JP6254096B2 - 多光子イメージングシステム用多色励起モジュール並びにそれに関連する方法及びシステム - Google Patents

Description

本発明は、多光子イメージングシステム用多色励起モジュールに関する。多光子又は非線形イメージング、特に多光子又は非線形の顕微鏡観察において、同様に参照される。

本発明の分野は、特に多色励起及び多光子蛍光イメージング、すなわち、パルス励起レーザビームからの光の吸収に応答して、試料中に存在する色素体によって放出される「蛍光」戻り信号として知られている戻り信号の観測である。

一般的に、多光子イメージングは、二光子又は三光子の励起を使用する。 これは、生物組織の深さ方向の非破壊観察に特に有用である。
色素体は、試料中に元から存在するものでもよい。色素体が注入されることにより準備が行われてもよい。より正確には、フルオロフォア、すなわち、励起後に蛍光を発することができる化学物質にも参照される。

戻り信号は、分子の励起（ここでは少なくとも二つの光子の吸収による）の結果としての発光に対応するので、「蛍光」信号と呼ばれる。
本発明の分野は、非限定的ではあるが、特に、二光子顕微鏡観察に関する。
本発明は、上述のモジュールに実装されている方法と同様にして、異なるいくつかの色素体を励起させることができる励起モジュールを有する多色多光子イメージングシステムにも関する。

少なくとも３つの別個の色素体を励起させることができる多光子イメージングシステムに用いるための種々の多色多光子励起モジュールが、従来技術として知られている。

第１の解決手段は、色素体を励起するために少なくとも1つのチューナブルレーザ光源を使用することからなる。チューナブルレーザ光源の発光波長のスキャンにより、少なくとも三つの異なる色素体を連続して励起することができる。少なくとも三つの画像が連続して得られ、それぞれの画像が一つの色素体に対応し、そして、これらの画像を重ね合わせることができる。

上述のレーザ光源の発光波長の変化は、多光子イメージングシステムで一般的に使用される狭スペクトルフェムト秒パルスレーザ光源においては、良くても数秒かかる。
それゆえ、この第１の解決手段の欠点は、前述の少なくとも３つの色素体のそれぞれに対応する戻り信号を同時に生成することができないということである。
この欠点は、秒単位のスケールでの素早い動きが起こる生物試料のイメージングを特に制限している。そして、画像の重ね合わせは、困難であり、又は実行することが不可能とさえいえる。

第２の解決手段は、非常に近い励起周波数を有する少なくとも３つの別個の色素体を同時に励起するために、一つのレーザ光源を使用することからなる。

この第２の解決手段の欠点は、励起周波数の範囲が制限されることであり、効率的に励起することができる色素体の範囲を狭めてしまうことになる。スペクトル的に近いセットの色素体のみ（例えば、２つの励起ピークの間隔が約１０ｎｍなど）を同時に撮像することができる。この第２の解決手段の他の欠点は、異なる色素体の励起効率を独立して制御することができないことである。

第３の解決手段は、同時に励起される色素体ごとに一つのレーザ光源を使用することからなる。
この第３の解決手段の欠点は、少なくとも３つのパルスレーザ光源が必要になるので、もちろん法外に高いコストがかかることである。

本発明の目的は、試料の少なくとも３つの色素体を同時に撮像でき、少なくとも一つの従来技術の欠点がない多光子イメージングシステムに用いるための多色多光子励起モジュールを提案することである。

特に、本発明の目的は、試料の少なくとも３つの色素体を効率的に励起し、かつ、同時に撮像する多光子イメージングシステムに用いるためのモジュールを提案することである。

本発明のもう一つの目的は、試料の少なくとも３つの色素体を効率的に励起する多光子イメージングシステムに用いるためのシンプルかつ安価なモジュールを提案することである。

本発明のもう一つの目的は、試料の少なくとも３つの色素体を効率的に励起し、前述の３つの色素体は互いに離れた励起波長、例えば、少なくとも５０ｎｍ離れた励起波長を有する多光子イメージングシステムに用いるためのモジュールを提案することである。

最後に、本発明の目的は、上述のモジュールにより実行される方法だけでなく、そのモジュールも有する多光子イメージングシステムを提案することである。

これらの目的は、試料の少なくとも３つの色素体を同時に励起するための多光子イメージングシステム用のモジュールにより達成され、そのモジュールは、
繰り返し率１／Ｔと、多光子吸収により第１の色素体を励起することができる（中心）波長λ_１と、を有するパルス形状の第１励起ビームを放出し、前記吸収された光子は前記第１励起ビームから発生する、第１フェムト秒レーザ光源と、
多光子吸収により第２の色素体を励起することができる（中心）波長λ_２を有する第２励起ビームを放出し、前記吸収された光子は前記第２励起ビームから発生する、第２フェムト秒レーザ光源と、を備える。

第１励起ビームは、励起部として知られ、前記試料を励起するために働く部分と、ポンピング部と知られる部分と、を有し、前記ポンピング部は、前記第２フェムト秒レーザ光源が前記第１フェムト秒レーザ光源と同期するように、すなわち、同じ繰り返し率１／Ｔになるように、第２フェムト秒レーザ光源を同期して励起するためのポンプビームとして働く。

本発明のモジュールはまた、少なくとも多光子吸収により第３の色素体を励起するように、第１励起ビームの励起部及び第２励起ビームを空間的及び時間的に重ね合わせるように配置され、前記吸収された光子は前記第１及び第２励起ビームから発生する、光遅延線を有する。

簡潔のために、第１励起ビームから発生する（複数の）光子の吸収は、第１励起ビームの励起部から発生する（複数の）光子の吸収よりも、簡単に参照される。
第１励起ビームの一部による第２レーザ光源の励起の励起が、２つの励起ビームのパルス列が同じ比率を持つことを確保するので、「同期」励起について参照される。
第２フェムト秒レーザ光源は、このように、第１フェムト秒レーザ光源と同期して形成される。

このように、第１及び第２励起ビームを空間的及び時間的に重ね合わせることができる。それらは、実際には、時間ラグ（time lag）を別にして、もともと類似している。この時間ラグは、遅延線により補償される。
空間的及び時間的な重なりについて言うとき、これは、好ましくは、試料中の空間的及び時間的な重なりを意味する。

好ましくは、光学的遅延線（以降、単純に「遅延線」と称される）は、第２励起ビームと、第２レーザ光源のためのポンプビームとして用いられていない第１励起ビームの残存部と、を空間的及び時間的に重ね合わせる。

代わりに、遅延線は、特に、第１励起ビームの励起部が、遅延線の出力において第２励起ビームの励起部と重なるように進む光路を、調整するために配置されていてもよい。
遅延線は、第２励起ビームと第１励起ビームの励起部との間の時間ラグを制御するために、横移動部に搭載されたミラーを有することができる。

遅延線の出力において、第１及び第２励起ビームは空間的及び時間的に重なるので、
第１励起ビームだけ、
第２励起ビームだけ、又は、
同時での第１及び第２励起ビーム
から発生する光子の同時吸収を実行する励起により、少なくとも３つの色素体を同時に励起することができる。

続けて、「蛍光」戻り信号として知られる戻り信号に対応する画像を同時に撮像することも可能である。
少なくとも３つの色素体の同時イメージングのために、２つのレーザ光源だけが必要となるので、本発明に係るモジュールは安価である。追加された遅延線は、ありふれた市販されている光学素子なので、本当の追加コストには含まれない。

少なくとも３つのそれぞれの色素体は、
第１励起ビームだけ、
第２励起ビームだけ、又は、
同時での第１及び第２励起ビーム
から発生するいくつかの光子の多光子吸収により励起されることができる。
第１及び第２レーザ光源の選択に応じて、様々な吸収波長（例えば、２つの励起波長の間隔が５０ｎｍ）を有する色素体を励起することができる。例えば、放射が青色から赤色へと変わるいくつかの蛍光タンパク質でマークされた組織を、迅速かつ効率的に撮像することができる。

フェムト秒（ｆｓ）光源は、一般的に数百ｆｓのオーダーの継続時間を有する超短パルスを生成する（１ｆｓ＝１０^−１５秒である）。
色素体の同時励起はまた、それらの同時検出を可能にする。このように、素早く動き、秒スケールで存在する試料に属する少なくとも３つの色素体を、それぞれの色素体のために得られた画像又は信号の比較の間これらの動きに影響されることなく、撮像することを可能にする。

特に有利な実施形態によれば、第１励起ビームを励起部及びポンピング部に分離するために、第２フェムト秒レーザ光源の上流に分離手段が配置される。
「上流」及び「下流」という用語は、第１励起ビームの伝播の方向を示している。
分離手段は、一方は第１励起ビームのポンピング部に、他方は第１励起ビームの励起部に、分離するためのダイクロイックミラーを有する。
「分離」という用語は、一方のポンピング部及び他方の励起部の伝播方向を前提として用いられるものではない。

遅延線は、特に、遅延した励起ビームを遅延のない励起ビームと同じ光路に戻すために、第２フェムト秒レーザ光源の下流に配置されるダイクロイックミラーのような結合素子を有する。
遅延線は、第２フェムト秒レーザ光源の外側に配置されることが好ましい。

少なくとも部分的に統合されている第１励起ビームの励起部及びポンピング部についての考察がなされることができる。第１励起ビームは第２フェムト秒レーザ光源を通過し、その後ポンプビームとして振る舞う。出力時には、少なくとも部分的に励起ビームとして再利用される。この場合、上述の分離手段なしに行うことができる。
遅延線は、第２フェムト秒レーザ光源の内側に設けることもできる。

代わりに、遅延線は、第２フェムト秒レーザ光源の下流に配置されてもよい。この場合、第２レーザ光源からの出力において第１励起ビーム及び第２励起ビームを分離するための手段が設けられなければならない。２つの励起ビームの一方が遅延線に導かれる。次に、２つの励起ビームは再結合される。

第１フェムト秒レーザ光源は、例えば、チタンサファイア（ＴｉＳ）レーザ又はファイバーレーザのような発振器により形成されているのが好ましい。
このタイプのフェムト秒レーザは、多くの場合８００ｎｍ付近を中心とする、近赤外領域におけるブロードな放射スペクトルを有する。

第２フェムト秒レーザ光源（３）は、光パラメトリック発振器（ＯＰＯ：Optical Parametric Oscillator）により形成されていてもよい。光パラメトリック発振器は、第１フェムト秒レーザ光源により放出された第１励起ビームの一部によってここで形成されたポンプ信号からの非線形相互作用を行う光源である。ＯＰＯの利点は、他のタイプのレーザ光源では達成するのが難しい波長（１０００ｎｍ以上の波長）へのアクセスを供給することである。ＯＰＯは第１フェムト秒励起ビームによりポンプされるので、同様にして、第２励起ビームをまたフェムト秒で放出する。

本発明に係るモジュールは、「蛍光」戻り信号として知られ、互いに少なくとも５０ｎｍの間隔が空いている戻り信号を発する色素体を励起するのに適しており、それぞれの戻り信号が波長単位で表されることが好ましい。
それぞれの戻り信号は、上述した少なくとも５０ｎｍの間隔の測定を考慮された波長に中心が位置するピークを有する。

本発明に係るモジュールは、試料中において、第２励起ビームと第１励起ビームの励起部との空間的な重なりを実現するために配置された少なくとも一つのテレスコープをさらに有する。

少なくとも１つのテレスコープが、第１励起ビームの励起部及び第２励起ビームの光路上に配置されていることが好ましい。
例えば、テレスコープは遅延線の一部を形成することができる。
有利に、テレスコープは、第２励起ビームだけの光路上に、及び、第１励起ビームの励起部だけの光路上に、配置されうる。

第２及び第１励起ビームは、異なる波長を有する。特定の測定が行われず、これらの波長が互いに非常に離れているとき（例えば、３００ｎｍ以上）、これらは試料中における異なる深さにそれぞれ合焦される。そうすると、試料中における２つの励起ビームの空間的な重なりは実行されないだろう。それゆえ、第１励起信号の少なくとも１つの光子及び第２励起信号の少なくとも１つの光子に対応する吸収に対応する戻り信号を得ることは可能でないだろう。

少なくとも１つのテレスコープは、特に、第１励起ビームの励起部及び第２励起ビームの相対サイズ及び発散を、独立して制御することができる。このようにして、試料の深さ方向の軸における第１励起ビームの励起部及び第２励起ビームにおけるオフセットを修正することができる。

本発明に係るモジュールの有利な実施形態によると、
第１フェムト秒レーザ光源は、二光子吸収により第１の色素体を励起することができる（中心）波長λ_１の第１励起ビームを発し、吸収された光子は第１励起ビームから発生するものであり、
第２フェムト秒レーザ光源は、二光子吸収により第２の色素体を励起することができる（中心）波長λ_２の第２励起ビームを発し、吸収された光子は第２励起ビームから発生するものであり、
光遅延線は、二光子吸収により第３の色素体を励起するように、第１励起ビームの励起部及び第２励起ビームを空間的及び時間的に重ね合わせるように配置され、２つの光子のうち一方は第１励起ビームから、他方は第２励起ビームから発生する。

特に多光子顕微鏡観察の分野において一般的に用いられる二光子吸収現象は、このように実行される（「２ＰＥＦ」すなわち「２光子励起蛍光」について参照される）。
この実施形態は制限的ではなく、例えば、３光子吸収現象の実行を予測することもできる（「３ＰＥＦ」すなわち「３光子励起蛍光」について参照される）。

本発明は、本発明に係るモジュールを有する多光子イメージングシステムに関し、少なくとも３つのチャネルを有し、各チャネルは対応する多光子吸収に関連するそれぞれの戻り信号を検出するように配置されている、検出手段をさらに備える。

チャネル数は、検出される色素体の数に依存する（「色素体の数」という表現は、色素体のタイプの数を意味する）。検出できる色素体の数は、多光子吸収により実行される光子の数に依存する（それぞれの色素体は別々の波長により励起されると考えられる）。二光子吸収に関しては、３つの組み合わせ（光子Ａ−Ａ、光子Ｂ−Ｂ、光子Ａ−Ｂ）が可能であり、そして、それゆえ本発明に係るシステムは３つのチャネルを有する。三光子吸収に関しては、４つの組み合わせ（光子Ａ−Ａ−Ａ、光子Ａ−Ａ−Ｂ、光子Ａ−Ｂ−Ｂ、光子Ｂ−Ｂ−Ｂ）が可能であり、そして、それゆえ本発明に係るシステムは４つのチャネルを有する。

異なる戻り信号の検出は同時なので、１つのチャネルのスペクトル幅がスペクトル的に隣接する戻り信号の一部を検出するような場合には、それぞれのチャネルにより受信された信号は、専用の戻り信号及びスペクトル的に隣接するチャネル専用の戻り信号に対応する疑似（spurious）戻り信号をそれぞれのチャネルに分離するように、処理される。

本発明に係る多光子イメージングシステムのよりよい実施形態によれば、
第１の二光子吸収に対応し、２つの吸収された光子は第１励起ビームから発生する、第１チャネルと、
第２の二光子吸収に対応し、２つの吸収された光子は第２励起ビームから発生する、第２チャネルと、
第３の二光子吸収に対応し、２つの吸収された光子の一方は第１励起ビームから発生し、他方は第２励起ビームから発生する、第３チャネルと、
からなる３つのチャネルを有する特定の検出手段を備える。

本発明に係る多光子イメージングシステムは、
内視鏡；
顕微鏡；
コンフォーカル顕微鏡；
マルチポイント光顕微鏡；
光シート顕微鏡；
肉眼イメージングシステム；
のいずれかに組み込まれていることが好ましい。

このように、本発明は特定の１つのアプリケーションに限定されるものではなく、様々な多光子イメージングシステムに適用することができる。

本発明は、本発明に係るモジュールに実装された方法に関する。この方法によれば、多光子吸収による少なくとも第３の色素体の励起と対応する戻り信号の出現を検出しながら、遅延線の設定は、第１励起ビームの励起部及び第２励起ビームと空間的及び時間的に重なるように調整され、吸収された光子は第１及び第２励起ビームから発生する。

実際には、上述した少なくとも第３の色素体の励起が、第１励起ビームから発生する少なくとも１つの光子及び第１励起ビームの励起部から発生する少なくとも１つの光子の上述の色素体による同時吸収を担う。この目的を達成するために、それゆえ、第１励起ビームの励起部及び第２励起ビームが空間的及び時間的に重なることが必要である。遅延線の設定は、それゆえ、特に実行が単純である。

本発明に係る方法のよりよい実施形態によれば、
二光子吸収を実行し、かつ、
２つの吸収された光子が第１励起ビームから発生する二光子吸収、
２つの吸収された光子が第２励起ビームから発生する二光子吸収、及び、
２つの吸収された光子の一方が第１励起ビームから発生し、他方が第２励起ビームから発生する二光子吸収、
にそれぞれ対応する３つの戻り信号を検出する。

このよりよい実施形態において、遅延線の設定を調整することにより、２つの吸収された光子の一方が第１励起ビームから発生し、他方が第２励起ビームから発生する、二光子吸収に対応する戻り信号の相対強度により調整が行うことが可能である。

実際には、第１励起ビームの励起部及び第２励起ビームが、完全に又は別の方法で空間的及び時間的に重なるかどうかによって、２つの励起ビームのそれぞれからの光子の同時吸収は多かれ少なかれ高くなる。それゆえ、第１励起信号からの２つの光子又は第２励起信号からの２つの光子の吸収にそれぞれ対応する、２つの他の戻り信号の強度を修正することなく、上述の戻り信号の強度を調整することができる。

特に、この同じくより好ましい実施形態において、
第１フェムト秒レーザ光源の出力強度、
第２フェムト秒レーザ光源の出力強度、及び
遅延線の設定、をそれぞれ調整することにより、３つの戻り信号の相対強度を、独立して調整することが可能である。

本発明に係る方法は、少なくとも互いに５０ｎｍの間隔を空けている「蛍光」戻り信号として知られる戻り信号を発し、それぞれの戻り信号は波長単位で表される色素体を励起することを実行することができる。

本発明の他の利点及び特性は、実施形態に決して限定されるものではなく、詳細な説明の試験及び添付された図により明らかになる。

本発明に係るモジュール及びシステムの実施形態を示す図である。 遅延線が生じることなく空間的及び時間的な重ね合わせを行う第１及び第２励起ビームを示す図である。 本発明に係るモジュール及びシステムの実施形態において行われる多光子吸収を示す図である。 本発明に係るモジュール及びシステムの実施形態において行われる多光子吸収を示す図である。 本発明に係るモジュール及びシステムの実施形態において行われる多光子吸収を示す図である。 本発明に係るモジュール及びシステムの実施形態において行われる多光子吸収を示す図である。 異なる蛍光タンパク質の励起スペクトルを示す図である。 本発明のモジュール及びシステムにより得られた異なる取得画像を示す図である。 本発明のモジュール及びシステムにより得られた異なる取得画像を示す図である。 異なる蛍光タンパク質の励起スペクトル及び関連する検出チャネルの検出スペクトル幅を示す図である。 第１及び第２励起ビームの間の時間遅延を変えることにより、本発明のモジュール及びシステムにより得られた戻り信号を示す図である。 第１及び第２励起ビームの間の最適な空間的重なりのための試験を示す図である。 第１及び第２励起ビームの間の最適な空間的重なりのための試験を示す図である。 第１及び第２励起ビームの間の最適な空間的重なりのための試験を示す図である。 第１及び第２励起ビームの間の最適な空間的重なりのための試験を示す図である。

まず、図１を参照しながら、多光子イメージングシステム１００用のモジュール１の第１実施形態の説明をする。

後述する通り、二光子吸収により一の試料の３つの色素体を同時にイメージングするために、本発明に係るモジュール１の実施例が開発されるであろう。しかしながら、この実施例には決して限定されず、かつ、本発明に係るモジュール及びイメージングシステムについて、試料中の少なくとも４つの色素体を同時にイメージングする目的で、少なくとも三光子吸収との関連で実現されると考えられる。
色素体に言及するとき、与えられた物質（及び個別ではない分子）は示されている。

本発明に係るモジュール１は、８２０ｎｍに等しい波長λ_１の第１励起ビーム２０を放出するチタン−サファイア発振器２（Ｔｉ：Ｓ）を有する。チタン−サファイア発振器２は、フェムト秒レーザであり、すなわち、約１０又は約１００フェムト秒のオーダーのパルス幅を有するパルス信号を発する。この発振器の発振波長λ_１は特に、多光子吸収により研究されている試料の少なくとも一つの色素体を励起することができるように選択される。チタン−サファイア発振器２（Ｔｉ：Ｓ）は、励起ダイオードにより励起されなければならない。本発明に係るモジュール１は、一つだけシングル励起ダイオードを有する。

第１励起ビーム２０は、光パラメトリック発振器（ＯＰＯ：optical parametric oscillator）３へと送られ、ポンプビームとして働く。ＯＰＯの上流の第１励起ビーム２０の光路上に４５°（１８０°がπラジアンと等しくなる度数法で表された角度）の傾きで配置されたダイクロイックミラー４１は、一方は、第１励起ビームの「ポンピング」部として知られている部分と、他方は、第１励起ビームの「励起」部として知られている部分と、に分離する。

その次に、光パラメトリック発振器（ＯＰＯ）３は、１１８０ｎｍに等しい波長λ_２の第２励起ビーム３０を放出する。この発振器の発振波長λ_２は特に、多光子吸収により研究されている試料の少なくとも一つの色素体を励起することができるように選択される。

これらの発振器の２つの発振波長λ_１及びλ_２は、特に、これら２つの波長を混合する多光子吸収により、研究されている試料の少なくとも一つの色素体を励起することができるように選択される。

第１励起ビーム２０の光路上に４５°傾いて配置されたダイクロイックミラー４１は、第１励起ビームの励起部を、本発明に係るモジュール１の遅延線４に向かわせる。

遅延線４は、第１励起ビーム２０の励起部のために追加の光路を規定する少なくとも二つの反射鏡４２を有する。

遅延線はまた、第２励起ビーム３０と第１励起ビーム２０の励起部とを同一の光路に戻すために配置された第２ダイクロイックミラー４３を有する。第２ダイクロイックミラー４３は、第１励起ビームの励起部及び第２励起ビームの光路上に４５°傾いて配置されている。第２励起ビームは、屈折されることなく第２ダイクロイックミラー４３を透過する。第１励起ビームの励起部は、第２ダイクロイックミラー４３により９０°屈折される。

以降の図の説明では、簡潔のために、遅延線４に向かわされた第１励起ビーム２０の励起部は単に「第１励起ビーム２０」と呼ばれる。

図１では、図のわかりやすさのために、第２励起ビーム３０と第１励起ビーム２０とは重ね合わされていない。実際は、これらの２本のビームは全く明らかに空間的に重ね合わされている。
第１励起ビームの励起部のサイズ及び発散を第２励起ビームとは独立して制御することにより、パルスの空間的な重なりを確保するために遅延線４の中にテレスコープ９０のような光学要素を用意しておくことができる。

図１に表される実施例では、第２ダイクロイックミラー４３の上流における第２励起ビームの光路上にだけ第２のテレスコープ９０’も配置されている。
テレスコープ９０，９０’はそれぞれの励起ビームの発散を独立して調整できて、そして、望ましくはビームのサイズもまた独立して調整できる。
例えば、３枚又は４枚のレンズを有するテレスコープを用いることができる。これらのビーム処理システムは、アクティブ又はアダプティブな光学素子に基づいていると考えることができる。

前述したモジュール１から離れて、本発明に係る多光子イメージングシステム１００の要素について、図１を参照しながら説明を始める。
第２ダイクロイックミラー４３から出射された第１及び第２励起ビーム２０，３０は、平面（ｘＯｙ）においてスキャン手段５に向かい、軸（Ｏｚ）に沿ったスキャン手段６は試料７の深さの軸に一致する。
スキャン手段６はまた、試料７中の臨む位置に励起信号を合わせるフォーカス光学系を有する。

試料７は、８２０ｎｍの２つの光子、１１８０ｎｍの２つの光子、又は８２０ｎｍの１つの光子及び１１８０ｎｍの１つの光子の吸収に対応して蛍光信号を発する、少なくとも３つの色素体を有する。
異なる蛍光信号は反射により放出される。ダイクロイックミラー８０はそれらを、３つの蛍光信号８２，８２'，８２’’のそれぞれに対応する個別のチャネル８１，８１'，８１’’を有する検出ステージへと屈折させる。

このように、別々に設けられた発振器により生成された複数の信号、及びこれら２つの発振器の間の混合周波数により生成された信号を、同時に検出することができる。
このように、２つの同期されたレーザを有する励起チェーン（excitation chain）を用いて、スペクトルの全く異なる３種類の色素体を同時に励起することができる。特に、同期されたパルスによる多色多光子イメージング、又は周波数結合による多色多光子イメージングについて述べる。
特に、青黄赤、又は青緑赤の蛍光タンパク質の３つの信号を同時に撮像することができる。

図２は、本発明について実行される原理を明らかにする。図２は、遅延線４を除き、時間の関数としての複数のパルス列を示し、第１励起ビーム２０（実線）及び第２励起ビーム３０（点線）が示される。遅延線は、特に、２つのパルスの間の時間差Δｔを無効にする。

本発明は、
開発された実施例において、第１励起ビーム２０の２つの光子を吸収し、波長λ_１／２、すなわち４１０ｎｍ（青色）の戻り信号を生成する色素体（図３Ａを参照）と、
開発された実施例において、第２励起ビーム３０の２つの光子を吸収し、波長λ_２／２、すなわち５９０ｎｍ（赤色）の戻り信号を生成する色素体（図３Ｃを参照）と、
開発された実施例において、第１励起ビーム２０の１つの光子及び第２励起ビーム３０の１つの光子を吸収し、波長１／（１／λ_１＋１／λ_２）、すなわち４８４ｎｍ（黄色）の、波長９６８ｎｍの中心励起ビームの二光子吸収に一致する、戻り信号を生成する色素体（図３Ｂを参照）と、
を同時に励起することを可能にする。そして、第３の、仮想的な励起ビームについて述べる。

図３Ｄは、特に、本発明により人工的に再生成される仮想励起信号に用いられる励起信号を示す。Ｘ軸はｎｍ単位の波長を示し、Ｙ軸は任意の単位における強度を示す。

図４は、ｎｍ（ナノメートル）単位で表された波長に対応するＸ軸上に、
異なる蛍光タンパク質の励起スペクトル（Ｙ軸は任意の単位で、吸収されるパワーに対応する）と、
励起信号（Ｙ軸は任意の単位で、光強度に対応する）、特に、本発明により人工的に再生成される仮想励起信号と、
を示す。

本発明に係るモジュール１及び多光子イメージングシステム１００により撮像される、人工的に得られた、又は、そうでなければ本発明に係る励起信号は、他のいくつかの蛍光タンパク質の吸収ピークに一致することがわかる。

曲線４０１は、ｅＣＦＰタンパク質（Enhanced Cyan Fluorescent Protein、すなわち、ブルーシアンの蛍光戻り信号を発するタンパク質）に対応する。
曲線４０２は、ｅＹＦＰタンパク質（Enhanced Yellow Fluorescent Protein、すなわち、イエローシアンの蛍光戻り信号を発するタンパク質）に対応する。
曲線４０３は、ｔｄＴｏｍａｔｏタンパク質（すなわち、鮮やかな赤の蛍光戻り信号を発するタンパク質）に対応する。
曲線４０４は、ｍＣｈｅｒｒｙタンパク質（すなわち、チェリーレッドの蛍光戻り信号を発するタンパク質）に対応する。

例えば、これらの異なるたんぱく質によりマークされたマウスの脳組織を撮像することができる。「ブレインバウ（brainbow）手法」という用語は、このマーク手法を示す。

それぞれの励起波長（特に、「仮想」波長として知られる波長）は、いくつかの異なる種類の色素体を励起することができる。これは、ｍＣｈｅｒｒｙ及びｔｄＴｏｍａｔｏ双方の最大吸収に対応する、１１００ｎｍでの信号から明らかである。

下記の表に示された、本発明に係るモジュール１及び多光子イメージングシステム１００によって同時に撮像された、３つの色素体の異なるグループについて参照されるであろう。
色素体の名称は、丸括弧の中に、いくつかの色素体を用いることができる場合はコンマで区切られて、示されている。

本発明に係る遅延線４をセッティングするための方法について、図５Ａ及び図５Ｂを参照しながら、説明がなされる。
図１には、遅延線４の反射鏡４２が、電動の横移動部の上に設けられており、２つの励起ビーム２０，３０を最もよく重ねるために、上述の遅延線のセッティングを調整できる。

第１励起ビーム２０上において遅延線４により発生する遅延のコントロールは、周波数混合（一方は第１励起ビームから発生し、他方は第２励起ビームから発生する、２つの光子の吸収）により得られた戻り信号の光強度の調整のための手段を提供する。戻り信号は、一の単一の励起ビームだけによって単独で決まる。さらに、周波数混合により得られた第３の戻り信号の存在は、第１及び第２励起信号が、多光子イメージングシステム１００の解像力と等しい正確性を持って、空間的又は時間的に重ね合わさることを確かめる。それゆえ、本発明は、特に実行することが単純な位置合わせテストを提供することがわかる。

２つの励起ビームの平均パワーのコントロールは、さらに、３つの戻り信号の相対強度のコントロールを可能にする。

蛍光戻り信号として知られる戻り信号の強度は、実際には、Ｐ_１ ^２、Ｐ_２ ^２、２Ｐ_１Ｐ_２ｇ（τ）に比例する。
ここで、Ｐ_１は、第１励起ビーム２０の励起部の平均パワー（第１励起ビームの二光子吸収）である。
Ｐ_２は、第２励起ビーム３０の励起部の平均パワー（第２励起ビームの二光子吸収）である。
τは、遅延線の下流（一方は第１励起ビームから発生し、他方は第２励起ビームから発生する、２つの光子の吸収）での、第１及び第２励起ビームのそれぞれの、２つのパルス列の間の遅延である。ｇは、２つの励起ビームの時間の相互相関関数であり、励起ビームがガウシアンの時間プロフィルを有する場合には、ｅｘｐ（−τ^２）に比例する。

この原理は、図５Ａ及び図５Ｂに、それぞれ右から左に、
第１励起ビームの二光子吸収に対応する戻り信号により得られた画像と、
一つは第１励起ビームで、他方は第２励起ビームの二光子吸収に対応する戻り信号により得られた画像と、
第２励起ビームの二光子吸収に対応する戻り信号により得られた画像と、
の順番で示される。

撮像された試料は、青、緑、赤の３つの蛍光マーキングがなされたショウジョウバエである。
図５Ａでは、第１及び第２励起ビームのパルスは遅延線により完璧に同期されている（τ＝０ｆｓ）。
中央の画像は、一つは第１励起ビームで、他方は第２励起ビームの二光子吸収に対応する、非常に弱い戻り信号の存在を示している。

この結果は、一つは第１励起ビームで、他方は第２励起ビームの二光子吸収に対応する戻り信号の相対強度を減衰させることが多い、第１及び第２励起ビームの間の「クロストーク」として知られる干渉効果を相殺するために用いられる。
この原理は、試料の深さ方向のスキャン中にずっと一定に検出されるように（結果として励起ビーム及び戻り信号の減衰係数を変えるように）、３つの戻り信号の絶対強度を維持するために用いられる。

取得データは、０．８×０．８×３μｍ^３の次元のピクセルで得られる。例えば、試料の深さ方向のスキャンによりイメージは３次元で生成され、例えば一のイメージは４５秒ごとに３次元で生成される。

図６は、多チャネル同時検出のさらなる利点を示す。
Ｘ軸は、ｎｍ単位の波長を表す。
Ｙ軸は、任意の単位の戻り信号強度を表す。

曲線６０１，６０２，６０３は、戻り信号のスペクトルを示す。
曲線６０１は、青色蛍光戻り信号を発するエンドタンパク質（endoprotein）に対応する。
曲線６０２は、ＧＦＰタンパク質（Green Fluorescent Protein）、すなわち、緑色蛍光戻り信号を発するタンパク質に対応する。
曲線６０３は、ＲＦＰタンパク質（Red Fluorescent Protein）、すなわち、赤色蛍光戻り信号を発するタンパク質に対応する。

点線で示された区間６１１，６１２，６１３は、それぞれ、
青色戻り信号のみを検出する検出チャネルにより検出されたスペクトル幅と、
緑色戻り信号のみを検出する検出チャネルにより検出されたスペクトル幅と、
赤色戻り信号のみを検出する検出チャネルにより検出されたスペクトル幅と、
を示す。

放出は同時に起こるので、検出もまた同時に行われる。それゆえ、それぞれのチャネル（その中でも特に、区間６１２に対応するチャネル）は、異なる戻り信号の寄与を分離することができる。

チャネルＣ１及びＣ２での２つの色素体Ａ及びＢの寄与を分離するために、下記の線型方程式が解かれる。

ここで、
ＲＡ１，ＲＡ２はそれぞれ、チャネルＣ１，Ｃ２それぞれの色素体Ａの正規化された寄与（既知）であり、
ＲＢ１，ＲＢ２はそれぞれ、チャネルＣ１，Ｃ２それぞれの色素体Ｂの正規化された寄与（既知）であり、
Ｃ１及びＣ２は、測定された強度であり、
Ａ及びＢは、決定されるべき強度である。

図７は、図４の戻り信号４０４，４０１，４０２を示す。Ｘ軸は、遅延線の出力における、第２励起ビームと第１励起ビームの励起部との間の、フェムト秒での遅延τを示す。
Ｙ軸は、任意の単位での強度を示す。
上述したように、さらなる戻り信号（第１及び第２励起ビームから同時に発生した多光子吸収に対応する）の出現は、第１及び第２励起ビームの間の時間的重なりの最適な調整を指し示す、という事実を示す。

図８Ａから図８Ｄは、遅延線の下流における、第２励起ビームと第１励起ビームの励起部との間の最適な空間的重なりのためのテストを、特に示している。

二光子吸収の特定の例は、
同じ励起ビームの二光子吸収に対応する赤色戻り信号、
同じ励起ビームの二光子吸収に対応する青色戻り信号、及び、
もし、必要であれば、第１励起信号の一つの光子及び第２励起信号の一つの光子に対応する緑色戻り信号、
の放出と共に、用いられる。

図８Ａは、２つのビームの間に空間的な重なりがないときの、第１励起ビームの焦点ゾーン８１及び第２励起ビームの焦点ゾーン８２をそれぞれ示す。
図８Ｂは、この場合に得られた画像を示す。２つの別々の信号が得られ、一方は赤で他方は青である。
図８Ｃは、２つのビームの間に空間的な重なりがあるときの、第１励起ビームの焦点ゾーン１８１及び第２励起ビームの焦点ゾーン１８２をそれぞれ示す。
図８Ｄは、この場合に得られた画像を示す。１つの白色信号が得られ、赤、青、及び緑の３つの別々の信号の重なりに対応する。

このように、得られた画像の観察は、第１及び第２励起ビームの間の空間的重なりの最適な調整を可能とする。

従来技術によると、青色戻り信号及び赤色戻り信号は連続的に取得され、そして、これらの信号に対応するイメージは、それと同じイメージとで重ね合わされる。しかしながら、フォーカス光学系６において生じ得る色収差により、赤色信号に対応する画像及び青色信号に対応する画像はそれぞれ歪みを持ち、特に画角の端部では、異なる歪み方を持つ（対応するフォーカス光学系６による色収差の励起信号への影響から生じる歪み）。実際には、画角の中心が用いられる。そして、テレスコープ９０，９０’を調整することにより、第１励起信号の焦点距離と第２励起信号の焦点距離との間のオフセットは取り去られる。この目的のために、同一の焦平面から発生する青色信号及び赤色信号を検出しようとする（２つの信号のそれぞれは、同一の励起信号から発生するいくつかの光子の多光子吸収に対応する）。

２つの励起信号の間の時間ラグは遅延線により除去される。第１励起信号の少なくとも１つの光子及び第２励起信号の少なくとも１つの光子の多光子吸収に対応する第３信号の出現は、ラグが除去されたときを指し示す。このステップの間、画角の中心において戻り信号はまだ観察され、色収差によりそれらは歪んでいない。

最終的に、画角の端部において、どの角度でフォーカス光学系の色収差が２つの励起信号の良好な重なりを妨げ始めるかを、図８Ａから図８Ｄに示されたテストを用いることにより、確認することができる。さらに正確には、この方法により、画角の中心から徐々に離れ、かつ、第３信号の消失を指摘する。

本発明によれば、はるかに現実に近い、異なる戻り信号を分類する最終画像が得られる。実際には、第３の戻り信号の欠落は、歪んだ赤色及び青色の画像に対応する画角のゾーンが到達されることを示す。戻り信号のこの部分はそれゆえ除去され、戻り信号だけは、残っている色収差により影響されない。

もちろん、本発明は、ちょうど説明された実施例に限定されず、本発明の範囲を超えることなく多くの調整がこれらの実施例になされうる。
特に、全ての特性、外形、変形例、及び上述の実施形態は、矛盾したり、相互に排他的なものに関しない限り、様々な組み合わせで結合されうる。

Claims (15)

1. 試料の少なくとも３つの色素体を同時に励起するための多光子イメージングシステム（１００）用のモジュール（１）であって、
   繰り返し率１／Ｔと、多光子吸収により第１の色素体を励起することができる波長λ_１と、を有するパルス形状の第１励起ビーム（２０）を放出し、前記吸収された光子は前記第１励起ビームから発生する、第１フェムト秒レーザ光源（２）と、
   多光子吸収により第２の色素体を励起することができる波長λ_２を有する第２励起ビーム（３０）を放出し、前記吸収された光子は前記第２励起ビームから発生する、第２フェムト秒レーザ光源と、を備え、
   第１励起ビーム（２０）は、励起部として知られ、前記試料を励起するために働く部分と、ポンピング部と知られる部分と、を有し、前記ポンピング部は、前記第２フェムト秒レーザ光源が前記第１フェムト秒レーザ光源と同期するように、すなわち、同じ繰り返し率１／Ｔになるように、第２フェムト秒レーザ光源（３）を同期して励起するためのポンプビームとして働き、
   光遅延線（４）は、少なくとも多光子吸収により第３の色素体を励起するように、第１励起ビーム（２０）の励起部及び第２励起ビーム（３０）を空間的及び時間的に重ね合わせるように配置され、前記吸収された光子は前記第１及び第２励起ビーム（２０，３０）から発生することを特徴とするモジュール。
2. 前記第１励起ビーム（２０）を前記励起部及び前記ポンピング部に分離するために前記第２フェムト秒レーザ光源（３）の上流に配置された、分離手段（４１）を有することを特徴とする請求項１に記載のモジュール（１）。
3. 前記第１フェムト秒レーザ光源（２）は、チタンサファイアレーザ又はファイバーレーザにより形成されていることを特徴とする請求項１又は２に記載のモジュール（１）。
4. 前記第２フェムト秒レーザ光源（３）は、光パラメトリック発振器により形成されていることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載のモジュール（１）。
5. 蛍光戻り信号として知られ、互いに少なくとも５０ｎｍの間隔が空いている戻り信号を発する色素体を励起するのに適しており、それぞれの前記戻り信号が波長単位で表されることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載のモジュール（１）。
6. 前記試料中において、前記第２励起ビーム（３０）と前記第１励起ビーム（２０）の前記励起部との空間的な重なりを実現するために配置された少なくとも一つのテレスコープをさらに有することを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載のモジュール（１）。
7. 前記第１フェムト秒レーザ光源（２）は、二光子吸収により第１の色素体を励起することができる波長λ_１の前記第１励起ビーム（２０）を発し、前記吸収された光子は前記第１励起ビームから発生するものであり、
   前記第２フェムト秒レーザ光源（３）は、二光子吸収により第２の色素体を励起することができる波長λ_２の前記第２励起ビーム（３０）を発し、前記吸収された光子は前記第２励起ビームから発生するものであり、
   光遅延線（４）は、二光子吸収により第３の色素体を励起するように、前記第１励起ビーム（２０）の前記励起部及び前記第２励起ビーム（３０）を空間的及び時間的に重ね合わせるように配置され、前記２つの光子のうち一方は前記第１励起ビーム（２０）から、他方は前記第２励起ビーム（３０）から発生することを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載のモジュール（１）。
8. 請求項１〜７のいずれか１項に記載のモジュール（１）を備え、
   少なくとも３つのチャネル（８１、８１'、８１’’）を有し、各チャネルは対応する多光子吸収に関連するそれぞれの戻り信号を検出するように配置されている検出手段を、さらに備えることを特徴とする多光子イメージングシステム（１０００）。
9. 第１の二光子吸収に対応し、２つの吸収された光子は前記第１励起ビーム（２０）から発生する、第１チャネル（８１；８１'；８１’’）と、
   第２の二光子吸収に対応し、２つの吸収された光子は第２励起ビーム（３０）から発生する、第２チャネル（８１’’；８１；８１’）と、
   第３の二光子吸収に対応し、２つの吸収された光子の一方は第１励起ビーム（２０）から発生し、他方は第２励起ビーム（３０）から発生する、第３チャネル（８１’；８１’'；８１’’）と、
   からなる３つのチャネルを有する特定の検出手段を備えることを特徴とする請求項８に記載の多光子イメージングシステム（１０００）。
10. 内視鏡；
    顕微鏡；
    コンフォーカル顕微鏡；
    マルチポイント光顕微鏡；
    光シート顕微鏡；
    肉眼イメージングシステム；
    のいずれかに組み込まれていることを特徴とする請求項８又は９に記載の多光子イメージングシステム（１０００）。
11. 請求項１〜７のいずれか１項に記載のモジュールにより実行される方法であって、
    多光子吸収による少なくとも第３の色素体の励起と対応する戻り信号の出現を検出しながら、前記遅延線（４）の設定は、前記第１励起ビーム（２０）の前記励起部及び前記第２励起ビーム（３０）を空間的及び時間的に重ね合わせるように調整され、前記吸収された光子は前記第１及び第２励起ビーム（２０，３０）から発生することを特徴とする方法。
12. 二光子吸収を実行し、かつ、
    ２つの吸収された光子が前記第１励起ビーム（２０）から発生する二光子吸収、
    ２つの吸収された光子が前記第２励起ビーム（３０）から発生する二光子吸収、及び、
    ２つの吸収された光子の一方が前記第１励起ビーム（２０）から発生し、他方が前記第２励起ビーム（３０）から発生する二光子吸収、
    にそれぞれ対応する３つの戻り信号を検出することを特徴とする請求項１１に記載の方法。
13. 前記遅延線（４）の設定を調整することにより、２つの吸収された光子の一方が前記第１励起ビーム（２０）から発生し、他方が前記第２励起ビーム（３０）から発生する、二光子吸収に対応する戻り信号の相対強度により調整が行われる
    ことを特徴とする請求項１２に記載の方法。
14. 前記第１フェムト秒レーザ光源（２）の出力強度、
    前記第２フェムト秒レーザ光源（３）の出力強度、及び、
    前記遅延線（４）の設定、をそれぞれ調整することにより、
    前記３つの戻り信号の相対強度は、独立して調整されることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
15. 互いに少なくとも５０ｎｍの間隔を空けている蛍光戻り信号として知られる戻り信号を発し、それぞれの前記戻り信号は波長単位で表される、色素体を励起することを実行することを特徴とする請求項１１〜１４のいずれか１項に記載の方法。

Images