はアレルバリアントを含む。例示的なヒトＩＬ−２のアミノ酸配列を配列番号１に示す。プロセシングされていないヒトＩＬ−２は、更に、Ｎ末端に２０アミノ酸のシグナルペプチドを含むが、これは、成熟ＩＬ−２分子には存在しない。
「野性型ＩＬ−２」とも呼ばれる「ネイティブＩＬ−２」は、天然のＩＬ−２を意味する。ネイティブヒトＩＬ−２分子の配列を配列番号１に示す。本発明の目的のために、野性型という用語は、例えば、ヒトＩＬ−２の残基１２５に対応する位置のシステインをアラニンに置換する等、天然のネイティブＩＬ−２に比べてＩＬ−２受容体結合を変化させない１つ以上のアミノ酸変異を含むＩＬ−２の形態も含む。幾つかの実施態様では、本発明の目的のために、野性型ＩＬ−２は、アミノ酸置換Ｃ１２５Ａを含む（配列番号３を参照）。
用語「ＣＤ２５」又は「ＩＬ−２受容体α」は、本明細書で使用するとき、特に指定しない限り、霊長類（例えば、ヒト）及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）等の哺乳類を含む、任意の脊椎動物起源由来の任意のネイティブＣＤ２５を指す。この用語は、「完全長」のプロセシングされていないＣＤ２５に加えて、細胞内でプロセシングにより生じる任意の形態のＣＤ２５も含む。また、この用語は、ＣＤ２５の天然バリアント、例えば、スプライシングバリアント又はアレルバリアントを含む。特定の実施態様では、ＣＤ２５は、ヒトＣＤ２５である。例示的なヒトＣＤ２５のアミノ酸配列（シグナル配列Ａｖｉ−タグ及びＨｉｓタグを有する）を配列番号２５に示す。
用語「高親和性ＩＬ−２受容体」とは、本明細書で使用するとき、受容体γサブユニット（共通サイトカイン受容体γサブユニット、γｃ、又はＣＤ１３２としても知られている）、受容体βサブユニット（ＣＤ１２２又はｐ７０としても知られている）、及び受容体αサブユニット（ＣＤ２５又はｐ５５としても知られている）からなる、ＩＬ−２受容体のヘテロ三量体形態を指す。一方、用語「中親和性ＩＬ−２受容体」又は「ＩＬ−２受容体βγ」は、αサブユニットを含まず、γサブユニット及びβサブユニットのみを含むＩＬ−２受容体を指す（総説については、例えば、Olejniczak and Kasprzak, Med Sci Monit 14, RA179-189 (2008)を参照）。例示的なヒトＣＤ１２２及びＣＤ１３２（Ｈｉｓタグと共にＦｃ領域に融合）のアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号２１及び２３に示す。
「制御性Ｔ細胞」又は「Ｔｒｅｇ細胞」とは、他のＴ細胞（エフェクターＴ細胞）の応答を抑制することができる特殊な種類のＣＤ４＋Ｔ細胞を意味する。Ｔｒｅｇ細胞は、ＣＤ４、ＩＬ−２受容体のαサブユニット（ＣＤ２５）、及び転写因子forkhead box P3（ＦＯＸＰ３）の発現を特徴とし（Sakaguchi, Annu Rev Immunol 22, 531-62 (2004)）、そして、腫瘍が発現する抗原を含む抗原に対する末梢自己寛容の誘導及び維持において重要な役割を果たす。
「従来型ＣＤ４＋Ｔ細胞」とは、制御性Ｔ細胞以外のＣＤ４＋Ｔ細胞を意味する。従来型ＣＤ４＋メモリーＴ細胞は、ＣＤ４、ＣＤ３を発現するが、ＦＯＸＰ３は発現しないことを特徴とする。「従来型ＣＤ４＋メモリーＴ細胞」は、ＣＤ４５ＲＡを発現する「従来型ＣＤ４＋ナイーブＴ細胞」とは対照的に、ＣＤ４５ＲＡを発現しないことを更に特徴とする、従来型ＣＤ４＋Ｔ細胞のサブセットである。
「Ｔｒｅｇ細胞の選択的活性化」とは、本質的に、他のＴ細胞サブセット（例えば、ＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞、ＮＫ Ｔ細胞）又はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を同時に活性化することのないＴｒｅｇ細胞の活性化を意味する。これら細胞型を同定及び区別する方法については、実施例に記載する。活性化は、ＩＬ−２受容体のシグナル伝達の誘導（例えば、リン酸化ＳＴＡＴ５ａの検出によって測定される）、増殖の誘導（例えば、Ｋｉ−６７の検出によって測定される）、及び／又は活性化マーカー（例えば、ＣＤ２５）の発現のアップレギュレーションを含み得る。
用語「ペプチドリンカー」とは、１つ以上のアミノ酸、典型的には、約２〜２０のアミノ酸を含むペプチドを指す。ペプチドリンカーは、当技術分野において公知であるか、又は本明細書に記載される。好適な非免疫原性リンカーペプチドは、例えば、（Ｇ４Ｓ）ｎ、（ＳＧ４）ｎ、又はＧ４（ＳＧ４）ｎペプチドリンカーを含む。「ｎ」は、一般的に、１〜１０、典型的に、２〜４の数字である。
用語「改変」とは、ポリペプチドのペプチド骨格（例えば、アミノ酸配列）の任意の操作、又は翻訳後修飾（例えば、グリコシル化）を指す。
「knob-into-hole改変」とは、ｉ）一方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、あるアミノ酸残基がより大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換されて、一方の重鎖のＣＨ３ドメインにおける界面内に、他方の重鎖のＣＨ３ドメインにおける界面内のくぼみ（「ホール」）に配置し得る隆起（「ノブ」）が作製され、そして、ｉｉ）他方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、あるアミノ酸残基がより小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換されて、第２のＣＨ３ドメインにおける界面内に、第１のＣＨ３ドメインにおける界面内の隆起（「ノブ」）を配置し得るくぼみ（「ホール」）が作製される、ＣＨ３ドメインにおける２本の免疫グロブリン重鎖間の界面内の改変を指す。１つの実施態様では、「knob-into-hole改変」は、抗体重鎖のうちの１本にアミノ酸置換Ｔ３６６Ｗ及び場合によりアミノ酸置換Ｓ３５４Ｃを含み、そして、抗体重鎖のうちの他方の１本にアミノ酸置換Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、及び場合によりＹ３４９Ｃを含む。knob-into-hole技術は、例えば、米国特許第５，７３１，１６８号；米国特許第７，６９５，９３６号；Ridgway et al., Prot Eng 9, 617-621 (1996)、及びCarter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001)に記載されている。一般的に、この方法は、第１のポリペプチドの界面に隆起（「ノブ」）、そして、第２のポリペプチドの界面に対応するくぼみ（「ホール」）を導入することを含み、その結果、ヘテロ二量体の形成を促進し、そして、ホモ二量体の形成を妨げるために、隆起をくぼみ内に配置することができる。隆起は、第１のポリペプチドの界面からの小さなアミノ酸側鎖をより大きな側鎖（例えば、チロシン又はトリプトファン）で置換することによって構築される。隆起と同一又は類似のサイズの代償性くぼみは、大きなアミノ酸側鎖をより小さなアミノ酸側鎖（例えば、アラニン又はトレオニン）で置換することによって、第２のポリペプチドの界面に作製される。それぞれ、Ｓ３５４位及びＹ３４９位に２つのシステイン残基を導入することにより、Ｆｃ領域における２本の抗体重鎖間にジスルフィド架橋が形成されて、二量体が更に安定化される（Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001)）。
アミノ酸「置換」とは、ポリペプチドにおいてあるアミノ酸を別のアミノ酸で置換することを指す。１つの実施態様では、アミノ酸は、例えば、保存的アミノ酸置換等、類似の構造及び／又は化学的特性を有する別のアミノ酸で置換される。「保存的」アミノ酸置換は、関与する残基の極性、電荷、可溶性、疎水性、親水性、及び／又は両親媒性の類似性に基づいて行うことができる。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸は、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、及びメチオニンを含み；極性中性アミノ酸は、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、及びグルタミンを含み；正荷電（塩基性）アミノ酸は、アルギニン、リジン、及びヒスチジンを含み；そして、負荷電（酸性）アミノ酸は、アスパラギン酸及びグルタミン酸を含む。非保存的置換は、これらクラスのうちの１つのメンバーを別のクラスと交換することを伴う。例えば、ある群（例えば、極性）のアミノ酸が、異なる群（例えば、塩基性）の別のアミノ酸で置換される等、アミノ酸置換によって、あるアミノ酸が異なる構造及び／又は化学的特性を有する別のアミノ酸で置換されることもある。アミノ酸置換は、当技術分野において周知の遺伝学的方法又は化学的方法を用いて作製することができる。遺伝学的方法は、部位特異的突然変異誘発、ＰＣＲ、遺伝子合成等を含み得る。化学的改変等の遺伝子操作以外の方法によってアミノ酸の側鎖基を変化させる方法も有用であり得ると考えられる。同じアミノ酸置換を表すために本明細書では様々な表記を用いる場合がある。例えば、免疫グロブリン重鎖の３２９位におけるプロリンのグリシンへの置換は、３２９Ｇ、Ｇ３２９、Ｇ３２９、Ｐ３２９Ｇ、又はＰｒｏ３２９Ｇｌｙと表すことができる。
参照ポリペプチド配列に関する「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」は、配列をアラインメントし、そして、必要に応じて、ギャップを導入して、最高の配列同一性パーセントを達成した後、参照ポリペプチド配列におけるアミノ酸残基と同一である、候補配列におけるアミノ酸残基の百分率として定義され、そして、任意の保存的置換は、配列同一性の一部として考慮しない。アミノ酸配列同一性パーセントを求めるためのアラインメントは、例えば、BLAST、BLAST-2、ALIGN、又はMegalign（DNASTAR）ソフトウェア等の公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを用いて、当技術分野における技能の範囲内である様々な方法で行うことができる。当業者は、比較される配列の完全長に対して最高アラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、配列をアラインメントするための適切なパラメータを決定することができる。しかし、本明細書における目的のために、アミノ酸配列同一性％の値は、配列比較コンピュータプログラムALIGN-2を用いて生成される。ALIGN-2配列比較コンピュータプログラムは、Genentech, Inc.によって作成され、そして、ソースコードは、米国著作権局（Washington D.C., 20559）にユーザー文書と共に提出されており、米国著作権登録第TXU510087号として登録されている。ALIGN-2プログラムは、Genentech, Inc.（South San Francisco, California）から公的に入手可能であるか、又はソースコードからコンパイルしてもよい。ALIGN-2プログラムは、digital UNIX（登録商標）V4.0Dを含むUNIX（登録商標）オペレーティングシステムにおいて用いるためにコンパイルされるべきである。全ての配列比較パラメータは、ALIGN-2プログラムによって設定され、変化しない。アミノ酸配列を比較するためにALIGN-2を使用する状況では、所与のアミノ酸配列Ｂへの、それとの、又はそれに対する所与のアミノ酸配列Ａのアミノ酸配列同一性％（これは、あるいは、所与のアミノ酸配列Ｂへの、それとの、又はそれに対する特定のアミノ酸配列同一性％を有するか又は含む所与のアミノ酸配列Ａと、表すこともできる）は、以下の通り計算する：
１００×割合Ｘ／Ｙ
（式中、Ｘは、このプログラムによるＡ及びＢのアラインメントにおける、配列アラインメントプログラムALIGN-2によって完全一致としてスコア化されたアミノ酸残基の数であり、そして、式中、Ｙは、Ｂにおけるアミノ酸残基の合計数である）。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合、ＡのＢに対するアミノ酸配列同一性％は、ＢのＡに対するアミノ酸配列同一性％と等しくはならないことが理解されるであろう。特に具体的に記載しない限り、本明細書で用いられる全てのアミノ酸配列同一性％の値は、ALIGN-2コンピュータプログラムを用いて、直前の段落に記載の通り得られる。
本明細書で互換的に使用される「ポリヌクレオチド」又は「核酸」は、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを指し、そして、ＤＮＡ及びＲＮＡを含む。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、若しくは塩基、及び／又はこれらの類似体、あるいは、ＤＮＡ若しくはＲＮＡポリメラーゼによって又は合成反応によって、ポリマーに組み込まれ得る任意の基質であってよい。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチド及びその類似体等の修飾ヌクレオチドを含んでよい。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって中断されてもよい。ポリヌクレオチドは、標識への結合等、合成後に行われる修飾を含んでよい。
本発明の参照ヌクレオチド配列に対して、例えば、少なくとも９５％「同一」であるヌクレオチド配列を有する核酸又はポリヌクレオチドとは、ポリヌクレオチド配列が、参照ヌクレオチド配列の各１００ヌクレオチド当たり５個以下の点変異を含み得ることを除いて、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が参照配列と同一であることを意図する。言い換えれば、参照ヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るためには、参照配列におけるヌクレオチドの５％以下を欠失させるか又は別のヌクレオチドで置換してもよく、あるいは、参照配列における全ヌクレオチドの５％以下の数のヌクレオチドを参照配列に挿入してもよい。参照配列のこれら変化は、参照ヌクレオチド配列の５’若しくは３’末端位置、又はこれら末端位置間のどこにでも生じ得、この場合、参照配列における残基間に個々に、又は参照配列内の１つ以上の連続する基に散在する。実際問題として、任意の特定のポリヌクレオチド配列が、本発明のヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるかどうかは、ポリペプチドについて上で論じたもの（例えば、ALIGN-2）等の公知のコンピュータプログラムを用いて従来通り決定することができる。
用語「ベクター」とは、本明細書で使用するとき、それが結合している別の核酸を増殖させることができる核酸分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクターに加えて、ベクターが導入されている宿主細胞のゲノムに組み込まれているベクターも含む。特定のベクターは、それらが機能的に連結されている核酸の発現を導くことができる。このようなベクターを、本明細書では「発現ベクター」と称する。
用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」、及び「宿主細胞培養物」は、互換的に使用され、そして、外因性核酸が導入されている細胞を指し、このような細胞の後代を含む。宿主細胞は、「形質転換体」及び「形質転換細胞」を含み、これらは、一次形質転換細胞、及び継代回数を問わず、該一次形質転換細胞に由来する後代を含む。後代は、核酸含量が親細胞と完全には同一でなくてもよく、変異を含んでいてもよい。本明細書では、最初に形質転換した細胞においてスクリーニング又は選別したのと同じ機能又は生物活性を有する変異体後代が含まれる。宿主細胞は、本発明の融合タンパク質を作製するために用いることができる任意の種類の細胞系である。宿主細胞は、ほんの数例を挙げると、培養細胞、例えば、哺乳類培養細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＹＯ骨髄腫細胞、Ｐ３Ｘ６３マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、又はハイブリドーマ細胞）、酵母細胞、昆虫細胞、及び植物細胞を含むが、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物、又は植物若しくは動物の培養組織内に含まれる細胞も含む。
薬剤の「有効量」とは、投与される細胞又は組織において生理学的変化をもたらすのに必要な量を指す。
薬剤、例えば、医薬組成物の「治療上有効な量」とは、所望の治療的又は予防的結果を達成するために、必要な投与量で必要な期間にわたり有効な量を指す。例えば、治療上有効な量の薬剤は、疾患の有害作用を排除、減少、遅延、最小化、又は予防する。
「個体」又は「被験体」は、哺乳類である。哺乳類は、家畜動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、及びウマ）、霊長類（例えば、ヒト、及びサル等の非ヒト霊長類）、ウサギ、及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）を含むが、これらに限定されない。特に、個体又は被験体は、ヒトである。
用語「医薬組成物」とは、含有される活性成分の生物活性を有効にすることができるような形態であり、そして、製剤が投与される被験体に対して許容不可能なほどの毒性を有する追加成分を含有しない調製物を指す。
「薬学的に許容し得る担体」とは、被験体に対して非毒性である、医薬組成物中の活性成分以外の成分を指す。薬学的に許容し得る担体は、バッファ、賦形剤、安定剤、又は保存剤を含むが、これらに限定されない。
本明細書で使用するとき、「処置」（及び「処置する」又は「処置している」等の文法上の変形）とは、処置される個体における疾患の自然経過を変化させようとする試みにおける臨床的介入を指し、そして、予防のため又は臨床病理の経過中に実施してよい。処置の望ましい効果は、疾患の発症又は再発の予防、症状の軽減、疾患の任意の直接的又は間接的な病理学的帰結の減弱、転移の予防、疾患進行の速度の低減、疾患状態の寛解又は緩和、及び緩解又は予後の改善を含むが、これらに限定されない。幾つかの実施態様では、本発明の抗体は、疾患の発症を遅延させるか又は疾患の進行を減速させるために用いられる。
「自己免疫疾患」とは、個体自身の組織から発生し、そして、個体自身の組織に対する非悪性の疾患又は障害を指す。自己免疫疾患又は障害の例は、炎症性皮膚疾患（乾癬及び皮膚炎（例えば、アトピー性皮膚炎）を含む）等の炎症反応；炎症性腸疾患に関連する反応（例えば、クローン病及び潰瘍性大腸炎）；皮膚炎；湿疹及び喘息等のアレルギー症状；関節リウマチ；全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）（ループス腎炎、皮膚ループスを含むがこれらに限定されない）；糖尿病（例えば、１型糖尿病又はインスリン依存性糖尿病）；多発性硬化症及び若年発症糖尿病を含むが、これらに限定されない。
本発明の融合タンパク質
本発明は、本明細書に記載する通り、治療方法で用いるために特に有利な特性を有する新規免疫グロブリン−ＩＬ−２融合タンパク質を提供する。
第１の態様では、本発明は、（ｉ）免疫グロブリン分子と、（ｉｉ）野性型ＩＬ−２分子と比べたとき、中親和性ＩＬ−２受容体に対する変異体ＩＬ−２分子の親和性を低減するアミノ酸変異を含む２つの変異体インターロイキン−２（ＩＬ−２）分子とを含む融合タンパク質を提供する。
１つの実施態様では、前記融合タンパク質は、免疫グロブリン分子と、野性型ＩＬ−２分子と比べたとき、中親和性ＩＬ−２受容体に対する変異体ＩＬ−２分子の親和性を低減するアミノ酸変異を含む２つの変異体インターロイキン−２（ＩＬ−２）分子と、場合により１つ以上のペプチドリンカーとから本質的になる。
実施例に示す通り、２つのＩＬ−２分子を含む融合タンパク質は、驚くべきことに、単一のＩＬ−２分子を含む対応する融合タンパク質と比べたとき、制御性Ｔ細胞の活性化において大きく改善された有効性及び選択性を提供する。更に、中親和性ＩＬ−２受容体への結合が低減した２つの（１つだけではなく）変異体ＩＬ−２分子を含む融合タンパク質のみが、制御性Ｔ細胞に対して著しい刺激活性を保持する。
１つの実施態様では、前記免疫グロブリン分子は、ＩｇＧクラスの免疫グロブリン分子、特に、ＩｇＧ１サブクラスの免疫グロブリン分子である。１つの実施態様では、前記免疫グロブリン分子は、ヒト免疫グロブリン分子であり、すなわち、ヒトの可変領域及び定常領域を完全に含む。例示的なヒトＩｇＧ１定常領域の配列を、配列番号８に示す。ＩｇＧクラスの免疫グロブリン分子は、（ｉ）それぞれＮ末端からＣ末端に向かって軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）及び軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）を含む、２本の免疫グロブリン軽鎖と、（ｉｉ）それぞれＮ末端からＣ末端に向かって重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、重鎖定常ドメイン（ＣＨ）１、免疫グロブリンヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインを含む、２本の免疫グロブリン重鎖とを含む。後者２つのドメインは、免疫グロブリン分子のＦｃ領域の一部を形成する。２本の重鎖は、Ｆｃ領域において二量体化する。
本発明に係る融合タンパク質の１つの実施態様では、前記２つの変異体ＩＬ−２分子は、それぞれ、Ｎ末端アミノ酸において、場合によりペプチドリンカーを介して、前記免疫グロブリン分子の免疫グロブリン重鎖のうちの１本のＣ末端アミノ酸に融合する。２つの（同一の）ＩＬ−２分子と免疫グロブリン重鎖との融合により、融合タンパク質を簡便に産生し、不所望の副生成物の形成を避け、そして、knob-into-hole改変等の非同一重鎖のヘテロ二量体化を促進する改変の必要性をなくすことができる。
本発明に係る融合タンパク質の特定の実施態様では、前記２つの変異体ＩＬ−２分子は、ペプチドリンカーを介して前記免疫グロブリン分子に融合する。１つの実施態様では、前記２つの変異体ＩＬ−２分子は、それぞれ、ペプチドリンカーを介して前記免疫グロブリン分子に融合する。１つの実施態様では、前記２つの変異体ＩＬ−２分子は、それぞれ、Ｎ末端アミノ酸において、ペプチドリンカーを介して、前記免疫グロブリン分子の免疫グロブリン重鎖のうちの１本のＣ末端アミノ酸に融合する。１つの実施態様では、前記変異体ＩＬ−２分子は、それぞれ、同一のアミノ酸配列を有するペプチドリンカーを介して前記免疫グロブリン分子に融合する。１つの実施態様では、前記ペプチドリンカーは、少なくとも１０個のアミノ酸を含む。具体的な実施態様では、前記ペプチドリンカーは、少なくとも１５個のアミノ酸を含む。理論に束縛されることは望まないが、この長さのペプチドリンカーは、変異体ＩＬ−２分子をＩＬ−２受容体、特に、高親和性（ヘテロ三量体）ＩＬ−２受容体に最適に結合させるための柔軟性を提供することができる。具体的な実施態様では、前記ペプチドリンカーは、１５個のアミノ酸を含む。更により具体的な実施態様では、前記ペプチドリンカーは、アミノ酸配列（Ｇ４Ｓ）３（配列番号６６）を含む。１つの実施態様では、前記ペプチドリンカーは、１５アミノ酸長である。１つの実施態様では、前記ペプチドリンカーは、アミノ酸配列（Ｇ４Ｓ）３（配列番号６６）を有する。１つの実施態様では、前記ペプチドリンカーは、１５個のアミノ酸からなる。１つの実施態様では、前記ペプチドリンカーは、アミノ酸配列（Ｇ４Ｓ）３（配列番号６６）からなる。
ＩＬ−２分子の免疫グロブリン分子への融合は、遊離（融合していない）ＩＬ−２と比べて、長い血清半減期を含む好ましい薬物動態特性を提供する（ＦｃＲｎへの結合を通じた再利用、そして、腎臓濾過の閾値をかなり上回る分子サイズに起因する）。更に、免疫グロブリン分子の存在は、例えば、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーにより融合タンパク質を簡便に精製することも可能にする。興味深いことに、実施例に示す通り、中親和性ＩＬ−２受容体に対する結合が低減した２つの変異体ＩＬ−２分子を含む融合タンパク質は、２つの野性型ＩＬ−２分子を含む対応する融合タンパク質よりも長い血清半減期を有する。また、免疫グロブリン分子、すなわち、天然に存在する種類の分子への融合は、抗薬物抗体の形成を通して融合タンパク質の毒性を最小化することができる。
免疫グロブリン分子、具体的には、免疫グロブリン分子のＦｃ領域の存在は、融合タンパク質の薬物動態特性のためには好ましいが、同時に、好ましいＩＬ−２受容体担持細胞ではなくＦｃ受容体を発現している細胞に対する融合タンパク質の不所望のターゲティングを導くことがある。更に、Ｆｃ受容体の会合は、（炎症促進性）サイトカインの放出、及び制御性Ｔ細胞以外の様々な免疫細胞の不所望の活性化を導くことがある。したがって、特定の実施態様では、本発明の融合タンパク質に含まれる前記免疫グロブリン分子は、下記改変を含まない対応する免疫グロブリン分子と比べたとき、Ｆｃ受容体に対する免疫グロブリン分子の結合親和性を低減する改変を含む。具体的な実施態様では、前記Ｆｃ受容体は、Ｆｃγ受容体、特に、ヒトＦｃγ受容体である。Ｆｃ受容体に対する結合親和性は、例えば、ＥＬＩＳＡによって、又はBIAcore装置（GE Healthcare）等の標準的な装置を用いる表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって、容易に決定することができ、そして、このようなＦｃ受容体は、組み換え発現によって得ることができる。結合親和性を測定するための具体的な実例となる例示的な実施態様について、以下に記載する。１つの実施態様によれば、Ｆｃ受容体に対する結合親和性は、ＣＭ５チップに固定されたリガンド（Ｆｃ受容体）を用い、２５℃で、BIACORE（登録商標）T100機器（GE Healthcare）を用いて、表面プラズモン共鳴によって測定される。簡潔に述べると、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５、GE Healthcare）を、供給業者の指示書に従って、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）で活性化する。組み換えリガンドを１０mM 酢酸ナトリウム（pH５．５）で０．５〜３０μg/mLに希釈した後、１０μL/分の流速で注入して、およそ１００〜５０００応答単位（ＲＵ）の結合タンパク質を得る。リガンドの注入後、１M エタノールアミンを注入して未反応基をブロックする。反応速度測定のために、抗体の３〜５倍連続希釈物（約０．０１nM〜３００nMの範囲）を、およそ３０〜５０μL/分の流速で２５℃にてＨＢＳ−ＥＰ＋（GE Healthcare、１０mM ＨＥＰＥＳ、１５０mM ＮａＣｌ、３mM ＥＤＴＡ、０．０５％ Surfactant P20、pH７．４）に注入する。会合及び解離センサグラムを同時にフィッティングすることによって、単純な１対１Langmuir結合モデル（BIACORE（登録商標）T100評価ソフトウェアバージョン１．１．１）を用いて、会合速度（ｋｏｎ）及び解離速度（ｋｏｆｆ）を計算する。ｋｏｆｆ／ｋｏｎの比として平衡解離定数（ＫＤ）を計算する。例えば、Chen et al., J Mol Biol 293, 865-881 (1999)を参照。あるいは、抗体のＦｃ受容体に対する結合親和性は、ＦｃγＩＩＩａ受容体を発現しているＮＫ細胞等、特定のＦｃ受容体を発現することが知られている細胞株を用いて評価してもよい。
１つの実施態様では、改変は、免疫グロブリンのＦｃ受容体に対する結合親和性を低減する１つ以上のアミノ酸変異を含む。１つの実施態様では、アミノ酸変異は、アミノ酸置換である。典型的には、２本の免疫グロブリン重鎖のそれぞれに、同じ１つ以上のアミノ酸変異が存在する。１つの実施態様では、前記アミノ酸変異は、免疫グロブリンのＦｃ受容体に対する結合親和性を、少なくとも２倍、少なくとも５倍、又は少なくとも１０倍低減する。免疫グロブリンのＦｃ受容体に対する結合親和性を低減する１超のアミノ酸変異が存在する実施態様では、これらアミノ酸変異の組み合わせは、免疫グロブリンのＦｃ受容体に対する結合親和性を、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、又は更には少なくとも５０倍低減することができる。１つの実施態様では、前記免疫グロブリン分子は、前記改変を含まない対応する免疫グロブリン分子と比べて、２０％未満、具体的には１０％未満、より具体的には５％未満のＦｃ受容体に対する結合親和性を示す。
１つの実施態様では、前記Ｆｃ受容体は、活性化Ｆｃ受容体である。具体的な実施態様では、前記Ｆｃ受容体は、ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２）、及びＦｃαＲＩ（ＣＤ８９）の群から選択される。具体的な実施態様では、Ｆｃ受容体は、Ｆｃγ受容体、より具体的には、ＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩ、又はＦｃγＲＩＩａ受容体である。好ましくは、これら各受容体に対する結合親和性は低減される。更により具体的な実施態様では、前記Ｆｃ受容体は、ＦｃγＩＩＩａ、特に、ヒトＦｃγＩＩＩａである。幾つかの実施態様では、補体成分に対する結合親和性、具体的には、Ｃ１ｑに対する結合親和性も低減される。１つの実施態様では、新生児型Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対する結合親和性は低減されない。ＦｃＲｎに対する実質的に同様の結合、すなわち、免疫グロブリン分子の前記受容体に対する結合親和性の保持は、免疫グロブリン分子が、非改変型免疫グロブリン分子のＦｃＲｎに対する結合親和性の約７０％超を示すときに実現される。本発明の融合タンパク質に含まれる免疫グロブリン分子は、このような親和性の約８０％超、そして、更には約９０％超を示し得る。
１つの実施態様では、免疫グロブリン分子のＦｃ受容体に対する結合親和性を低減する前記改変は、免疫グロブリン分子のＦｃ領域、特に、ＣＨ２領域に存在する。１つの実施態様では、前記免疫グロブリン分子は、免疫グロブリン重鎖の３２９位（ＥＵ付番）にアミノ酸置換を含む。より具体的な実施態様では、前記アミノ酸置換は、Ｐ３２９Ａ又はＰ３２９Ｇ、特にＰ３２９Ｇである。１つの実施態様では、前記免疫グロブリン分子は、免疫グロブリン重鎖の２３４位及び２３５位（ＥＵ付番）にアミノ酸置換を含む。具体的な実施態様では、前記アミノ酸置換は、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ（ＬＡＬＡ）である。１つの実施態様では、前記免疫グロブリン分子は、抗体重鎖の３２９位（ＥＵ付番）にアミノ酸置換を含み、そして、免疫グロブリン重鎖の２２８位、２３３位、２３４位、２３５位、２９７位、及び３３１位（ＥＵ付番）から選択される位置に更なるアミノ酸置換を含む。より具体的な実施態様では、更なるアミノ酸置換は、Ｓ２２８Ｐ、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｄ、又はＰ３３１Ｓである。具体的な実施態様では、前記免疫グロブリン分子は、免疫グロブリン重鎖のＰ３２９、Ｌ２３４、及びＬ２３５位（ＥＵ付番）にアミノ酸置換を含む。より具体的な実施態様では、前記免疫グロブリン分子は、免疫グロブリン重鎖にアミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｇ（ＬＡＬＡ Ｐ３２９Ｇ；ＥＵ付番）を含む。このアミノ酸置換の組み合わせは、全文が参照により本明細書に組み入れられる国際公開第２０１２／１３０８３１号に記載の通り、ヒトＩｇＧクラス免疫グロブリンのＦｃγ受容体結合を特に有効に消滅させる。また、国際公開第２０１２／１３０８３１号には、このような改変型免疫グロブリンを調製する方法、及びＦｃ受容体結合又はエフェクター機能等の該改変型免疫グロブリンの特性を決定する方法についても記載されている。
免疫グロブリン重鎖に改変を含む免疫グロブリンは、当技術分野において周知の遺伝学的方法又は化学的方法を用いてアミノ酸を欠失、置換、挿入、又は改変することによって調製することができる。遺伝学的方法は、コードＤＮＡ配列の部位特異的突然変異誘発、ＰＣＲ、遺伝子合成等を含み得る。正確なヌクレオチドの変化は、例えば、シーケンシングによって確認することができる。
Ｆｃ受容体の結合を低減する改変を含む免疫グロブリン又は抗体は、一般的に、対応する非改変型の免疫グロブリン又は抗体と比べて、エフェクター機能、特に、ＡＤＣＣが低減されている。したがって、１つの実施態様では、免疫グロブリン分子のＦｃ受容体に対する結合親和性を低減する前記改変は、免疫グロブリン分子のエフェクター機能を低減する。具体的な実施態様では、前記エフェクター機能は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）である。１つの実施態様では、ＡＤＣＣは、前記改変を含まない対応する免疫グロブリン分子によって誘導されるＡＤＣＣの２０％未満まで低減される。免疫グロブリン又は抗体のエフェクター機能は、当技術分野において公知の方法によって測定することができる。対象となる分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのインビトロアッセイの例は、 米国特許第５，５００，３６２号；Hellstrom et al. Proc Natl Acad Sci USA 83, 7059-7063 (1986)及びHellstrom et al., Proc Natl Acad Sci USA 82, 1499-1502 (1985)；米国特許第５，８２１，３３７号；Bruggemann et al., J Exp Med 166, 1351-1361 (1987)に記載されている。あるいは、非放射性アッセイ法を使用してもよい（例えば、フローサイトメトリー用のACTI（商標）非放射性細胞傷害アッセイ（CellTechnology, Inc. Mountain View, CA）；及びCytoTox 96（登録商標）非放射性細胞傷害アッセイ(Promega, Madison, WI)を参照）。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞は、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む。あるいは又は更に、対象となる分子のＡＤＣＣ活性は、インビボで、例えば、Clynes et al., Proc Natl Acad Sci USA 95, 652-656 (1998)に開示されているような動物モデルにおいて評価してよい。幾つかの実施態様では、免疫グロブリン分子の補体成分、具体的には、Ｃ１ｑに対する結合も低減される。したがって、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）も低減され得る。免疫グロブリンがＣ１ｑに結合することができるかどうか、ひいては、ＣＤＣ活性を有するかどうかを決定するために、Ｃ１ｑ結合アッセイを行ってよい。例えば、国際公開第２００６／０２９８７９号及び国際公開第２００５／１００４０２号におけるＣ１ｑ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照。補体活性を評価するために、ＣＤＣアッセイを実施してもよい（例えば、Gazzano-Santoro et al., J Immunol Methods 202, 163 (1996)；Cragg et al., Blood 101, 1045-1052 (2003)；及びCragg and Glennie, Blood 103, 2738-2743 (2004)を参照）。
上記及び国際公開第２０１２／１３０８３１号に記載の免疫グロブリン分子に加えて、Ｆｃ受容体の結合及び／又はエフェクター機能の低減された免疫グロブリンは、また、Ｆｃ領域の残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７、及び３２９のうちの１つ以上が置換されているものを含む（米国特許第６，７３７，０５６号）。このようなＦｃ変異体は、残基２６５及び２９７がアラニンに置換されている、いわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ変異体を含む、アミノ酸２６５位、２６９位、２７０位、２９７位、及び３２７位のうちの２つ以上が置換されているＦｃ変異体を含む（米国特許第７，３３２，５８１号）。
ＩｇＧ４サブクラスの免疫グロブリンは、ＩｇＧ１免疫グロブリンと比べて低減されたＦｃ受容体に対する結合親和性及びエフェクター機能を示す。したがって、幾つかの実施態様では、本発明の融合タンパク質に含まれる前記免疫グロブリン分子は、ＩｇＧ４サブクラスの免疫グロブリン、具体的には、ヒトＩｇＧ４サブクラスの免疫グロブリンである。１つの実施態様では、前記ＩｇＧ４サブクラスの免疫グロブリンは、Ｓ２２８位（ＥＵ付番）においてＦｃ領域におけるアミノ酸置換、具体的には、アミノ酸置換Ｓ２２８Ｐを含む。Ｆｃ受容体に対する結合親和性及び／又はそのエフェクター機能を更に低減するために、１つの実施態様では、前記ＩｇＧ４サブクラスの免疫グロブリンは、Ｌ２３５位におけるアミノ酸置換、具体的には、アミノ酸置換Ｌ２３５Ｅ（ＥＵ付番）を含む。別の実施態様では、前記ＩｇＧ４サブクラスの免疫グロブリンは、Ｐ３２９位におけるアミノ酸置換、具体的には、アミノ酸置換Ｐ３２９Ｇ（ＥＵ付番）を含む。具体的な実施態様では、前記ＩｇＧ４サブクラスの免疫グロブリンは、Ｓ２２８位、Ｌ２３５位、及びＰ３２９位におけるアミノ酸置換、具体的には、アミノ酸置換Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、及びＰ３２９Ｇ（ＥＵ付番）を含む。このような改変型ＩｇＧ４サブクラスの免疫グロブリン及びそのＦｃγ受容体結合特性については、全文が参照により本明細書に組み入れられる国際公開第２０１２／１３０８３１号に記載されている。
１つの実施態様では、前記免疫グロブリン分子は、抗原に特異的に結合することができる。１つの実施態様では、前記免疫グロブリン分子は、モノクローナル抗体である。１つの実施態様では、前記免疫グロブリン分子は、抗原に特異的に結合することができない、具体的には、ヒト抗原に特異的に結合することができない。このような免疫グロブリン分子の抗原に対する特異的結合の欠如（すなわち、非特異的相互作用と識別することができる任意の結合の欠如）は、例えば、本明細書に記載する通り、ＥＬＩＳＡ又は表面プラズモン共鳴によって決定することができる。このような免疫グロブリン分子は、例えば、特定の組織に対するターゲティングが望ましくない場合、融合タンパク質の血清半減期を延長するために特に有用である。
１つの実施態様では、前記免疫グロブリン分子は、ヒトＶｈ３−２３生殖系列配列に基づく重鎖可変領域配列を含む。具体的な実施態様では、前記免疫グロブリン分子は、配列番号９の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一である重鎖可変領域配列を含む。１つの実施態様では、前記免疫グロブリン分子は、ヒトＶｋ３−２０生殖系列配列に基づく軽鎖可変領域配列を含む。具体的な実施態様では、前記免疫グロブリン分子は、配列番号１１の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一である軽鎖可変領域配列を含む。更により具体的な実施態様では、前記免疫グロブリン分子は、配列番号９の重鎖可変領域配列及び配列番号１１の軽鎖可変領域配列を含む。これら可変領域配列を含む免疫グロブリン分子は、抗原、特に、ヒト抗原に対して特異的に結合することができない。これらは、正常組織に加えてＰＢＭＣにも結合せず、多重反応性を有さず、そして、イメージングによってインビボにおける非特異的蓄積を示さない（データは示さない）。可変領域配列は、非結合免疫グロブリンを作製するためにＧＳＧ配列が導入されている重鎖ＣＤＲ３を除いて、全体的に、ヒト生殖系列配列に基づいている。
１つの実施態様では、前記変異体ＩＬ−２分子は、ヒトＩＬ−２（配列番号１）の残基８８に対応する位置にアミノ酸変異を含む。１つの実施態様では、前記アミノ酸変異は、アミノ酸置換である。より具体的な実施態様では、前記アミノ酸置換は、Ｎ８８Ｄ、Ｎ８８Ｒ、Ｎ８８Ｉ、及びＮ８８Ｇの群から選択される。具体的な実施態様では、前記アミノ酸置換は、Ｎ８８Ｄである。１つの実施態様では、前記変異体ＩＬ−２分子は、ヒトＩＬ−２分子である。具体的な実施態様では、前記変異体ＩＬ−２分子は、配列番号６０の配列（ＩＬ−２ Ｎ８８Ｄ）を含む。１つの実施態様では、前記変異体ＩＬ−２分子は、野性型ＩＬ−２分子と比べたとき、中親和性ＩＬ−２受容体に対する変異体ＩＬ−２分子の親和性を低減するアミノ酸変異を１つだけ含む。１つの実施態様では、前記変異体ＩＬ−２分子は、野性型ＩＬ−２分子と比べたとき、高親和性ＩＬ−２受容体に対する変異体ＩＬ−２分子の親和性を変化させるアミノ酸変異を含まない。１つの実施態様では、前記変異体ＩＬ−２分子は、野性型ＩＬ−２分子と比べたとき、ＩＬ−２受容体に対する変異体ＩＬ−２分子の親和性を変化させるアミノ酸変異を１つだけ含む。
１つの実施態様では、前記変異体ＩＬ−２分子は、更に、ヒトＩＬ−２の残基１２５に対応する位置にアミノ酸置換を含む。１つの実施態様では、前記アミノ酸置換は、Ｃ１２５Ａである。具体的な実施態様では、前記変異体ＩＬ−２分子は、配列番号６２の配列（アミノ酸置換Ｃ１２５Ａを有するＩＬ−２ Ｎ８８Ｄ）を含む。あるいは、米国特許第４，５１８，５８４号に記載の通り、１２５位におけるシステインを、セリン、トレオニン、又はバリン等の別の中性アミノ酸で置換して、それぞれ、Ｃ１２５Ｓ ＩＬ−２、Ｃ１２５Ｔ ＩＬ−２、又はＣ１２５Ｖ ＩＬ−２を得ることもできる。本明細書に記載する通り、ＩＬ−２のＮ末端アラニン残基を欠失させて、ｄｅｓ−Ａ１ Ｃ１２５Ｓ又はｄｅｓ−Ａ１ Ｃ１２５Ａ等の変異体を得ることもできる。あるいは又は更に、ＩＬ−２分子は、野性型ヒトＩＬ−２の１０４位に通常存在するメチオニンがアラニン等の中性アミノ酸で置換されている変異を含んでもよい（米国特許第５，２０６，３４４号を参照）。このようなヒトＩＬ−２における改変は、発現又は安定性の増大等の更なる利点を提供し得る。
また、本発明の融合タンパク質に含まれる変異体ＩＬ−２分子は、非グリコシル化ＩＬ−２分子であってもよい。例えば、ＩＬ−２分子のＯ−グリコシル化部位を削除すると、ＣＨＯ又はＨＥＫ細胞等の哺乳類細胞において融合タンパク質を発現させたとき、より均質な生成物が得られる。したがって、特定の実施態様では、変異体ＩＬ−２分子は、ヒトＩＬ−２の残基３に対応する位置におけるＩＬ−２のＯ−グリコシル化部位を削除する改変を更に含む。１つの実施態様では、ヒトＩＬ−２の残基３に対応する位置におけるＩＬ−２のＯ−グリコシル化部位を削除する前記改変は、アミノ酸置換である。例示的なアミノ酸置換は、Ｔ３Ａ、Ｔ３Ｇ、Ｔ３Ｑ、Ｔ３Ｅ、Ｔ３Ｎ、Ｔ３Ｄ、Ｔ３Ｒ、Ｔ３Ｋ、及びＴ３Ｐを含む。具体的な実施態様では、前記改変は、アミノ酸置換Ｔ３Ａである。具体的な実施態様では、前記変異体ＩＬ−２分子は、配列番号６４の配列（ＩＬ−２ Ｔ３Ａ Ｎ８８Ｄ）を含む。
具体的な実施態様では、変異体ＩＬ−２分子は、アミノ酸置換Ｔ３Ａ、Ｎ８８Ｄ、及びＣ１２５Ａを含む。具体的な実施態様では、前記変異体ＩＬ−２分子は、配列番号５８の配列（ＩＬ−２ Ｔ３Ａ Ｎ８８Ｄ Ｃ１２５Ａ）を含む。
１つの実施態様では、本発明の融合タンパク質のＩＬ−２βγ受容体に対する結合は、２つの野性型ＩＬ−２分子を含む対応する融合タンパク質のＩＬ−２βγ受容体に対する結合と比べたとき、少なくとも１．５倍、好ましくは少なくとも２倍、又は少なくとも３倍低減される。１つの実施態様では、本発明の融合タンパク質は、２５℃でＳＰＲによって測定したとき、２つの野性型ＩＬ−２分子を含む対応する融合タンパク質のＫＤよりも少なくとも２倍高い親和性定数（ＫＤ）でＩＬ−２βγ受容体に結合する。具体的な実施態様では、前記ＩＬ−２βγ受容体は、ヒトＩＬ−２βγ受容体である。１つの実施態様では、本発明の融合タンパク質のＩＬ−２α受容体に対する結合は、２つの野性型ＩＬ−２分子を含む対応する融合タンパク質のＩＬ−２α受容体に対する結合とほぼ同等である。１つの実施態様では、本発明の融合タンパク質は、２５℃でＳＰＲによって測定したとき、２つの野性型ＩＬ−２分子を含む対応する融合タンパク質のＫＤとほぼ同等の親和性定数（ＫＤ）でＩＬ−２α受容体に結合する。具体的な実施態様では、前記ＩＬ−２α受容体は、ヒトＩＬ−２α受容体である。ＩＬ−２βγ又はＩＬ−２α受容体に対する結合親和性をＳＰＲによって測定する方法は、本明細書に記載する。１つの実施態様によれば、結合親和性（ＫＤ）は、ＣＭ５又はストレプトアビジンチップに固定されたＩＬ−２受容体を用い、２５℃で、BIACORE（登録商標）T200機器（GE Healthcare）を用いて、表面プラズモン共鳴によって測定される。親和性定数（ＫＤ）は、ｋｏｆｆ／ｋｏｎの比として計算される。例えば、Chen et al., J Mol Biol 293, 865-881 (1999)を参照。
特定の態様では、本発明は、（ｉ）免疫グロブリン重鎖にアミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｇ（ＥＵ付番）を含むＩｇＧ１サブクラスの免疫グロブリン分子と、（ｉｉ）それぞれ、Ｎ末端アミノ酸において、ペプチドリンカーを介して、免疫グロブリン重鎖のうちの１本のＣ末端アミノ酸に融合している、アミノ酸置換Ｎ８８Ｄを含む２つの変異体インターロイキン−２（ＩＬ−２）分子とを含む融合タンパク質を提供する。１つの実施態様では、前記免疫グロブリン分子及び前記ＩＬ−２分子は、ヒトである。具体的な実施態様では、前記免疫グロブリン分子は、配列番号９の重鎖可変領域配列及び配列番号１１の軽鎖可変領域配列を含む。更に具体的な実施態様では、前記ＩＬ−２分子は、それぞれ、配列番号５８のアミノ酸配列を含む。更なる実施態様では、前記ペプチドリンカーは、アミノ酸配列（Ｇ４Ｓ）３（配列番号６６）を含む。更により具体的な実施態様では、前記融合タンパク質は、配列番号５０の配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるポリペプチド配列と、配列番号１９の配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるポリペプチド配列とを含む。
実施例に示す通り、本発明の融合タンパク質は、制御性Ｔ細胞を選択的に活性化する（すなわち、他のＴ細胞サブセット及び／又はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を同時に活性化することは本質的にない）。したがって、１つの態様では、本発明は、免疫グロブリン分子及び２つの変異体ＩＬ−２分子を含む融合タンパク質であって、エフェクターＴ細胞及びＮＫ細胞、具体的には、従来型ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、及びＮＫ細胞よりも制御性Ｔ細胞を選択的に活性化する融合タンパク質を提供する。１つの実施態様では、前記融合タンパク質は、エフェクターＴ細胞及びＮＫ細胞よりも少なくとも１０倍、少なくとも１００倍、又は少なくとも１０００倍高く、制御性Ｔ細胞を活性化する。１つの実施態様では、前記融合タンパク質は、従来型ＣＤ４＋メモリーＴ細胞よりも制御性Ｔ細胞を選択的に活性化する。１つの実施態様では、前記融合タンパク質は、従来型ＣＤ４＋メモリーＴ細胞よりも少なくとも１０倍、少なくとも１００倍、又は少なくとも１０００倍高く、制御性Ｔ細胞を活性化する。１つの実施態様では、前記活性化は、細胞内のＳＴＡＴ、特に、ＳＴＡＴ５のリン酸化レベルを測定することによって求められる。１つの実施態様では、細胞内ＳＴＡＴのリン酸化レベルの前記測定は、フローサイトメトリー分析によって行われる。１つの実施態様では、制御性Ｔ細胞におけるＩＬ−２受容体シグナル伝達の誘導についての前記融合タンパク質のＥＣ５０値は、エフェクターＴ細胞及びＮＫ細胞におけるＩＬ−２受容体シグナル伝達の誘導についてのＥＣ５０値よりも少なくとも１０倍、少なくとも１００倍、又は少なくとも１０００倍低い。１つの実施態様では、前記ＩＬ−２受容体シグナル伝達の誘導は、ＳＴＡＴリン酸化の誘導である。１つの実施態様では、制御性Ｔ細胞におけるＩＬ−２受容体シグナル伝達の誘導についての前記融合タンパク質のＥＣ５０値は、従来型ＣＤ４＋メモリーＴ細胞におけるＩＬ−２受容体シグナル伝達の誘導についてのＥＣ５０値よりも少なくとも１０倍、少なくとも１００倍、又は少なくとも１０００倍低い。１つの実施態様では、前記ＩＬ−２受容体シグナル伝達の誘導は、ＳＴＡＴリン酸化の誘導である。
更なる態様では、本発明は、具体的には、インビトロ又はインビボにおける制御性Ｔ細胞の選択的活性化において使用するための融合タンパク質を提供する。１つの実施態様では、前記使用は、インビトロ又はインビボにおいて制御性Ｔ細胞を前記融合タンパク質と接触させることを含む。１つの実施態様では、前記使用は、更に、他の（非制御性）Ｔ細胞を前記融合タンパク質と接触させることを含む。１つの実施態様では、前記使用は、インビトロにおける使用であり、そして、前記融合タンパク質は、約１０ng/mL以下、具体的には、約１ng/mL以下の濃度で使用される。別の実施態様では、前記使用は、インビボにおける使用であり、そして、前記融合タンパク質は、約１００μg/kg（体重）以下、具体的には、約２５μg/kg（体重）以下、より具体的には、約１０μg/kg（体重）以下の用量で使用される（「体重」とは、融合タンパク質が投与される個体の体重を指す）。
また、本発明は、インビトロ又はインビボにおいて制御性Ｔ細胞を選択的に活性化する方法であって、該制御性Ｔ細胞を本発明の融合タンパク質と接触させることを含む方法を提供する。１つの実施態様では、前記方法は、更に、他の（非制御性）Ｔ細胞を前記融合タンパク質と接触させることを含む。１つの実施態様では、前記活性化は、増殖の誘導及び／又はＩＬ−２受容体シグナル伝達の誘導を含む。１つの実施態様では、前記方法は、インビトロにおける方法であり、そして、前記融合タンパク質は、約１０ng/mL以下、具体的には、約１ng/mL以下の濃度で使用される。別の実施態様では、前記方法は、インビボにおける使用であり、そして、前記融合タンパク質は、約１００μg/kg（体重）以下、具体的には、約２５μg/kg（体重）以下、より具体的には、約１０μg/kg（体重）以下の用量で使用される（「体重」とは、融合タンパク質が投与される個体の体重を指す）。
上の段落に記載した融合タンパク質、使用、又は方法の特定の実施態様によれば、前記活性化は、制御性Ｔ細胞の増殖の誘導及び／又は制御性Ｔ細胞におけるＩＬ−２受容体シグナル伝達の誘導を含む。増殖の誘導は、実施例に記載する通り、例えば、細胞内増殖マーカーＫｉ−６７を検出することによって測定することができる。１つの実施態様では、本発明の融合タンパク質によって活性化される制御性Ｔ細胞の増殖は、非活性化制御性Ｔ細胞の増殖と比べて、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、又は少なくとも約３倍増大する。１つの実施態様では、本発明の融合タンパク質と接触した他の（非制御性）Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞の増殖は、前記融合タンパク質と接触していない対応する細胞の増殖と比べて、約１．５倍未満、約１．２倍未満、又は約１．１倍未満増大する。ＩＬ−２受容体シグナル伝達の誘導は、実施例に記載する通り、例えば、リン酸化ＳＴＡＴ５を検出することによって測定することができる。１つの実施態様では、本発明の融合タンパク質によって活性化される制御性Ｔ細胞におけるＩＬ−２受容体シグナル伝達は、非活性化制御性Ｔ細胞におけるＩＬ−２受容体シグナル伝達と比べて、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、又は少なくとも約５倍増大する。１つの実施態様では、本発明の融合タンパク質と接触した他の（非制御性）Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞におけるＩＬ−２受容体シグナル伝達は、前記融合タンパク質と接触していない対応する細胞におけるＩＬ−２受容体シグナル伝達と比べて、約１．５倍未満、又は約１．２倍未満、又は約１．１倍未満増大する。
ポリヌクレオチド
本発明は、更に、本明細書に記載する融合物をコードするポリヌクレオチド又はそのフラグメントを提供する。
本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１０、１２、２０、５１、５９、６１、６３、及び６５に記載の配列（これらの機能的フラグメント又はバリアントを含む）と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるものを含む。
本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、融合タンパク質全体をコードする単一のポリヌクレオチドとして、又は共発現する複数の（例えば、２つ以上の）ポリヌクレオチドとして発現し得る。共発現するポリヌクレオチドによってコードされているポリヌクレオチドは、例えば、ジスルフィド結合、又は機能的融合タンパク質を形成するための他の手段を通して連結し得る。例えば、免疫グロブリンの軽鎖部分は、免疫グロブリンの重鎖部分とは別のポリヌクレオチドによってコードされていてよい。共発現するとき、重鎖ポリペプチドは、軽鎖ポリペプチドと連結して、免疫グロブリンを形成する。
１つの実施態様では、本発明は、免疫グロブリン分子及び２つのＩＬ−２分子の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、配列番号９又は１１に示す可変領域配列をコードする配列を含むポリヌクレオチド、又はそのフラグメントを目的とする。別の実施態様では、本発明は、免疫グロブリン分子及び２つのＩＬ−２分子の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、配列番号１９又は５０に示すポリペプチド配列をコードする配列を含むポリヌクレオチド、又はそのフラグメントを目的とする。別の実施態様では、本発明は、更に、免疫グロブリン分子及び２つのＩＬ−２分子の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、配列番号１０、１２、２０、５１、５９、６１、６３、又は６５に示す核酸配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である配列を含むポリヌクレオチド、又はそのフラグメントを目的とする。別の実施態様では、本発明は、免疫グロブリン分子及び２つのＩＬ−２分子の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、配列番号１０、１２、２０、５１、５９、６１、６３、又は６５に示す核酸配列を含むポリヌクレオチド、又はそのフラグメントを目的とする。別の実施態様では、本発明は、免疫グロブリン分子及び２つのＩＬ−２分子の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、配列番号９又は１１のアミノ酸配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である可変領域配列をコードする配列を含むポリヌクレオチド、又はそのフラグメントを目的とする。別の実施態様では、本発明は、免疫グロブリン分子及び２つのＩＬ−２分子の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、配列番号１９又は５０のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるポリペプチド配列をコードする配列を含むポリヌクレオチド、又はそのフラグメントを目的とする。本発明は、免疫グロブリン分子及び２つのＩＬ−２分子の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、保存的アミノ酸置換を有する配列番号９又は１１の可変領域配列をコードする配列を含むポリヌクレオチド、又はそのフラグメントを包含する。また、本発明は、免疫グロブリン分子及び２つのＩＬ−２分子の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、保存的アミノ酸置換を有する配列番号１９又は５０のポリペプチド配列をコードする配列を含むポリヌクレオチド、又はそのフラグメントを包含する。
特定の実施態様では、ポリヌクレオチド又は核酸は、ＤＮＡである。他の実施態様では、本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡ、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の形態のＲＮＡである。本発明のＲＮＡは、一本鎖又は二本鎖であってよい。
組み換え方法
本発明の融合タンパク質は、例えば、固相ペプチド合成（例えば、Merrifield固相合成）又は組み換え産生によって得ることができる。組み換え産生については、例えば、上記の融合タンパク質（フラグメント）をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを単離し、そして、宿主細胞において更にクローニング及び／又は発現させるために１つ以上のベクターに挿入する。このようなポリヌクレオチドは、従来の手順を用いて容易に単離及び配列決定することができる。１つの実施態様では、本発明のポリヌクレオチドのうちの１つ以上を含むベクター、好ましくは、発現ベクターが提供される。当業者に周知の方法を用いて、適切な転写／翻訳制御シグナルと共に、融合タンパク質（フラグメント）のコード配列を含む発現ベクターを構築することができる。これら方法は、インビトロ組み換えＤＮＡ技術、合成技術、及びインビボ組み換え／遺伝子組み換えを含む。例えば、Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1989)；及びAusubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1989)に記載の技術を参照。発現ベクターは、プラスミド、ウイルスの一部であってもよく、又は核酸フラグメントであってもよい。発現ベクターは、融合タンパク質（フラグメント）をコードするポリヌクレオチド（すなわち、コード領域）が、プロモータ及び／又は他の転写若しくは翻訳制御エレメントと機能的に連結するようにクローニングされた発現カセットを含む。本明細書で使用するとき、「コード領域」は、アミノ酸に翻訳されるコドンからなる核酸の部分である。「終止コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡ、又はＴＡＡ）はアミノ酸には翻訳されないが、存在する場合、コード領域の一部であるとみなしてよい。しかし、任意の隣接配列、例えば、プロモータ、リボソーム結合部位、転写終結配列、イントロン、５’及び３’非翻訳領域等は、コード領域の一部ではない。２つ以上のコード領域が、（例えば、単一のベクターにおける）単一のポリヌクレオチドコンストラクトに存在してもよく、又は（例えば、別々の（異なる）ベクターにおける）別々のポリヌクレオチドコンストラクトに存在してもよい。更に、任意のベクターは、単一のコード領域を含んでもよく、又は２つ以上のコード領域を含んでもよく、例えば、本発明のベクターは、１つ以上のポリペプチドをコードし得、該ポリペプチドは、タンパク質分解的切断を介して翻訳後又は翻訳と同時に最終タンパク質に分けられる。更に、本発明のベクター、ポリヌクレオチド、又は核酸は、本発明の融合タンパク質（フラグメント）をコードするポリヌクレオチド、又はそのバリアント若しくは誘導体に融合しているか又は融合していない、非相同なコード領域をコードし得る。非相同なコード領域は、分泌シグナルペプチド又は非相同機能ドメイン等、特殊なエレメント又はモチーフを含むが、これらに限定されない。機能的な連結は、遺伝子産物、例えば、ポリペプチドのコード領域が、調節配列の影響又は制御下で前記遺伝子産物を発現するように１つ以上の調節配列に連結されているときである。２つのＤＮＡフラグメント（例えば、ポリペプチドコード領域及びそれに連結したプロモータ）は、プロモータ機能の誘導によって、所望の遺伝子産物をコードするｍＲＮＡが転写される場合、及び前記２つのＤＮＡフラグメント間の連結の性質が、前記遺伝子産物を発現させる発現調節配列の能力に干渉せず、又は転写されるＤＮＡテンプレートの能力に干渉しない場合、「機能的に連結されている」。したがって、プロモータ領域は、プロモータがその核酸を転写させることができる場合、ポリペプチドをコードする核酸と機能的に連結されているであろう。プロモータは、所定の細胞においてのみＤＮＡを実質的に転写させる細胞特異的プロモータであってもよい。プロモータに加えて、他の転写制御エレメント、例えば、エンハンサー、オペレータ、リプレッサ、及び転写終結シグナルをポリヌクレオチドと機能的に連結させて、細胞特異的に転写させることができる。好適なプロモータ及び他の転写制御領域は、本明細書に開示される。様々な転写制御領域が、当業者に公知である。該転写制御領域は、サイトメガロウイルス（例えば、前初期プロモータ、イントロンＡと連結）、シミアンウイルス４０（例えば、初期プロモータ）、及びレトロウイルス（例えば、ラウス肉腫ウイルス）由来のプロモータセグメント及びエンハンサーセグメント等であるがこれらに限定されない、脊椎動物細胞で機能する転写制御領域を含むが、これらに限定されない。他の転写制御領域は、アクチン、熱ショックタンパク質、ウシ成長ホルモン、及びウサギａ−グロビン等の脊椎動物遺伝子に加えて、真核細胞における遺伝子発現を制御することができる他の配列に由来するものを含む。更なる好適な転写制御領域は、組織特異的なプロモータ及びエンハンサーに加えて、誘導性プロモータ（例えば、テトラサイクリン誘導プロモータ）を含む。同様に、様々な翻訳制御エレメントが、当業者に公知である。該翻訳制御エレメントは、リボソーム結合部位、翻訳開始及び終止コドン、並びにウイルス系に由来するエレメント（特に、配列内リボソーム進入部位、すなわちＩＲＥＳ、ＣＩＴＥ配列とも呼ばれる）を含むが、これらに限定されない。また、発現カセットは、複製開始点、及び／又はレトロウイルス末端反復配列（ＬＴＲ）若しくはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端配列（ＩＴＲ）等の染色体組み込みエレメント等の他の機構も含み得る。
本発明のポリヌクレオチド及び核酸コード領域は、分泌ペプチド又はシグナルペプチドをコードする更なるコード領域と連結してよく、これによって、本発明のポリヌクレオチドによってコードされているポリペプチドが分泌される。例えば、融合物の分泌が望ましい場合、シグナル配列をコードするＤＮＡを、本発明の融合タンパク質又はそのフラグメントをコードする核酸の上流に配置してよい。シグナル仮説によれば、哺乳類細胞によって分泌されるタンパク質は、一旦成長タンパク質鎖の粗面小胞体外への輸送が開始されたら成熟タンパク質から切断される、シグナルペプチド又は分泌リーダー配列を有する。当業者は、脊椎動物細胞によって分泌されるポリペプチドが、一般的に、ポリペプチドのＮ末端に融合しているシグナルペプチドを有し、該シグナルペプチドは、翻訳されたポリペプチドから切断されて、分泌又は「成熟」型のポリペプチドを産生することを認識している。特定の実施態様では、ネイティブシグナルペプチド、例えば、免疫グロブリン重鎖又は軽鎖シグナルペプチド、又はそれに機能的に連結されたポリペプチドを分泌させる能力を保持する、その配列の機能誘導体を用いる。あるいは、異種哺乳類シグナルペプチド、又はその機能誘導体を用いてもよい。例えば、野性型リーダー配列を、ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）又はマウスβ−グルクロニダーゼのリーダー配列で置換してもよい。例示的な分泌シグナルペプチドのアミノ酸及びヌクレオチドの配列を、配列番号３９〜４７に示す。
後で精製するのを容易にする（例えば、ヒスチジンタグ）か、又は融合タンパク質の標識を支援するために用いることができる短いタンパク質配列をコードするＤＮＡを、融合タンパク質（フラグメント）をコードするポリヌクレオチド内又は末端に含めてもよい。
更なる実施態様では、本発明の１つ以上のポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供する。特定の実施態様では、本発明の１つ以上のベクターを含む宿主細胞を提供する。ポリヌクレオチド及びベクターは、それぞれ、ポリヌクレオチド及びベクターに関して本明細書に記載した機構のいずれかを単独で又は組み合わせて組み込んでもよい。１つのこのような実施態様では、前記宿主細胞は、本発明の融合タンパク質（の一部）をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含む（例えば、該ベクターで形質転換又はトランスフェクトされている）。本明細書で使用するとき、用語「宿主細胞」とは、本発明の融合タンパク質又はそのフラグメントを作製するように操作することができる任意の種類の細胞系を指す。融合タンパク質の複製及び発現支援に好適な宿主細胞は、当技術分野において周知である。このような細胞は、適宜、特定の発現ベクターでトランスフェクト又は形質導入してよく、そして、多量のベクター含有細胞を大型発酵槽に播種するために成長させて、臨床応用のために十分な量の融合タンパク質を得ることができる。好適な宿主細胞は、大腸菌（E. coli）等の原核微生物、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、昆虫細胞等の様々な真核細胞を含む。例えば、ポリペプチドは、特に、グリコシル化が必要ないときに、細菌で産生され得る。発現後、ポリペプチドは、可溶性画分中の細菌細胞ペーストから単離することができ、そして、更に精製することができる。原核生物に加えて、糸状菌又は酵母等の真核微生物は、ポリペプチドをコードしているベクターに好適なクローニング又は発現宿主であり、例えば、部分的に又は完全にヒトのグリコシル化パターンを有するポリペプチドが産生される、グリコシル化経路が「ヒト化」されている菌類及び酵母菌株を含む。Gerngross, Nat Biotech 22, 1409-1414 (2004)及びLi et al., Nat Biotech 24, 210-215 (2006)を参照。また、（グリコシル化）ポリペプチドを発現させるのに好適な宿主細胞は、多細胞生物（無脊椎動物及び脊椎動物）に由来する。無脊椎動物細胞の例は、植物細胞及び昆虫細胞を含む。特に、ヨトウガ（Spodoptera frugiperda）細胞のトランスフェクトについては、昆虫細胞と併用できる多数のバキュロウイルス株が同定されている。また、植物細胞培養物も宿主として利用できる。例えば、米国特許第５，９５９，１７７号、同第６，０４０，４９８号、同第６，４２０，５４８号、同第７，１２５，９７８号、及び同第６，４１７，４２９号（トランスジェニック植物において抗体を産生するためのPLANTIBODIES（商標）技術について記載）を参照。また、脊椎動物細胞を宿主として用いてもよい。例えば、懸濁液中で成長するように適応した哺乳類細胞株が有用であり得る。有用な哺乳類宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７）；ヒト胚腎臓株（例えば、Graham et al., J Gen Virol 36, 59 (1977)に記載されている、２９３又は２９３Ｔ細胞）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、マウスセルトリ細胞（例えば、Mather, Biol Reprod 23, 243-251 (1980)に記載されている、ＴＭ４細胞）、サル腎臓細胞（ＣＶ１）、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６）、ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）、バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）、ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ Ｇ２）、マウス乳癌細胞（ＭＭＴ０６０５６２）、ＴＲＩ細胞（例えば、 Mather et al., Annals N.Y. Acad Sci 383, 44-68 (1982)に記載されている）、ＭＲＣ５細胞、及びＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳類宿主細胞株は、ｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（Urlaub et al., Proc Natl Acad Sci USA 77, 4216 (1980)）；並びにＹＯ、ＮＳ０、Ｐ３Ｘ６３、及びＳｐ２／０等の骨髄腫細胞株を含む。タンパク質産生に好適な特定の哺乳類宿主細胞株の総説については、例えば、Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003)を参照。宿主細胞は、ほんの数例を挙げると、培養細胞、例えば、哺乳類培養細胞、酵母細胞、昆虫細胞、細菌細胞及び植物細胞を含むが、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物、又は植物若しくは動物の培養組織内に含まれる細胞も含む。１つの実施態様では、前記宿主細胞は、真核細胞、好ましくは、哺乳類細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胚腎臓（ＨＥＫ）細胞、又はリンパ系細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。
これら系において外来遺伝子を発現させるための標準的な技術は、当技術分野において公知である。免疫グロブリンの重鎖又は軽鎖のいずれかを含むポリペプチドを発現する細胞は、発現産物が、重鎖及び軽鎖の両方を有する免疫グロブリンになるように、免疫グロブリン鎖の他方も発現するように操作してよい。
１つの実施態様では、本発明に係る融合タンパク質を産生する方法であって、該融合タンパク質の発現に好適な条件下で、本発明に提供する、該融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を培養し、そして、該宿主細胞（又は宿主細胞培養培地）から該融合タンパク質を回収することを含む方法が提供される。
本発明の融合タンパク質では、構成要素（免疫グロブリン分子及びＩＬ−２分子）は、互いに遺伝的に融合する。融合タンパク質は、その構成要素が互いに直接的に、又はリンカー配列を介して間接的に融合するように設計することができる。リンカーの組成及び長さは、当技術分野において周知の方法に従って決定することができ、そして、有効性について試験することができる。また、必要に応じて、融合タンパク質の個々の構成要素を分離するための切断部位を組み込むために、更なる配列、例えば、エンドペプチダーゼ認識配列を含んでもよい。
特定の実施態様では、本発明の融合タンパク質は、抗原に結合することができる免疫グロブリン可変領域を少なくとも含む。可変領域は、天然又は非天然の抗体及びそのフラグメントの一部を形成することができ、そして、これらに由来してよい。ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を産生する方法は、当技術分野において周知である（例えば、Harlow and Lane, “Antibodies, a laboratory manual”, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988を参照）。非天然の抗体は、固相ペプチド合成を用いて構築することもでき、組み換えによって産生することもでき（例えば、米国特許第４，１８６，５６７号に記載の通り）、又は例えば、可変重鎖及び可変軽鎖を含むコンビナトリアルライブラリをスクリーニングすることによって得ることもできる（例えば、米国特許第５，９６９，１０８号（McCafferty）を参照）。
任意の動物種の免疫グロブリンを本発明において用いることができる。本発明において有用な非限定的な免疫グロブリンは、マウス、霊長類、又はヒト起源であってよい。融合タンパク質をヒトに使用することを意図する場合、免疫グロブリンの定常領域がヒト由来であるキメラ型の免疫グロブリンを用いてよい。また、ヒト化又は完全ヒト型の免疫グロブリンを当技術分野において周知の方法に従って調製することもできる（例えば、米国特許第５，５６５，３３２号（Winter）を参照）。ヒト化は、（ａ）非ヒト（例えば、ドナー抗体）ＣＤＲを、重要なフレームワーク残基（例えば、優れた抗原結合親和性又は抗体機能を保持するために重要なもの）を保持して又は保持せずにヒト（例えば、レシピエント抗体）フレームワーク及び定常領域にグラフトする、（ｂ）非ヒト特異性決定領域（ＳＤＲ又はａ−ＣＤＲ；抗体−抗原相互反応に重要な残基）のみをヒトフレームワーク及び定常領域にグラフトする、又は（ｃ）非ヒト可変ドメイン全体を移植するが、表面残基の置換によってヒト様セクションで該非ヒト可変ドメインを「クローキング（cloaking）」することを含むが、これらに限定されない様々な方法によって行うことができる。ヒト化抗体及びその作製方法は、例えば、Almagro and Fransson, Front Biosci 13, 1619-1633 (2008)に概説されており、そして、更に、例えば、Riechmann et al., Nature 332, 323-329 (1988)；Queen et al., Proc Natl Acad Sci USA 86, 10029-10033 (1989)；米国特許第５，８２１，３３７号、同第７，５２７，７９１号、同第６，９８２，３２１号、及び同第７，０８７，４０９号; Jones et al., Nature 321, 522-525 (1986)；Morrison et al., Proc Natl Acad Sci 81, 6851-6855 (1984)；Morrison and Oi, Adv Immunol 44, 65-92 (1988)；Verhoeyen et al., Science 239, 1534-1536 (1988)；Padlan, Molec Immun 31(3), 169-217 (1994)；Kashmiri et al., Methods 36, 25-34 (2005)（ＳＤＲ（ａ−ＣＤＲ）グラフトについて記載）；Padlan, Mol Immunol 28, 489-498 (1991)（「 リサーフェシング」について記載）；Dall’Acqua et al., Methods 36, 43-60 (2005)（「ＦＲシャフリング」について記載）；並びにOsbourn et al., Methods 36, 61-68 (2005)及びKlimka et al., Br J Cancer 83, 252-260 (2000)（ＦＲシャフリングに対する「ガイドセレクション（guided selection）アプローチについて記載）に記載されている。本発明に係る具体的な免疫グロブリンは、ヒト免疫グロブリンである。ヒト抗体及びヒト可変領域は、当技術分野において公知の様々な技術を用いて産生することができる。ヒト抗体は、一般的に、van Dijk and van de Winkel, Curr Opin Pharmacol 5, 368-74 (2001)及びLonberg, Curr Opin Immunol 20, 450-459 (2008)に記載されている。ヒト可変領域は、ハイブリドーマ法によって作製されるヒトモノクローナル抗体の一部を形成することができ、そして、それに由来してよい（例えば、Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)を参照）。また、ヒト抗体及びヒト可変領域は、抗原曝露に応答してインタクトなヒト抗体又はヒト可変領域を有するインタクトな抗体を産生するように改変されたトランスジェニック動物に免疫原を投与することによって調製することもできる（例えば、Lonberg, Nat Biotech 23, 1117-1125 (2005)を参照）。また、ヒト抗体及びヒト可変領域は、ヒト由来ファージディスプレイライブラリから選択されるＦｖクローン可変領域配列を単離することによって作製することもできる（例えば、Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178, 1-37 (O’Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001)；及びMcCafferty et al., Nature 348, 552-554；Clackson et al., Nature 352, 624-628 (1991)を参照）。ファージは、典型的には、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメント又はＦａｂフラグメントとして、抗体フラグメントを表示する。
特定の実施態様では、本発明の融合タンパク質に含まれる免疫グロブリンは、例えば、全文が参照により本明細書に組み入れられる国際公開第２０１２／０２０００６号（親和性成熟に関する実施例を参照）又は米国特許出願公開第２００４／０１３２０６６号に開示されている方法に従って、強化された結合親和性を有するように操作される。本発明の融合タンパク質の特定の抗原決定基に結合する能力は、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を通して、又は当業者によく知られている他の技術、例えば、表面プラズモン共鳴技術（Liljeblad et al., Glyco J 17, 323-329 (2000)）及び従来の結合アッセイ(Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002))を通して測定することができる。競合アッセイを用いて、特定の抗原に対する結合について参照抗原と競合する抗体を同定することができる。特定の実施態様では、このような競合抗体は、参照抗体が結合するのと同じエピトープ（例えば、直鎖状又は立体構造エピトープ）に結合する。抗体が結合するエピトープをマッピングするための詳細な例示的方法は、Morris (1996) “Epitope Mapping Protocols”, in Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ)に提供されている。例示的な競合アッセイでは、抗原に結合する第１の標識抗体と、該抗原に対する結合について該第１の抗体と競合する能力を試験する第２の非標識抗体とを含む溶液中で．固定抗原をインキュベートする。第２の抗体は、ハイブリドーマ上清中に存在してよい。対照として、第１の標識抗体を含むが、第２の非標識抗体は含まない溶液中で、固定抗原をインキュベートする。第１の抗体が抗原に結合できる条件下でインキュベートした後、過剰の非結合抗体を除去し、そして、固定抗原に連結した標識の量を測定する。固定抗原に連結した標識の量が、対照サンプルに比べて試験サンプルにおいて実質的に減少している場合、それは、抗原に対する結合について第２の抗体が第１の抗体と競合していることを示す。Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)を参照。
本明細書に記載の通り調製した融合タンパク質は、高性能液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー等の当技術分野において公知の技術によって精製することができる。特定のタンパク質を精製するために用いられる実際の条件は、１つには、正味電荷、疎水性、親水性等の要因に依存し、そして、当業者には明らかであろう。アフィニティークロマトグラフィー精製については、融合タンパク質が結合する抗体、リガンド、受容体、又は抗原を用いてよい。例えば、本発明の融合タンパク質のアフィニティークロマトグラフィー精製については、プロテインＡ又はプロテインＧを含むマトリクスを用いてよい。連続するプロテインＡ又はＧアフィニティークロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーを用いて、本質的に実施例に記載の通り融合タンパク質を単離することができる。融合タンパク質の純度は、ゲル電気泳動、高圧液体クロマトグラフィー等を含む様々な周知の分析方法のいずれかによって決定することができる。例えば、実施例に記載の通り発現させた融合タンパク質は、還元及び非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって示される通り、インタクトであり、そして、適切に構築されていることが示された（例えば、図４を参照）。
組成物、製剤、及び投与経路
更なる態様では、本発明は、例えば、以下の治療方法のいずれかにおいて用いるための、本明細書に提供する融合タンパク質のいずれかを含む医薬組成物を提供する。１つの実施態様では、前記医薬組成物は、本明細書に提供する融合タンパク質のいずれかと薬学的に許容し得る担体とを含む。別の実施態様では、前記医薬組成物は、本明細書に提供する融合タンパク質のいずれかと、例えば、下記のような少なくとも１つの追加治療剤とを含む。
更に、インビボ投与に好適な形態の本発明の融合タンパク質を産生する方法であって、（ａ）本発明に係る融合タンパク質を得、そして、（ｂ）少なくとも１つの薬学的に許容し得る担体と共に該融合タンパク質を製剤化して、インビボ投与用の融合タンパク質の調製物を製剤化することを含む方法を提供する。
本発明の医薬組成物は、薬学的に許容し得る担体に溶解又は分散している、治療上有効な量の１つ以上の融合タンパク質を含む。語句「薬学的又は薬理学的に許容し得る」とは、一般的に、適宜、動物、例えば、ヒト等に投与したとき、使用される投与量及び濃度においてレシピエントに対して非毒性である、すなわち、副作用、アレルギー反応、又は他の有害反応を生じさせない分子実体及び組成物を指す。少なくとも１つの融合タンパク質及び場合により追加活性成分を含有する医薬組成物の調製は、参照により本明細書に組み入れられるRemington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990に例示されている通り、本開示を踏まえて当業者に公知になるであろう。更に、動物（例えば、ヒト）に投与する場合、調製物は、ＦＤＡの生物学的規格部門（Office of Biological Standards）又は他国の対応する当局によって要求される無菌性、発熱性、一般的安全性、及び純度の基準を満たさなければならないことが理解されよう。好ましい組成物は、凍結乾燥製剤又は水溶液である。本明細書で使用するとき、「薬学的に許容し得る担体」は、当業者に公知である通り、任意の及び全ての溶媒、バッファ、分散媒、コーティング、界面活性剤、抗酸化剤、保存剤（例えば、抗菌剤、抗真菌剤）、等張剤、吸収遅延剤、塩、保存剤、抗酸化剤、タンパク質、薬物、薬物安定剤、ポリマー、ゲル、結合剤、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、甘味剤、風味剤、染料、このような類似物質、及びこれらの組み合わせを含む（例えば、参照により本明細書に組み入れられるRemington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990, pp. 1289-1329を参照）。任意の従来の担体が活性成分と不適合である場合を除いて、治療組成物又は医薬組成物におけるその使用が意図される。
組成物は、それが固体、液体、又はエアゾール形態のいずれで投与されるか、及び注射等の投与経路の場合滅菌する必要があるかどうかに依存して、様々な種類の担体を含んでよい。本発明の融合タンパク質（及び任意の追加治療剤）は、当業者に公知である任意の方法又は方法の任意の組み合わせによって投与することができる（例えば、参照により本明細書に組み入れられるRemington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990を参照）。非経口投与、特に、静脈内注射が、本発明の融合タンパク質等のポリペプチド分子を投与するために最も一般的に用いられる。
非経口組成物は、注射、例えば、皮下、皮内、病巣内、静脈内、動脈内、筋肉内、くも膜下腔内、又は腹腔内注射によって投与するように設計されたものを含む。注射の場合、本発明の融合タンパク質は、好ましくは生理学的に適合するバッファ（例えば、ハンクス液、リンゲル液、又は生理食塩水バッファ）等の水性溶液として製剤化してよい。溶液は、懸濁剤、安定剤、及び／又は分散剤等の調合剤（formulatory agent）を含有してよい。あるいは、融合タンパク質は、使用前に、好適なビヒクル、例えば、滅菌パイロジェンフリー水で構成するための粉末形態であってよい。滅菌注射液は、必要に応じて、下に列挙する様々な他の成分と共に、必要量の本発明の融合タンパク質を適切な溶媒中に組み込むことによって調製される。無菌性は、例えば、滅菌濾過膜を通して濾過することによって、容易に達成し得る。一般的に、分散液は、塩基性分散媒及び／又は他の成分を含有する滅菌ビヒクルに、様々な滅菌活性成分を組み込むことによって調製される。滅菌注射液、懸濁液、又は乳液を調製するための滅菌粉末の場合、調製の好ましい方法は、真空乾燥又は凍結乾燥技術であり、これにより、活性成分に加えて、その既に滅菌濾過された液体媒体から任意の更なる所望の成分の粉末が得られる。液体媒体は、必要に応じて、好適に緩衝しなければならず、そして、液体希釈剤は、注射する前に、十分な生理食塩水又はグルコースを用いてまず等張にしなければならない。組成物は、製造及び保存条件下で安定でなければならず、そして、細菌及び真菌等の微生物の汚染作用から保護されなければならない。エンドトキシンの汚染は、安全なレベルにおいて最低限に、例えば、０．５ng/mg タンパク質未満に維持しなければならないことが理解されよう。好適な薬学的に許容し得る担体は、バッファ（例えば、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸）；抗酸化剤（アスコルビン酸及びメチオニンを含む）；保存剤（例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；アルキルパラベン（例えば、メチル又はプロピルパラベン）；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン）；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリジン）；単糖類、二糖類、及び他の炭水化物（グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む）；キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）；糖類（例えば、スクロース、マンニトール、トレハロース、又はソルビトール）；塩形成対イオン（例えば、ナトリウム）；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；及び／又は非イオン性界面活性剤（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ））を含むが、これらに限定されない。水性注射懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、デキストラン等、懸濁液の粘度を増大させる化合物を含有してよい。場合により、懸濁液は、高度に濃縮された溶液の調製を可能にするために、好適な安定剤又は化合物の溶解度を増大させる薬剤を含有してもよい。更に、活性化合物の懸濁液は、適切な油性注射用懸濁液として調製してもよい。好適な親油性溶媒又はビヒクルは、ゴマ油等の脂肪油、又はエチルクリート（ethyl cleat）若しくはトリグリセリド等の合成脂肪酸エステル、又はリポソームを含む。
本発明の融合タンパク質を含む医薬組成物は、従来の混合、溶解、乳化、封入、捕捉、又は凍結乾燥の方法を用いて製造することができる。医薬組成物は、タンパク質の薬学的に使用し得る調製物への加工を容易にする１つ以上の生理学的に許容し得る担体、希釈剤、賦形剤、又は補助剤を用いて従来の方法で製剤化してよい。適切な製剤は、選択される投与経路に依存する。
融合タンパク質は、遊離酸又は遊離塩基、中性又は塩形態で組成物中に製剤化され得る。薬学的に許容し得る塩は、遊離酸又は遊離塩基の生物活性を実質的に保持する塩である。該薬学的に許容し得る塩は、酸付加塩、例えば、タンパク質性組成物の遊離アミノ基と形成される酸付加塩、又は無機酸（例えば、塩酸又はリン酸等）若しくは有機酸（酢酸、シュウ酸、酒石酸、若しくはマンデル酸等）と形成される酸付加塩を含む。また、遊離カルボキシル基と形成される塩は、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、若しくは第二鉄の水酸化物等の無機塩基、又はイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、若しくはプロカイン等の有機塩基から誘導され得る。薬学的塩は、対応する遊離塩基形態よりも水性及び他のプロトン性溶媒に対する可溶性がより高い傾向がある。
治療方法及び組成物
本明細書に提供する融合タンパク質はいずれも、治療方法で用いることができる。
治療方法で用いるために、本発明の融合タンパク質は、優れた医療行為と整合するように製剤化、投薬、及び投与されよう。この状況において考慮すべき要因は、処置される具体的な障害、処置される具体的な哺乳類、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与スケジュール、及び医師に公知の他の要因を含む。
１つの態様では、医薬として使用するための本発明の融合タンパク質が提供される。更なる態様では、疾患の処置において使用するための本発明の融合タンパク質が提供される。特定の実施態様では、処置方法において使用するための本発明の融合タンパク質が提供される。１つの実施態様では、本発明は、それを必要としている個体における疾患の処置において使用するための、本明細書に記載する融合タンパク質を提供する。特定の実施態様では、本発明は、疾患を有する個体に治療上有効な量の融合タンパク質を投与することを含む、該個体を処置する方法において使用するための融合タンパク質を提供する。特定の実施態様では、処置される疾患は、自己免疫疾患である。例示的な自己免疫疾患は、１型糖尿病、乾癬、喘息、関節リウマチ、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、及び多発性硬化症を含む。１つの実施態様では、前記疾患は、移植拒絶反応又は移植片対宿主病である。具体的な実施態様では、前記疾患は、１型糖尿病、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、ＳＬＥ、及び多発性硬化症の群から選択される。より具体的な実施態様では、前記疾患は、１型糖尿病である。別の具体的な実施態様では、前記疾患は、炎症性腸疾患である。別の具体的な実施態様では、前記疾患は、多発性硬化症である。更なる実施態様では、前記疾患は、喘息、肺線維症、又は閉塞性肺疾患である。なお更なる実施態様では、前記疾患は、心血管疾患、具体的には、アテローム性動脈硬化症及び急性冠症候群である。更なる実施態様では、前記疾患は、アレルギー症状、具体的には、食物アレルギーである。特定の実施態様では、前記方法は、治療上有効な量の少なくとも１つの追加治療剤、例えば、処置される疾患が自己免疫疾患である場合、免疫抑制剤を個体に投与することを更に含む。上記実施態様のいずれかに係る「個体」は、哺乳類、好ましくは、ヒトである。
更なる態様では、本発明は、それを必要としている個体における疾患を処置するための医薬の製造又は調製における、本発明の融合タンパク質の使用を提供する。１つの実施態様では、前記医薬は、疾患を有する個体に治療上有効な量の医薬を投与することを含む、疾患を処置する方法において使用するためのものである。特定の実施態様では、処置される疾患は、自己免疫疾患である。１つの実施態様では、前記疾患は、移植拒絶反応又は移植片対宿主病である。具体的な実施態様では、前記疾患は、１型糖尿病、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、ＳＬＥ、及び多発性硬化症の群から選択される。より具体的な実施態様では、前記疾患は、１型糖尿病である。別の具体的な実施態様では、前記疾患は、炎症性腸疾患である。別の具体的な実施態様では、前記疾患は、多発性硬化症である。更なる実施態様では、前記疾患は、喘息、肺線維症、又は閉塞性肺疾患である。なお更なる実施態様では、前記疾患は、心血管疾患、具体的には、アテローム性動脈硬化症及び急性冠症候群である。更なる実施態様では、前記疾患は、アレルギー症状、具体的には、食物アレルギーである。１つの実施態様では、前記方法は、治療上有効な量の少なくとも１つの追加治療剤、例えば、処置される疾患が自己免疫疾患である場合、免疫抑制剤を個体に投与することを更に含む。上記実施態様のいずれかに係る「個体」は、哺乳類、好ましくは、ヒトであってよい。
更なる態様では、本発明は、治療上有効な量の本発明の融合タンパク質を個体に投与することを含む、該個体における疾患を処置する方法を提供する。１つの実施態様では、薬学的に許容し得る形態の本発明の融合タンパク質を含む組成物を前記個体に投与する。特定の実施態様では、処置される疾患は、自己免疫疾患である。１つの実施態様では、前記疾患は、移植拒絶反応又は移植片対宿主病である。具体的な実施態様では、前記疾患は、１型糖尿病、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、ＳＬＥ、及び多発性硬化症の群から選択される。より具体的な実施態様では、前記疾患は、１型糖尿病である。別の具体的な実施態様では、前記疾患は、炎症性腸疾患である。別の具体的な実施態様では、前記疾患は、多発性硬化症である。更なる実施態様では、前記疾患は、喘息、肺線維症、又は閉塞性肺疾患である。更なる実施態様では、前記疾患は、アレルギー症状、具体的には、食物アレルギーである。なお更なる実施態様では、前記疾患は、心血管疾患、具体的には、アテローム性動脈硬化症及び急性冠症候群である。特定の実施態様では、前記方法は、治療上有効な量の少なくとも１つの追加治療剤、例えば、処置される疾患が自己免疫疾患である場合、免疫抑制剤を個体に投与することを更に含む。上記実施態様のいずれかに係る「個体」は、哺乳類、好ましくは、ヒトであってよい。
幾つかの実施態様では、有効量の本発明の融合タンパク質を細胞に投与する。他の実施態様では、治療上有効な量の本発明の融合タンパク質を、疾患を処置するために個体に投与する。
疾患を予防又は処置するため、本発明の融合タンパク質の適切な投与量（単独で又は１つ以上の他の追加治療剤と組み合わせて用いるとき）は、処置される疾患の種類、投与経路、患者の体重、融合タンパク質の種類、疾患の重篤度及び経過、融合タンパク質が予防目的で投与されるか又は治療目的で投与されるか、以前の又は併用される治療的介入、患者の臨床歴及び融合タンパク質に対する応答、並びに主治医の裁量に依存するであろう。投与に責任のある医師が、いかなる場合も、個々の被験体について、組成物中の活性成分の濃度及び適切な用量を決定するであろう。単回投与又は様々な時点にわたる複数回投与、ボーラス投与、及びパルス注入を含むがこれらに限定されない様々な投与スケジュールが本明細書において意図される。
融合タンパク質は、一度に、又は一連の処置にわたって好適に患者に投与される。疾患の種類及び重篤度に応じて、例えば、１回以上の別々の投与によってであろうと、持続注入によってであろうと、患者に投与するための初期候補投与量は、約１μg/kg〜１５mg/kg（例えば、０．１mg/kg〜１０mg/kg）融合タンパク質であり得る。１つの典型的な１日投与量は、上記要因に依存して、約１μg/kg〜１００mg/kg、又はそれ以上であってよい。数日間以上にわたって繰り返し投与する場合、症状に応じて、処置は、一般的に、疾患症状の所望の抑制が生じるまで持続されよう。融合タンパク質の１つの例示的な投与量は、約０．００５mg/kg〜約１０mg/kgの範囲であろう。他の非限定的な例では、用量は、投与１回当たり、約１μg/kg（体重）、約５μg/kg（体重）、約１０μg/kg（体重）、約５０μg/kg（体重）、約１００μg/kg（体重）、約２００μg/kg（体重）、約３５０μg/kg（体重）、約５００μg/kg（体重）、約１mg/kg（体重）、約５mg/kg（体重）、約１０mg/kg（体重）、約５０mg/kg（体重）、約１００mg/kg（体重）、約２００mg/kg（体重）、約３５０mg/kg（体重）、約５００mg/kg（体重）から約１０００mg/kg（体重）又はそれ以上、及びこれらから得られる任意の範囲を含んでよい。本明細書に列挙する数字から得られる範囲の非限定的な例では、上記数字に基づいて、約５mg/kg（体重）〜約１００mg/kg（体重）、約５μg/kg（体重）〜約５００mg/kg（体重）等の範囲を投与してよい。したがって、約０．５mg/kg、２．０mg/kg、５．０mg/kg、又は１０mg/kg（又はこれらの任意の組み合わせ）のうちの１つ以上の用量を患者に投与してよい。このような用量は、断続的に、例えば、毎週又は３週間毎に投与してよい（例えば、患者が、約２用量〜約２０用量、又は例えば、約６用量の融合タンパク質を服用するように）。最初により高い負荷用量、続いて、より低い用量を１回以上投与してよい。しかし、他の投与レジメンも有用であり得る。この療法の進行は、従来の技術及びアッセイによって容易にモニターされる。
本発明の融合タンパク質は、一般的に、意図する目的を達成するのに有効な量で用いられる。疾患の状態を処置又は予防するために用いる場合、本発明の融合タンパク質又はその医薬組成物は、治療上有効な量で投与又は適用される。治療上有効な量の決定は、特に、本明細書に提供する詳細な開示を踏まえて、当業者が十分に対応できる範囲内である。
全身投与の場合、治療上有効な用量は、最初に、細胞培養物アッセイ等のインビトロアッセイから推定することができる。次いで、動物モデルにおいて、細胞培養物で決定したＩＣ５０を含む血中濃度範囲が得られるように、用量を製剤化してよい。このような情報を用いて、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定することができる。
また、初期投与量は、当技術分野において周知の技術を用いて、インビボデータ、例えば、動物モデルから推定することもできる。当業者は、動物のデータに基づいて、ヒトへの投与を容易に最適化することができる。
投与量及び投与間隔は、治療効果を維持するのに十分な血漿中濃度の融合タンパク質を提供するために個別に調整してよい。注射によって投与する場合における通常の患者投与量は、約０．１〜５０mg/kg/日、典型的には、約０．５〜１mg/kg/日である。治療上有効な血漿中濃度は、毎日複数用量を投与することによって達成することができる。血漿中濃度は、例えば、ＨＰＬＣによって測定することができる。
局所投与又は選択的取り込みの場合、融合タンパク質の有効局所濃度は、血漿中濃度に関連していなくてもよい。当業者は、過度の実験を行うことなく治療上有効な局所投与量を最適化することができよう。
本明細書に記載する融合タンパク質の治療上有効な用量は、一般的に、実質的な毒性を引き起こすことなく治療効果を提供する。融合タンパク質の毒性及び治療有効性は、細胞培養物又は実験動物において標準的な薬学的手順によって決定することができる。細胞培養物アッセイ及び動物実験を用いて、ＬＤ５０（集団の５０％にとって致死性である用量）及びＥＤ５０（集団の５０％において治療上有効な用量）を決定することができる。毒性作用と治療効果との間の用量比は、治療係数であり、これは、比ＬＤ５０／ＥＤ５０として表すことができる。大きな治療係数を示す融合タンパク質が好ましい。１つの実施態様では、本発明に係る融合タンパク質は、高い治療係数を示す。細胞培養物アッセイ及び動物試験から得られたデータを、ヒトにおいて使用するのに好適な範囲の投与量の製剤化において用いることができる。投与量は、好ましくは、ほとんど又は全く毒性を有しないＥＤ５０を含む血中濃度の範囲内である。投与量は、例えば、使用される投与形態、利用される投与経路、被験体の状態等の様々な要因に依存して、この範囲内で変動してよい。正確な製剤、投与経路、及び投与量は、患者の状態を鑑みて個々の医師が選択することができる（例えば、全文が参照により本明細書に組み入れられるFingl et al., 1975, in: The Pharmacological Basis of Therapeutics, Ch. 1, p. 1を参照）。
本発明の融合タンパク質で処置される患者の主治医は、毒性、臓器機能不全等が原因で、投与をどのように、そして、いつ、終えるか、中断するか、又は調整するかについて理解するであろう。逆に、主治医は、臨床応答が適切でなかった場合（毒性は除外する）、より高いレベルに処置を調整することも理解するであろう。対象となる障害の管理における投与量の規模は、処置される状態の重篤度、投与経路等によって変動するであろう。状態の重篤度は、例えば、標準的な予後評価法によって、部分的に評価することができる。更に、用量及び恐らく投薬頻度も、個々の患者の年齢、体重、及び応答に従って変動するであろう。
他の薬剤及び処置
本発明の融合タンパク質は、治療において１つ以上の他の薬剤と組み合わせて投与してよい。例えば、本発明の融合タンパク質は、少なくとも１つの追加治療剤と同時投与してよい。用語「治療剤」は、このような処置を必要としている個体における症状又は疾患を処置するために投与される任意の薬剤を包含する。このような追加治療剤は、処置される具体的な適応症に好適な任意の活性成分、好ましくは、互いに有害な影響を及ぼさない補完的活性を有するものを含み得る。特定の実施態様では、追加治療剤は、免疫抑制剤である。
このような他の薬剤は、好適には、意図する目的のために有効な量で併存する。有効量のこのような他の薬剤は、用いられる融合タンパク質の量、障害又は処置の種類、及び上で論じた他の要因に依存する。融合タンパク質は、一般的に、本明細書に記載するのと同じ投与量及び投与経路で、又は本明細書に記載する投与量の約１〜９９％で、又は任意の投与量で、そして、実験的に／臨床的に適切であると決定された任意の経路によって用いられる。
上述のこのような併用療法は、併用投与（２つ以上の治療剤が、同じ又は別々の組成物中に含まれる）、並びに、本発明の融合タンパク質の投与を、追加治療剤及び／又は補助剤の投与の前に、同時に、及び／又は後に行うことができる別々の投与を包含する。
製品
本発明の別の態様では、上記障害の処置、予防、及び／又は診断に有用な物質を含有する製品が提供される。該製品は、容器と、該容器上の又は該容器に付随するラベル又は添付文書とを含む。好適な容器は、例えば、瓶、バイアル、シリンジ、静脈注射溶液用袋等を含む。該容器は、ガラス又はプラスチック等の様々な材料から形成してよい。該容器は、組成物を単独で、又は状態の処置、予防、及び／若しくは診断に有効な別の組成物と組み合わせられて保持し、そして、滅菌アクセスポートを有し得る（例えば、容器は、皮下注射針によって穿刺可能な栓を有する静脈注射溶液用の袋又はバイアルであってよい）。組成物中の少なくとも１つの活性剤は、本発明の融合タンパク質である。ラベル又は添付文書は、前記組成物が、対象となる状態を処置するために用いられることを示す。更に、前記製品は、（ａ）本発明の融合タンパク質を含む組成物が収容されている第１の容器と；（ｂ）更なる治療剤を含む組成物が収容されている第２の容器とを含んでもよい。本発明のこの実施態様における製品は、更に、特定の状態を処置するために前記組成物を用いることができることを示す添付文書を含んでよい。あるいは又は更に、前記製品は、注射用静菌性水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液、及びデキストロース溶液等の薬学的に許容し得るバッファを含む第２の（又は第３の）容器を更に含んでよい。前記製品は、他のバッファ、希釈剤、フィルタ、針、及びシリンジを含む、商業的観点及びユーザーの立場から望ましい他の材料を更に含んでよい。
実施例
以下は、本発明の方法及び組成物の例である。上に提供した一般的記載を鑑みて、様々な他の実施態様を実施できることが理解される。
組み換えＤＮＡ技術
標準的な方法を用いて、Sambrook et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989に記載の通りＤＮＡを操作した。分子生物学的試薬は、製造業者の指示書に従って用いた。ヒト免疫グロブリン軽鎖及び重鎖のヌクレオチド配列に関する一般的情報は、Kabat, E.A. et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Ed., NIH Publication No 91-3242に記載されている。
ＤＮＡ配列決定
ＤＮＡ配列は、二本鎖配列決定によって決定した。
遺伝子合成
所望の遺伝子セグメントは、状況によって、適切なテンプレートを用いるＰＣＲによって作製したか、又は自動遺伝子合成による合成オリゴヌクレオチド及びＰＣＲ産物からGeneart AG（Regensburg, Germany）によって合成した。正確な遺伝子配列が入手不可能であった場合、最も近縁なホモログの配列に基づいてオリゴヌクレオチドプライマーを設計し、そして、適切な組織に由来するＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲによって遺伝子を単離した。唯一の制限エンドヌクレアーゼ切断部位に隣接する遺伝子セグメントを標準的なクローニング／シーケンシングベクターにクローニングした。形質転換された細菌からプラスミドＤＮＡを精製し、そして、紫外分光法によって濃度を求めた。サブクローニングした遺伝子フラグメントのＤＮＡ配列を、ＤＮＡシーケンシングによって確認した。それぞれの発現ベクターにサブクローニングできるように好適な制限部位を有する遺伝子セグメントを設計した。全てのコンストラクトを、真核細胞において分泌するためのタンパク質を標的とするリーダーペプチドをコードする５’末端ＤＮＡ配列を有するように設計した。配列番号３９〜４７は、例示的なリーダーペプチド及びそれらをコードするポリヌクレオチド配列を提示する。
ＩＬ−２Ｒβγサブユニット−Ｆｃ融合物及びＩＬ−２ＲαサブユニットＦｃ融合物の調製
ＩＬ−２受容体の結合親和性を調べるために、ヘテロ二量体ＩＬ−２受容体を発現させるツールを作製した。「knobs-into-holes」技術（Merchant et al., Nat Biotech. 16, 677-681 (1998)）を用いて、ＩＬ−２受容体のβサブユニットを、ヘテロ二量体化するように操作したＦｃ分子（Ｆｃ（ホール））（配列番号２１及び２２（ヒト）、配列番号２７及び２８（マウス）、並びに配列番号３３及び３４（カニクイザル）を参照）に融合させた。次いで、ＩＬ−２受容体のγサブユニットを、Ｆｃ（ホール）とヘテロ二量体化するＦｃ（ノブ）バリアント（配列番号２３及び２４（ヒト）、配列番号２９及び３０（マウス）、並びに配列番号３５及び３６（カニクイザル）を参照）に融合させた。次いで、このヘテロ二量体Ｆｃ−融合タンパク質を、ＩＬ−２／ＩＬ−２受容体相互作用を分析するための基質として用いた。ＩＬ−２Ｒαサブユニットは、ＡｃＴｅｖ切断部位及びＡｖｉ Ｈｉｓタグを有する単量体鎖（配列番号２５及び２６（ヒト）、配列番号３１及び３２（マウス）、並びに配列番号３７及び３８（カニクイザル））として発現させた。それぞれのＩＬ−２Ｒサブユニットを、ＩＬ−２Ｒβγサブユニットコンストラクトについては血清を含み、そして、αサブユニットコンストラクトについては血清を含まない、ＨＥＫ ＥＢＮＡ２９３細胞において一時的に発現させた。ＩＬ−２Ｒβγサブユニットコンストラクトは、プロテインＡ（GE Healthcare）、次いで、サイズ排除クロマトグラフィー（GE Healthcare、Superdex 200）によって精製した。ＩＬ−２Ｒαサブユニットは、NiNTAカラム（Qiagen）においてＨｉｓタグを介して、次いで、サイズ排除クロマトグラフィー（GE Healthcare、Superdex 75）によって精製した。様々な受容体コンストラクトのアミノ酸及び対応するヌクレオチド配列を配列番号２１〜３８に示す。
融合タンパク質の調製
遺伝子合成及び／又は古典的な分子生物学的技術によってＤＮＡ配列を作製し、そして、ＭＰＳＶプロモータ及び上流の合成ｐｏｌｙＡ部位の制御下で哺乳類発現ベクターにサブクローニングし、各ベクターは、ＥＢＶ ＯｒｉＰ配列を有していた。リン酸カルシウムトランスフェクションを用いて、指数関数的に成長しているＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞を哺乳類発現ベクターでコトランスフェクトすることによって、以下の実施例で適用する融合タンパク質を産生した。あるいは、懸濁液中で成長しているＨＥＫ２９３細胞を、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）によってそれぞれの発現ベクターでトランスフェクトした。あるいは、無血清培地で産生するために、安定的にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞プール又はＣＨＯ細胞クローンを用いた。次いで、上清から融合タンパク質を精製した。簡潔に述べると、２０mM リン酸ナトリウム、２０mM クエン酸ナトリウム（pH７．５）において平衡化されたプロテインＡ（HiTrap ProtA、GE Healthcare）を用いる１段階アフィニティーによって、融合タンパク質を精製した。上清の投入後、カラムを、まず２０mM リン酸ナトリウム、２０mM クエン酸ナトリウム（pH７．５）で洗浄し、続いて１３．３mM リン酸ナトリウム、２０mM クエン酸ナトリウム、５００mM 塩化ナトリウム（pH５．４５）で洗浄した。融合タンパク質を、２０mM クエン酸ナトリウム、１００mM 塩化ナトリウム、１００mM グリシン（pH３）又は１０mM クエン酸ナトリウム（pH３．０）で溶出した。画分を０．５M Ｎａ２ＨＰＯ４（pH８．０）（１：１０）で中和し、プールし、そして、最終製剤バッファ：２０mM ヒスチジン、１４０mM ＮａＣｌ（pH６．０）中で、サイズ排除クロマトグラフィー（HiLoad 16/60 Superdex 200、GE Healthcare、又はHiLoad 26/60 Superdex 200、GE Healthcare）によって精製した。精製タンパク質サンプルのタンパク質濃度は、アミノ酸配列に基づいて計算したモル吸光係数を用いて、２８０nmにおける光学濃度（ＯＤ）を測定することによって求めた。また、分子量は、アミノ酸配列に基づいて求めた。融合タンパク質の純度及び分子量は、還元剤（５mM １，４−ジチオトレイトール（dithiotreitol））の存在下及び非存在下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、そして、クマシーブルー（SimpleBlue（商標）SafeStain、Invitrogen）で染色した。NuPAGE（登録商標）Pre-Castゲルシステム(Invitrogen)を、製造業者の指示書に従って用いた（４〜２０％ Ｔｒｉｓ−グリシンゲル又は３〜１２％ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ）。あるいは、分子の純度及び分子量は、製造業者の指示書に従ってCaliper LabChip GXIIシステム（Caliper Lifescience）を用いて、還元剤の存在下及び非存在下でＣＥ−ＳＤＳ分析によって分析した。融合タンパク質サンプルの凝集量は、２５℃で、２mM ＭＯＰＳ、１５０mM ＮａＣｌ、０．０２％ ＮａＮ３（pH７．３）ランニングバッファ中でSuperdex 200 10/300GL分析サイズ排除カラム（GE Healthcare）を用いて分析した。あるいは、抗体サンプルの凝集量は、２５℃で２５mM Ｋ２ＨＰＯ４、１２５mM ＮａＣｌ、２００mM Ｌ−アルギニン一塩酸塩、０．０２％（w/v） ＮａＮ３（pH６．７）ランニングバッファ中でTSKgel G3000 SW XL分析サイズ排除カラム（Tosoh）を用いて分析した。
DP47GS IgG-IL-2、DP47GS IgG-(IL-2)2、DP47GS IgG-IL-2 N88D、DP47GS IgG-(IL-2 N88D)2、及びDP47GS IgG-(IL-2 E95A)2コンストラクトの精製及び特性評価の結果を、それぞれ、図１、２、３、４、及び５に示す。
ＩＬ−２受容体に対する親和性
以下の条件下で、組み換えＩＬ−２Ｒβγヘテロ二量体を用いて、ヒト、マウス、及びカニクイザルＩＬ−２Ｒβγヘテロ二量体に対する融合タンパク質の親和性を、Biacore T200（GE Healthcare）において表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって求めた：リガンド：ＳＡチップに固定化されたビオチン化ヒト、マウス、及びカニクイザルＩＬ−２Ｒβノブγホールヘテロ二量体（固定化レベルは、それぞれ、１９４、１１４、及び１１６RUであった）、検体：DP47GS IgG-IL-2（配列番号１３、１５、及び１９を参照）、DP47GS IgG-(IL-2)2（配列番号１７及び１９を参照）、DP47GS IgG-IL-2 N88D（配列番号１５、１９、及び４８を参照）、DP47GS IgG-(IL-2 N88D)2（配列番号１９及び５０を参照）、及びDP47GS IgG-(IL-2 E95A)2（配列番号１９及び５２を参照）、温度：２５℃、バッファ：ＨＢＳ−ＥＰ、検体濃度：１００nMから１．２nMに低下（１：３希釈）、流速：３０μL/分、会合：１２０ｓ、解離：２つの最高濃度については６００ｓ、そして、より低濃度については１２０ｓ、再生：６０ｓ ３M ＭｇＣｌ２、フィッティング：１：１ラングミュア結合モデル、ＲＩ≠０、Ｒｍａｘ＝ローカル。親和性は、反応速度定数Ｋｏｎ及びｋｏｆｆに基づいて求めた。また、以下の条件下で、組み換え単量体ＩＬ−２Ｒαサブユニットを用いて、ヒト、マウス、及びカニクイザルＩＬ−２Ｒαサブユニットに対する融合タンパク質の親和性を求めた：リガンド：アミンカップリングを介してＣＭ５チップに固定化されたヒト、マウス、及びカニクイザルＩＬ−２Ｒαサブユニット（固定化レベルは、それぞれ、２４０、２４５、及び２２０RUであった）、検体：DP47GS IgG-IL-2（配列番号１３、１５、及び１９を参照）、DP47GS IgG-(IL-2)2（配列番号１７及び１９を参照）、DP47GS IgG-IL-2 N88D（配列番号１５、１９、及び４８を参照）、DP47GS IgG-(IL-2 N88D)2（配列番号１９及び５０を参照）、及びDP47GS IgG-(IL-2 E95A)2（配列番号１９及び５２を参照）、温度：２５℃、バッファ：ＨＢＳ−ＥＰ、検体濃度３００nMから０．４１nMに低下（１：３希釈）、流速：３０μL/分、会合：１２０ｓ、解離：１８０ｓ、再生：１０mM グリシン（pH１．５）、６０秒間。親和性は、定常状態分析によって求めた。
ＩＬ−２Ｒβγヘテロ二量体についての反応速度及びＩＬ−２Ｒαサブユニットについての定常状態に基づく親和性測定の結果を表１に示す。
ヒトDP47GS IgG-IL-2融合物及びその変異体は、３つの異なるヒトＩＬ−２受容体鎖α、β、及びγだけではなく、カニクイザル及びマウス由来のそれぞれの受容体鎖にも結合するが、親和性は、平均して、後者２種についてわずかに低い傾向がある。これらサイトカイン融合物のヒト及びカニクイザルのα鎖に対する親和性は、マウスのα鎖に対する親和性と同等であり、サイトカイン部分を１つしか有しない分子については、ヒトα鎖に比べて約２倍の親和性差が観察される。２つのサイトカイン部分を有する分子については、恐らくアビディティに起因して、この差は存在しない。DP47GS IgG-IL-2及びDP47GS IgG-IL-2 N88Dのα鎖に対する親和性は、理論的には等しいはずであり、その理由は、Ｎ８８Ｄ変異はα鎖との界面に影響を及ぼさないはずであるからである。Ｎ８８は、ＩＬ−２受容体β鎖との界面に位置し、そして、Ｄへの突然変異誘発は、３種全てのＩＬ−２Ｒβγに対するDP47GS IgG-IL-2及びDP47GS IgG-IL-2 N88Dの結合（それぞれ、０．１５nM、０．６０nM、及び０．８５ nM対０．９３nM、１．３nM、及び２．４nM）を比較して分かる通り、親和性の低下につながる。２つの変異型ＩＬ−２サイトカインを有するDP47GS IgG-(IL-2 N88D)2については、少なくともヒトＩＬ−２Ｒβγに対して、恐らくアビディティに起因して、この差はそれほど顕著ではない。DP47GS IgG-(IL-2)2及びDP47GS IgG-(IL-2 E95A)2は、３種全てのＩＬ−２Ｒβγに対する結合において、非常に類似のアビディティを示す。Ｅ９５もＩＬ−２受容体β鎖との界面に位置するが、Ａへの突然変異誘発は、少なくともこれら変異体の２つがＩｇＧに融合するとき、アビディティの著しい低下にはつながらない。
免疫細胞におけるＩＬ−２受容体の発現
高親和性三量体Ｉｌ−２受容体は、α（ＩＬ−２ＲＡ、ＣＤ２５）、β（ＩＬ−２ＲＢ、ＣＤ１２２）、及びγ（ＩＬ−２ＲＧ、ＣＤ１３２）鎖で構成され、そして、約１０pMのＫＤを有する。ＣＤ２５単独では、ＩＬ−２に対して低い親和性（ＫＤ約１０nM）しか有しない。ＩＬ−２ＲＡの非存在下で幾つかの細胞型において発現するＩＬ−２ＲＢ／ＩＬ−２ＲＧ二量体もＩＬ−２に結合するが、中親和性（ＫＤ約１nM）である。ＩＬ−２受容体を介するシグナル伝達は、ＩＬ−２ＲＢ鎖及びＩＬ−２ＲＧ鎖によって媒介される。結晶構造解析から、ＩＬ−２ＲＡは、ＩＬ−２ＲＢにもＩＬ−２ＲＧにも接触しないと思われる。三量体受容体の協同性の基礎は、ＣＤ２５がＩＬ−２ＲＢ及びＩＬ−２ＲＧに提示するために細胞表面においてＩＬ−２を捕捉するとき、あるいはＩＬ−２の立体構造がＣＤ２５に誘導されて変化するときのエントロピー低減であり、これによって複合体が安定化されると提唱されている。ＦＯＸＰ３＋制御性ＣＤ４＋Ｔ細胞では、受容体のβ鎖及びγ鎖に比べて化学量論的に大きく過剰のＩＬ−２ＲＡが存在し、これは、α鎖の二量体、又は更に大きな複合体が、ＩＬ−２の結合を支援するという仮説を支持する。また、ある細胞におけるＣＤ２５は、高親和性細胞間相互作用で、ＩＬ−２を別の細胞におけるＩＬ−２ＲＢ／ＩＬ−２ＲＧ二量体に提示することができるという証拠も存在し、これは、高親和性ＩＬ−２受容体を構成する３本の鎖間の独自の関係を強調するものである。
ＣＤ４＋Ｔｒｅｇサブセット、ＮＫ細胞サブセット、及びＮＫＴ細胞、並びにＣＤ４＋及びＣＤ８＋従来型Ｔ細胞サブセットにおけるＣＤ２５（ＩＬ−２ＲＡ）及びＣＤ１２２（ＩＬ−２ＲＢ）の発現をＦＡＣＳによって決定した（図６及び７）。細胞表面マーカーを用いて、ＣＤ４＋Ｔｒｅｇサブセット、ＮＫＴ細胞、及びＮＫ細胞を定義した（図６）。ＣＤ２５及びＣＤ１２２に対する染色を最適化するために、細胞内ＦｏｘＰ３染色は実施しなかった。簡潔に述べると、健常ボランティアによって提供された血液 １５０μLを用いて、暗条件下室温で４５分間蛍光抗体をインキュベートした（開始時及び２０分後にボルテックスした）。赤血球を９分間ＢＤリシスバッファ（BD FACS（商標） Lysing Solution、349202）で溶解し、そして、残りの細胞を洗浄（ＰＢＳ ２mL＋０．１％ ＢＳＡ）及び固定（１％ ＰＦＡ）した。細胞をLSRFortess（商標）細胞分析機（Becton Dickinson）で分析し、そして、FloJoソフトウェア（TreeStar）を用いてデータを解析した。ＴＣＲαβ−ＦＩＴＣ（ＩＰ２６、BioLegend）、ＣＤ４−Alexa Fluor（登録商標）７００（ＲＰＡ−Ｔ４、BioLegend）、ＣＤ１２７−ＰＥ／ＣＹ７（ebioRDR5、Ebioscience）、ＣＤ４５ＲＡ−Pacific Blue（ＨＩ１００、BioLegend）、ＣＤ２５−ＡＰＣ（２Ａ３、Ｍ−Ａ２５１、BD Biosciences）、及びＣＤ１２２−ＰＥ（ＴＵ２７、BioLegend）に特異的な抗体を用いてＴｒｅｇサブセットを同定した。ＮＫ細胞及びＮＫＴ細胞を、別々のチューブにおいて、ＴＣＲαβ−ＦＩＴＣ、ＣＤ４−Alexa Fluor（登録商標）７００、ＣＤ８−ＰＥ／ＣＹ７（ＨＴＴ８ａ、BioLegend）、ＣＤ５６−Pacific Blue（ＨＣＤ５６、BioLegend）、ＣＤ２５−ＡＰＣ、及びＣＤ１２２−ＰＥに特異的な抗体で染色した。ＦＳＣ／ＳＳＣに基づくリンパ球のゲーティング及びダブレットの除去に続いて、ナイーブＴｒｅｇをＴＣＲαβ＋ＣＤ４＋ＣＤ１２７−ＣＤ２５＋ＣＤ４５ＲＡ＋として同定し、メモリーＴｒｅｇをＴＣＲαβ＋ＣＤ４＋ＣＤ１２７−ＣＤ２５＋ＣＤ４５ＲＡ−として同定し、そして、活性化ＴｒｅｇをＴＣＲαβ＋ＣＤ４＋ＣＤ１２７−ＣＤ２５ｈｉｇｈＣＤ４５ＲＡ−として同定した。ＮＫ細胞をＴＣＲαβ−ＣＤ５６−／ｄｉｍとして同定し、そして、活性化ＮＫ細胞をＴＣＲαβ−ＣＤ５６brightとして同定した。ＮＫＴ細胞をＴＣＲαβ＋ＣＤ５６＋として同定した。それぞれ、ＣＤ２５及びＣＤ１２２についてのバックグラウンド蛍光を推定するために、ＡＰＣ及びＰＥにコンジュゲートしたアイソタイプ対照（ＩＣ）を用いた。
同様に、細胞表面マーカーを用いて、ナイーブ及びメモリー従来型ＣＤ４＋Ｔ細胞（図７Ａ及び７Ｂ）、メモリー従来型ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ８Ｔ細胞（ナイーブ及びＴＥＭＲＡサブセットの組み合わせ；ＴＥＭＲＡは、ＣＤ４５ＲＡを発現するように復帰したエフェクターメモリーＴ細胞を指す）（図７Ｃ及び７Ｄ）を定義した。染色及び分析は、上記の通り実施した。ＣＤ４＋Ｔｒｅｇを特性評価するために上記と同じチューブを用いて、ＣＤ４＋従来型ナイーブＴ細胞をＴＣＲαβ＋ＣＤ４＋ＣＤ１２７＋ＣＤ２５−／＋ＣＤ４５ＲＡ＋として同定し、そして、ＣＤ４＋従来型メモリーＴ細胞をＴＣＲαβ＋ＣＤ４＋ＣＤ１２７＋ＣＤ２５−／＋ＣＤ４５ＲＡ−として同定した。ＣＤ８Ｔ細胞を、ＴＣＲαβ−ＦＩＴＣ、ＣＤ８−Alexa Fluor（登録商標）７００（ＨＴＴ８ａ、BioLegend）、ＣＤ２８−ＰＥ／ＣＹ７（ＣＤ２８．２、BioLegend）、ＣＤ４５ＲＡ−Pacific Blue、ＣＤ２５−ＡＰＣ、及びＣＤ１２２−ＰＥを用いて定義した。ＣＤ８＋メモリーＴ細胞をＴＣＲαβ＋ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＡ−として同定した。ＣＤ８＋ナイーブ及びＴＥＭＲＡ細胞をＴＣＲαβ＋ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＡ＋として同定した。ＣＤ８＋ナイーブＴ細胞をＣＤ８＋ＴＥＭＲＡ Ｔ細胞と区別するためにＣＤ２８を用いなかったが、その理由は、ＣＤ２８マーカーが下記ｐＳＴＡＴ５ａ分析に含まれていなかったからである（図８を参照）。幾つかの試験では（図１５）、更なるサブセットを以下のとおり定義した：セントラルメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞（ＴＣＲαβ＋ＣＤ４＋ＣＤ５６−ＦＯＸＰ３−ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ１２７＋ＣＤ２５−／＋）、エフェクターメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞（ＴＣＲαβ＋ＣＤ４＋ＣＤ５６−ＦＯＸＰ３−ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ１２７−ＣＤ２５−／＋）、セントラルメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞（ＴＣＲαβ＋ＣＤ８＋ＣＤ５６−ＦＯＸＰ３−ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ１２７＋ＣＤ２５−／＋）、エフェクターメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞（ＴＣＲαβ＋ＣＤ８＋ＣＤ５６−ＦＯＸＰ３−ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ１２７−ＣＤ２５−／＋）、及びＴＥＭＲＡ ＣＤ８＋細胞(ＴＣＲαβ＋ＣＤ８＋ＣＤ５６−ＦＯＸＰ３−ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ１２７-ＣＤ２５−／＋）。
図６及び７では、ヒト末梢血におけるＴ細胞、ＮＫ細胞、及びＮＫ Ｔ細胞のサブセットについて、ＩＬ−２ＲＡ及びＩＬ−２ＲＢの細胞特異的発現を示す（ＩＬ−２ＲＧは、造血細胞で本質的に遍在的に発現しているが、その理由は、多数のサイトカイン受容体とパートナーになるからである）。最高レベルのＩＬ−２ＲＡが、３つの制御性ＣＤ４＋Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）集団に存在する：ナイーブ（ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２５＋）、メモリー(ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ２５＋）、及び活性化(ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ２５ｈｉ） （図６Ａ）。平均して、従来型メモリーＣＤ４＋Ｔ細胞は、Ｔｒｅｇよりも約１０倍少ないＣＤ２５を発現する（図７Ａ）。ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＣＤ２５の発現は、ドナー間で著しく変動するが、常に、メモリーＣＤ４＋Ｔ細胞で観察されるよりも低い（図７Ａ）。ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、及びＣＤ８Ｔ細胞におけるＣＤ２５の発現は、ＣＤ５６brightＮＫ細胞を除いて、非常に低いか又は検出できない（図６Ｃ及び７Ｃ）。ＣＤ５６brightＮＫ細胞及びＣＤ５６＋ＮＫ細胞（図６Ｄ）は、ＮＫＴ細胞を含むＴ細胞サブセットのいずれよりも約１０倍高い、最高レベルのＩＬ−２ＲＢを発現する（図６Ｂ、６Ｄ、７Ｂ、７Ｄ）。
ヒト末梢血細胞サブセットにおけるｐＳＴＡＴ５ａの誘導
三量体ＩＬ−２ＲのＩＬ−２誘導オリゴマー化に続いて、それぞれ、ＩＬ−２ＲＢ及びＩＬ−２ＲＧの細胞内ドメインと連結するＪＡＫ１及びＪＡＫ３細胞質タンパク質チロシンキナーゼが活性化される。これらキナーゼは、次にリン酸化されるＳＴＡＴ５ａ及びＳＴＡＴ５ｂに対するドッキング部位として作用する特定のＩＬ−２ＲＢチロシン残基をリン酸化する。幾つかのシグナル伝達経路のＩＬ−２誘導活性化により、最終的に、ＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒ経路に関連する様々な機能に寄与する標的遺伝子が転写される。様々な細胞型が様々なレベルのＩＬ−２受容体ＩＬ−２ＲＡ分子及びＩＬ−２ＲＢ分子を発現する（図６及び７）ので、高及び中親和性受容体の様々な組み合わせによって媒介されるＩＬ−２に対する統合シグナル伝達応答について理解するために、多色フローサイトメトリーによって個々の細胞内のｐＳＴＡＴ５ａレベルを測定した。
ＳＴＡＴ５ａリン酸化の誘導に対する様々な用量のDP47GS IgG-IL-2、DP47GS IgG-(IL-2)2、DP47GS IgG-(IL-2E95A)2、DP47GS IgG-IL-2N88D、及びDP47GS IgG-(IL-2N88D)2の効果を、ヒトＣＤ４＋Ｔｒｅｇサブセット、ナイーブ及びメモリー従来型ＣＤ４＋Ｔ細胞、メモリー従来型ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ８Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、及びＮＫ細胞において評価した（図８〜１４、並びに表２及び３）。全てのサブセットを、各用量について１本のチューブにおいて特性評価した。簡潔に述べると、健常ヒト成人ボランティア由来の血液をヘパリン化チューブに回収した。様々な濃度のDP47GS IgG-IL-2融合タンパク質を血液 ５００μLに添加し、そして、３７℃でインキュベートした。３０分後、予め温めておいた溶解／固定バッファ（Becton Dickinson #558049）を用いて、３７℃で１０分間、血液を溶解及び固定し、０．２％ ＢＳＡを含有するＰＢＳで２回洗浄し、続いて、−２０℃の予冷メタノール（Sigma, Biotech grade #494437）を用いて氷上で２０分間透過処理した。次いで、細胞を、０．２％ ＢＳＡを含有するＰＢＳで４回広範に洗浄した後、様々なリンパ球及びＮＫ細胞亜集団、並びにｐＳＴＡＴ５ａ状態を区別するために、蛍光抗体のパネルを用いてＦＡＣＳ染色を実施した。利用した抗体は、抗ＣＤ４−Alexa Fluor（登録商標）７００（クローンＲＰＡ−Ｔ４）、ＣＤ３−ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５（ＵＣＨＴ１）、ＣＤ４５ＲＡ−ＰＥ／Ｃｙ７（ＨＩ１００）、ＣＤ８−Brilliant Violet 605（ＲＰＡ−Ｔ８）、ＣＤ５６−Brilliant Violet 421（ＨＣＤ５６）、ＦＯＸＰ３−ＰＥ（２５９Ｄ）（全てBioLegend製）、ＣＤ２５−ＡＰＣ（クローンＭ−Ａ２５１及び２Ａ３）、及びｐＳＴＡＴ５ａ−Alexa Fluor（登録商標）４８８（ｐＹ６９４）（Becton Dickinson）であった。LSRFortessa（商標）細胞分析機（Becton Dickinson）を用いてサンプルを取得し、そして、FlowJoソフトウェア（FlowJo, LLC）を用いてデータを解析した。リンパ球をゲーティングし、そして、ダブレットを除去した後、Ｔｒｅｇを ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＦＯＸＰ３＋として定義し、そして、ＣＤ４５−ＦＯＸＰ３ｈｉ（活性化Ｔｒｅｇ）、ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ-ＦＯＸＰ３＋ (メモリーＴｒｅｇ）、及びＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ４５＋ＦＯＸＰ３＋（ナイーブＴｒｅｇ）として細分した。従来型ＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ＋（ナイーブ）及びＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ−（メモリー）として定義した。ＣＤ８Ｔ細胞を、ＣＤ３＋ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＡ−（メモリー）及びＣＤ３＋ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＡ＋として定義した。ＮＫＴ細胞を、ＣＤ３＋ＣＤ５６＋として定義し、そして、ＮＫ細胞を、ＣＤ３−ＣＤ５６bright（活性化ＮＫ細胞）又はＣＤ３−ＣＤ５６＋（ＮＫ細胞）として定義した。全ての用量の全ての細胞サブセットにおいて、細胞内ｐＳＴＡＴ５ａレベルを定量した。
図８は、それぞれ異なる日に試験した３人の個々のドナー由来のヒト末梢血におけるＴ細胞、ＮＫ細胞、及びＮＫ Ｔ細胞に対するDP47GS IgG-IL-2免疫コンジュゲートの用量応答を示す。DP47GS IgG-IL-2に対する応答性の階層は、３人のドナー全てにおいて同じであり、そして、組み換えヒトＩＬ−２（Proleukin（登録商標））を用いたときに観察されたものと同じであった（データは示さない）。３つのＴｒｅｇ集団、活性化（ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ２５ｈｉ）、メモリー(ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ２５＋）、及びナイーブ（ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２５＋）は全て、濃度０．１ng/mLのDP47GS IgG-IL-2においてｐＳＴＡＴ５ａレベルを増大させたが、他の細胞集団では、ｐＳＴＡＴ５ａを検出可能な程度増大させるために、１ng/mL超（ＣＤ５６brightＮＫ及びメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞）又は１０〜１００ng/mL（メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ５６＋ ＮＫ細胞、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、及びＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ８Ｔ細胞）のDP47 IgG-IL-2が必要であった。また、DP47GS IgG-IL-2に対して高い感受性を示すＴｒｅｇ集団による用量応答のより詳細については図１１を参照。Ｔ細胞サブセットにおけるＩＬ−２ＲＢ発現と比べたとき、中レベルのＣＤ５６を有するＮＫ細胞におけるＩＬ−２ＲＢの高発現（図６Ｄ）は、Ｔｒｅｇ様のＩＬ−２感受性を可能にするには十分ではないことに留意すべきである。全体的に、活性化、メモリー、及びナイーブＴｒｅｇサブセットは、DP47GS IgG-IL-2に対して最も高い感受性を示したが、ＣＤ５６brightＮＫ細胞及びＣＤ４＋従来型メモリーＴエフェクター細胞の感受性は、２０〜５０倍低かった。ｐＳＴＡＴ５ａの増加について分析した他の細胞サブセットの中でも、ＣＤ８＋メモリーＴエフェクター細胞、ＣＤ４＋ナイーブＴエフェクター細胞、ＮＫＴ細胞、「静止」ＮＫ細胞（陽性、ＣＤ５６について強く染色されない）、及びＣＤ８＋ナイーブＴエフェクター＋ＣＤ４５ＲＡ＋メモリー細胞は、IgG-IL-2免疫コンジュゲートに対して比較的感受性が低かった。
図９は、それぞれ異なる日に試験した５人の個々のドナー由来のヒト末梢血におけるＴ細胞、ＮＫ細胞、及びＮＫ Ｔ細胞に対するDP47GS IgG-(IL-2)2の用量応答を示す。DP47GS IgG-IL-2について観察された通り（図８）、３つのＴｒｅｇサブセットは、DP47GS IgG-(IL-2)2誘導ｐＳＴＡＴ５ａに対して最も感受性の高い細胞であり（図９及び１１）、そして、５人のドナー全てにおいて他の細胞サブセットについて同様の階層的用量応答がみられた。
DP47GS IgG-IL-2及びDP47GS IgG-(IL-2)2をより容易に比較するために、ｐＳＴＡＴ５ａ値を正規化した（図１０）。ＭＦＩ値を正規化するために、各ゲーティングされたサブセットに特異的な非刺激ｐＳＴＡＴ５ａのＭＦＩ値を、その細胞サブセットについての全ての刺激ＭＦＩ値から減じた。得られた値を、用量応答においてそのサブセットによって得られた最も高いｐＳＴＡＴ５ａのＭＦＩ値で除した。そのサブセットについて観察された最高のｐＳＴＡＴ５ａ ＭＦＩの５０％に達するのに必要なＩＬ−２融合タンパク質の量に基づいて、ＥＣ５０を推定した。図１０に示す通り、DP47GS IgG-(IL-2)2免疫コンジュゲートは、恐らく高親和性ＩＬ−２受容体に対する免疫コンジュゲートのアビディティが増大した結果として、ＣＤ２５を構成的に発現する細胞においてｐＳＴＡＴ５ａをより強力に誘導した。ｐＳＴＡＴ５ａ活性化についてのＥＣ５０は、DP47GS IgG-(IL-2)2をDP47GS IgG-IL-2と直接比較したとき、Ｔｒｅｇにおいて５〜９倍低いと観察された。様々な細胞サブセットにおけるDP47GS IgG-IL-2対DP47GS IgG-(IL-2)2によるｐＳＴＡＴ５ａ活性化についての代表的なＥＣ５０値及び倍数差を表２に要約する。
極度に制限された濃度でさえも、DP47GS IgG-(IL-2)2は、DP47GS IgG-IL-2と比べたとき、より高いレベルのｐＳＴＡＴ５ａを産生した（図１１）。この実験では、限界濃度のＩＬ−２における２倍力価のDP47 IgG-IL-2及びDP47 IgG-(IL-2)2に対する応答について、３人の健常ボランティア由来の血液を同日、個々に試験した。図１１のグラフは、３人のドナーについてのｐＳＴＡＴ５ａのＭＦＩの平均±ＳＤを表す。個々に調べた３つのＴｒｅｇサブセットに加えて（図１１Ｂ〜Ｄ）、ゲートを適用して、全ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋ＴｒｅｇにおけるｐＳＴＡＴ５ａを評価した（図１１Ａ）。結果は、ＩｇＧ１分子当たりＩＬ−２が２倍しか増加していないにもかかわらず、ＴｒｅｇのDP47GS IgG-(IL-2)2活性化について効力が５〜１０倍増大したことを明らかに示す。多色フローサイトメトリーを上記の通り実施した（図８を参照）。
また、ＣＤ４＋従来型メモリーＴエフェクター細胞は、DP47GS IgG-IL-2と比べて、より低濃度（７倍）のDP47GS IgG-(IL-2)2に応答した。DP47GS IgG-(IL-2)2をDP47 IgG-IL-2と比較したとき、ＣＤ５６brightＮＫ細胞及びＣＤ５６＋ＮＫ細胞についてのＥＣ５０値はより低かったが、低下は、それぞれ、わずか３倍及び４倍であった。これは、ＩＬ−２媒介シグナル伝達についての、中親和性ＩＬ−２受容体に対するこれら細胞の確実性に起因している可能性がある。このＴｒｅｇ対ＮＫ細胞についてのＥＣ５０の差異シフトは、Ｔｒｅｇ活性化に対する優先度を数倍増大させる。
図１２は、それぞれ異なる日に試験した３人の個々のドナー由来のヒト末梢血におけるＴ細胞、ＮＫ細胞、及びＮＫ Ｔ細胞に対するDP47GS IgG-(IL-2E95A)2の用量応答を示す。IL-2E95A分子を設計し、そして、ＩＬ−２Ｒβγ結合活性を低減すると予測したが、実際は、野性型ＩＬ−２と同様のＩＬ−２Ｒβγ受容体に対する結合特性を示した。DP47GS IgG-(IL-2E95A)2に対する応答性の階層は、３人のドナー全てにおいて同じであり、そして、野性型ＩＬ−２免疫コンジュゲートDP47GS IgG-(IL-2)2を用いて同じドナーにおいて観察されたものと同じであった。３つのＴｒｅｇ集団、活性化（ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ２５ｈｉ）、メモリー(ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ２５＋）、及びナイーブ（ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２５＋）は全て、濃度０．１ng/mL未満のDP47GS IgG-(IL-2E95A)2においてｐＳＴＡＴ５ａレベルを増大させたが、他の細胞集団は、ｐＳＴＡＴ５ａを検出可能な程度増大させるために、１ng/mL（ＣＤ５６brightＮＫ及びＣＤ４＋従来型メモリーＴ エフェクター細胞）又は１０〜１００ng/mL（メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ５６＋ ＮＫ細胞、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、及びＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞）のDP47 IgG-(IL-2E95A)2が必要であった。Ｔ細胞サブセットにおけるＩＬ−２ＲＢ発現と比べたとき、中レベルのＣＤ５６を有するＮＫ細胞におけるＩＬ−２ＲＢの高発現（図６Ｄ）は、Ｔｒｅｇ様のＩＬ−２感受性を可能にするには十分ではないことに留意すべきである。全体的に、活性化、メモリー、及びナイーブＴｒｅｇサブセットは、DP47GS IgG-(IL-2E95A)2に対して最も高い感受性を示したが、ＣＤ５６brightＮＫ細胞及びＣＤ４＋従来型メモリーＴエフェクター細胞の感受性は、２０〜５０倍低かった。ｐＳＴＡＴ５ａの増加について分析した他の細胞サブセットの中でも、ＣＤ８＋メモリーＴエフェクター細胞、ＣＤ４＋ナイーブＴエフェクター細胞、ＮＫＴ細胞、「静止」ＮＫ細胞（陽性、ＣＤ５６について強く染色されない）、及びＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＡ＋ナイーブＴエフェクター細胞は、IgG-(IL-2E95A)2免疫コンジュゲートに対して比較的感受性が低かった。
図１３は、それぞれ異なる日に試験した５人の個々のドナー由来のヒト末梢血におけるＴ細胞、ＮＫ細胞、及びＮＫ Ｔ細胞に対するDP47GS IgG-(IL-2N88D)2の用量応答を示す。ＩＬ２Ｒβγ結合活性を低減するようにIL-2N88D分子を設計したところ、Ｅ９５Ａ点変異とは異なり、Biacore分析によってＩＬ２Ｒβγに対して６．２倍低い結合親和性を有していた（表１、ＫＤ０．１５nM対０．９３nM）。これまでに全てのＩＬ−２免疫コンジュゲートについて観察された通り、３つのＴｒｅｇサブセットは、DP47GS IgG-(IL-2N88D)2によるｐＳＴＡＴ５ａ活性化に対して最も感受性の高い細胞であり、そして、５人のドナー全てにおいて他の細胞サブセットについて同様の階層的用量応答がみられた。特に留意すべきは、DP47GS IgG-(IL-2N88D)2で刺激したときのＣＤ４＋メモリーＴエフェクター細胞の応答性の欠如であり；１０００ng/mLの用量でさえも、この重要な自己免疫細胞集団を刺激する効果をほとんど有していなかった。
この実施例では、独自に設計したＩＬ−２単一点変異Ｎ８８Ｄは、新規かつ改善された治療実体に必要なＴｒｅｇ刺激効果を全て維持しながら、所望の細胞集団ＣＤ４＋メモリーＴエフェクター細胞に対する刺激活性を劇的に低減した。
野性型IL-2 DP47GS IgG-(IL-2)2をＥ９５Ａ及びＮ８８Ｄ ＩＬ−２点変異免疫コンジュゲートと比較するために、試験した各細胞型について、ｐＳＴＡＴ５ａ値を互いに対してプロットした（図１４）。DP47GS IgG-(IL-2E95A)2は、各ヒト細胞集団を刺激するその野性型対応物DP47GS IgG-(IL-2)2と同一の活性を示し、用量応答曲線を重ね合わせることができた。対照的に、ＩＬ２Ｒβγ結合が低減された分子であるDP47GS IgG-IL-2N88D及びDP47GS IgG-(IL-2N88D2)2は、ＣＤ４＋メモリーＴエフェクター細胞に対してほとんど効果を有しておらず、そして、二価コンジュゲートDP47GS IgG-(IL-2N88D)2のみが、様々なＴｒｅｇ集団に対して著しい刺激活性を保持していた。
図１５における結果は、更に１０人のヒト血液ドナーから回収した全血ｐＳＴＡＴ５ａ応答を示す。別々の日に、各ドナーを試験して、広い（≧６log）力価範囲のDP47GS IgG-(IL-2)2及びDP47GS IgG-(IL-2N88D)2を比較した。DP47GS IgG-(IL-2)2で既にみられた通り（図９）、メモリーＴｒｅｇ及びナイーブＴｒｅｇは、DP47GS IgG-(IL-2)2及びDP47GS IgG-(IL-2N88D)2誘導ｐＳＴＡＴ５ａに対して最も感受性の高い細胞であり（図１５Ａ、Ｂ）；各融合タンパク質は、最高ｐＳＴＡＴ５ａ応答を刺激したが、活性化の変曲点に必要な濃度及び活性化のための最高用量が異なっていた。ＣＤ５６brightＮＫ細胞は、野性型ＩＬ−２融合タンパク質に比べてDP47GS IgG-(IL-2N88D)2に対する感受性がＴｒｅｇよりも低い細胞サブセットとして提示され（図１５Ｃ）；活性化の変曲点はより高く、そして、この場合、試験した最高用量（５０００ng/mL）でさえも、最高効果を得ることはできなかった。DP47GS IgG-(IL-2)2とは異なり、ＮＫ細胞は、DP47GS IgG-(IL-2N88D)2に対して非応答性であった（図１５Ｄ）。セントラルメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞（図１５Ｅ）及びエフェクターメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞（図１５Ｆ）はいずれも、DP47GS IgG-(IL-2N88D)2に対して比較的応答性が低く、活性化の変曲点はDP47GS IgG-(IL-2)2よりも１０００倍高く、そして、試験した最高用量（５０００ng/mL）において部分応答しか誘導しなかった。DP47GS IgG-(IL-2)2は、様々な程度の活性化を誘導したが、DP47GS IgG-(IL-2N88D)2は、以下の細胞サブセットに対して効果を有していなかった：ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞（図１５Ｇ）、セントラルメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞（図１５Ｈ）、エフェクターメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞（図１５Ｉ）、ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞（図１５Ｊ）、エフェクターメモリーＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞（図１５Ｋ）、ＮＫＴ細胞（図１５Ｌ）、及びＣＤ３＋ＣＤ４−ＣＤ８−ＣＤ５６−Ｔ細胞（図１５Ｍ）。
ＥＣ５０値を表３に示し、そして、ＥＣ５０値は、その細胞サブセットについて観察された最高ｐＳＴＡＴ５ａ応答の５０％に達するのに必要なＩＬ−２融合タンパク質の量に基づいていた。DP47GS IgG-(IL-2E95A)2は、その野性型ＩＬ−２対応物DP47GS IgG-(IL-2)2と同様に、恐らく高親和性ＩＬ−２受容体に対するアビディティの増大の結果として、高親和性受容体ＣＤ２５（ＩＬ２Ｒα）を構成的に発現する細胞であるＴｒｅｇにおいてｐＳＴＡＴ５ａを最も強力に誘導した。DP47GS IgG-(IL-2E95A)2及びDP47GS IgG-(IL-2)2に対する用量応答は、重ね合わせることができた。ＴｒｅｇにおけるｐＳＴＡＴ５ａ活性化についてのＥＣ５０は、一価DP47GS IgG-IL-2と比べてDP47GS IgG-(IL-2E95A)2及びDP47GS IgG-(IL-2)2では６〜７倍低かった。同様に、Ｔｒｅｇ活性化についてのＥＣ５０は、二価DP47GS IgG-(IL-2N88D)2に比べて一価DP47GS IgG-IL-2では７〜１０倍低かった。そして最後に、Ｔｒｅｇ活性化についてのＥＣ５０は、二価DP47GS IgG-(IL-2N88D)2に比べて二価DP47GS IgG-(IL-2)2では３６〜６１倍低かった。
自己免疫障害の処置のためにDP47GS IgG-(IL-2N88D)2が有している最も著しい免疫学的利点は、表３に最もよく示されており、これは、ＣＤ４＋メモリーＴエフェクター細胞に対するＴｒｅｇ活性化についてDP47GS IgG-(IL-2N88D)2が有する劇的な特異性限度（margin of specificity）を示す（＞３２０倍〜＞５００倍）。比較すると、ＣＤ４＋メモリーＴエフェクター細胞に対するＴｒｅｇの特異性限度は、DP47GS IgG-(IL-2)2（１３〜１４倍）及びDP47GS IgG-IL-2（１０〜１６倍）については実質的に低い。
インビトロにおけるヒトＮＫ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞に対するＩＬ−２融合タンパク質の差異効果
新鮮ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、ＮＫ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞の生存及び成長に好ましいことが知られている条件で、ＩＬ−２以外の更なる刺激なしに、インビトロで培養した。ヒトＮＫ細胞は、検出可能なＣＤ５６をほとんど又は全く発現しないもの（ＣＤ５６−／ｄｉｍと称する）及び高レベルのＣＤ５６を発現する「活性化」サブセット（ＣＤ５６brightと称する）に細分することができ；血液中のＮＫ細胞の大部分は、ＣＤ５６−／ｄｉｍであり、ＣＤ５６brightとして分類されるのはわずかである。ＣＤ５６brightである「活性化」ＮＫ細胞は、ＣＤ５６を発現しないＮＫ細胞（すなわち、ＣＤ５６−／ｄｉｍ）の前駆体であると考えられる。DP47GS IgG-(IL-2)2及びDP47GS IgG-(IL-2N88D)2（それぞれ、０、５、５０、及び５００ng/mL）と共にインビトロで６日間後、ＮＫ ＣＤ５６−／ｄｉｍ細胞、ＮＫ ＣＤ５６bright細胞、及びＣＤ８＋Ｔ細胞の成長及び生存における差を検出した。ＣＤ５６bright細胞（メジアン：１０１×１０３対３８×１０３、ｐ＜０．００５）（図１６Ａ）、及び、ＣＤ８＋Ｔ細胞（メジアン：細胞１３．６×１０３個対細胞２．５×１０３個、ｐ＜０．０００１）（図１６Ｂ）でも、最高増加を刺激するDP47GS IgG-(IL-2)2による刺激間に細胞数の著しい差がみられた。
ヒト化マウスにおけるＩＬ−２融合タンパク質の効果
免疫低下宿主として軽度に放射線照射された新生仔NOD.PrkdcscidIL2rgnull（ＮＳＧ）マウスを用い、そして、ヒト胎児肝臓ＣＤ３４＋幹細胞をＩＰ注射で移植することによって、ヒト化マウスを構築した。８〜１０週齢において、各マウス由来の血液を試験してヒト生着が生じたことを確認した。ProleukinとDP47GS IgG-(IL-2)2とを比較したところ、インビボで影響を受けた一次細胞は、ＮＫ細胞及びＴｒｅｇであり；DP47GS IgG-(IL-2)2処置後、ＮＫ細胞及びＴｒｅｇの両方が実質的に増加し、ＮＫ細胞は比例的に大きく応答することが見出された。Proleukinのインビボにおける効果は、同様であったが、群内のＮＫ細胞及びＴｒｅｇに対する効果は、それほど一致しておらず、そして、増加の程度は、DP47GS IgG-(IL-2)2と比べて低かった。また、ヒト化マウスは、ＩＬ−２融合タンパク質のインビボにおける効果を識別することができた。野性型DP47GS IgG-(IL-2)2は、Ｔｒｅｇ（図１７Ａ）及びＮＫ細胞（図１７Ｂ）の両方を増加させ、一方、DP47GS IgG-(IL-2N88D)2は、ＮＫに対して全く効果を有していなかった（図１７Ｂ）が、野性型IgG-(IL-2)2よりも著しく大きくＴｒｅｇを増加させた（図１７Ａ）。
ヒト化ＮＳＧマウスの長期的結果は、体重減少及び多臓器不全をもたらすヒト異種移植片対宿主反応に起因する生存期間の短縮である。ビヒクルの週２回投与は、全く効果を有しておらず、そして、処置開始後３６日間の生存期間中央値をもたらした（図１８）。ビヒクルと同様に、DP47GS IgG-(IL-2N88D)2による処置は、３７日間の生存期間中央値をもたらした。対照的に、DP47GS IgG-(IL-2)2による週２回処置は、この群の生存期間中央値を２１日間に短縮した（図１８、DP47GS IgG-(IL-2N88D)2と比べてｐ＜０．００３７）。
所定の重篤度の移植片対宿主反応が、各マウスについて生存部分の終わりを決定づけたとき（体重減少≧１５％）、血液中のヒト細胞組成を評価した。進行中の命にかかわる移植片対宿主反応では、血液中のＴｒｅｇ、ＮＫ細胞、及びＣＤ８＋Ｔ細胞の最終組成において処置アーム間で顕著な差がみられた（図１９）。ビヒクル処置マウスでは、血液中において、ヒトＴｒｅｇは、全ヒトＣＤ４５＋細胞の１％未満を占め、そして、ＮＫ及びＣＤ８＋Ｔ細胞は、ヒトＣＤ４５＋細胞の約３％含まれていた。DP47GS IgG-(IL-2N88D)2による処置は、ＮＫ及びＣＤ８＋Ｔ細胞を、それぞれ、２％及び５％に増加させ、一方、Ｔｒｅｇは６％に増加した。対照的に、野性型DP47GS IgG-(IL-2)2処置は、ＮＫ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞の割合を、全ヒトＣＤ４５＋細胞の３０％に増加させ、そして、Ｔｒｅｇを３．５％に増加させた。これは、恐らく、DP47GS IgG-(IL-2N88D)2処置マウスと比べたとき、この群における生存期間の著しい短縮を説明するものである。
カニクイザル末梢血細胞サブセットにおけるｐＳＴＡＴ５ａの誘導
ヒト末梢血で観察された通り、ＩＬ−２（Proleukin）で刺激したカニクイザル末梢血中のＴｒｅｇサブセットでは、ｐＳＴＡＴ５ａが優先的かつ同様に用量依存的に誘導される（データは示さない）。３つのＴｒｅｇサブセットにおいてDP47GS IgG-(IL-2)2及びDP47GS IgG-IL-2のｐＳＴＡＴ５ａを誘導する能力を直接比較すると、ｐＳＴＡＴ５ａの最高レベルの５０％に達するのに必要なDP47GS IgG-(IL-2)2は、DP47GS IgG-IL-2よりも２〜８倍少なかった。様々なカニクイザルＴｒｅｇサブセットにおけるDP47GS IgG-IL-2対DP47GS IgG-(IL-2)2 によるｐＳＴＡＴ５ａの活性化についてのＥＣ５０を表４に要約し、結果は、ヒト末梢血でみられたもの（表３）と著しく類似している。
ヒト全血と同様に、細胞表面及び細胞内マーカーを用いて、正常健常カニクイザル由来の全血における制御性Ｔ細胞サブセット及び従来型Ｔ細胞を同定した。３匹の健常カニクイザルから同日にヘパリンナトリウムチューブに血液サンプルを回収し、そして、様々な濃度のDP47GS IgG-IL-2又はDP47GS IgG-(IL-2)2を血液 ５００μLに添加し、そして、３７℃でインキュベートした。３７℃で１０分後、予め温めておいたBD 溶解／固定バッファ（BD Biosciences）でサンプルを溶解及び固定した。洗浄後、細胞を氷上で３０分間、メタノール １mLで透過処理した。サンプルを３回洗浄し、そして、４℃で１時間、ＦＯＸＰ３−Alexa Fluor（登録商標）６４７（クローン：２５９Ｄ、BioLegend）、ＣＤ４−Ｖ５００（クローン：Ｌ２００、BD Biosciences）、ＣＤ４５ＲＡ−Ｖ４５０（クローン：５Ｈ９、BD Biosciences）、ＣＤ２５−ＰＥ（クローン：４Ｅ３、eBioscience）、ｐＳＴＡＴ５ａ−Alexa Fluor（登録商標）４８８（クローン：４７、BD Biosciences）、及びＫｉ−６７−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５（クローン：Ｂ５６、BD Biosciences）のパネルで染色した。全てのサンプルをLSRFortessa（商標）細胞分析機（Becton Dickinson）によって取得し、次いで、FlowJoソフトウェア（FlowJo, LLC）を用いてデータを解析した。
更なる実験では、ヒト血液を用いたｐＳＴＡＴ５ａアッセイと同様に、正常健常成体カニクイザル由来の新鮮ヘパリン化血液を、ビヒクル対照としてのＰＢＳ、DP47GS IgG-(IL-2)2、及びDP47GS IgG-(IL-2N88D)2でインビトロにおいて刺激し、そして、Ｔｒｅｇサブセット及び従来型ＣＤ４＋メモリーＴエフェクター細胞におけるＳＴＡＴ５ａリン酸化に対する効果を調べた。≦１ng/mLにおける最高ヒトＴｒｅｇ応答及びその用量範囲における従来型ＣＤ４＋メモリーＴエフェクター細胞の最高応答付近（図９における結果）に基づいて、２０ng/mL 刺激用量を選択した。
実験条件は上記の通りであった。３匹の健常カニクイザル（ドナーＣ１、Ｃ２、Ｃ３）から同日にヘパリンナトリウムチューブに血液サンプルを回収し、そして、２０ng/mL DP47GS IgG-(IL-2)2又はDP47GS IgG-(IL-2N88D)2を血液 ５００μLに添加し、そして、３７℃で２０間インキュベートした後、溶解及び分析した。
カニクイザルＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇを、分析のためにナイーブ（ＦＯＸＰ３＋ＣＤ４５ＲＡ＋）、メモリー（ＦＯＸＰ３＋ＣＤ４５ＲＡ−）、及び活性化（ＦＯＸＰ３ｈｉＣＤ４５ＲＡ−）サブセットに分類するためのフローサイトメトリーゲーティングストラテジーを図２０Ａに示す。ヒトと同様に、各ドナー由来のＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋Ｔｒｅｇの３つのサブセットは、高レベルの高親和性ＩＬ−２受容体ＣＤ２５を発現した（図２０Ｂ）。２０ng/mL DP47GS IgG-(IL-2)2及びDP47GS IgG-(IL-2N88D)2でインビトロにおいて刺激した後、３匹のドナー全てに由来するＴｒｅｇは、ＳＴＡＴ５ａを著しくリン酸化した（図２０Ｃ）。ヒトと同様に、カニクイザルの活性化及びメモリーＴｒｅｇは、ナイーブＴｒｅｇと比べて、ｐＳＴＡＴ５ａ誘導についてより高い可能性を示した。
ヒト従来型ＣＤ４＋メモリーＴエフェクター細胞は、Ｔｒｅｇほど感受性が高いわけではないが、ＩＬ−２で刺激され得、活性化のバイオマーカーとしてｐＳＴＡＴ５ａを用いたDP47GS IgG-(IL-2)2についての推定ＥＤ９０は２０ng/mLであった（図１４）。カニクイザル従来型ＣＤ４＋メモリーＴエフェクター細胞は、同様に、血液中でＣＤ４＋ＦＯＸＰ３−ＣＤ４５ＲＡ−細胞として同定することができ、細胞の大部分はＣＤ２５−であり、そして、ＣＤ２５＋サブセットはより少なかった（図２１Ａ）。集団全体としてみたとき、３匹全てのドナー由来のカニクイザルメモリーＴｅｆｆ細胞は、２０ng/mL DP47GS IgG-(IL-2)2に応答し、ｐＳＴＡＴ５Ａを増加させたが、２０ng/mL DP47GS IgG-(IL-2N88D)2は、ｐＳＴＡＴ５ａに対してほとんど（ｃｙｎｏ２）又は全く（ｃｙｎｏ１及び３）効果を有していなかった（図２１Ｂ）。メモリーＴｅｆｆ細胞をＣＤ２５−及びＣＤ２５＋サブセットに更に細分したとき、DP47GS IgG-(IL-2)2に対する応答は、主に、ＣＤ２５＋サブセットに存在し（図２１Ｄ）、ＣＤ２５−サブセットではほとんど応答しない（図２１Ｃ）ことが見出された。対照的に、DP47GS IgG-(IL-2N88D)2は、ＣＤ２５−メモリーＴｅｆｆ細胞に対して効果を有さず（図２１Ｃ）、そして、ＣＤ２５＋サブセットに対しては７０〜８０％低い刺激活性を有していた（図２１Ｄ）。
新鮮正常カニクイザル血液における更なる試験では、様々なＴ細胞サブセット、すなわち、活性化、ナイーブ、及びメモリーＴｒｅｇ、並びにＣＤ４＋メモリーＴエフェクター細胞においてｐＳＴＡＴ５ａを刺激する能力について、用量応答的に、様々な濃度のDP47GS IgG-(IL-2)2及びDP47GS IgG-(IL-2N88D)2を直接比較した。DP47GS IgG-(IL-2)2及びDP47GS IgG-(IL-2N88D)2はいずれも、用量依存的にＴｒｅｇを刺激し、野性型二価ＩＬ−２融合タンパク質は、各Ｔｒｅｇサブセットにおいて二価IL-2N88D融合タンパク質よりも約１０倍強力であった（図２２Ａ〜Ｃ）。対照的に、ＣＤ４＋メモリーＴエフェクター細胞をｐＳＴＡＴ５ａ誘導について評価したとき、２つの分子間で劇的な差がみられた（図２２Ｄ）。DP47GS IgG-(IL-2)2は、３００ng/mLの〜ＥＣ９０を示したが、DP47GS IgG-(IL-2N88D)2は、その高用量では実質的に効果を有していなかった。カニクイザルｐＳＴＡＴ５ａ刺激についてのＥＣ５０値に加えて、ＣＤ４＋メモリーＴエフェクター細胞に対するＴｒｅｇの刺激についての相対倍数特異性を表５に示す。カニクイザル全血におけるこれら結果は、ヒト全血を用いた結果にかなり類似しており（図１４及び表３）、そして、カニクイザルにおける試験が、ヒト臨床試験に対して高い予測値を有し得ることを示唆する。
マウスにおける薬物動態特性
マウスにおいて機能試験を実施する前に、野性型及びＮ８８Ｄの一価及び二価ＩＬ−２免疫コンジュゲートの薬物動態（ＰＫ）特性を、ＮＯＤ、NOD.scid、及びNOD.scid.Il2rα-/-マウスにおいて評価した（図２３）。
ＮＯＤ及びNOD.scidマウス（ｎ＝３）に、０．５％ マウス血清を含有するＰＢＳ中DP47GS IgG-IL-2又はDP47GS IgG-(IL-2)2をマウス１匹当たり０．３mg/kgで静脈内（i.v.）注射し、そして、２分〜１６８時間にわたる注射後の様々な時点で失血させた（図２３Ａ）。ＩＬ−２を捕捉するために、マウス抗ヒトＩＬ−２ｍＡｂ（BD Pharmingen、#555051、クローン5344.111）を用いて９６ウェルプレートをコーティングして、マウス血清サンプル中のヒトＩＬ−２を評価した。次いで、ビオチン化マウス抗ヒトＩＬ−２ｍＡｂ（BD Pharmingen、#555040、クローンB33-2）を用いてヒトＩＬ−２を検出した。ＩＬ−２結合を可視化し、そして、ユウロピウムコンジュゲートストレプトアビジンを用いて定量した。最初の２４時間にわたり、DP47GS IgG-(IL-2)2は、ＮＯＤ及びNOD.scidマウスの両方でDP47GS IgG-IL-2よりも速やかにクリアランスされた。４８時間までに、それぞれの血清レベルは同程度の濃度になり、そして、７２時間では全て検出限界未満であった。ＩＬ−２の検出限界は、０．０５ng/mLであり、そして、点線によって示されている。驚くべきことに、適応免疫系のないマウスにおける一価及び二価のIgG-IL-2免疫コンジュゲートの速やかなクリアランスは、非造血性ＩＬ−２コンパートメント又は「シンク（sink）」がマウスに存在し、そして、ＩＬ−２免疫コンジュゲートのインビボにおける速やかなクリアランスを駆動している可能性があることを示唆する。
この仮説を試験するために、高親和性ＩＬ−２受容体、ＩＬ２Ｒα（ＣＤ２５）も欠失しているNOD.scidマウス、すなわち、NOD.scid.Il2rα-/-マウスにおいてＰＫ試験を実施した（図２３Ｂ）。NOD.scid.Il2rα-/-マウスでは、DP47GS IgG-(IL-2)2は、３倍高い用量（０．３mg/kg）で投与されたにもかかわらず、最初の２４〜４８時間にわたり、０．１mg/kg DP47GS IgG-IL-2及び０．１mg/kg DP47GS IgG-(IL-2N88D)2よりも速やかにクリアランスされた。しかし、４８時間後、各コンジュゲートの血中レベルは、緩徐な定常排出相を示し、６日目まで血液中で容易にＩＬ−２を検出可能であった。興味深いことに、これら高親和性ＩＬ−２受容体欠損マウスでは、DP47GS IgG-(IL-2N88D)2分子は、IgG-IL-2よりもわずかに速い初期２４時間分布相を有していたが、その後、試験した最後の日である６日目まで野性型一価免疫コンジュゲートと同様の排出相を示した。これらDP47GS IgG-(IL-2N88D)2についてのデータは、特に関連性があるが、その理由は、NOD.scid.Il2rα-/-マウスにおけるＰＫ結果が、非ヒト霊長類におけるＰＫ結果を厳密に予測すると思われるためである。
ＩＬ−２で処置した後のマウスＴｒｅｇにおけるＦＯＸＰ３及びＣＤ２５の増加
様々な分子形態及び立体構造のヒトＩＬ−２のインビボにおいてＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇを刺激する能力を比較するために、ビヒクル、Proleukin（組み換えヒトＩＬ−２）、DP47GS IgG-IL-2、DP47GS IgG-(IL-2)2、又はDP47GS IgG-(IL-2N88D)2をマウスに皮下注射し、そして、既に決定した２４時間の最適時間において、細胞表面ＣＤ２５及び細胞内ＦＯＸＰ３の発現の変化についてＴｒｅｇを評価した（図２４）。幼若健常ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝３／処置群、ｎ＝４／ビヒクルコホート）に、Proleukin（２０，０００又は１００，０００IU/マウス）、DP47GS IgG-IL-2（６０、３００、又は１５００IU/マウス）、DP47GS IgG-(IL-2)2（６０、３００、又は１５００IU/マウス）、又はDP47GS IgG-(IL-2N88D)2（６０、３００、又は１５００IU/マウス）を皮下注射した。用量は、０．５％ 滅菌濾過マウス血清を含有する滅菌ＰＢＳ（pH７．２） １００μLで構成されるビヒクル中で送達した。２４時間後、マウスを安楽死させ、そして、脾臓を切除した。脾細胞の単一細胞懸濁液をＬ−１５培地 １mL中で作製し、そして、更に加工するまで氷上で保管した。単一細胞懸濁液の濾過アリコート ４０μLをＦＡＣＳチューブに移し、そして、ＦＡＣＳバッファ ２mLで洗浄した（６００×ｇ、５分間）。次いで、細胞表面抗原：ＣＤ４（クローンＲＭ４−５、蛍光色素（fluorochrome） A700）、ＣＤ２５（ｅＢｉｏ７Ｄ４、Ａｆ４８８）、ＣＤ４４（ＩＭ７、ｅ６０５）、ＣＤ６２Ｌ（ＭＥＬ−１４、ＰＥ）、ＩＣＯＳ（Ｃ３９８．４Ａ、ＰＥ／Ｃｙ７）、ＣＤ１０３（２Ｅ７、ＡＰＣ）に対する蛍光色素コンジュゲート抗体と共にサンプルをインキュベートした。染色は、ＦＡＣＳバッファ（ＰＢＳ（pH７．２）＋０．２％ ＢＳＡ） １００μL中４℃で３０分間実施した。細胞表面染色後、サンプルをＦＡＣＳバッファ ４mLで洗浄（６００×ｇ、５分間）した後、（eBioscienceの細胞内染色プロトコールに従って）細胞内染色した。簡潔に述べると、サンプルを固定／透過処理バッファ（eBioscience #00-5521） ２００μL中に再懸濁させ、そして、４℃で１時間インキュベートした。１×透過処理バッファ（eBioscience #00-8333） １mLをサンプルに添加した後、ＦＡＣＳバッファ ３mLを添加し、そして、洗浄（６００×ｇ、５分間）した。細胞内抗原Ｋｉ−６７（Ｂ５６、ＰｅｒＣＰ Ｃｙ５．５）及びＦＯＸＰ３（ＦＪＫ−１６Ｓ、ｅ４５０）を、１×透過処理バッファ １００μL中４℃で１時間染色した。サンプルをＦＡＣＳバッファ ４mLで洗浄（６００×ｇ、５分間−２回）し、そして、BD Fortessa（商標）分析機においてデータを取得し、そして、FlowJoソフトウェア（FlowJo, LLC）を用いて解析した。Ｔｒｅｇをリンパ球ゲート内のシングレットからＣＤ４＋ＦＯＸＰ３＋と定義し；この集団から、全てのサンプルについてＣＤ２５及びＦＯＸＰ３の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を計算した。
図２４に示す通り、３つのＩＬ−２免疫コンジュゲートは、マウスＴｒｅｇにおけるＣＤ２５（２４Ａ）及びＦｏｘＰ３（２４Ｂ）の発現の刺激において等効力であり、そして、６０、３００、及び１５００IU/マウスの用量範囲にわたって一貫して用量依存的応答を示した。いずれの場合も、各免疫コンジュゲート １５００IU（黒色棒）は、Proleukin １００，０００IU（黒色棒）よりも著しく有効性が高かった。ほとんどの場合、免疫コンジュゲート ３００IU（濃灰色棒）は、Proleukin １００，０００IUと等価であり、そして、免疫コンジュゲート ６０IU（薄灰色棒）は、Proleukin ２０，０００IU（薄灰色棒）と等価であった。全ての処置群において、データを平均±ＳＤとして示す。
カニクイザルにおける薬物動態特性
非ヒト霊長類において機能試験を実施する前に、ＩＬ−２免疫コンジュゲートの薬物動態（ＰＫ）特性を、生物学的ナイーブ健常成体カニクイザルにおいて評価した（図２５）。サル（ｎ＝２／用量）に、０．５％ カニクイザル血清を含有するＰＢＳ中滅菌DP47GS IgG-IL-2又はDP47GS IgG-(IL-2)2のショートボーラスを静脈内（i.v.）注射し、そして、３０分〜７２時間にわたる注射後の様々な時点で失血させた。ヒトＩＬ−２を捕捉するために、マウス抗ヒトＩＬ−２ｍＡｂ（BD Pharmingen、カタログ#555051、クローン5344.111）を用いて９６ウェルプレートをコーティングして、カニクイザル血清サンプル中のヒトＩＬ−２を評価した。次いで、ビオチン化マウス抗ヒトＩＬ−２ｍＡｂ（BD Pharmingen、カタログ#555040、クローンB33-2）を用いてヒトＩＬ−２を検出した。ＩＬ−２結合を可視化し、そして、ユウロピウムコンジュゲートストレプトアビジンを用いて定量した。アッセイにおけるカニクイザル血清を用いた検出レベルは、０．０５ng/mL ＩＬ−２であった（図中点線）。処置前に採取したカニクイザル血清は、検出可能なＩＬ−２を有していなかった（したがって、＜０．０５ng/mL）。
全ての用量のDP47GS IgG-IL-2（図２５Ａ）及びDP47GS IgG-(IL-2)2（図２５Ｂ）をi.v.注射した３０分〜４８時間後、カニクイザル血清においてＩＬ−２を検出した。７２時間までに、ＩＬ−２の血清レベルは、１０及び２５μg/kg DP47GS IgG-IL-2又はDP47GS IgG-(IL-2)2で処置した全ての動物について、検出限界（０．０５ng/mL、点線）未満であった。１００μg/kg DP47GS IgG-IL-2の投与後、７２時間でも検出可能な血清ＩＬ−２が依然として存在していた。
カニクイザルにおけるＴｒｅｇ数の誘導
インビボにおいてDP47GS IgG-IL-2で処置したカニクイザルは、Ｔｒｅｇの絶対数が用量依存的に増加したことに加えて、投与後７日目にベースラインを超えて倍数増加した（それぞれ、図２６Ａ及び２６Ｂ）。３〜６年齢の両性別の正常健常カニクイザルを全ての試験で用い、そして、１回を超えて用いた動物は存在しなかった。麻酔下にある間、様々な用量のDP47GS IgG-IL-2（ｎ＝４〜６）又はビヒクル（ｎ＝３）を外側足背にＳＣ注射した。DP47GS IgG-IL-2の個々の用量は、体重に基づいており、そして、０．５％ 滅菌正常カニクイザル血清を含有する滅菌ＰＢＳ（pH７．２）のビヒクル中で注射用に製剤化したものであった。処置後の様々な時点で血液サンプルを回収し、そして、Advia Automated Hematology Analyzer、並びに上に詳述した（表４についての実験手順）細胞表面及び細胞内マーカーを用いて血液学的変化（ＣＢＣ及び差異）について試験した。処置後７日目における全血ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋制御性Ｔ細胞の変化を、全血１mm３当たりの絶対細胞数（図２６Ａ）及びＴｒｅｇの倍数変化（図２６Ｂ）として図２６に示し；全てのデータを平均±ＳＤとして表す。より高用量の２５μg/kg及び３６μg/kg DP47GS IgG-IL-2では、それぞれ、ほぼ３倍（１１１〜２５５％の範囲、ｎ＝６）及び４倍（１１０〜４７０％の範囲、ｎ＝６）の平均Ｔｒｅｇ増加が観察された。DP47GS IgG-IL-2のＳＣ用量を更に低減すると（１２、６、及び２μg/kg）、Ｔｒｅｇ数の変化及び倍数変化は、対応して減少し続けた。理論に束縛されることは望まないが、１２μg/kg DP47GS IgG-IL-2の用量によるＴｒｅｇの〜２倍の増加（６７〜１３３％の範囲、ｎ＝６）は、幾つかの自己免疫疾患及び炎症性疾患に対して望ましいＴｒｅｇの増加を表し得る。ヒトにおいてＴｒｅｇ数は広い範囲で存在し（血液１mm3当たり２０〜９０個のＴｒｅｇ；ＣＤ４＋Ｔ細胞の４〜１０％）、そして、個体内のＩＬ−２によって誘導されるＴｒｅｇの増加によって、機能抑制が全体的に増大すると推測することが合理的である。
より低用量のDP47GS IgG-IL-2を評価するとき（２〜６μg/kg）、より頻繁に血液サンプルを回収して、DP47GS IgG-IL-2投与後にＴｒｅｇの変化を検出するための最適時間を同定した（図２７）。７日目にＴｒｅｇの変化が存在していたが、４日目に最高刺激が生じ、これは、より高用量のDP47GS IgG-IL-2で測定したとき（７日目、図２６）よりも早かった。
Proleukin及びDP47GS IgG-IL-2は、Ｔｒｅｇ及び他のＩＬ−２応答性細胞においてｐＳＴＡＴ５ａを刺激するために用いられるＩＬ−２活性の単位によって直接比較するとき、インビトロにおいて、ヒト及びカニクイザルの全血アッセイで同等である（データは示さない）。ヒトにおいて半減期が短いことが知られているProleukinを用いて、カニクイザルで単一用量試験を行って、インビボにおけるＴｒｅｇ誘導及び活性化を評価した。Proleukinは、絶対数の倍数変化及びｐＳＴＡＴ５ａ活性化によって測定したとき、Ｔｒｅｇを用量及び時間依存的に変化させた。Ｔｒｅｇ数の増加は名ばかりであったが（図２８Ａ：１０〜４０％）、Ｔｒｅｇ ｐＳＴＡＴ５ａにおけるProleukin（登録商標）誘導増加は、実質的であり、そして、処置の１日間は用量依存的であったが（図２８Ｂ）、インビボにおいて短期間のものであり、２日目〜３日目までに正常に戻った。
カニクイザルにおいてインビボでＴｒｅｇの増加を誘導するDP47GS IgG-IL-2の能力とProleukinの能力との比較を図２９に示す。正常健常カニクイザル（ｎ＝５の群）を低用量のDP47GS IgG-IL-2又は高用量のProleukinで処置し、そして、１０日目に制御性Ｔ細胞の変化を試験した。０及び７日目に、用量１６，８００IU/kg（図２６に示す用量１２μg/kg）のDP47 IgG-IL-2をＳＣ投与した。Proleukinを１型糖尿病患者に投与（４．５×１０６IU/人、３回／週）したところ、Ｔｒｅｇを増加させることを示した発表済の研究、及び図２８における単一用量のデータに基づいて、それぞれ２００，０００IU/kg（カニクイザルの４．５×１０６IU/人と等価）のProleukinを、合計５用量、週３回（M/W/F）ＳＣ投与した。血液１mm３当たりの全Ｔｒｅｇの変化（図２９Ａ）、Ｔｒｅｇ数の倍数増加（図２９Ｂ）、及びＴｒｅｇの従来型ＣＤ４＋ＦＯＸＰ３−細胞に対する比の変化（図２９Ｃ）について、結果を平均±ＳＤとして図２９に示す。
ほぼ３０倍低いDP47GS IgG-IL-2活性を１０日間にわたって投与したが、DP47GS IgG-IL-2は、Proleukinよりも大きなＴｒｅｇ数の増加を誘導した（図２９Ａ、ｐ＝０．０６）。ベースラインを超えるＴｒｅｇ数の倍数増加（図２９Ｂ）及び従来型ＣＤ４Ｔ細胞に対するＴｒｅｇの増加（図２９Ｃ）も、Proleukinに比べてDP47GS IgG-IL-2を投与したサル方が大きかった（それぞれ、ｐ＝０．００１１及びｐ＝０．０１６）。ヒトにおいて、ＣＤ４＋制御性Ｔ細胞（通常、ＦＯＸＰ３＋及び表面マーカーの組み合わせとして定義される）の非制御性ＣＤ４Ｔ細胞（従来型又はエフェクター細胞と呼ばれる）に対する比は、多くの場合、時系列でみて患者におけるＴｒｅｇの機能レベルを定義するために用いられる。
低用量DP47GS IgG-IL-2処置に対するカニクイザル末梢血細胞サブセットのインビボにおける応答
低用量ＩＬ−２処置のインビボにおける細胞特異性は、重要なパラメータである。本発明者らは、カニクイザル又はマウスに投与した後の様々な時点で採取した血液中のエクスビボｐＳＴＡＴ５ａレベルを測定することによって、DP47GS IgG-IL-2又はProleukinによって誘導されるインビボ細胞活性化を高感度でモニターできることを見出した。インビトロでモニターすることができる全ての細胞集団のインビボ応答（図８〜１０）もエクスビボで調べることができる。
単一低用量のDP47GS IgG-IL-2（１２μg/kg）を健常カニクイザル（ｎ＝５）にインビボ投与した１及び３日後、全血を回収し、そして、上記（表４の実験手順）の通りＳＴＡＴ５ａリン酸化について試験した。処置前の０日目に各サルを失血させ、そして、ＳＴＡＴ５ａリン酸化の量を測定し、そして、処置後の倍数変化を評価するために個々に用いた。１日目及び３日目におけるＴｒｅｇ中のｐＳＴＡＴ５ａの倍数変化を図３０Ａに示し、従来型ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ−メモリーＴエフェクター細胞中のｐＳＴＡＴ５ａの倍数変化を図３０Ｂに示し、そして、従来型ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ＋ナイーブＴエフェクター細胞中のｐＳＴＡＴ５ａの倍数変化を図３０Ｃに示す。結果は、明らかに、単一低用量（１２μg/kg）のDP47GS IgG-IL-2投与の１日後及び３日後に得られたカニクイザル血液が、メモリー及びナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞と比べてＴｒｅｇ細胞において優先的なｐＳＴＡＴ５ａ増加を示したことを示す（図３０Ａ〜Ｃ）。単一低用量のDP47GS IgG-IL-2は、インビボにおいてＴｒｅｇを持続的に活性化状態にすることにおいて、単一高用量のProleukin（図２８Ｂ）よりも明らかに優れていた。
Ｔｒｅｇ活性化のインビボバイオマーカーとしてＳＴＡＴ５ａリン酸化を用いた最初の試験では、単一用量Proleukinでは１日目のみ（図２８Ｂ）、そして、低用量（１２μg/kg）のDP47GS IgG-IL-2では１及び３日目に（図３０Ａ）、最高ｐＳＴＡＴ５ａがみられた。サンプリング時間を追加してDP47GS IgG-IL-2の更なる力価測定を行ったところ、インビボｐＳＴＡＴ５ａシグナルを４日間維持することができ、その後、７日目に正常まで低下した（図３１Ａ、３１Ｂ）。２μg/kg（３１Ａ、ｎ＝４）及び６μg/kg（３１Ｂ、ｎ＝６）の両用量についてのｐＳＴＡＴ５ａシグナルのＭＦＩ（平均蛍光強度）は、最高未満のｐＳＴＡＴ５ａシグナル伝達が生じたことを示唆していた（図３３Ｂを参照）。これら超低用量のDP47GS IgG-IL-2でさえも、持続的にＴｒｅｇのインビボシグナル伝達をもたらし、そして、Proleukinよりも優れていた（図２８Ｂ）。これら結果は、超低レベルの長寿命ＩＬ−２、すなわち、DP47GS IgG-IL-2は、インビボにおいて長期間Ｔｒｅｇを刺激することができ、それによって、優性自己寛容を再確立するために必要な処置の頻度を減らし、そして、疾患の予後を改善することができるが、Proleukinにはできないという本発明者らによる仮説を支持する。低用量のＩＬ−２で処置した後の末梢血中のＴｒｅｇ細胞の増加は、細胞の実際の増加ではなく、体内の細胞の分布の変化を反映している可能性がある。インビボにおけるＴｒｅｇ増加が、少なくとも部分的にＩＬ−２処置による細胞分裂の誘導に起因していることを実証するために、増殖の細胞内マーカーであるＫｉ−６７を評価した。Ｋｉ−６７は、Ｇ１、Ｓ、Ｇ２、及び有糸分裂中の核では検出することができるが、細胞周期のＧ０期にある静止細胞には存在しないタンパク質である。上記の通り（図３１）２及び６μg/kg DP47GS IgG-IL-2で処置したカニクイザルを、上記の通り（表４の実験手順）細胞内マーカーＫｉ−６７のエクスビボにおける変化についてもモニターして、インビボにおける増殖の程度を評価した。０日目における細胞周期にある細胞（Ｋｉ−６７＋）の割合を、処置後１〜１１日目における細胞（Ｋｉ−６７＋）の割合と比較した。Ｋｉ−６７＋Ｔｒｅｇを図３２Ａに示し、従来型ＣＤ４＋ＣＤＲＡ４５−メモリーＴエフェクター細胞を図３２Ｂに示し、そして、従来型ＣＤ４＋ＣＤＲＡ４５＋ナイーブＴエフェクター細胞を図３２Ｃに示す。単一低用量のDP47GS IgG-IL-2（６μg/kg）の１〜７日後に得られたカニクイザル血液細胞は、従来型ＣＤ４＋ナイーブＴエフェクター細胞に比べてＴｒｅｇにおいて優先的なＫｉ−６７増加を示した（図３２Ａ対３２Ｃ）。ナイーブＴエフェクター細胞とは異なり、DP47GS IgG-IL-2（６μg/kg）は、従来型メモリーＣＤ４＋Ｔエフェクター細胞の増殖を刺激することができた（図３２Ｂ）。最低用量のDP47GS IgG-IL-2（２μg/kg）では、６μg/kg用量と比較して細胞周期及び増殖への活性化が最低であった。
ヒト及びカニクイザルの全血アッセイでは、二価DP47GS IgG-(IL-2)2のインビトロ活性は、合計で、一価DP47GS IgG-IL-2よりもＴｒｅｇに対して約６倍強力であった（表２及び４）。したがって、カニクイザルへの最初の用量は、試験したDP47GS IgG-IL-2の最高用量（３６μg/kg）よりも６倍少なくした。６μg/kgで投与したDP47GS IgG-(IL-2)2（ｎ＝４）により、循環Ｔｒｅｇが大きく増加し（図３３Ａ）、これは、処置後１４日間正常を大きく超えたままであり、Ｔｒｅｇ中でｐＳＴＡＴ５ａが著しくかつ長期にわたって生成されるが、１週間で正常に戻り（図３３Ｂ）、そして、Ｔｒｅｇ数がほぼ３倍増加した（図３３Ｃ）。DP47GS IgG-IL-2によって誘導された倍数変化（図２６から、白抜き棒）を、用量６μg/kgの二価DP47GS IgG-(IL-2)2（網かけ棒）と比較した（図３３Ｄ）。ヒト及びカニクイザル全血アッセイと同様に、DP47GS IgG-(IL-2)2は、ＩｇＧ１分子当たりＩＬ−２の２倍増加を超えて、インビボにおける効力の強化を示した。
追加用量の二価DP47GS IgG-(IL-2)2をカニクイザルに投与して、超低用量（２及び０．７μg/kg）におけるインビボ効果を評価した（図３４）。２μg/kgは中程度の倍数変化（平均４６％、２０〜７０％の範囲、ｎ＝８）をもたらしたが、用量０．７μg/kgは、Ｔ細胞数に対してほとんど効果を有していなかった（平均増加１６％、ｎ＝３）（図３４Ａ）。両低用量は、Ｔｒｅｇ中のｐＳＴＡＴ５ａ増加を刺激したが（図３４Ｂ、各ｎ＝３）、Ｔｅｆｆ／ｍｅｍ細胞のｐＳＴＡＴ５ａに対してはほとんど効果を有していなかった（図３４Ｃ、各ｎ＝３）。
一価及び二価の野性型ＩＬ−２融合タンパク質療法の包括的な効果及びそのカニクイザルにおいてＴｒｅｇを増加させる能力を図３５に示す。両形態の長寿命IgG-IL-2は、Ｔｒｅｇの強力なインデューサーであり、この後、インビボにおいて、活性化のバイオマーカーとして、そして、この図では、循環Ｔｒｅｇ数の倍数増加としてのｐＳＴＡＴ５ａが続き得る。ＩｇＧのＣ末端におけるＩＬ−２分子を２倍にすることによって達成される、強化された効力を有するDP47GS IgG-(IL-2)2は、DP47GS IgG-IL-2よりも用量依存的優位性を有する。
カニクイザルＴ細胞サブセットにおけるＦＯＸＰ３及びＣＴＬＡ−４のＤＮＡ脱メチル化
機能的に活性のＴｒｅｇは、免疫抑制性サイトカインＣＴＬＡ−４、ＩＬ−１０、及びＴＧＦβを産生することができ、そして、転写因子ＦＯＸＰ３の安定な発現を必要とする。ヒト及びカニクイザルＴｒｅｇにおけるＦＯＸＰ３の発現は、ＦＯＸＰ３遺伝子座内のＴｒｅｇ特異的脱メチル化領域（ＴＳＤＲ）における１０個のＣｐＧ ＤＮＡメチル化部位の脱メチル化に依存する。同様に、ＣＴＬＡ−４の発現及び産生は、ヒト及びカニクイザルのＣＴＬＡ−４遺伝子座における７個のＣｐＧ ＤＮＡメチル化部位の脱メチル化に依る。したがって、本発明者らは、血液中のＴｒｅｇ数を著しく増加させることが既に示されている用量及び回数で投与されたDP47GS IgG-IL-2（ｎ＝４、２５μg/kg s.c.）及びDP47GS IgG-(IL-2)2（ｎ＝４、６μg/kg s.c.）による処置前及び処置後に、様々なＣＤ４＋Ｔ細胞サブセットにおけるＦＯＸＰ３及びＣＴＬＡ−４の脱メチル化状態を評価した。試験では生物学的ナイーブ成体雄カニクイザルのみを用い、そして、その体重は、９．１〜１０．９kgであった。処置は、初期ベースライン血液回収の３週間後に投与し、そして、処置後血液を４〜５日後に回収した。ヘパリン化血液 ３０mL由来のＰＢＭＣを、FACSAria（商標）（Becton Dickinson）を用いて、Ｔｒｅｇ（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏｗ）、メモリーＴエフェクター（ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ−）、ナイーブＴエフェクター（ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ＋）、及びＣＤ４＋ＣＤ２５−ＣＤ１２７−細胞を含む関連ＣＤ４＋サブセットに選別した。
選別した細胞サブセットを１００，０００細胞のアリコートで凍結させ、そして、全てのサンプルを一緒に加工できるように−８０℃で乾燥ペレットとして保管した。細胞ペレットを解凍し、そして、ＤＮＡを抽出し、そして、製造業者の指示書に従ってEpitect Fast Lyse Allキット（Qiagen）を用いて一段階で亜硫酸水素塩処置した。亜硫酸水素塩ＤＮＡ ５ng（２μL中）を、Multiplex PCRキット（Qiagen） １０μL、水 ６μL、ＦＯＸＰ３フォワードプライマーtgtaaaacgacggccagtTTTAGAAGTTGTATGGGGGATGTT（配列番号５４）０．５μL、ＦＯＸＰ３リバースプライマーcaggaaacagctatgaccAAAATATCTACCCTCTTCTCTTCCTC（配列番号５５） ０．５μL、ＣＴＬＡ−４フォワードプライマーtgtaaaacgacggccagtGGGTTTGGTTATGAAGGAGTATGA（配列番号５６） ０．５μL、及びＣＴＬＡ−４リバースプライマーcaggaaacagctatgaccTTCACTTAATTTCCACTAAAAATACCC（配列番号５７） ０．５μLを含有する第１ラウンド二本鎖ＰＣＲ ２０μLにおいて用いた。第１ラウンドＰＣＲサイクルは、９５℃で１５分間、次いで、９５℃で３０秒間、６０℃で９０秒間、及び７２℃で６０秒間を２０サイクル、次いで、７２℃で１０分間であった。ＰＣＲ産物を、製造業者の指示書に従ってAMPure XPビーズ（Becton Coulter）を用いて精製し、そして、水 ２０μLで溶出した。Multiplex PCRキット（Qiagen） ７．５μL、第１ラウンドＰＣＲ産物 ６．５μL、及びインデックスプライマー １μLを含有するＰＣＲ １５μLを通して、各サンプルの先頭に独自のインデックス配列を付加する第２ラウンドＰＣＲを実施した。第２ラウンドＰＣＲサイクル条件は、９５℃で１５分間、次いで、９５℃で３０秒間、５４℃で９０秒間、及び７２℃で６０秒間を７サイクル、次いで、７２℃で５分間であった。ＰＣＲ産物をAMPure XPビーズを用いて精製し、水 １５μLで溶出し、そして、Shimadzu MultiNAを用いてＰＣＲ産物の量を定量するために４μLを用いた。等モル濃度の各サンプルをプールして、シーケンシングライブラリを作製し、これをKapa Illumina library定量キットを用いて定量した。ｖ３試薬及び２×３００bpのpaired end runを用いて、Illumina MiSeqでライブラリの配列決定を行った。配列決定したデータを、特注パイソンスクリプトを用いてデマルチプレックス化し、そして、Cutadaptプログラムを用いてシーケンシングアダプタを除去した。フォワード及びリバースの読み取りを、FLASHを用いてマージし、そして、各メチル化部位の配列を抽出した。
DP47GS IgG-IL-2及びDP47GS IgG-(IL-2)2によるカニクイザルの処置によって、処置された全ての動物において血液中のＴｒｅｇ数の実質的な増加が誘導され、これは、同じ処置プロトコールを用いて以前にみられたものと同様であった（図３３及び３５）。重要なことに、DP47GS IgG-IL-2及びDP47GS IgG-(IL-2)2による処置後のＴｒｅｇの速やかかつ劇的な増加は、ＦＯＸＰ３（図３６、上図）又はＣＴＬＡ−４（図３６、下図）の脱メチル化状態に悪影響を及ぼすこともなく、低減することもなかった。同様の結果が両分子についてみられ、そして、DP47GS IgG-(IL-2)2のデータを図３６に示す。ＦＯＸＰ３及びＣＴＬＡ−４の脱メチル化状態が、処置によって影響を受けることもなく、低減もしなかったことは、Ｔｒｅｇの全てが、絶対数の実質的な増加にもかかわらず、天然の成熟した機能的免疫抑制性表現型を維持していたことを示す。非ヒト霊長類におけるこれらＴｒｅｇ ＦＯＸＰ３及びＣＴＬＡ−４の脱メチル化の結果は、ヒトにおける低用量の長寿命IgG-(IL-2)2様分子による処置が、十分に機能的な成熟Ｔｒｅｇの数を増加させることができるはずであり、次いで、ヒトの自己免疫疾患並びに他の慢性免疫介在慢性炎症性疾患に存在する免疫制御性の不均衡を修正することを示唆する。
カニクイザルにおけるDP47GS IgG-(IL-2N88D)2の薬物動態
DP47GS IgG-(IL-2N88D)2のＰＫ特性を、生物学的ナイーブカニクイザルにおいて評価した（図３７）。サル（ｎ＝２／用量）に、０．５％ カニクイザル血清を含有するＰＢＳ中３０又は１００μg/kg 滅菌DP47GS IgG-(IL-2N88D)2を静脈内（iv）及び皮下（sc）注射し、そして、３０分〜１４日間にわたる注射後の様々な時点で失血させた。上記の通り、カニクイザル血漿サンプル中のヒトＩＬ−２を評価した。アッセイにおけるカニクイザル血漿を用いた検出レベルは、０．０５ng/mL ＩＬ−２であった。処置前に採取したカニクイザル血漿は、検出可能なＩＬ−２を有していなかった（したがって、＜０．０５ng/mL）。
血液レベルを４８〜７２時間までしか検出することができなかった野性型融合タンパク質のＰＫ（図２５）とは異なり、DP47GS IgG-(IL-2N88D)2は、iv（図３７Ａ）及びsc（図３７Ｂ）投与経路で１４日目までの全時点において全動物由来のカニクイザル血漿で検出された。血漿レベルは、最初の２〜３日間は用量に比例し、そして、野性型ＩＬ−２融合分子に比べて長い半減期を示した。
インビボにおけるＩＬ−２曝露のバイオマーカーとして、可溶性ＣＤ２５（ｓＣＤ２５、ＩＬ−２ＲＡ）の血漿レベルを測定した（図３７Ｃ）。Ｅｕ＋＋コンジュゲートストレプトアビジンを用いて、捕捉抗体（MAB623、R&D Systems）及びビオチン化検出抗体（BAF223、R&D Systems）を用いるサンドイッチイムノアッセイにおいて、カニクイザルｓＣＤ２５と交差反応することが知られているヒトｓＣＤ２５用のモノクローナル抗体試薬を用いて、結合型ｓＣＤ２５を検出した。DP47GS IgG-(IL-2N88D)2投与後のｓＣＤ２５の増加は、用量依存的であり、そして、１〜７日間存在し、８日目までに正常レベルに戻った。
DP47GS IgG-(IL-2N88D)2によるカニクイザルにおけるＴｒｅｇの誘導
野性型DP47GS IgG-IL-2及びDP47GS IgG-(IL-2)2によってインビボで処置したカニクイザルにおける既に記載した試験では、ヒト全血アッセイにおけるインビトロ活性を反映していたＴｒｅｇの絶対数の２〜４倍の用量依存的増加（それぞれ、図２６及び３３）、すなわち、６〜９倍のインビトロ差（表２及び３）が示された。ヒト全血におけるインビトロ効力の喪失（表３）から、DP47GS IgG-(IL-2N88D)2について３０及び１００μg/kgのインビボ用量を選択した。以前の試験と同様に、０．５％ 滅菌正常カニクイザル血清を含有する滅菌ＰＢＳ（pH７．２）のビヒクル中で注射用に製剤化した、体重に基づく個々の用量のDP47GS IgG-(IL-2N88D)2を、iv又はsc経路によって注射した（ｎ＝２／用量及び注射経路）。処置前（−４及び−５日目）、処置直前（０日目）、及び処置後の様々な時点（１〜１４日目）に血液サンプルを回収し、そして、血液学的変化（ＣＢＣ及び差異）並びに既に記載した細胞表面及び細胞内マーカーについて試験した。
全ＣＤ４＋Ｔｒｅｇ、ＣＤ４＋メモリーＴｒｅｇ、ＣＤ４＋ナイーブＴｒｅｇ、及びＣＤ８＋ＦＯＸＰ３＋Ｔｒｅｇの増加は、絶対細胞数／mL（血液）（図３８Ａ及び３８Ｂ）又は全ＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞の％（図３８Ｃ及び３８Ｄ）として、時間依存的応答として示される。
全ＣＤ４＋Ｔｒｅｇ数は、１００μg/kg後に９０，０００/mLから８１０，０００/mL（９倍）に増加し、そして、全ＣＤ４＋Ｔ細胞の４．２％から２６％（６．２倍）に増加し、そして、１４日目にも依然として上昇していた。３０μg/kgでは、全ＣＤ４＋Ｔｒｅｇは、６２，０００/mLから４４７，０００/mL（７．２倍）に、そして、全ＣＤ４＋Ｔ細胞の４．５％から１６．７％（３．７倍）に増加した。
メモリーＴｒｅｇ数は、１００μg/kgでは、４２，０００/mLから５３６，０００/mL（１２．８倍）に、そして、全ＣＤ４＋Ｔ細胞の２％から１７．４％（８．７倍）に増加した。３０μg/kgでは、メモリーＴｒｅｇは、５１，０００/mLから２８０，０００/mL（５．５倍）に、そして、全ＣＤ４＋Ｔ細胞の２．３％から１０．５％（４．６倍）に増加した。
ナイーブＴｒｅｇ数は、１００μg/kgでは、３５，０００/mLから２７２，０００/mL（７．８倍）に、そして、全ＣＤ４＋Ｔ細胞の２％から８．６％（４．３倍）に増加した。３０μg/kgでは、ナイーブＴｒｅｇは、４６，０００/mLから１６６，０００/mL（３．６倍）に、そして、全ＣＤ４＋Ｔ細胞の２．２％から６．２％（２．８倍）に増加した。
１００μg/kg DP47GS IgG-(IL-2N88D)2の投与後、ＣＤ８＋ＦＯＸＰ３＋Ｔｒｅｇは、１６，０００/mLの稀な細胞型から１８３，０００/mL（１１．４倍）に、そして、全ＣＤ８＋Ｔ細胞の０．７％から７．８％（１１．１倍）に増加した。用量３０μg/kgのDP47GS IgG-(IL-2N88D)2では、全ＣＤ８＋Ｔｒｅｇは、１７，０００/mLから１０１，０００/mL（５．９倍）に、そして、全ＣＤ８＋Ｔ細胞の０．５％から４．３％（８．６倍）に増加した。１００μg/kg又は３０μg/kg DP47GS IgG-(IL-2N88D)2後のＣＤ４＋メモリーＴｅｆｆ細胞では、処置に関連する増加は存在しておらず（図３９Ａ）；実際、恐らくその時点におけるＣＤ４＋Ｔｒｅｇの大きな増加に起因して、４日目に割合が減少した。ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉメモリーＴｅｆｆ細胞は、３０μg/kg DP47GS IgG-(IL-2N88D)2後には変化しなかったが、４日目に１．６倍に上昇し、７〜１０日目にベースラインに戻った（図３９Ｂ）。
DP47GS IgG-(IL-2N88D)2によるカニクイザルにおけるｐＳＴＡＴ５ａ、ＣＤ２５、及びＫｉ−６７の誘導
上記の通り、ＩＬ−２処置のインビボ細胞特異性は、重要なパラメータであり、そして、本発明者らは、投与後の様々な時点で採取した血液中のｐＳＴＡＴ５ａ、細胞表面ＣＤ２５、及び細胞内Ｋｉ−６７をエクスビボにおいて測定することによって、インビボにおける細胞サブセットの活性化をモニターできることを実証した。
図４０Ａ及び４０Ｂにおける結果は、DP47GS IgG-(IL-2N88D)2による処置後の優先的ｐＳＴＡＴ５ａ誘導、並びにＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔｒｅｇの長期にわたるｐＳＴＡＴ５ａシグナル伝達応答を示し；１００μg/kg及び３０μg/kgによる最高応答は、１日目〜４日目は維持され、７日目にベースラインに戻った。ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉメモリーＴｅｆｆは、１日目に最高の約半分の応答を示し、そして、４日目までに正常に戻った。試験した他の全ての細胞型は、処置後、ｐＳＴＡＴ５ａをほとんど又は全く誘導しなかった。
細胞表面ＣＤ２５の増加は、ＩＬ−２活性化の結果であり、そして、インビボ活性化の感受性バイオマーカーである。１００μg/kg及び３０μg/kg DP47GS IgG-(IL-2N88D)2で処置した直後、ＣＤ２５は、ＣＤ４＋メモリー及びナイーブＴｒｅｇ、並びにＣＤ８＋ＦＯＸＰ３＋Ｔｒｅｇにおいて優先的に増加した（図４１Ａ、４１Ｂ）。ＣＤ４＋メモリー及びナイーブＴｒｅｇのＣＤ２５応答は、４日目にピークに達し、そして、７日目までにベースラインに戻ったが、ＣＤ８＋ＦＯＸＰ３＋ＴｒｅｇにおけるＣＤ２５の上昇は、１０日目〜１４日目も持続していた。
野性型ＩＬ−２融合タンパク質を用いた試験において、本発明者らは、Ｋｉ−６７が、インビボで増殖し始めた細胞の感受性細胞内マーカーであり、そして、カニクイザルにおけるＩＬ−２誘導活性化の感受性バイオマーカーであることを示した。１００μg/kg DP47GS IgG-(IL-2N88D)2に対する応答は、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔｒｅｇの８０〜９０％が、Ｋｉ−６７＋になったことを示し（図４２Ａ）、一方、３０mg/kg後には６０〜９０％がＫｉ−６７＋になった（図４２Ｂ）。示されている通り、試験した他の細胞サブセットは、Ｔｒｅｇに比べて応答性が低かった。
新規操作ＩＬ−２分子によってＴｒｅｇ数を増加させる最後から２番目の（penultimate）インビボ効果を得るために、全てのカニクイザル用量をpmol/kgに変換して、分子量にかかわらず直接比較できるようにし；ＣＤ４＋Ｔｒｅｇにおける最高増加及び全ＣＤ４＋Ｔ細胞の％として、用量依存的応答を直接比較した（図４３）。野性型融合タンパク質に比べてインビトロ効力が喪失していたにもかかわらず、DP47GS IgG-(IL-2N88D)2は、カニクイザルＴｒｅｇにおいて予想外に大きな増加を誘導したが、これは、恐らく部分的には、iv及びsc投与後の全身曝露における増加に起因している。
インビボＩＬ−２投与の結果としての好酸球増多
ヒトにおけるProleukinは、１×１０６〜４．５×１０６IU/ヒトの用量で毎日投与したとき、好酸球増多を刺激する。カニクイザルでは、高用量のProleukinによる反復処置後又は２２６pmol/kgの用量のDP47GS IgG-IL-2による単回処置後に、動物の１００％で同様の好酸球増多がみられた（図４４）。図４４の結果は、好酸球数が正常であるか増加しているかにかかわらず、試験した全ての動物を表す（コロニーベースラインは、試験前の動物：（ｎ＝４４及びｎ＝３０）及び様々なＩＬ−２処置群（ｎ＝５〜９）について求めた）。Proleukin及びDP47GS IgG-IL-2の効果とは全く対照的に、１７０及び５７０pmol/kg（それぞれ、３０及び１００μg/kg）のインビボ用量のDP47GS IgG-(IL-2N88D)2による好酸球に対する効果は、実質的に存在していなかった。DP47GS IgG-(IL-2N88D)2によって全身好酸球増多が誘導されなかったことは、これら様々な処置によって誘導されるＴｒｅｇ拡大の程度に鑑みて特筆すべきである（図４３において比較）。
DP47GS IgG-IL-2によるインビボ処置は、マウスにおける免疫応答を抑制する
予備的な試験において、本発明者らは、４０００IUの用量のDP47GS IgG-IL-2が、インビボにおいてマウスＦＯＸＰ３＋制御性Ｔ細胞を活性化することを観察し；次いで、この用量を用いて、マウスにおける古典的Ｔ依存性免疫応答、すなわち、遅延型過敏（図４５）及びＩｇＧ抗ＫＬＨ応答（図４６）を抑制する能力を評価した。
ＮＯＤマウス及びＣ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝７）をヒツジ赤血球（srbc）でIV免疫付与し、そして、３日後に１本の後肢をsrbcのボーラスに曝露して、遅延型過敏（ＤＴＨ）応答を誘導した。曝露の１日後、マウスをＣＯ２で安楽死させ、そして、肢を切除し、そして、計量した。ＤＴＨ応答の規模を、非免疫付与マウスと比較した肢重量の変化（Δ肢重量）として示す。srbc免疫付与の３日前及び当日に４０００IU/マウス DP47GS IgG-IL-2をＳＣ投与し、そして、ビヒクルは、滅菌ＰＢＳ（pH７．２）であった。GraphPad Prismにおけるマンホイットニー検定から統計的有意性を求めた。
ヒツジ赤血球免疫付与の３日前及び当日にDP47GS IgG-IL-2を投与すると、ヒツジ赤血球曝露に対する後続の遅延型過敏応答が、ＮＯＤマウスにおいて５１％（図４５Ａ；ｐ＝０．００２３）、そして、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて３８％（図４５Ｂ；ｐ＝０．００２）抑制された。ポジティブ対照免疫抑制剤としてのマウスＣＴＬＡ−４−Ｉｇは、DP47GS IgG-IL-2と同レベルまでＤＴＨ応答を阻害した。
また、DP47GS IgG-IL-2は、Ｃ５７ＢＬ／６（７８％阻害、ｐ＝０．０００７、図４６Ａ）マウス及びＮＯＤ（６７％阻害、ｐ＝０．００４、図４６Ｂ）マウスにおいてＫＬＨ特異的ＩｇＧ応答を抑制することもできた。この実験では、健常幼若Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝７〜１０）及びＮＯＤマウス（ｎ＝１３〜１４）を、製造業者（Stellar）によって推奨されている通り、補助剤を含まないヒトワクチングレードＫＬＨ １００μgでIP免疫付与した。DP47GS IgG-IL-2処置は、免疫付与日に開始した４０００IU/マウスによる週１回（ＮＯＤ）又は２回（Ｃ５７ＢＬ／６）のＳＣ処置からなっていた。免疫付与後７日目（ＮＯＤ）及び２１日目（Ｃ５７ＢＬ／６）に血液を回収し、そして、血清ＫＬＨ特異的ＩｇＧ応答をＥＬＩＳＡによって測定した。
DP47GS IgG-IL-2のインビボにおいて免疫応答を抑制する能力は、低用量のＩＬ−２によって誘導される制御性Ｔ細胞の活性化が、免疫応答の低減を媒介する機能的制御性Ｔ細胞を産生するという仮説を支持するものである。
理解を明確にするために例証及び例示を用いて幾分詳細に上記発明を記載したが、明細書及び実施例は、本発明の範囲を限定するものと解釈すべきではない。本明細書に引用した全ての特許及び科学文献の開示は、全文が参照によって明示的に組み入れられる。

Claims (37)

  1. （ｉ）抗原に特異的に結合することができない免疫グロブリン分子と、（ｉｉ）野性型ＩＬ−２分子と比べたとき、中親和性ＩＬ−２受容体に対する変異体ＩＬ−２分子の親和性を低減するアミノ酸変異を含む２つの変異体インターロイキン−２（ＩＬ−２）分子とを含む融合タンパク質であって、
    ここで、該変異体ＩＬ−２分子は、配列番号５８の配列を含む、融合タンパク質。
  2. 前記免疫グロブリン分子が、ＩｇＧクラスの免疫グロブリン分子、特に、ＩｇＧ１サブクラスの免疫グロブリン分子である、請求項１記載の融合タンパク質。
  3. 前記免疫グロブリン分子が、ヒト免疫グロブリン分子である、請求項１又は２記載の融合タンパク質。
  4. 前記免疫グロブリン分子が、ヒトＶｈ３−２３生殖系列配列に基づく重鎖可変領域配列を含む、請求項１〜３のいずれか一項記載の融合タンパク質。
  5. 前記免疫グロブリン分子が、配列番号９の重鎖可変領域配列を含む、請求項１〜４のいずれか一項記載の融合タンパク質。
  6. 前記免疫グロブリン分子が、ヒトＶｋ３−２０生殖系列配列に基づく軽鎖可変領域配列を含む、請求項１〜５のいずれか一項記載の融合タンパク質。
  7. 前記免疫グロブリン分子が、配列番号１１の軽鎖可変領域配列を含む、請求項１〜６のいずれか一項記載の融合タンパク質。
  8. 前記免疫グロブリン分子が、下記改変を含まない対応する免疫グロブリン分子と比べたとき、Ｆｃ受容体に対する免疫グロブリン分子の結合親和性を低減する改変を含む、請求項１〜７のいずれか一項記載の融合タンパク質。
  9. 前記Ｆｃ受容体が、Ｆｃγ受容体、特に、ヒトＦｃγ受容体である、請求項８に記載の融合タンパク質。
  10. 前記Ｆｃ受容体が、活性化Ｆｃ受容体である、請求項８又は９記載の融合タンパク質。
  11. 前記Ｆｃ受容体が、ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２）、及びＦｃαＲＩ（ＣＤ８９）の群から選択される、請求項８〜１０のいずれか一項記載の融合タンパク質。
  12. 前記Ｆｃ受容体が、ＦｃγＲＩＩＩａ、特に、ヒトＦｃγＲＩＩＩａである、請求項８〜１１のいずれか一項記載の融合タンパク質。
  13. 前記免疫グロブリン分子が、免疫グロブリン重鎖の３２９位（ＥＵ付番）にアミノ酸置換を含む、請求項１〜１２のいずれか一項記載の融合タンパク質。
  14. 前記アミノ酸置換が、Ｐ３２９Ｇである、請求項１３記載の融合タンパク質。
  15. 前記免疫グロブリン分子が、免疫グロブリン重鎖の２３４位及び２３５位（ＥＵ付番）にアミノ酸置換を含む、請求項１〜１４のいずれか一項記載の融合タンパク質。
  16. 前記アミノ酸置換が、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ（ＬＡＬＡ）である、請求項１５記載の融合タンパク質。
  17. 前記免疫グロブリン分子が、免疫グロブリン重鎖にアミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｇ（ＥＵ付番）を含む、請求項１〜１６のいずれか一項記載の融合タンパク質。
  18. 前記変異体ＩＬ−２分子が、それぞれ、Ｎ末端アミノ酸において、場合によりペプチドリンカーを介して、前記免疫グロブリン分子の免疫グロブリン重鎖のうちの１本のＣ末端アミノ酸に融合する、請求項１〜１７のいずれか一項記載の融合タンパク質。
  19. 前記変異体ＩＬ−２分子が、それぞれ、ペプチドリンカーを介して前記免疫グロブリン分子に融合する、請求項１〜１８のいずれか一項記載の融合タンパク質。
  20. 前記ペプチドリンカーが、少なくとも１０個、特に、少なくとも１５個のアミノ酸を含む、請求項１９記載の融合タンパク質。
  21. 前記ペプチドリンカーが、アミノ酸配列（Ｇ４Ｓ）３（配列番号６６）を含む、請求項１９又は２０記載の融合タンパク質。
  22. 配列番号１９及び配列番号５０のポリペプチド配列を含む、請求項１〜２１のいずれか一項記載の融合タンパク質。
  23. 制御性Ｔ細胞を選択的に活性化する、請求項１〜２２のいずれか一項記載の融合タンパク質。
  24. 請求項１〜２３のいずれか一項記載の融合タンパク質をコードしているポリヌクレオチド。
  25. 請求項２４記載のポリヌクレオチドを含むベクター、特に、発現ベクター。
  26. 請求項２４記載のポリヌクレオチド又は請求項２５記載のベクターを含む宿主細胞。
  27. 免疫グロブリン分子と、野性型ＩＬ−２分子と比べたとき、中親和性ＩＬ−２受容体に対する変異体ＩＬ−２分子の親和性を低減するアミノ酸変異を含む２つの変異体ＩＬ−２分子とを含む融合タンパク質を産生する方法であって、（ｉ）前記融合タンパク質を発現させるのに好適な条件下で請求項２６記載の宿主細胞を培養する工程と、（ｉｉ）前記融合タンパク質を回収する工程とを含む方法。
  28. 請求項２７記載の方法によって産生される融合タンパク質。
  29. 請求項１〜２３又は２８のいずれか一項記載の融合タンパク質と、薬学的に許容し得る担体とを含む医薬組成物。
  30. 医薬として使用するための、請求項１〜２３若しくは２８のいずれか一項記載の融合タンパク質又は請求項２９記載の医薬組成物。
  31. 自己免疫疾患の処置又は予防において使用するための、請求項１〜２３若しくは２８のいずれか一項記載の融合タンパク質又は請求項２９記載の医薬組成物。
  32. 前記自己免疫疾患が、１型糖尿病、全身性エリテマトーデス、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、及び多発性硬化症の群から選択される、請求項３１記載の融合タンパク質又は医薬組成物。
  33. 移植拒絶反応又は移植片対宿主病の処置又は予防において使用するための、請求項１〜２３若しくは２８のいずれか一項記載の融合タンパク質又は請求項２９記載の医薬組成物。
  34. インビトロ又はインビボにおける制御性Ｔ細胞の選択的活性化において使用するための、請求項１〜２３又は２８のいずれか一項記載の融合タンパク質。
  35. 前記活性化が、制御性Ｔ細胞の増殖の誘導及び／又は制御性Ｔ細胞におけるＩＬ−２受容体シグナル伝達の誘導を含む、請求項３４記載の融合タンパク質。
  36. インビトロにおいて制御性Ｔ細胞を選択的に活性化する方法であって、前記制御性Ｔ細胞を請求項１〜２３又は２８のいずれか一項記載の融合タンパク質と接触させることを含む方法。
  37. 前記活性化が、制御性Ｔ細胞の増殖の誘導及び／又は制御性Ｔ細胞におけるＩＬ−２受容体シグナル伝達の誘導を含む、請求項３６記載の方法。
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WO (1) WO2015118016A1 (ja)
ZA (1) ZA201603262B (ja)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US12084484B2 (en) 2019-07-26 2024-09-10 Visterra, Inc. Interleukin-2 agents and uses thereof
US12098178B2 (en) 2020-12-04 2024-09-24 Visterra, Inc. Methods of using interleukin-2 agents

Families Citing this family (67)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EA201892619A1 (ru) 2011-04-29 2019-04-30 Роше Гликарт Аг Иммуноконъюгаты, содержащие мутантные полипептиды интерлейкина-2
US20140044675A1 (en) 2012-08-10 2014-02-13 Roche Glycart Ag Interleukin-2 fusion proteins and uses thereof
LT3102595T (lt) 2014-02-06 2019-01-25 F. Hoffmann-La Roche Ag Interleukino-2 sulieti baltymai ir jų panaudojimas
GB201403775D0 (en) 2014-03-04 2014-04-16 Kymab Ltd Antibodies, uses & methods
AU2015301936B2 (en) 2014-08-11 2019-03-07 Delinia, Inc. Modified IL-2 variants that selectively activate regulatory T cells for the treatment of autoimmune diseases
MX381829B (es) 2014-12-05 2025-03-13 Aragon Pharmaceuticals Inc Composiciones anticancerígenas.
CN108602870A (zh) 2015-12-04 2018-09-28 诺华股份有限公司 抗体细胞因子嫁接组合物及用于免疫调节的方法
US10905727B2 (en) 2016-01-14 2021-02-02 Intrexon Actobiotics N.V. Compositions and methods for the treatment of type 1 diabetes
US20170204154A1 (en) 2016-01-20 2017-07-20 Delinia, Inc. Molecules that selectively activate regulatory t cells for the treatment of autoimmune diseases
US9567399B1 (en) 2016-06-20 2017-02-14 Kymab Limited Antibodies and immunocytokines
JP7461741B2 (ja) 2016-06-20 2024-04-04 カイマブ・リミテッド 抗ｐｄ－ｌ１およびｉｌ－２サイトカイン
KR20190057113A (ko) 2016-09-28 2019-05-27 조마 (유에스) 엘엘씨 인터루킨-2에 결합하는 항체 및 그 용도
EP3529350A1 (en) 2016-10-19 2019-08-28 H. Hoffnabb-La Roche Ag Method for producing an immunoconjugate
WO2018083248A1 (en) 2016-11-03 2018-05-11 Kymab Limited Antibodies, combinations comprising antibodies, biomarkers, uses & methods
EP3538548A4 (en) 2016-11-08 2020-08-19 Delinia, Inc. IL-2 VARIANTS FOR THE TREATMENT OF AUTOIMMUNE DISEASES
CA3044416A1 (en) * 2016-12-13 2018-06-21 Delinia, Inc. Multivalent regulatory t cell modulators
AU2018234810B2 (en) 2017-03-15 2023-05-11 Pandion Operations, Inc. Targeted immunotolerance
PE20200303A1 (es) 2017-05-24 2020-02-06 Novartis Ag Proteinas de anticuerpo injertadas con citocina y metodos de uso en el tratamiento del cancer
US10676516B2 (en) 2017-05-24 2020-06-09 Pandion Therapeutics, Inc. Targeted immunotolerance
JOP20190271A1 (ar) * 2017-05-24 2019-11-21 Novartis Ag بروتينات مطعّمة بسيتوكين- الجسم المضاد وطرق الاستخدام للاضطرابات المتعلقة بالمناعة
RU2020120145A (ru) * 2017-11-21 2021-12-22 Дзе Борд Оф Трастиз Оф Дзе Лелэнд Стэнфорд Джуниор Юниверсити Частичные агонисты интерлейкина-2
US10174092B1 (en) 2017-12-06 2019-01-08 Pandion Therapeutics, Inc. IL-2 muteins
US10946068B2 (en) 2017-12-06 2021-03-16 Pandion Operations, Inc. IL-2 muteins and uses thereof
WO2019113221A1 (en) * 2017-12-06 2019-06-13 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Engineered proteins to enhance sensitivity of a cell to il-2
USRE50550E1 (en) 2017-12-06 2025-08-26 Pandion Operations, Inc. IL-2 muteins and uses thereof
SG11202005732XA (en) 2017-12-19 2020-07-29 Xencor Inc Engineered il-2 fc fusion proteins
US12247060B2 (en) 2018-01-09 2025-03-11 Marengo Therapeutics, Inc. Calreticulin binding constructs and engineered T cells for the treatment of diseases
WO2019158764A1 (en) 2018-02-16 2019-08-22 Iltoo Pharma Use of interleukin 2 for treating sjögren's syndrome
WO2019178362A1 (en) 2018-03-14 2019-09-19 Elstar Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules that bind to calreticulin and uses thereof
BR112020018709A2 (pt) 2018-03-28 2021-01-05 Bristol-Myers Squibb Company Proteínas de fusão do receptor alfa de interleucina-2/interleucina-2 e métodos de uso
JP7637415B2 (ja) 2018-06-22 2025-02-28 キュージーン インコーポレイテッド インターロイキン－２バリアントおよびその使用方法
WO2020007937A1 (en) 2018-07-03 2020-01-09 Iltoo Pharma Use of interleukin-2 for treating systemic sclerosis
CA3105448A1 (en) 2018-07-03 2020-01-09 Elstar Therapeutics, Inc. Anti-tcr antibody molecules and uses thereof
WO2020035482A1 (en) 2018-08-13 2020-02-20 Iltoo Pharma Combination of interleukin-2 with an interleukin 1 inhibitor, conjugates and therapeutic uses thereof
WO2020057646A1 (zh) 2018-09-21 2020-03-26 信达生物制药(苏州)有限公司 新型白介素2及其用途
SG11202106700WA (en) * 2019-01-07 2021-07-29 Inhibrx Inc Polypeptides comprising modified il-2 polypeptides and uses thereof
WO2020172571A1 (en) 2019-02-21 2020-08-27 Elstar Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules that bind to t cell related cancer cells and uses thereof
CN119039441A (zh) 2019-02-21 2024-11-29 马伦戈治疗公司 与nkp30结合的抗体分子及其用途
CN114126637A (zh) * 2019-03-29 2022-03-01 居里研究所 具有经修饰的生物活性的白介素-2变体
CN111944036B (zh) * 2019-05-14 2024-09-06 上海盖浦生物科技有限公司 一种增殖免疫细胞的突变体蛋白
US11739146B2 (en) 2019-05-20 2023-08-29 Pandion Operations, Inc. MAdCAM targeted immunotolerance
JP7778571B2 (ja) * 2019-06-05 2025-12-02 アッシャー バイオセラピューティクス， インコーポレイテッド 免疫細胞機能をモジュレートするための変異体インターロイキン－２ポリペプチドと抗原結合分子の融合体
US20220170028A1 (en) * 2019-06-14 2022-06-02 Cugene Inc Novel interleukin-2 variants and bifunctional fusion molecules thereof
AU2020315282A1 (en) * 2019-07-12 2022-02-10 Proviva Therapeutics (Hong Kong) Limited IL-2 compositions and methods of use thereof
IL293978A (en) * 2019-12-20 2022-08-01 Regeneron Pharma New il2 agonists and methods of using them
JP2023509708A (ja) 2020-01-03 2023-03-09 マレンゴ・セラピューティクス，インコーポレーテッド 抗ｔｃｒ抗体分子およびその使用
EP4087865A2 (en) 2020-01-10 2022-11-16 Bright Peak Therapeutics AG Modified il-2 polypeptides and uses thereof
MX2022008771A (es) 2020-01-14 2022-10-07 Synthekine Inc Metodos y composiciones de muteinas de il2 sesgadas.
IL295143B1 (en) 2020-02-13 2025-10-01 Hoffmann La Roche A method for determining the loading state of AAV particles using nuclear magnetic resonance relaxometry
US11981715B2 (en) 2020-02-21 2024-05-14 Pandion Operations, Inc. Tissue targeted immunotolerance with a CD39 effector
EP4122951A4 (en) * 2020-03-19 2024-05-29 Innovent Biologics (Singapore) Pte. Ltd. INTERLEUKIN-2 MUTANT AND USE THEREOF
CA3177843A1 (en) 2020-05-13 2021-11-18 John Thomas MULLIGAN Compositions of protein complexes and methods of use thereof
CN113912735B (zh) * 2020-07-08 2025-03-28 南京师范大学 多肽二聚体及其用途
EP4208474A2 (en) * 2020-09-01 2023-07-12 Takeda Pharmaceutical Company Limited Interleukin-2 muteins and uses thereof
WO2022087458A1 (en) 2020-10-23 2022-04-28 Asher Biotherapeutics, Inc. Fusions with cd8 antigen binding molecules for modulating immune cell function
AU2021369823A1 (en) 2020-10-29 2023-06-01 Bristol-Myers Squibb Company Fusion proteins for the treatment of disease
CN112724259B (zh) * 2020-11-16 2022-12-20 天津林达生物科技有限公司 人血清白蛋白与白介素2的融合蛋白及其用途
CR20230219A (es) * 2020-12-04 2023-07-07 Hoffmann La Roche Polipéptidos de interleucina-2 mutante dependientes del ph
CN116964068A (zh) 2021-02-24 2023-10-27 豪夫迈·罗氏有限公司 深度过滤器的再生和多次使用
CN115232215A (zh) * 2021-04-23 2022-10-25 北京大学 一种融合蛋白ABD/Fc/IL-2及其编码基因、制备方法和应用
EP4340866A4 (en) 2021-05-19 2025-05-21 Asher Biotherapeutics, Inc. Il-21 polypeptides and targeted constructs
CN113789346A (zh) * 2021-08-25 2021-12-14 北京伟德杰生物科技有限公司 长效化重组人白细胞介素2融合蛋白及其制备方法和应用
CA3233644A1 (en) * 2021-10-06 2023-04-13 David Klatzmann Interleukin 2 chimeric constructs with targeting specificy to inflamed tissues
GB202115122D0 (en) * 2021-10-21 2021-12-08 Dualyx Nv Binding molecules targeting IL-2 receptor
WO2024056154A1 (en) 2022-09-12 2024-03-21 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Interleukin-2 for use in treating autism spectrum disorder
CN116041539B (zh) * 2022-10-31 2023-07-21 山东博安生物技术股份有限公司 Il-2突变体免疫缀合物
CN116554356B (zh) * 2023-05-16 2024-01-23 武汉大学 一种hyperIL-15与sCD4及Fc的融合蛋白及其应用

Family Cites Families (46)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2388385B1 (fr) 1977-04-18 1982-01-08 Hitachi Metals Ltd Piece d'ornement fixee par des aimants permanents
US4518584A (en) 1983-04-15 1985-05-21 Cetus Corporation Human recombinant interleukin-2 muteins
WO1985000817A1 (en) 1983-08-10 1985-02-28 Amgen Microbial expression of interleukin ii
US5206344A (en) 1985-06-26 1993-04-27 Cetus Oncology Corporation Interleukin-2 muteins and polymer conjugation thereof
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
US5959177A (en) 1989-10-27 1999-09-28 The Scripps Research Institute Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US5650150A (en) 1990-11-09 1997-07-22 Gillies; Stephen D. Recombinant antibody cytokine fusion proteins
AU675916B2 (en) 1991-06-14 1997-02-27 Genentech Inc. Method for making humanized antibodies
ES2136092T3 (es) 1991-09-23 1999-11-16 Medical Res Council Procedimientos para la produccion de anticuerpos humanizados.
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US6040498A (en) 1998-08-11 2000-03-21 North Caroline State University Genetically engineered duckweed
ES2375931T3 (es) 1997-12-05 2012-03-07 The Scripps Research Institute Humanización de anticuerpo murino.
AU758240B2 (en) 1998-02-25 2003-03-20 Merck Patent Gmbh Enhancing the circulating half-life of antibody-based fusion proteins
DZ2788A1 (fr) 1998-05-15 2003-12-01 Bayer Ag Agonistes et antagonistes selectifs à IL-2.
US6955807B1 (en) 1998-05-15 2005-10-18 Bayer Pharmaceuticals Corporation IL-2 selective agonists and antagonists
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
PT1222292E (pt) 1999-10-04 2005-11-30 Medicago Inc Metodo para regulacao da transcricao de genes exogenos na presenca de azoto
US6962696B1 (en) 1999-10-04 2005-11-08 Vion Pharmaceuticals Inc. Compositions and methods for tumor-targeted delivery of effector molecules
US7125978B1 (en) 1999-10-04 2006-10-24 Medicago Inc. Promoter for regulating expression of foreign genes
ES2381025T3 (es) * 2001-12-04 2012-05-22 Merck Patent Gmbh Inmunocitocinas con selectividad modulada
US7432063B2 (en) 2002-02-14 2008-10-07 Kalobios Pharmaceuticals, Inc. Methods for affinity maturation
WO2005007121A2 (en) 2003-07-18 2005-01-27 Massachusetts Institute Of Technology Mutant interleukin-2(il-2) polypeptides
RU2006135112A (ru) 2004-03-05 2008-04-10 Чирон Корпорейшн (Us) Тест-система in vitro для прогнозирования устойчивости пациента к терапевтическим средствам
RU2386638C2 (ru) 2004-03-31 2010-04-20 Дженентек, Инк. Гуманизированные анти-тфр-бета-антитела
CN1942483B (zh) 2004-04-13 2012-09-26 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 抗p型选凝素抗体
TWI309240B (en) 2004-09-17 2009-05-01 Hoffmann La Roche Anti-ox40l antibodies
CA2587572A1 (en) 2004-11-24 2006-06-01 Schering Corporation Dap-10 and uses thereof
EP2038417A2 (en) 2006-07-06 2009-03-25 Merck Patent GmbH Compositions and methods for enhancing the efficacy of il-2 mediated immune responses
US8119130B2 (en) 2007-07-25 2012-02-21 Medimmune Limited Targeted binding agents directed to KDR and uses thereof—035
US8906356B2 (en) 2007-11-05 2014-12-09 Massachusetts Institute Of Technology Mutant interleukin-2 (IL-2) polypeptides
EP2231904B1 (en) 2007-12-19 2016-01-13 Janssen Biotech, Inc. Design and generation of human de novo pix phage display libraries via fusion to pix or pvii, vectors, antibodies and methods
DE102008023820A1 (de) 2008-05-08 2009-11-12 Aicuris Gmbh & Co. Kg Mittel zur Behandlung und/oder Prophylaxe einer Autoimmunerkrankung und zur Bildung von Regulatorischen T-Zellen
CA2749539C (en) * 2009-01-21 2022-07-19 Amgen Inc. Compositions and methods comprising interleukin-2 mutants for treating inflammatory and autoimmune diseases
BR112013003361B8 (pt) 2010-08-13 2022-01-25 Roche Glycart Ag Anticorpo, composição, conjugado de anticorpo,formulação farmacêutica e uso do anticorpo
CU23923B1 (es) 2010-11-12 2013-07-31 Ct De Inmunología Molecular Polipéptidos derivados de la il-2 con actividad agonista
TWI666027B (zh) 2011-02-10 2019-07-21 羅齊克雷雅公司 突變介白素-２多肽
EP3443979B1 (en) 2011-03-11 2020-05-27 Assistance Publique - Hôpitaux De Paris Il-2 dosage regimen for treating systemic lupus erythematosus
BR112013024574B1 (pt) 2011-03-29 2022-08-09 Roche Glycart Ag Anticorpo e uso do anticorpo
EA201892619A1 (ru) 2011-04-29 2019-04-30 Роше Гликарт Аг Иммуноконъюгаты, содержащие мутантные полипептиды интерлейкина-2
ES2758884T3 (es) * 2011-06-24 2020-05-06 Stephen D Gillies Proteínas de fusión de inmunoglobulina a través de cadena ligera y métodos de uso de ellas
US20140044675A1 (en) 2012-08-10 2014-02-13 Roche Glycart Ag Interleukin-2 fusion proteins and uses thereof
US9546203B2 (en) 2013-03-14 2017-01-17 Amgen Inc. Aglycosylated Fc-containing polypeptides with cysteine substitutions
LT3102595T (lt) 2014-02-06 2019-01-25 F. Hoffmann-La Roche Ag Interleukino-2 sulieti baltymai ir jų panaudojimas
MA40094B1 (fr) 2014-08-06 2022-05-31 Univ Miami Protéines de fusion de l'interleukine-2/récepteur alpha de l'interleukine-2 et procédés d'utilisation

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US12084484B2 (en) 2019-07-26 2024-09-10 Visterra, Inc. Interleukin-2 agents and uses thereof
US12297249B2 (en) 2019-07-26 2025-05-13 Visterra, Inc. Interleukin-2 agents and uses thereof
US12098178B2 (en) 2020-12-04 2024-09-24 Visterra, Inc. Methods of using interleukin-2 agents

Also Published As

Publication number Publication date
MX2019014695A (es) 2020-02-07
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PH12016501406B1 (en) 2022-04-22
TW201534625A (zh) 2015-09-16
WO2015118016A1 (en) 2015-08-13
CR20160333A (es) 2016-09-05
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