CN111630147B - 细胞培养用载体和细胞培养容器 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及细胞培养用载体，其中，在具有刺激响应性聚合物和外部信号接收材料的细胞培养用刺激响应性基材中担载有活性物质。

Description

细胞培养用载体和细胞培养容器
技术领域
本发明涉及细胞培养用载体和细胞培养容器。
背景技术
近年，伴随再生医疗技术、癌症治疗技术的进展，需要制备大量用于临床的细胞。为了培养细胞，而需要定期性地向培养基(细胞培养液)追加易于分解的成分、根据细胞的状态而变更为不同的需求成分。培养基更换，伴随有培养系统污染(Contamination)的风险。因此，优选尽可能在没有人工干预的情况下，自动执行。
例如，非专利文献1中记载了，将担载有细胞因子等活性物质的载体放置于培养容器中的细胞周围，通过从载体向培养基内的扩散而供给活性物质的方法。
此外，专利文献1中记载了，将微量的细胞配置于微流路装置内期望的位置处，有效地实施抗癌症剂等药物敏感性试验的方法。在专利文献1所述的方法中，使用微流体装置，使用泵将细胞因子等活性物质供给至装置中的培养基中。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本专利第5881031号公报
非专利文献
非专利文献1：Lotz,S et al.Sustained Levels of FGF2 MaintainUndifferentiated Stem Cell Cultures with Biweekly Feeding.PLoS One.8(2)：e56289(2013).
发明内容
发明所解决的技术问题
非专利文献1中所述的方法仅将载体放置于培养基内即可，可以通过简单操作来实施。然而，由于活性物质继续通过扩散被释放，因此，存在活性物质的供给控制较为困难这样的问题。
专利文献1所述的方法可以通过对微流体装置外的泵的驱动进行控制，而精细地实施活性物质的供给控制。然而，具备这样的机构的微流体装置存在结构变得复杂并且生产成本提高这样的问题。此外，由于泵等机构占用区域增加，因此，存在不能确保较大的培养空间，不能培养大量细胞这样的问题。
鉴于所述情况完成了本发明，目的是提供可以控制活性物质的精细供给、能够培养大量细胞、能够以低成本进行制造的细胞培养用载体和细胞培养容器。
解决问题的技术手段
即，本发明包含下述[1]～[20]的发明。
[1]一种细胞培养用载体，其中，
在具有刺激响应性聚合物和外部信号接收材料的细胞培养用刺激响应性基材中担载有活性物质。
[2]根据[1]所述的细胞培养用载体，其中，
所述活性物质内含在多孔质基材中，在所述细胞培养用刺激响应性基材中担载有所述多孔质基材和所述活性物质。
[3]根据[1]或[2]所述的细胞培养用载体，其中，
所述刺激响应性聚合物为温度响应性聚合物。
[4]根据[1]～[3]中任一项所述的细胞培养用载体，其中，
所述外部信号接收材料为有机化合物、金属结构体或碳材料。
[5]根据[4]所述的细胞培养用载体，其中，
所述金属结构体为金纳米棒。
[6]根据[1]～[5]中任一项所述的细胞培养用载体，其中，
所述活性物质为酶、细胞因子、分化诱导因子、抗体等蛋白质、激素等肽、抗生素、氨基酸、葡萄糖、视黄酸等低分子化合物、DNA等核酸、纳米粒子或脂质体。
[7]根据[1]～[6]中任一项所述的细胞培养用载体，其中，
所述外部信号接收材料所接收的外部信号为近红外光。
[8]根据[2]所述的细胞培养用载体，其中，
包含所述活性物质的所述多孔质基材的一部分被所述细胞培养用刺激响应性基材包覆，所述部分以外的部分被活性物质不透过层包覆。
[9]根据[1]所述的细胞培养用载体，其中，
所述外部信号接收材料以形成浓度分布的方式混合于所述细胞培养用刺激响应性基材中。
[10]根据[1]所述的细胞培养用载体，其具备：
用于注入所述活性物质的注入口；和
由活性物质不透过性材料形成并且密封所述注入口的密封部。
[11]一种细胞培养容器，其具备：
细胞培养用载体，其在具有刺激响应性聚合物和外部信号接收材料的细胞培养用刺激响应性基材中担载有活性物质；和
细胞培养部。
[12]根据[11]所述的细胞培养容器，其中，
所述活性物质内含在多孔质基材中，在所述细胞培养用刺激响应性基材中担载有所述多孔质基材和所述活性物质。
[13]根据[11]或[12]所述的细胞培养容器，其中，
所述刺激响应性聚合物为温度响应性聚合物。
[14]根据[11]～[13]中任一项所述的细胞培养容器，其中，
所述外部信号接收材料为有机化合物、金属结构体或碳材料。
[15]根据[14]所述的细胞培养容器，其中，
所述金属结构体为金纳米棒。
[16]根据[11]～[15]中任一项所述的细胞培养容器，其中，
所述活性物质为酶、细胞因子、分化诱导因子、抗体等蛋白质、激素等肽、抗生素、氨基酸、葡萄糖、视黄酸等低分子化合物、DNA等核酸、纳米粒子或脂质体。
[17]根据[11]～[16]中任一项所述的细胞培养容器，其中，
所述外部信号接收材料所接收的外部信号为近红外光。
[18]根据[12]所述的细胞培养容器，其中，
包含所述活性物质的所述多孔质基材的一部分被所述细胞培养用刺激响应性基材包覆，所述部分以外的部分被活性物质不透过层包覆。
[19]根据[11]所述的细胞培养容器，其中，
所述外部信号接收材料以形成浓度分布的方式混合于所述细胞培养用刺激响应性基材中。
[20]根据[11]所述的细胞培养容器，其具备：
用于注入所述活性物质的注入口；和
由活性物质不透过性材料形成并且密封所述注入口的密封部。
参照附图，对以下的实施方式进行详细说明，由此，本发明的其他特征和方式变得显而易见。
发明效果
如果采用本发明，则能够提供可以控制活性物质的精细供给、能够培养大量细胞、能够以低成本进行制造的细胞培养用载体和细胞培养容器。
附图说明
[图1]是表示本发明的细胞培养用载体的一个实例的示意图。
[图2]是表示本发明的细胞培养用载体的一个实例的示意图。
[图3]是表示本发明的细胞培养用载体的一个实例的示意图。
[图4]是表示本发明的细胞培养用载体的一个实例的示意图。
[图5]是表示本发明的细胞培养用载体的一个实例的示意图。
[图6]是表示本发明的细胞培养用载体的一个实例的示意图。
[图7]是对使用了本发明的细胞培养容器的一个实例的细胞培养方法进行说明的示意图。
[图8]是表示本发明的细胞培养容器的一个实例的示意图。
[图9]是表示本发明的细胞培养容器的一个实例的示意图。
[图10]是表示本发明的细胞培养容器的一个实例的示意图。
[图11]是表示本发明的细胞培养容器的一个实例的示意图。
[图12]是表示本发明的细胞培养容器的一个实例的示意图。
[图13]是表示本发明的细胞培养容器的一个实例的示意图。
[图14]是表示本发明的细胞培养容器的一个实例的示意图。
[图15]是表示本发明的细胞培养容器的一个实例的示意图。
具体实施方式
<细胞培养用载体>
本实施方式涉及细胞培养用载体，其中，在具有刺激响应性聚合物和外部信号接收材料的细胞培养用刺激响应性基材中担载有活性物质。以下，将对作为可以在刺激响应性聚合物的凝聚状态和溶胀状态中切换活性物质的扩散的理由而假定的理论进行说明。但是，本发明不限于该理论。
就本实施方式的细胞培养用载体而言，在细胞培养用刺激响应性基材中担载有活性物质。就细胞培养用载体而言，细胞培养用刺激响应性基材中的刺激响应性聚合物在接受外部信号之前发生凝聚。在该凝聚状态下，聚合物的密度较高、疏水性较高，因此对水的溶解性较低。此外，由于担载于细胞培养用载体中的活性物质不向载体外扩散，因此，活性物质仍担载于细胞培养用载体中。在细胞培养用载体中，活性物质处于被储存的状态。
当接受外部信号时，细胞培养用刺激响应性基材中的刺激响应性聚合物的凝聚解开。因此，对水的溶解性提高并且溶胀，担载于细胞培养用载体的活性物质向细胞培养用载体外扩散。此外，当停止外部信号的输入时，细胞培养用刺激响应性基材再次变成凝聚状态，活性物质的扩散停止。通过对外部信号的输入进行控制，而能够可逆性地对刺激响应性聚合物的凝聚进行控制。即，本实施方式的细胞培养用载体通过对外部信号的输入进行控制，而能够精细地对活性物质的扩散进行控制。
以下，对本实施方式的细胞培养用载体详细地进行说明。
<<第1实施方式>>
图1是表示第1实施方式的细胞培养用载体40的截面的示意图。图1所示的细胞培养用载体40处于在细胞培养用刺激响应性基材33中担载有活性物质32的状态。通过将活性物质32直接担载在细胞培养用刺激响应性基材33中，而能够使结构变得简单并且高效地进行制造。当向细胞培养用载体40输入外部信号时，变成发生了整体性溶胀的溶胀状态41。
图1中的符号(X)处于刺激响应性聚合物凝聚、活性物质的扩散停止的状态。此外，图1中的符号(Y)处于刺激响应性聚合物溶胀、活性物质可以扩散的状态。在本实施方式中，通过对外部信号的输入进行控制，而能够可逆性地对活性物质的扩散状态(Y)和扩散停止(X)进行控制。对于之后的附图，(X)和(Y)也意味着同样的状态。
作为一个实例，在外部信号的输入前处于符号(X)所示的凝聚状态的情况下，接收外部信号，细胞培养用刺激响应性基材33中的刺激响应性聚合物变成非凝聚状态41(或溶胀状态)时，对水的溶解性提高。由此，所担载的活性物质32向载体外进行扩散。
作为其他实例，在外部信号的输入前处于符号(Y)所示的非凝聚状态的情况下，接收外部信号，细胞培养用响应性基材33中的刺激响应性聚合物变成凝聚状态时，对水的溶解性降低。由此，所担载的活性物质32仍保持在载体内。
·刺激响应性聚合物
通过外部刺激而使刺激响应性聚合物的结构发生变化、使活性物质的透过性发生变化。刺激响应性聚合物可以是链状的聚合物，也可以是支化的聚合物。可以使刺激响应性聚合物分子间交联而进行使用。可以形成使用了刺激响应性聚合物的聚合物刷结构而进行使用。在活性物质的分子尺寸较小的情况下，因交联、聚合物刷结构等而使刺激响应性聚合物具有高密度，从密封效率的方面出发，为优选的。
刺激响应性聚合物，可以适宜使用对温度、光、pH、磁场、电场、超声波、氧化还原、分子浓度等各种刺激进行响应的物质。在本实施方式中，从即使进行局部加热，也能够通过热平衡向培养温度进行收敛，对培养环境的影响较小的方面出发，由于对细胞没有不良影响而优选使用温度响应性聚合物。
作为温度响应性聚合物，可以使用最低临界共溶温度(LCST)型聚合物和最高临界共溶温度(UCST)型聚合物。作为最低临界共溶温度(LCST)型聚合物，可以使用聚酰胺类LCST型聚合物、聚醚类LCST型聚合物、磷酸酯类LCST型聚合物和组入了蛋白质的聚合物等。更具体而言，作为最低临界共溶温度(LCST)型聚合物，可以使用聚(N-异丙基丙烯酰胺)、泊洛沙姆、聚(N-乙烯基己内酰胺)、聚甲基乙烯基醚、甲基纤维素、含弹性蛋白的聚合物等。此外，作为最高临界共溶温度(UCST)型聚合物，可以使用聚(烯丙基胺-共-烯丙基脲)、聚(丙烯酰胺-共-丙烯腈)、羟丙基纤维素、泊洛沙姆407等的泊洛沙姆、甲基丙烯酰胺聚合物和具有磺基甜菜碱基的聚甲基丙烯酸酯等。这些高分子可以单独使用，也可以组合使用多个。此外，LCST型高分子或UCST型高分子可以是使用选自异丙基丙烯酰胺、己内酰胺、烯丙基胺、烯丙基脲、磺基甜菜碱、乙二醇、甲基丙烯酸酯、苯乙烯、降冰片烯、Phosphazenes、甲基乙烯基醚、丙烯腈和丙交酯中的2种以上的单体形成的嵌段共聚物。这些嵌段共聚物的相变温度可以根据所使用的单体的种类和量比来进行调整。此外，可以将LCST型高分子和UCST型高分子组合并用作温度响应性聚合物。这些温度响应性材料的相变温度可以根据要导入的官能团的量等进行适宜调整。例如，作为要导入的官能团，可以使用：烷基、酰胺基、哌嗪基、四氢吡咯基、缩醛基、缩酮基、噁唑啉基、氧乙烯基、磺酸基、醇基、磺基甜菜碱基、尿嘧啶基、脲基和甘氨酸酰胺基等。作为刺激响应温度，优选在20℃～60℃的范围内。期望温度响应性聚合物的刺激响应温度的至少一个为培养温度以上。特别是在人等动物细胞的培养中，由于培养温度为37℃，因此优选刺激响应温度为38℃以上50℃以下。通过分别使用LCST型和UCST型，而能够可逆性地控制外部信号输入前后的状态(X)和(Y)。
·外部信号
就外部信号而言，从不需要配线的观点出发，优选光或磁场。作为光，优选不易对细胞产生影响的近红外光。尤其是，用作外部信号的光的波长优选是水分子不易吸收的波长。例如，用作外部信号的光的波长可以为650nm以上950nm以下；1000nm以上1350nm以下；1500nm以上1800nm以下的波长。
·外部信号接收材料
外部信号接收材料，根据外部信号和刺激响应性高分子的组合进行适宜决定。例如，在使用近红外光作为外部信号，使用温度响应性高分子作为刺激响应性高分子的情况下，外部信号接收材料使用能够高效地将近红外光转换为热的有机材料和无机材料。作为这样的材料，可以使用有机化合物、金属结构体或碳结构体。优选金属结构体和碳结构体是微细的。通过使金属结构体和碳结构体微细，而能够容易地使这些结构体均匀且没有沉淀，同时，由于能够使表面积增加，因此能够使近红外光的吸收效率提高。
通过使用这样的材料作为外部信号接收材料，而能够通过接收信号，对外部信号接收材料周围进行局部加热而使温度响应性聚合物的结构发生变化，可逆性地控制活性物质的扩散和扩散停止。
··有机化合物
在本实施方式中，作为有机化合物，优选有机色素。作为有机色素，可以使用花青色素、酞菁色素、萘酞菁化合物、镍连二硫烯络合物、方酸菁色素(Squarylium　dye)、醌类化合物、二铵化合物、偶氮化合物、卟啉化合物、二硫醇金属络合物、萘醌化合物、二铵化合物等。此外，作为有机化合物，可以使用含有有机色素的树脂制粒子。需要说明的是，有机化合物的形状可不限于粒子。通过将有机色素混炼至树脂中，而能够抑制有机色素向培养液中的漏出，因此，有效地避免了有机色素对细胞等培养对象的影响。
··金属结构体
在本实施方式中，作为金属结构体，从能够通过长径比对光的吸收波长进行控制出发，优选金属纳米棒，特别优选金纳米棒。
··碳材料
作为碳材料，优选碳结构体。作为碳结构体，可以使用：碳纳米管、富勒烯、碳纳米线等。
在外部信号使用磁场的情况下，接收外部信号的物质优选使用磁性纳米粒子等磁性体。通过交流磁场的负荷，而使磁性纳米粒子发热。
刺激响应性聚合物与外部信号接收材料的接合、刺激响应性聚合物的分子间的交联、细胞培养用刺激响应性基材与活性物质的固定中，可以使用各种官能团和与该官能团反应的交联剂而进行。
在本实施方式中，交联剂可以是均双官能性交联剂，可以是异双官能性交联剂，也可以是三官能以上的多官能性交联剂。
如果官能团为伯胺，则可以使用包含NHS酯、碳二亚胺、醛、异硫氰酸酯、异氰酸酯、酰基叠氮化物、磺酰氯、乙二醛、环氧化物、环氧乙烷、碳酸酯、芳基卤化物、酰亚胺酯、酸酐、氟代酯等的交联剂。
如果官能团为羧基，则可以使用碳二亚胺等。
如果官能团为巯基，则可以使用包含马来酰亚胺、卤乙酸、吡啶基二硫化物、硫代砜、乙烯基砜等交联剂。
如果官能团为醛基，则可以使用包含酰肼、烷氧基胺等的交联剂。
此外，可以使用重氮甲烷、芳基叠氮化物等光反应性基团。可以使用叠氮化物-炔烃间、叠氮化物-膦间等化学选择性连接。可以使用聚乙二醇、DNA等分子作为间隔物。
此外，可以通过电子束照射等能量赋予而使各种部件活性化，用于接合、交联。
·活性物质
在本实施方式中，作为活性物质22，可以使用：酶、细胞因子、分化诱导因子、抗体等蛋白质、激素等肽、抗生素、氨基酸、葡萄糖、视黄酸等低分子化合物、DNA等核酸、纳米粒子、脂质体等，没有特别限制。此外，活性物质22可以是生物体材料提取物、细胞分泌物。活性物质22不限于化学物质，可以是病毒。可以通过将用于分泌活性物质的细胞包埋在多孔质基材中并与培养对象的细胞进行共培养，而供给细胞分泌物。由此，还可以向培养对象的细胞供给未知的活性物质。
<<第2实施方式>>
图2是表示第2实施方式的细胞培养用载体30的截面的示意图。图2所示的细胞培养用载体30具备细胞培养用刺激响应性基材33、多孔质基材34、活性物质32和活性物质不透过层31。活性物质32被内含在多孔质基材34中。在本实施方式中，包含活性物质32的多孔质基材34的一部分被细胞培养用刺激响应性基材33包覆，所述部分以外的部分被活性物质不透过层31包覆。活性物质不透过层31优选为疏水性聚合物等有机材料，优选活性物质32不从被细胞培养用刺激响应性基材33包覆的部分以外的部分释放。活性物质不透过层31只要不透过并且不吸附活性物质即可，除了疏水性聚合物以外，可以使用金属薄膜等无机材料，也可以通过交联剂使多孔质基材交联。根据需要，可以进行亲水化等涂布。
通过分别对细胞培养用刺激响应性基材33的配置位置和包覆面积进行调整，而能够将活性物质32的扩散量和扩散方向控制为期望的供给量。
如图2(Y)所示，当向细胞培养用载体30输入外部信号时，仅配置了细胞培养用刺激响应性基材33的位置变成溶胀状态33a。由于活性物质32通过扩散仅从变成溶胀状态33a的部分释放，因此，能够将活性物质32的扩散量和扩散方向控制为期望的供给量。
·多孔质基材
在本实施方式中，活性物质32被内含在基材中。作为该基材，优选多孔质基材。作为多孔质基材，可以是基于共价键的化学凝胶、基于非共价键性的分子间力等的物理凝胶，也可以是两者在形成凝胶结构中都起作用的凝胶。具体而言，作为多孔质基材，可以使用：由琼脂糖、糊精、果胶、海藻酸钠、黄原胶等的糖链形成的水凝胶；由胶原蛋白、透明质酸、弹性蛋白、明胶等的蛋白质形成的水凝胶；由聚丙烯酰胺、聚乙二醇等的合成高分子形成的水凝胶；聚硅氧烷水凝胶；中孔碳、中孔硅酸铝、中孔二氧化硅等无机材料。作为多孔质基材，可以使用这些的复合材料。
在本实施方式中，优选活性物质32被内含在多孔质基材34中。
<<第3实施方式>>
图3是表示第3实施方式的细胞培养用载体20的截面的示意图。图3所示的细胞培养用载体20具备细胞培养用刺激响应性基材21、多孔质基材34和活性物质22。活性物质22被内含在多孔质基材34中。在本实方式的细胞培养用载体20中，活性物质22被包覆并被储存在细胞培养用刺激响应性基材21中。
图3中的符号(X)处于刺激响应性聚合物凝聚、活性物质的扩散停止的状态。此外，图3中的符号(Y)处于刺激响应性聚合物溶胀、活性物质可扩散的状态。在本实施方式中，通过对外部信号的输入进行控制，而能够可逆性地对活性物质的扩散状态(Y)和扩散停止(X)进行控制。
作为一个实例，在外部信号的输入前处于符号(X)所示的凝聚状态的情况下，接收外部信号，细胞培养用刺激响应性基材21中的刺激响应性聚合物变成非凝聚状态21a时，对水的溶解性提高。由此，所担载的活性物质22向载体外扩散。
作为其他实例，在外部信号的输入前处于符号(Y)所示的非凝聚状态的情况下，接收外部信号，细胞培养用响应性基材21中的刺激响应性聚合物变成凝聚状态时，对水的溶解性降低。由此，所担载的活性物质22仍保持在载体内。
<<第4实施方式>>
图4是表示第4实施方式的细胞培养用载体50的截面的示意图。图4所示的细胞培养用载体50具有将外部信号接收材料52以形成浓度分布方式混合于细胞培养用刺激响应性基材51中，并且包覆包含活性物质的多孔质基材34的形态。符号51a表示浓度分布的梯度。由于具有浓度分布，即使输入相同的外部信号，也可以使活性物质的扩散速度不同。因此，在细胞培养容器内，能够在空间上控制活性物质的浓度分布。
<<第5实施方式>>
图5是表示第5实施方式的细胞培养用载体92的截面的示意图。就图5所示的细胞培养用载体92而言，活性物质91被细胞培养用刺激响应性基材90包覆。活性物质91被内含在多孔质基材34中。在活性物质91中，多种活性物质91a、活性物质91b以进行了混合的状态而被储存。
<<第6实施方式>>
图6是表示第6实施方式的细胞培养用载体100的截面的示意图。就图6所示的细胞培养用载体100而言，包含活性物质的多孔质基材101被细胞培养用刺激响应性基材103包覆。细胞培养用载体100在表面具备注入口102，可以注入期望的活性物质91。就注入口102而言，在注入活性物质后，用疏水性聚合物等活性物质不透过性材料形成的密封部105密封时，得到使活性物质91的漏出减少的作用效果。
<细胞培养容器>
本实施方式的细胞培养容器具备所述本实施方式的细胞培养用载体和细胞培养部。
图7是表示本实施方式的细胞培养容器1的一个实例的截面图的示意图。细胞培养容器1具备细胞培养部11和细胞培养用载体3和4。细胞培养部11具备细胞收纳部2。
细胞收纳部2可以使用现有的培养皿、培养板的槽、芯片实验室(Lab-on-a-chip)等公知的材料。细胞收纳部2的表面可以进行了用于防止细胞的粘接、脱离、蛋白质的非特异吸附等的涂布。
在对本实施方式的细胞培养容器1进行说明的同时，对使用了本实施方式的细胞培养容器1的细胞培养方法进行说明。
在图7(a)所示的细胞培养容器1中，细胞培养用载体3担载细胞诱导因子9作为活性物质，细胞培养用载体4担载生长因子10作为活性物质。
接下来，如图7(b)所示，使用移液管6将悬浮液6a导入细胞收纳部2。然后，如图7(c)所示，用盖7覆盖细胞培养部11，对细胞进行培养。然后，如图7(d)所示，细胞粘接于细胞收纳部2，形成细胞群8。
细胞培养用载体3包含金纳米棒作为接收外部信号的物质，所述金纳米棒在780nm附近的波长具有吸收峰。细胞培养用载体4包含金纳米棒作为接收外部信号的物质，所述金纳米棒在900nm附近的波长具有吸收峰。
如图7(e)所示，当照射780nm的近红外光作为A外部信号时，细胞诱导因子9从细胞培养用载体3扩散。此外，当停止近红外光A的照射时，细胞诱导因子9的扩散停止。
如图7(f)所示，通过细胞诱导因子9的扩散，而使细胞群8向细胞培养用载体3的方向移动。
如图7(g)所示，当照射900nm的近红外光B作为外部信号时，生长因子10从细胞培养用载体4扩散。此外，当停止近红外光B的照射时，生长因子10的扩散停止。
通过生长因子10的扩散，而使细胞增殖。
·细胞
作为培养对象的细胞，可以是间充质干细胞、ES细胞、iPS细胞等干细胞、祖细胞、肝等分化细胞、源自肿瘤等的细胞系等中的任一种，可以是哺乳动物细胞以外的细胞。也可以是细菌、酵母、真菌。
<<细胞培养容器的其它的实施方式>>
图8是表示细胞培养容器的一个实施方式的图。就细胞培养容器60而言，在盖7的容器内侧具备细胞培养用刺激响应性基材61和包含活性物质的多孔质基材62。多孔质基材62以与盖7接触的方式进行配置。细胞培养用刺激响应性基材61以与细胞培养部11内的细胞悬浮液6a接触的方式进行配置。
多孔质基材62中包含的活性物质可以在多孔质基材62内具有浓度梯度。可以通过从细胞培养容器60的盖7侧输入外部信号，而供给活性物质。
图9是表示细胞培养容器的一个实施方式的图。在细胞培养容器71的细胞培养部11中设置有多个珠状的细胞培养用载体70。可以通过分别将不同的活性物质担载在细胞培养用载体70中，而供给各种种类的活性物质。
图10是表示细胞培养容器的一个实施方式的图。当将细胞培养用载体80设置在细胞培养部11时，可以将细胞培养用载体80载置于细胞群8的上部。
图11是表示细胞培养容器的一个实施方式的图。细胞群可以是存在于细胞培养部11内的立体细胞群8a。细胞培养用载体110可以不与立体细胞群8a接触。如图12所示，多个细胞培养用载体110也可以与立体细胞群8a接触。
图13是表示细胞培养容器的一个实施方式的图。细胞培养容器133具备：细胞培养部11、细胞培养用载体132、半透膜131、培养基130和细胞悬浮液6a。培养基130在半透膜131上进行回流。如果采用本实施方式，则可以使营养素、代谢物这样的小分子通过半透膜而进行交换。由此，能够将细胞培养部11内的环境保持在适合生存的状态。此外，由于培养基130在半透膜131上进行回流，因此，不需要更换培养基130。不能透过半透膜131的高分子材料可以通过担载在细胞培养用载体132中而进行供给。
图14是表示细胞培养容器的一个实施方式的图。细胞收纳部14的底部为凹型形状。可以利用细胞收纳部14的凹型形状形成立体细胞群8a，同时，可以连续地进行来自细胞培养用载体140的刺激。
图15是表示细胞培养容器的一个实施方式的图。将间隔物层152设置在存在于细胞培养部11内的立体细胞群8a与细胞培养用载体150之间。由此，细胞不易受输入外部信号时的加热的影响。
如果采用本实施方式的细胞培养容器，则由于培养空间以外的部分较少，因此，可以确保培养空间大，可以培养大量细胞。此外，由于没有复杂的结构，因此，能够以低成本进行制造。除此之外，通过对外部信号的输入进行调整，而能够精细地对活性物质的添加量、添加时机、种类等进行控制。
本实施方式的细胞培养容器适合通过长期进行复杂方案的培养、需要高效大量生产的再生医疗制品的细胞制造。
例如，在从iPS细胞向肝细胞的分化中，需要进行30日以上的长期培养，同时按日改变约3～5种细胞因子的种类。此外，当假定用于肝衰竭的移植治疗的情况下，需要的细胞数经计算为约109～1010个，期望高密度且高效的细胞生产。就本实施方式的细胞培养容器而言，配线、流路不是必需的构成，可以通过简单的机构应对需要各种活性物质的复杂方案，可以进行大量培养。
实施例
接下来，通过实施例对本发明进一步详细地进行说明。
<<实施例1>>
实施例1中使用的各材料如下。
·多孔质基材
作为多孔质基材，使用表面存在羧基的4％琼脂糖凝胶粒子(CarboxyLink；ThermoFisher Scientific)。
·刺激响应性聚合物
刺激响应性聚合物，使用聚(烯丙基胺-共-烯丙基脲)凝胶。就该凝胶而言，参考DDS载体作成方案集(CMC出版)的182-184页，对于分子量15000的聚(烯丙基胺)(NITTOBOMEDICAL)，通过将脲基导入93％的烯丙基胺的伯胺而制备。由于脲基也包含氨基，因此，通过戊二醛仅使一部分的分子内·分子间的氨基彼此交联，而能够进行凝胶化。
该凝胶富含氨基。因此，这些氢键的对象可以根据温度而在聚(烯丙基胺-共-烯丙基脲)分子中的氨基和溶剂中的水分子之间切换，发生凝聚和溶胀的相变。
该凝胶的相变温度在NaCl浓度150mM、pH7.5的生理条件下为44℃。通过使温度为相变温度以上的温度而发生溶胀、物质的透过性增加、对水的溶解性增加。
·外部信号接收材料
作为外部信号接收材料，使用在波长808nm处具有吸收峰，表面被氨基进行了修饰的直径10nm的金纳米棒(Sigma-Aldrich)。
·外部信号
作为外部信号源，使用高输出光纤输出LD光源808nm(AS ONE)。
·细胞收纳部
作为细胞收纳部，使用经过TC处理的96孔板(Corning)。
·活性物质和培养细胞
作为活性物质，使用作为血管内皮细胞生长因子的VEGF-A。
作为培养细胞，使用人脐静脉内皮细胞HUVEC。HUVEC用于血液凝固、血管形成等生理学和药理学试验。作为培养基，使用不添加VEGF的EBMTM内皮细胞基本培养基(LONZA)。
·细胞培养用载体的制造
通过EDC和sulfo-NHS使多孔质基材的琼脂糖凝胶粒子表面的羧基活性化。活性化的反应在pH6.0的MES缓冲液中于室温下进行。由此，可以通过共价键将包含氨基的物质固定在琼脂糖凝胶粒子上。
用MES缓冲液对得到的琼脂糖凝胶粒子进行清洗后，使氨基修饰金纳米棒在pH7.2的磷酸缓冲生理盐水中进行反应。
接着，使合成的聚(烯丙基胺-共-烯丙基脲)凝胶进行反应，通过凝胶中的一部分的氨基，使金纳米棒和聚(烯丙基胺-共-烯丙基脲)凝胶在琼脂糖凝胶粒子表面固定化。通过清洗除去未反应的金纳米棒、凝胶。由此，形成细胞培养用刺激响应性基材和多孔质基材的复合体1。
将得到的复合体1浸渍在添加了10mM的NaCl的pH7.5、10mM的HEPES缓冲液中。
在该条件下，相变温度降低，刺激响应性聚合物在室温下发生溶胀，可掺入活性物质。
除去上清液并且保留粒子，作为活性物质而添加溶解有VEGF的HEPES缓冲液。VEGF通过扩散而透过溶胀状态的刺激响应性聚合物，掺入多孔质基材内。由此，制造细胞培养用载体。
接下来，向培养基转移细胞培养用载体。由此，由于NaCl浓度上升，相变温度变成40℃以上，因此，可以使VEGF保持在多孔质基材内。掺入了VEGF的粒子以4℃进行保存直至使用。
·细胞培养
将悬浮于培养基中的HUVEC播种在培养板中，在孵化器内，通过在5％CO2、37℃下进行培养而使细胞粘接。
更换新鲜的培养基后，导入细胞培养用载体。通过照射近红外光，而对刺激响应性聚合物进行局部加热，发生溶胀，使其对水的溶解性增大。
随之，内含的VEGF通过扩散而被释放至培养基时，HUVEC加速增殖。在VEGF扩散量达到必要量后，为了防止VEGF通过作用于细胞代谢而影响实验结果，可以停止照射近红外光而停止VEGF的释放。
符号说明
20,30,40,50,70,80,92,100,110,132,140…细胞培养用载体
21,33,51,61,90,103…细胞培养用刺激响应性基材
22,32,52,62,91,101…活性物质
31…活性物质不透过层
34,62,101…多孔质基材
62…包含活性物质的多孔质基材
11…细胞培养部
1,60,71,133…细胞培养容器
2,14…细胞收纳部
3,5…细胞培养用载体
6…移液管
6a…悬浮液
7…盖
8…细胞群
8a…立体细胞群
9…细胞诱导因子
10…生长因子
131…半透膜
130…培养基

Claims (20)

1.一种细胞培养用载体，其中，
在具有刺激响应性聚合物和接收外部信号的外部信号接收材料的细胞培养用刺激响应性基材中担载有活性物质，
所述细胞培养用载体通过控制所述外部信号向所述刺激响应性基材的输入来可逆地控制第一状态和第二状态，
所述第一状态是：所述刺激响应性聚合物凝聚，所述活性物质的扩散停止的状态；
所述第二状态是：所述刺激响应性聚合物发生溶胀，所述活性物质能够扩散的状态。
2.根据权利要求1所述的细胞培养用载体，其中，
所述活性物质被内含在多孔质基材中，
在所述细胞培养用刺激响应性基材中担载有所述多孔质基材和所述活性物质。
3.根据权利要求1或2所述的细胞培养用载体，其中，
所述刺激响应性聚合物为温度响应性聚合物。
4.根据权利要求1或2所述的细胞培养用载体，其中，
所述外部信号接收材料为有机化合物、金属结构体或碳材料。
5.根据权利要求4所述的细胞培养用载体，其中，
所述金属结构体为金纳米棒。
6.根据权利要求1或2所述的细胞培养用载体，其中，
所述活性物质为酶、细胞因子、分化诱导因子、抗体等蛋白质、激素等肽、抗生素、氨基酸、葡萄糖、视黄酸等低分子化合物、DNA等核酸、纳米粒子或脂质体。
7.根据权利要求1或2所述的细胞培养用载体，其中，
所述外部信号接收材料所接收的外部信号为近红外光。
8.根据权利要求2所述的细胞培养用载体，其中，
包含所述活性物质的所述多孔质基材的一部分被所述细胞培养用刺激响应性基材包覆，所述部分以外的部分被活性物质不透过层包覆。
9.根据权利要求1所述的细胞培养用载体，其中，
所述外部信号接收材料以形成浓度分布的方式混合于所述细胞培养用刺激响应性基材中。
10.根据权利要求1所述的细胞培养用载体，其具备：
用于注入所述活性物质的注入口；和
由活性物质不透过性材料形成并且密封所述注入口的密封部。
11.一种细胞培养容器，其具备：
细胞培养用载体，其在具有刺激响应性聚合物和接收外部信号的外部信号接收材料的细胞培养用刺激响应性基材中担载有活性物质；和
细胞培养部，
所述细胞培养用载体通过控制所述外部信号向所述刺激响应性基材的输入来可逆地控制第一状态和第二状态，
所述第一状态是：所述刺激响应性聚合物凝聚，所述活性物质的扩散停止的状态；
所述第二状态是：所述刺激响应性聚合物发生溶胀，所述活性物质能够扩散的状态。
12.根据权利要求11所述的细胞培养容器，其中，
所述活性物质被内含在多孔质基材中，
在所述细胞培养用刺激响应性基材中担载有所述多孔质基材和所述活性物质。
13.根据权利要求11或12所述的细胞培养容器，其中，
所述刺激响应性聚合物为温度响应性聚合物。
14.根据权利要求11或12所述的细胞培养容器，其中，
所述外部信号接收材料为有机化合物、金属结构体或碳材料。
15.根据权利要求14所述的细胞培养容器，其中，
所述金属结构体为金纳米棒。
16.根据权利要求11或12所述的细胞培养容器，其中，
所述活性物质为酶、细胞因子、分化诱导因子、抗体等蛋白质、激素等肽、抗生素、氨基酸、葡萄糖、视黄酸等低分子化合物、DNA等核酸、纳米粒子或脂质体。
17.根据权利要求11或12所述的细胞培养容器，其中，
所述外部信号接收材料所接收的外部信号为近红外光。
18.根据权利要求12所述的细胞培养容器，其中，
包含所述活性物质的所述多孔质基材的一部分被所述细胞培养用刺激响应性基材包覆，所述部分以外的部分被活性物质不透过层包覆。
19.根据权利要求11所述的细胞培养容器，其中，
所述外部信号接收材料以形成浓度分布的方式混合于所述细胞培养用刺激响应性基材中。
20.根据权利要求11所述的细胞培养容器，其具备：
用于注入所述活性物质的注入口；和
由活性物质不透过性材料形成并且密封所述注入口的密封部。
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