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Description
本発明は広くは、放出媒体に関し、具体的には、生物材料(例えば細胞、タンパク質、ペプチドなど)および薬物のような物質を保持するのに、かつその後に放出するのに適した組成物に関する。本発明による組成物は、生物材料および薬物のような物質の保持およびその後の放出で用いるのに特に適しており、それゆえ、そのような用途に重点を置きながら本発明を記述することが好都合であろう。しかしながら、他の物質を保持し、かつその後に放出するために組成物が用いられうることが理解されるべきである。
関心対象の物質を(内部におよび/または表面に)保持し、その後に放出しうる組成物を開発するために今日までに行われた研究は多数存在した。例えば、薬物放出組成物は医療産業において重要な役割を形成している。そのような組成物は、薬物が重合体と混ぜ合わされて、薬物/重合体の複合材料を形成しているものを含む。重合体/薬物の複合材料はその後、薬物放出媒体として用いられうる。例えば、レボノルゲストレルを含むシリコーンロッドが徐放避妊インプラントとして用いられている。
該重合体粒子が、(i) ブロック共重合体を含み、かつ(ii) コアシェル構造を有し、該ブロック共重合体が、(a) コア構造の少なくとも一部を形成する非刺激応答性重合体ブロック、および(b) シェル構造の少なくとも一部を形成する刺激応答性重合体ブロックを含み;
該重合体粒子と該機能化された刺激応答性重合体との刺激応答性重合体が、少なくとも1つの共通の刺激に応答性である。
該重合体粒子が、(i) ブロック共重合体を含み、かつ(ii) コアシェル構造を有し、該ブロック共重合体が、(a) コア構造の少なくとも一部を形成する非刺激応答性重合体ブロック、および(b) シェル構造の少なくとも一部を形成する刺激応答性重合体ブロックを含み;
該重合体粒子と該機能化された刺激応答性重合体との刺激応答性重合体が、少なくとも1つの共通の刺激に応答性であり; かつ
重合体粒子は、重合体粒子の少なくとも刺激応答性重合体が少なくとも1つの共通の刺激に供された際に液体をゲルへ転換させるのに十分な濃度で、液体内に存在する。
(i) 重合体粒子、機能化された刺激応答性重合体、および液体を含む液体組成物を提供する段階であり;
該重合体粒子が、(a) ブロック共重合体を含み、かつ(b) コアシェル構造を有し、該ブロック共重合体が、(a) コア構造の少なくとも一部を形成する非刺激応答性重合体ブロック、および(b) シェル構造の少なくとも一部を形成する刺激応答性重合体ブロックを含み;
該重合体粒子と該機能化された刺激応答性重合体との刺激応答性重合体が、(a) 少なくとも1つの共通の刺激に応答性であり、かつ(b) 該液体中で可溶性である、段階; ならびに
(ii)該重合体粒子と該機能化された刺激応答性重合体との該刺激応答性重合体が、該液体中で可溶性である状態から該液体中で不溶性である状態への移行を生じるように、該液体組成物を該共通の刺激に供する段階であり、該移行がゲルの形成を促進する、段階
を含む、機能化された刺激応答性重合体を含むゲルを形成する方法を提供する。
(i) 重合体粒子、機能化された刺激応答性重合体、および液体を含むゲルを提供する段階であり;
該重合体粒子が、(a) ブロック共重合体を含み、かつ(b) コアシェル構造を有し、該ブロック共重合体が、(a) コア構造の少なくとも一部を形成する非刺激応答性重合体ブロック、および(b) シェル構造の少なくとも一部を形成する刺激応答性重合体ブロックを含み;
該重合体粒子と該機能化された刺激応答性重合体との刺激応答性重合体が、(a) 少なくとも1つの共通の刺激に応答性であり、かつ(b) 該液体中で不溶性である、段階; ならびに
(ii)該重合体粒子と該機能化された刺激応答性重合体との該刺激応答性重合体が、該液体中で可溶性である状態から該液体中で不溶性である状態への移行を生じるように、該ゲルを該共通の刺激に供する段階であり、該移行が、該ゲルを、重合体粒子、機能化された刺激応答性重合体、および液体を含む液体組成物にして、それによって該ゲルからの該機能化された刺激応答性重合体の放出を促進する、段階
を含む、機能化された刺激応答性重合体をゲルから放出させる方法を提供する。
本発明による組成物は、重合体粒子を含む。重合体粒子は、本明細書において記述されるコアシェル構造を有する。重合体粒子が必要とされるコアシェル構造を有し、本明細書において記述されるように用いられうるなら、その形状またはサイズに関する特定の制限は存在しない。
式中、UおよびWはCO2H、-CO2R1、-COR1、-CSR1、-CSOR1、-COSR1、-CONH2、-CONHR1、-CONR1 2、水素、ハロゲンおよび置換されてもよいC1〜C4アルキルより独立して選択され、またはUおよびWは、それ自体が置換されてもよいラクトン環、無水物環またはイミド環をともに形成し、ここで任意選択の置換基がヒドロキシ、-CO2H、-CO2R1、-COR1、-CSR1、-CSOR1、-COSR1、-CN、-CONH2、-CONHR1、-CONR1 2、-OR1、-SR1、-O2CR1、-SCOR1、および-OCSR1より独立して選択され;
Vは水素、R1、-CO2H、-CO2R1、-COR1、-CSR1、-CSOR1、-COSR1、-CONH2、-CONHR1、-CONR1 2、-OR1、-SR1、-O2CR1、-SCOR1、および-OCSR1から選択され;
式中、R1または各R1は、置換されてもよいアルキル、置換されてもよいアルケニル、置換されてもよいアルキニル、置換されてもよいアリール、置換されてもよいヘテロアリール、置換されてもよいカルボシクリル、置換されてもよいヘテロシクリル、置換されてもよいアリールアルキル、置換されてもよいヘテロアリールアルキル、置換されてもよいアルキルアリール、置換されてもよいアルキルヘテロアリール、および置換されてもよい重合体鎖より独立して選択される。
(i) 液体、基材に固定された重合体粒子および細胞受容体リガンドで機能化された刺激応答性重合体を含む液体組成物を提供する段階であり;
該重合体粒子が、(a) ブロック共重合体を含み、かつ(b) コアシェル構造を有し、該ブロック共重合体が、(a) コア構造の少なくとも一部を形成する非刺激応答性重合体ブロック、および(b) シェル構造の少なくとも一部を形成する刺激応答性重合体ブロックを含み;
該重合体粒子と該細胞受容体リガンドで機能化された刺激応答性重合体との刺激応答性重合体が、(a) 少なくとも1つの共通の刺激に応答性であり、かつ(b) 該液体中で可溶性である、段階;
(ii)該重合体粒子と該細胞受容体リガンドで機能化された刺激応答性重合体との該刺激応答性重合体が、該液体中で可溶性である状態から該液体中で不溶性である状態への移行を生じるように、該液体組成物を該共通の刺激に供する段階であり、該移行が、該重合体粒子および該細胞受容体リガンドで機能化された刺激応答性重合体の凝集を促進して、細胞受容体リガンドを含む表面と凝集体構造を形成させる、段階;
(iii) 細胞受容体リガンドと結合するように培養される1種または複数種の細胞を該液体に導入する段階; ならびに
(iv) 該細胞受容体リガンドを含む該表面上で細胞を培養する段階
を含む、細胞を培養する方法を提供する。
(v)重合体粒子と細胞受容体リガンドで機能化された刺激応答性重合体との刺激応答性重合体が、液体中で可溶性である状態から該液体中で不溶性である状態への移行を生じるように、培養された細胞を含む液体組成物を共通の刺激に供する段階であり、該移行が、該培養細胞の放出を容易にする、段階
をさらに含みうる。
(vi) 段階(v)において形成された培養細胞の少なくともいくつかを、前記液体組成物から取り出す段階
をさらに含みうる。
(vii) 細胞受容体リガンドを含む該表面上でさらなる細胞を培養するために段階(vi)の後に段階(i)〜(v)の1つまたは複数を繰り返す段階
をさらに含みうる。
(i) 液体、重合体粒子、および細胞受容体リガンドで機能化された刺激応答性重合体を含むゲル組成物を提供する段階であり;
該重合体粒子が、(a) ブロック共重合体を含み、かつ(b) コアシェル構造を有し、該ブロック共重合体が、(a) コア構造の少なくとも一部を形成する非刺激応答性重合体ブロック、および(b) シェル構造の少なくとも一部を形成する刺激応答性重合体ブロックを含み;
該重合体粒子と細胞で機能化された刺激応答性重合体との刺激応答性重合体が、(a) 少なくとも1つの共通の刺激に応答性であり、かつ(b) 該液体中で不溶性である、段階;
(ii) 細胞受容体リガンドと結合するように培養される1種または複数種の細胞をゲルに導入する段階; ならびに
(iii) 細胞をゲル表面上でおよび/またはゲル内部で培養する段階
を含む、細胞を培養する方法を提供する。
(iv)重合体粒子と細胞受容体リガンドで機能化された刺激応答性重合体との刺激応答性重合体が、液体中で可溶性である状態から該液体中で不溶性である状態への移行を生じるように、培養された細胞を含むゲルを共通の刺激に供する段階であり、該移行が該培養細胞の放出を容易にする、段階
をさらに含みうる。
(v) 段階(iv)において形成された培養細胞の少なくともいくつかを、液体組成物から取り出す段階
をさらに含みうる。
(vi) ゲル表面上でおよび/またはゲル内部でさらなる細胞を培養するために段階(v)の後に段階(i)〜(iv)の1つまたは複数を繰り返す段階
をさらに含みうる。
(i) 液体、重合体粒子、および細胞で機能化された刺激応答性重合体を含む液体組成物を提供する段階であり;
該重合体粒子が、(a) ブロック共重合体を含み、かつ(b) コアシェル構造を有し、該ブロック共重合体が、(a) コア構造の少なくとも一部を形成する非刺激応答性重合体ブロック、および(b) シェル構造の少なくとも一部を形成する刺激応答性重合体ブロックを含み;
該重合体粒子と該細胞で機能化された刺激応答性重合体との刺激応答性重合体が、(a) 少なくとも1つの共通の刺激に応答性であり、かつ(b) 該液体中で可溶性である、段階;
(ii)該重合体粒子と該細胞で機能化された刺激応答性重合体との該刺激応答性重合体が、該液体中で可溶性である状態から該液体中で不溶性である状態への移行を生じるように、該液体組成物を該共通の刺激に供する段階であり、該移行が、該重合体粒子および該細胞で機能化された刺激応答性重合体の凝集を促進して、細胞塊を形成させる、段階; ならびに
(iii) 該細胞塊の内部でおよび/または表面上で細胞を培養する段階
を含む、細胞を培養する方法を提供する。
(iv)重合体粒子と細胞で機能化された刺激応答性重合体との刺激応答性重合体が、液体中で可溶性である状態から該液体中で不溶性である状態への移行を生じるように、培養された細胞を含む液体組成物を共通の刺激に供する段階であり、ここで該移行が、細胞塊からの個々の細胞および/またはさらに小さな細胞塊の放出を容易にする、段階
をさらに含みうる。
(v) 段階(iv)においてそのように形成された個々の細胞および/または形成されたさらに小さな細胞塊の少なくともいくつかを、液体組成物から取り出す段階
をさらに含みうる。
(vi) そのように形成された細胞塊の内部でおよび/または表面上でさらなる細胞を培養するために段階(v)の後に段階(i)〜(iv)の1つまたは複数を繰り返す段階
をさらに含みうる。
用いた溶媒はHPLCまたはAR等級であった。活性化塩基性アルミナ(Aldrich: Brockmann I, 標準等級, およそ150メッシュ, 58Å)、MilliQ水、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS: Aldrich, 99%)は、受け取ったまま用いた。スチレン(STY: Aldrich, >99%)は塩基性アルミナカラムを通過させて、阻害因子を除去した。使用の前に、N-イソプロピルアクリルアミド(NIPAM: Aldrich, 97%)はヘキサンから再結晶化され、アゾビスイソブチロニトリル(AIBN: Riedel-de Haen)はメタノールから再結晶化された。二硫化炭素(99%)、1-ブタンチオール(99%)、ブロモプロピオン酸メチル(98%)、ジメチルスルホキシド(DMSO, >99.9%)、Aldrithil(商標)-2 (98%)、ヘキシルアミン(99%)は、Aldrichから受け取ったまま用いた。トリエチレンアミン(>99%)はMERCKから受け取ったまま用いた。hESC株MEL1 (雄性)およびMEL2 (雌性)は、Stem Core Queensland (Formerly Australian Stem Cell Centre)から提供され、オーストラリア国立保健医療研究審議会の承認(許可番号309709)の下、マウス胚性線維芽細胞支持層上にて手作業で継代された培養物として日常的に維持された。全ての実験において用いた媒体は、hESC用のStemPro(登録商標)無血清媒体(Life Technologies Carlsbad, CA, USA)であった。対照は、200分の1のGeltrex(商標)中で1時間コーティングされた組織培養プラスチック皿(BD Falcon)上に播種した。
サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)
オートサンプラを備えたWaters Alliance 2690 Separations Module、示差屈折率(Differential Refractive Index) (RI)検出器および直列につながれたフォトダイオードアレイ(PDA)検出器を用いてSEC測定を行った。HPLC等級のテトラヒドロフランを流速1 mL/分で溶出液として用いた。カラムは、直列につながれた2つの7.8×300 mm Waters線形Ultrastyragel SECカラムからなった。ポリスチレン標準物質を較正に用いた。
周囲温度にてスポットサイズ6で100 kVの加速電圧を利用しJEOL-1010透過型電子顕微鏡を使って重合体ラテックスのナノ構造の外観を分析した。典型的なTEMグリッドの調製は次の通りであった: 重合混合物をMilliQ水でおよそ0.05 wt%に希釈した。次いで、ホルムバール・プレコート銅TEMグリッドを希釈されたラテックス溶液に浸し、ろ紙上25℃で乾燥させた。
全てのNMRスペクトルは、Bruker DRX 500 MHz分光計に記録された。
窒素レーザー(337 nm, 200 Hzの最高射程率)を備えたBruker MALDI-ToF autoflex IIIスマートビームを用いてMALDI-ToF MSスペクトルを600〜400,000 Daの質量範囲で得た。スペクトルをリフレクトロンモード(2,000〜5,000 Da)および線形モード(5,000〜20,000 Da)の両方で記録した。トランス-2-[3-(4-tert-ブチルフェニル)-2-メチル-プロペニリデン]マロノニトリル(DCTB; THF中20 mg/mL)をマトリックスとして用い、Na(CF3COO) (THF中1 mg/mL)を陽イオン源として用いた。サンプルは、標的プレート上にマトリックス(20 μL)、Na(CF3COO) (1 μL)、および重合体(20 μL, THF中1 mg/mL)溶液を同時にスポットすることによって調製された。
窒素雰囲気下の1-ブタンチオール(10 mL, 0.093 mol)およびTEA (14.3 mL, 0.103 mol)のDCM (100 mL)撹拌溶液に、0℃で30分間にわたりDCM (50 mL)中の二硫化炭素(6.18 mL, 0.103 mol)を滴下した。溶液は添加中に徐々に黄色くなった。添加を完了した後に、溶液を1時間室温で撹拌した。次いで、DCM (50 mL)中のMBP (11.5 mL, 0.103 mol)を30分間にわたり溶液に滴下し、2時間撹拌した。DCMを窒素下で除去し、残留物をジエチルエーテルに溶解した。この溶液を10%冷HCl溶液(3×50 mL)およびMilliQ水(3×50 mL)で洗浄し、その後、無水MgSO4で乾燥した。溶媒を真空下で除去し、残留する黄色の油状物をカラムクロマトグラフィー(シリカ上、9:1の石油エーテル/酢酸エチル、第2のバンド)によって精製した。
NIPAM (15 g, 0.133 mol)、RAFT剤(0.75 g 3.0×10-3 mol)およびAIBN (50 mg, 3.0×10-4 mol)を50 ml Schlenkフラスコ中、DMSO 30 mlに溶解した。溶液を30分間Arによってパージした。反応溶液を次に、16時間、60℃で予熱された油浴中に浸した。氷浴中で冷却し、溶液を空気に曝すことにより反応を停止させた。重合混合物を次に、DCM 500 mlによって希釈し、MilliQ水によって3回洗浄した。有機相をMgSO4で乾燥し、ろ過し、濃縮し、ジエチルエーテル中で沈降させた。ろ過後、黄色の粉末を48時間室温にて真空下で乾燥した(Mn,GPC = 4800)。
1H NMR (CDCl3, 298K, 500 MHz); 6.47 (b, ポリ(NIPAM)反復単位の-NH-C=O-)、3.97 (b, ポリ(NIPAM)反復単位の-NH-CH(CH3)2)、4.62 (b, 1H, -CH-SC(=S)S- C4H9)、3.97 (b, ポリ(NIPAM)反復単位の-NH-CH(CH3)2)、3.66 (b, 3H, CH3O- RAFT残存基) 3.34 (b, 2H, -SC(=S)S-CH2C3H7)、1.06〜2.45 (b, ポリ(NIPAM)骨格のメチレンおよびメチンプロトン)、1.12 (b, ポリ(NIPAM)反復単位のメチルプロトン)、0.90 (b, 6H, RAFT残存基のメチルプロトン)。
PNIPAM43-SC(=S)SC4H9 (Mn,GPC = 4800, 0.29 g, 6.0×10-5 mol)、Aldrithiol(商標)-2 (40 mg, 1.8×10-4 mol)およびTEA (40 mg, 1.8×10-4 mol)をDMF 5 mlに溶解した。溶液を20分間Arによってパージし、ヘキシルアミン(40 mg, 1.8×10-4 mol)を気密注射器によって加えた。室温で終夜撹拌した後に、反応混合物に送気管で風を吹きつけて、いくらかのDMFを除去した。残留物を次に、ジクロロメタンに溶解し、ジエチルエーテル中で沈降させた。溶解/沈降操作を3回繰り返し、ろ過を行った。重合体を次に、48時間室温にて真空下で乾燥して、収率75.8%として白色の粉末状生成物0.22 gを得た。
1H NMR (CDCl3, 298K, 500 MHz); δ 8.45 (b, 1H, ピリジンプロトン)、7.63 (b, 2H, ピリジンプロトン)、7.13 (b, 1H; ピリジンプロトン)、6.47 (b, ポリ(NIPAM)反復単位の-NH-C=O-)、3.97 (b, ポリ(NIPAM)反復単位の-NH-CH(CH3)2)、3.66 (b, 3H, CH3O- RAFT残存基) 3.46 (b, 1H, ジスルフィド架橋に近いメチンプロトン)、1.36〜2.10 (b, ポリ(NIPAM)骨格のメチレンおよびメチンプロトン)、1.12 (b, ポリ(NIPAM)反復単位のメチルプロトン)、0.88 (b, 3H, RAFT残存基のメチルプロトン)。
組み換えタンパク質(GFPおよびmCherry)またはECMペプチド(フィブロネクチンおよびビトロネクチン)を文献に記述されているように産生したが、配列を表1に示す。PNIPAM-PDSを10 mg/mLの濃度でMilli-Q水に溶解した。タンパク質は既に(異なる濃度で)溶解していた。PNIPAM-PDS溶液をタンパク質溶液に加え、その結果、3:1のモル比が達成された。反応混合物を室温で6時間ゆっくり振盪した。結合効率をUV-Vis分光分析によって測定した。タンパク質と結合させた後にPNIPAM-PDSから放出されたピリジンチオンのものとみなした340 nmでの吸光度を用いて、結合効率を定量化した。GFP、Cherry、フィブロネクチンおよびビトロネクチンの場合に、結合効率は、それぞれ100%、97.7%、89.6%および28.0%であった。次いで、溶液を1日間、水に対して透析し(水交換3回)、凍結乾燥した。
典型的な重合は次のように行われた: PNIPAM43-SC(=S)SC4H9 (0.350 g, 7.4×l0-5 mol, 5 wt%)、SDS (0.0145 g, 5.0×10-5 mol)およびMilli-Q水(6.25 g)を、磁気撹拌棒を備えた10 mL Schlenk管に加えた。重合体を溶解するため、フラスコを氷浴中に入れることによって溶液をPNIPAMのLCST未満まで冷却した。重合体溶液を40分間アルゴンでパージした。スチレン(0.350 g, 3.4×10-3 mol, 5 wt%)およびAIBN (0.0012 g, 7.3×10-6 mol)の混合物を、冷却した重合体溶液に加えた。反応混合物をさらに10分間アルゴンでパージし、重合混合物を3時間70℃の油浴中で加熱した(SEC: Mn=8300, PDI=1.10)。
凍結乾燥したウォーム(またはナノスフィア)を4℃にてMilli-Q水で再水和した。PNIPAM-タンパク質溶液(4℃)を次に、ウォーム(またはナノスフィア)懸濁液に加え、振盪によって混合した。溶液を次に、LCST (29℃)超に加熱して、ウォーム(またはナノスフィア)のマトリックス表面上でのPNIPAM-タンパク質の結合を可能にした。
本明細書で記述される全ての哺乳動物組織培養試薬は、特に指定のない限りLife Technologies (Carlsbad, CA, USA)からのものであった。用いたhESC株は、NKX2-5 (eGFP/w) (hES3のバックグラウンド、Andrew Elefanty and Ed Stanley1からの物品寄付)、H9 (WiCell, Wisconsin, MI, USA)、MEL1およびMEL2 (2に言及されている)であった。NKX2-5、MEL1およびMEL2は、Stem Core Queenslandにより維持され、既述3のようにMEF支持層上にて手作業で継代された培養物として日常的に支持された。実験の前に、細胞を、4 ng/mLの塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)および0.1 mM 3-メルカプトエタノール(Sigma-Aldrich, Grand Island, NY, USA)を含有するKnockout血清代替媒体中で既述4, 5のように単個細胞の継代に適合させた。
PBS中pWorms (30% w/v) 35 μLの混合物をPBS中pVNまたはpFN 35 μL (各ECM重合体結合体0〜50 μgに及ぶ)と混ぜ合わせた。これらの溶液を臓器培養皿(直径15 mmの組織培養表面, BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA)の上に30秒間4000 rpmでスピンコートした。MEL1またはMEL2細胞の単個細胞懸濁液を皿1枚あたり細胞5×104個にてStemPro(登録商標)媒体中でプレーティングした。2時間の結合後、未結合の細胞を37℃で加温PBSにより表面から洗浄した。倍率20×でEVOSfl倒立顕微鏡(Advanced Microscopy Group, Bothell WA)にて撮像し、細胞を手作業でカウントした6。
PNIPAMのLCST未満まで温度を低下させることにより、hESCは酵素の補助なしに、表面から剥離した。本発明者らは、1時間4℃にてポリ(NIPAM)-タンパク質と混合されたウォームでコーティングされたスライドガラス上でまたはGeltrexコーティング組織培養プレート上で37℃にて24時間細胞を培養した。本発明者らは、ウォーム/ポリ(NIPAM)-タンパク質(すなわちタンパク質はフィブロネクチンまたはビトロネクチンのいずれかであった)でコーティングされたスライドガラス上でまたはGeltrexコーティング組織培養プレート上で37℃にて24時間細胞を培養した。培養物を1時間4℃に冷却した。4℃にてGeltrex対照表面での細胞のインキュベーションは、細胞剥離に顕著な特徴である細胞円形化を伴うことなく、細胞形態に大きな影響を及ぼさなかった(図4A〜C)。対照的に、ウォーム/ポリ(NIPAM)-タンパク質表面に付着された細胞をLCST未満でインキュベートした場合、顕著な細胞円形化を観察することができ、多くの細胞が表面から自発的に剥離した(図4D〜I)。残存している細胞を次に、媒体の穏やかな吸引により表面から取り除くことができた。
pVNまたはpFNのいずれか50 μgにより上記で調製された臓器培養皿に細胞1×106個/皿でMEL1またはMEL2細胞を播種し、これを24時間培養して、細胞間結合を形成させた。この皿を37℃のインキュベータから取り出し、30分間RTで(すなわちPNIPAMのLCST未満で)放置して、細胞シートの放出を可能にした。細胞をまた、低密度(細胞1×105個/皿)で播種して、酵素なしでの剥離をさらに実証し、およそ4℃でのインキュベーション後にLCST未満で放出させた。臓器培養皿上にコーティングされたGeltrex(商標) (DMEM-F12中0.5% v/v)を対照として用いた。室温でのこれらの培養物のインキュベーションによって、細胞シートが容易に遊離され、これは穏やかな振盪で完全に取り去ることができた(図5)。この方法は、分化プロトコルにおいて用いられることが多い小さなhESC塊の迅速な作出を可能にしうる。この方法を用いることで、トリプシン(typsin)およびコラゲナーゼのような酵素を使わなくても規定のサイズのインタクトな細胞塊の作出が可能とされうる。
pVNおよびpWormでのhESC 3D胚様体形成
いくつかの修正を加えつつ既述7のようにスピンEBプロセスを用いて、APEL媒体中で胚様体(EB)を形成させるためにMEL1、MEL2およびNKX2-5を用いた。手短に言えば、RTで丸底96ウェルプレートの1ウェルあたりに、細胞3500個を含有する細胞懸濁液50 μLを播種した。pWorm (156 μg/mL)、pVN (14 μg/mL)およびbFGF (100 ng/mL)の濃度のものを細胞懸濁液に加えた。プレートを次に、5分間480 gで37℃にて遠心分離した。細胞を5% CO2および5% O2雰囲気下、37℃でインキュベートした。3日目に、EBを30分間室温でインキュベートした後に、穏やかにピペッティングしてEBを分解した。図7A〜Bおよび図8B〜Cは、対照細胞もPNIPAM/RODジブロック共重合体/ビトロネクチン-PNIPAMとともにインキュベートされた細胞もともに、胚様体を形成させることが可能であったことを実証する。しかしながら、温度降下後、PNIPAM/RODジブロック共重合体/ビトロネクチン-PNIPAMの存在下で培養された胚様体しか、室温で小塊に手作業で解離させることができなかった(図7C〜D)。EBの解離を、図8Aに表された4つの分類に基づきスコア化した。
ポリビニルアルコール(PVA)を除去し、等容量をF-12栄養素ミックスと置き換えたことを除いて、既述のようにAPEL媒体を作出した。PVAを含まない媒体をAELと名付けた。pWorm (0〜1560 μg/mL)およびpVN (0〜50 μg/mL)を100 ng/mLのbFGFとともにAEL媒体に加えた。EBを、密度の均一性、球状のEB構造およびEB境界のなめらかさに基づき1日目に効率的な形成についてスコア化した。pVNおよびpWormの希釈系列に基づき(図8D)、それぞれ、50 μg/mLおよび1.56 ng/mLの最適濃度をPVAの非存在下でのEBの形成のために選択した。
pVNおよびpWormの希釈系列に基づき(図8DおよびE)、それぞれ、50 μg/mLおよび1.56 ng/mLの最適濃度をPVAの非存在下でのEB形成のために選択した。NKX2-5、MEL2およびH9を18日にわたる3D多能性増殖に用いた。スピンEB形成に用いた媒体は、BSA有りおよび無しのAELまたはStemPRO(登録商標) hESC SFM 8であった。AELおよびStemPRO(登録商標) hESC SFMに、それぞれ100および10 ng/mlのbFGFを補充した。プレートおよび細胞を5分間480 gで37℃にて遠心分離した。細胞を5% CO2および5% O2雰囲気下、37℃でインキュベートした。3および10日目に継代するために手作業によるピペッティングを用い室温でEBを穏やかに再懸濁した。qPCRおよびフローサイトメトリーの陽性対照は、記述2のようにKSR媒体中でのMEF支持層または20 μg/cm2のVN上のStemPRO(登録商標)媒体中での支持細胞なしのいずれかでの2D培養であった。
10、11および18日目にEVOSfl倒立顕微鏡(Advanced Microscopy Group)を用いてEBの明視野写真を撮った。Image J (v1.41)を用いてμm単位でEBの直径を測定した。1条件につき複製ごと60のEBのサイズを決定し、合算で1条件につき180となった。細胞カウントのため、選択のEBを、TrypLEを用いて解離させ、血球計にてカウントする前に死細胞の排除についてトリパンブルー(Trypan Blue)で染色した。代表的な倍増殖は図9Aに概略されており、継代前後の平均EBサイズ分布は図9BおよびCに概略されている。
用いた全プロトコルは、qPCRの結果の実施および報告に関する最近のガイドラインを厳密に順守している9。RNA抽出およびDNA除去は、Qiagen RNeasy RNA抽出キット(Qiagen)およびオンカラムDNASEセットを用いて行った。手短に言えば、増殖後18日目にhESCからまたは図に示されているようにさまざまな時点で分化細胞からRNAを抽出した。Life TechnologiesのSuperscript III First Strand Sythesis Supermixを用いて、DNAを含まないRNA 1マイクログラムをcDNAに変換した。qPCRの前にcDNAを10分の1希釈した。qPCRに用いたプライマー配列は、表2において見出すことができる。記述10のようにApplied Biosystems 7500 Fast ThermoCyclerおよびSYBR Green Master Mixを用いてqPCRを行った。段階的な融解曲線分析での1本のピークの存在により、プライマー産物の特異性が確認された。倍数変化の表現は、MEF上で増殖されたhESCに対して判定したものであった。関心対象の全ての遺伝子は、Pfaffl法12を用いて3種のハウスキーピング遺伝子: ヒト0-アクチン、HPRTおよびGAPDH11を基準にした。全ての実験およびqPCRの実行は、三つ組で行われた。結果は、図9Dに表示されている。
細胞を解離時に4%ホルマリン中で固定し、一次抗体マウスIgG1、抗Oct-4 (2 μg/mL) (Merck Millipore)により4℃で終夜染色した。Alexa fluor 488に結合されたアイソタイプ特異的な二次抗体を1 μg/mLで用いた。Samplerアーム(BD Biosciences)を有するC6 Accuriフローサイトメーターを用いてフローサイトメトリーにより、多能性マーカーOct-4の発現を判定した。CFlow Samplerソフトウェア(v1.0.264.15, BD Biosciences)を用いてデータを分析し、結果を図9Eに表示した。
(A) RTで手作業により穏やかに細かく砕いた(titration)後のEB塊分類の例。pWORM (156 μg/mL)およびpVN (14 μg/mL)を含有するAPEL媒体中でSpin EBプロトコルを用いてEBを形成させた。3日目に、EBをRTで20分間インキュベートした後に、200 μLのピペットチップを通過させて、解離させた。スケールバーは1000 μmである。(B) 手作業による解離後の分離したEBの割合。EBはAに定義されるようにpWORMs/pVN有りまたは無しのAPEL媒体中で形成された。3日目に、EBを37℃でまたはRTで手作業により解離させ、分離したまたは分離なかったと分類した。(C) RTで解離後のEB塊のサイズの分布。RTでの解離の後、EBをAに概説されているようにサイズにしたがって4つの部類に分類した。(D) PVAの非存在下でのpWORMおよびpVNの滴定中に形成されたEBの明視野像。EBは示したようにpWORMおよびpVN濃度の滴定中、PVAの非存在下でスピンコート法を用いて形成された。EBは、EBの形成(1)、部分的形成(2)、さまざまな塊の形成(3)および形成なし(4)に基づき、形成について1日目に1〜4にスコア化された。形成のスコアを3回の独立した実験および各実験内での技術的反復、n=18にわたって平均化した。(E) pWORMおよびpVNを有しPVA無しの媒体中RTでのEBの解離。pWORM (1.56 ng/mL)およびpVN (50 μg/mL)を有するAEL媒体中で形成されたEBを3日目に解離させ、(A)に概説されているようにEB塊のサイズにしたがって分類した。APEL; アルブミンポリビニルアルコール必須脂質(Albumin Polyvinylalcohol Essential Lipid)、pVN; PNIPAM-ビトロネクチン(Vitronectin)、AEL; アルブミン必須脂質(Albumin Essential Lipid)。
(A) 胚様体としてのNkx2-5 hESCの倍増殖。EBは、BSAおよびPNIPAM (pVN 50 μg/mLおよびpWorm 1.56 ng/mL)有りおよび無しのSP媒体中にて細胞3,500個/凝集体でスピンEB法を用いて形成された。EBは3日目および10日目に、20分間RTでインキュベートし、引き続いて穏やかにピペッティングすることによって継代された。倍数変化は0日目の投入細胞数と比べて18日目の総細胞数に基づいていた。(B) 平均のEB直径。EBを10、11および18日目に写真に撮った。EBの直径はImage J画像解析ソフトウェアを用いて判定された。1複製につき1サンプルあたり60個のEBをサイズ分類した、n= 180。(C) 継代前後のEBサイズの分布。(D) NanogおよびOct4遺伝子発現のqPCR分析。18日目に、mRNAをEBから抽出し、Oct4およびNanog発現のqPCR測定の前にcDNAに変換した。倍数変化は、MEF支持層上で成長させたhESCに対するものであり、3種のハウスキーピング遺伝子(3-アクチン、GAPDHおよびHPRTを用いて平均化されている。エラーバーは3回の独立した実験の標準偏差を表す。(E) フローサイトメトリーによって測定されたOct4タンパク質の発現。SP; StemPro、BSA; ウシ血清アルブミン、PNIPAM; pVN 50 μg/mLおよび1.56 ng/mLのpWORMでの培養、APEL; アルブミンポリビニルアルコール必須脂質、2D VN; ビトロネクチンでコーティングされた組織培養プラスチック上のhESC、2D MEF; マウス胚性線維芽細胞支持層上で成長させたhESC。
Claims (20)
- 重合体粒子および機能化された刺激応答性重合体を含む組成物であって;
該重合体粒子が、(i) ブロック共重合体を含み、かつ(ii) コアシェル構造を有し、該ブロック共重合体が、(a) コア構造の少なくとも一部を形成する非刺激応答性重合体ブロック、および(b) シェル構造の少なくとも一部を形成する刺激応答性重合体ブロックを含み;
該重合体粒子と該機能化された刺激応答性重合体との刺激応答性重合体が、少なくとも1つの共通の刺激に応答性である、
該組成物。 - 液体をさらに含み、前記重合体粒子および前記機能化された刺激応答性重合体の両方を伴う前記刺激応答性重合体が該液体内で可溶性である、請求項1記載の組成物。
- 液体をさらに含み、かつゲルの形態であり、前記重合体粒子および前記機能化された刺激応答性重合体の両方を伴う前記刺激応答性重合体が該液体内で不溶性である、請求項1記載の組成物。
- 請求項1〜3のいずれか一項記載の組成物を含む、細胞培養システム。
- 請求項1〜3のいずれか一項記載の組成物を含む、薬物送達システム。
- (i) 重合体粒子および細胞で機能化された刺激応答性重合体を含む液体組成物を提供する段階であり;
該重合体粒子が、(a) ブロック共重合体を含み、かつ(b) コアシェル構造を有し、該ブロック共重合体が、(a) コア構造の少なくとも一部を形成する非刺激応答性重合体ブロック、および(b) シェル構造の少なくとも一部を形成する刺激応答性重合体ブロックを含み;
該重合体粒子と該細胞で機能化された刺激応答性重合体との刺激応答性重合体が、(a) 少なくとも1つの共通の刺激に応答性であり、かつ(b) 該液体中で可溶性である、段階;
(ii)該重合体粒子と該細胞で機能化された刺激応答性重合体との該刺激応答性重合体が、該液体中で可溶性である状態から該液体中で不溶性である状態への移行を生じるように、該液体組成物を該共通の刺激に供する段階であり、該移行が、該重合体粒子および該細胞で機能化された刺激応答性重合体の凝集を促進して、細胞塊を形成させる、段階; ならびに
(iii) 該細胞塊の内部でおよび/または表面上で細胞を培養する段階
を含む、細胞を培養する方法。 - (iv)前記重合体粒子と前記細胞で機能化された刺激応答性重合体との前記刺激応答性重合体が、前記液体中で不溶性である状態から該液体中で可溶性である状態への移行を生じるように、培養された細胞を含む前記液体組成物を前記共通の刺激に供する段階であり、該移行が、前記細胞塊からの個々の細胞および/またはさらに小さな細胞塊の放出を容易にする、段階
をさらに含む、請求項6記載の方法。 - (v) 段階(iv)においてそのように形成された個々の細胞および/または形成されたさらに小さな細胞塊の少なくともいくつかを、前記液体組成物から取り出す段階
をさらに含む、請求項7記載の方法。 - 前記液体が水性液体であり、かつ前記重合体粒子と前記細胞で機能化された刺激応答性重合体との前記刺激応答性重合体が、共通のLCSTを有する熱応答性重合体である、請求項6〜8のいずれか一項記載の方法。
- 段階(ii)において加えられる共通の刺激が、前記液体の温度をLCST超まで上昇させることである、請求項9記載の方法。
- 37℃がLCSTであるかまたはLCST超である、請求項9または10記載の方法。
- (i) 液体、細胞受容体リガンドで機能化された刺激応答性重合体、および基材に固定された重合体粒子を含む液体組成物を提供する段階であり;
該重合体粒子が、(a) ブロック共重合体を含み、かつ(b) コアシェル構造を有し、該ブロック共重合体が、(a) コア構造の少なくとも一部を形成する非刺激応答性重合体ブロック、および(b) シェル構造の少なくとも一部を形成する刺激応答性重合体ブロックを含み;
該重合体粒子と該細胞受容体リガンドで機能化された刺激応答性重合体との刺激応答性重合体が、(a) 少なくとも1つの共通の刺激に応答性であり、かつ(b) 該液体中で可溶性である、段階;
(ii)該重合体粒子と該細胞受容体リガンドで機能化された刺激応答性重合体との該刺激応答性重合体が、該液体中で可溶性である状態から該液体中で不溶性である状態への移行を生じるように、該液体組成物を該共通の刺激に供する段階であり、該移行が、該重合体粒子および該細胞受容体リガンドで機能化された刺激応答性重合体の凝集を促進して、該細胞受容体リガンドを含む表面を有する凝集体構造を形成させる、段階;
(iii) 細胞受容体リガンドと結合するように培養される1種または複数種の細胞を該液体に導入する段階; ならびに
(iv) 該細胞受容体リガンドを含む該表面上で細胞を培養する段階
を含む、細胞を培養する方法。 - (v)前記重合体粒子と前記細胞受容体リガンドで機能化された刺激応答性重合体との前記刺激応答性重合体が、前記液体中で不溶性である状態から該液体中で可溶性である状態への移行を生じるように、培養された前記細胞を含む前記液体組成物を前記共通の刺激に供する段階であり、該移行が該培養細胞の放出を容易にする、段階
をさらに含む、請求項12記載の方法。 - (vi) 段階(v)において形成された培養細胞の少なくともいくつかを、前記液体組成物から取り出す段階
をさらに含む、請求項13記載の方法。 - 前記液体が水性液体であり、かつ前記重合体粒子と前記細胞受容体リガンドで機能化された刺激応答性重合体との前記刺激応答性重合体が、共通のLCSTを有する熱応答性重合体である、請求項12〜14のいずれか一項記載の方法。
- 段階(ii)において加えられる共通の刺激が、液体組成物の温度をLCST超まで上昇させることである、請求項15記載の方法。
- 請求項13に従属する場合、段階(v)において加えられる共通の刺激が、液体組成物の温度をLCST未満まで低下させることである、請求項15記載の方法。
- 37℃がLCSTであるかまたはLCST超である、請求項15、16、または17記載の方法。
- (i) 液体、重合体粒子、および機能化された刺激応答性重合体を含む液体組成物を提供する段階であり;
該重合体粒子が、(a) ブロック共重合体を含み、かつ(b) コアシェル構造を有し、該ブロック共重合体が、(a) コア構造の少なくとも一部を形成する非刺激応答性重合体ブロック、および(b) シェル構造の少なくとも一部を形成する刺激応答性重合体ブロックを含み;
該重合体粒子と該機能化された刺激応答性重合体との刺激応答性重合体が、(a) 少なくとも1つの共通の刺激に応答性であり、かつ(b) 該液体中で可溶性である、段階; ならびに
(ii)該重合体粒子と該機能化された刺激応答性重合体との該刺激応答性重合体が、該液体中で可溶性である状態から該液体中で不溶性である状態への移行を生じるように、該液体組成物を該共通の刺激に供する段階であり、該移行が、ゲルの形成を促進する、段階
を含む、機能化された刺激応答性重合体を含むゲルを形成する方法。 - (i) 重合体粒子、機能化された刺激応答性重合体、および液体を含むゲルを提供する段階であり;
該重合体粒子が、(a) ブロック共重合体を含み、かつ(b) コアシェル構造を有し、該ブロック共重合体が、(a) コア構造の少なくとも一部を形成する非刺激応答性重合体ブロック、および(b) シェル構造の少なくとも一部を形成する刺激応答性重合体ブロックを含み;
該重合体粒子と該機能化された刺激応答性重合体との刺激応答性重合体が、(a) 少なくとも1つの共通の刺激に応答性であり、かつ(b) 該液体中で不溶性である、段階; ならびに
(ii)該重合体粒子と該機能化された刺激応答性重合体との該刺激応答性重合体が、該液体中で不溶性である状態から該液体中で可溶性である状態への移行を生じるように、該ゲルを該共通の刺激に供する段階であり、該移行が、該ゲルを、該重合体粒子および該機能化された刺激応答性重合体を含む液体組成物にして、それによって該ゲルからの該機能化された刺激応答性重合体の放出を促進する、段階
を含む、機能化された刺激応答性重合体をゲルから放出させる方法。
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