WO2013113861A1 - Module d'excitation multi-couleurs pour un systeme d'imagerie multi-photonique, systeme et procede associes - Google Patents

Module d'excitation multi-couleurs pour un systeme d'imagerie multi-photonique, systeme et procede associes Download PDF

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WO2013113861A1
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excitation
excitation beam
chromophores
laser source
module
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Pierre MAHOU
Emmanuel Jean-Marc Beaurepaire
Delphine Debarre
Willy Supatto
Jean Louis Martin
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Ecole Polytechnique
Centre National De La Recherche Scientifique
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Definitions

  • Multi-color excitation module for a multi-photonic imaging system, associated system and method
  • the present invention relates to a multi-color excitation module for a multi-photon imaging system.
  • the field of the invention is more particularly that of multi-color excitation and multi-photon fluorescence imaging, that is to say the observation of so-called "fluorescence" return signals emitted by chromophores present in a sample, in response to the light absorption of a pulsed exciter laser beam.
  • multi-photon imaging uses two- or three-photon excitation. It is particularly useful for deep and non-destructive observation of biological tissues.
  • Chromophores can be naturally present in the sample. You can also plan to inject them. Fluorophores, that is to say chemical substances capable of emitting fluorescent light after excitation, are also more specifically referred to.
  • the return signals are called "fluorescence", since they correspond to a light emission consecutive to the excitation of a molecule (here by absorption of at least two photons).
  • the field of the invention is more particularly but not limited to that of two-photon microscopy.
  • the present invention also relates to a multi-color multi-photon imaging system comprising an excitation module for exciting several different chromophores, as well as a method implemented in said module.
  • a first solution consists in using at least one tunable laser source to excite the chromophores.
  • An emission wavelength scan of the tunable laser source makes it possible to successively excite the at least three distinct chromophores.
  • the change in the emission wavelength of said laser source takes at most several seconds for narrow-range femtosecond pulse laser sources generally used in multi-photon imaging systems.
  • a disadvantage of this first solution is that it is impossible to simultaneously produce the return signals corresponding to each of said at least three chromophores.
  • a second solution is to use a single laser source, to simultaneously excite at least three separate chromophores and having very close excitation frequencies.
  • a disadvantage of this second solution is that the excitation frequency range is restricted, which reduces the range of chromophores capable of being excited effectively. Only spectrally close sets of chromophores (for example about 10 nm between two excitation peaks) can be imaged simultaneously. Another disadvantage of this second solution is that it does not independently control the excitation efficiency of the different chromophores.
  • a third solution consists in using a pulsed laser source per chromophore that it is desired to excite simultaneously.
  • a disadvantage of this third solution is of course its prohibitive cost since at least three pulsed laser sources are required.
  • the objective of the present invention is to provide a multi-photon excitation module multi-color for a multi-photon imaging system, for simultaneously imaging at least three chromophores of a sample, and which does not present at least one of the disadvantages of the prior art.
  • an object of the present invention is to provide a module for a multi-photon imaging system, to effectively excite and simultaneously image at least three chromophores of a sample.
  • Another object of the present invention is to provide a simple and inexpensive module for a multi-photon imaging system, to effectively excite at least three chromophores of a sample.
  • Another objective of the present invention is to propose a module for a multi-photon imaging system, to effectively excite at least three chromophores of a sample, said three chromophores having excitation wavelengths distant from each other. others, for example at least 50 nm.
  • the present invention aims to provide a multi-photonic imaging system comprising such a module, and a method implemented in said module.
  • a module for a multi-photon imaging system for simultaneously exciting at least three chromophores of a sample, said module comprising:
  • a first femtosecond laser source emitting a first excitation beam in the form of pulses having a repetition rate 1 / T and a (central) wavelength ⁇ able to excite the first one of the chromophores by multi-photon absorption said absorbed photons from the first excitation beam;
  • a second femtosecond laser source emitting a second excitation beam in the form of pulses at a (central) wavelength ⁇ 2 able to excite a second of the chromophores by multi-photon absorption, said absorbed photons coming from the second excitation beam.
  • the first excitation beam comprises a so-called “excitation” portion for exciting the sample, and a so-called “pumping” portion, this pumping portion serving as a pump beam for synchronously exciting the second femtosecond laser source.
  • the second laser source is synchronous with the first laser source, that is to say the same repetition rate 1 / T.
  • the module according to the invention further comprises an optical delay line arranged for spatially and temporally superimposing the second excitation beam and the excitation portion of the first excitation beam, so as to excite at least a third of the chromophores by multi-photon absorption (two-color), said absorbed photons from the first and second excitation beams.
  • the second femtosecond laser source is thus formed synchronous with the first femtosecond laser source.
  • the optical delay line (we will speak simply of
  • Delay line in the following) spatially and temporally superimposes the second excitation beam and the remaining portion of the first excitation beam which is not used as a pump beam for the second laser source.
  • the delay line may be arranged in particular to adjust the optical path traveled by the excitation portion of the first excitation beam, so as to superpose said excitation portion on the second excitation beam at the exit of the line. late.
  • the delay line may be arranged to adjust the optical path traveled by the second excitation beam, so as to superimpose this beam on the excitation portion of the first excitation beam, at the output of the delay line.
  • the first and second excitation beams at the output of the delay line, are superimposed spatially and temporally, at least three chromophores can be excited simultaneously by an excitation using simultaneous absorption of photons originating from:
  • the module according to the invention is inexpensive.
  • the additional delay line does not imply any real additional costs since it is a common optical element of the trade.
  • the at least three respective chromophores can be excited by multi-photon absorption of several photons from:
  • chromophores having very varied absorption wavelengths (for example at least 50 nm between two excitation wavelengths) according to the choice of the first and the second laser source.
  • absorption wavelengths for example at least 50 nm between two excitation wavelengths
  • tissues labeled with several fluorescent proteins whose emissions range from blue to red can be imaged rapidly and efficiently.
  • the simultaneous excitation of the chromophores also allows their simultaneous detection. We can thus image the at least three chromophores belonging to a sample in which occur rapid movements, present at the scale of the second, without being affected by these movements during a comparison of the images or signals obtained for each chromophore.
  • separation means are arranged upstream of the second femtosecond laser source to separate the first excitation beam into the excitation part and the pumping part.
  • upstream and downstream refer to the direction of propagation of the first excitation beam.
  • the separation means may comprise a dichroic mirror, to separate:
  • the pumping part of the first excitation beam the pumping part of the first excitation beam
  • the delay line may then in particular comprise a meeting element such as a dichroic mirror, arranged downstream of the second femtosecond laser source, to replace the delayed excitation beam on the same optical path as the non-excitation beam. delayed.
  • a meeting element such as a dichroic mirror
  • the delay line is preferably arranged outside the second femtosecond laser source. It can also be considered that the excitation portion and the pumping portion of the first excitation beam are at least partially merged.
  • the first excitation beam passes through the second femtosecond laser source, then acting as a pump beam. At the output, it is at least partially reused as an excitation beam. In this case, it is possible to dispense with said separation means.
  • the delay line can then be located directly inside the second femtosecond laser source.
  • the delay line may be downstream of the second femtosecond laser source.
  • means must be provided for separating the first excitation beam and the second excitation beam at the output of the second laser source. One of the two excitation beams is brought to the delay line. Then, the two excitation beams are recombined.
  • the first femtosecond laser source is formed by an oscillator, for example a Titanium Sapphire laser (TiS) or a fiber laser.
  • an oscillator for example a Titanium Sapphire laser (TiS) or a fiber laser.
  • This type of femtosecond laser has a broad spectrum of emission in the near infrared, often centered around 800 nm.
  • the second femtosecond laser source may be formed by an optical parametric oscillator (OPO).
  • OPO optical parametric oscillator
  • An optical parametric oscillator is a source implementing nonlinear optical interactions from a pump signal formed here by a portion of the first excitation beam emitted by the first femtosecond laser source.
  • An advantage of OPOs is that they give access to wavelengths that are difficult to reach (wavelength greater than 1000 nm) with other types of laser sources.
  • the OPO being pumped by the first femtosecond excitation beam, it can in turn emit a second excitation beam also femtosecond.
  • the module according to the invention is adapted to excite chromophores emitting so-called "fluorescence" return signals spaced at least 50 nm apart from each other, where each return signal is expressed in units of wavelength.
  • Each return signal has a peak centered on a wavelength which is that taken into account to measure said spacing of at least 50 nm.
  • the module according to the invention may further comprise at least one telescope arranged to implement a spatial overlap, in the sample, of the second excitation beam and the excitation portion of the first excitation beam.
  • the at least one telescope is preferably arranged in the optical path of one of the second excitation beam and the excitation portion of the first excitation beam.
  • the telescope may be part of the delay line.
  • a telescope can be provided on the optical path of the second excitation beam alone, and a telescope on the optical path of the excitation portion of the first excitation beam alone.
  • the second and the first excitation beam have different wavelengths. In the absence of particular measurement and when these wavelengths are very far apart (for example more than 300 nm), they could be focused each to a different depth in the sample.
  • the two excitation beams in the sample would not be spatially overlapped. It would therefore not be possible to obtain a return signal corresponding to the absorption of at least one photon of the first excitation signal and at least one photon of the second excitation signal.
  • the at least one telescope makes it possible in particular to independently control the relative sizes and divergences of the second excitation beam and the excitation portion of the first excitation beam. It is thus possible to correct a possible offset of the second excitation beam and the excitation portion of the first excitation beam, in the axis of the depth of the sample.
  • the first femtosecond laser source emits a first excitation beam at a wavelength (central) ⁇ able to excite one first of the two-photon absorption chromophores, said absorbed photons from the first excitation beam;
  • the second laser source emits a second excitation beam at a (central) wavelength ⁇ 2 capable of exciting a second one of the two-photon absorption chromophores, said absorbed photons coming from the second excitation beam;
  • the optical delay line is arranged to spatially and temporally superpose the second excitation beam and the excitation portion of the first excitation beam, so as to excite a third of the two-photon absorption chromophores, the two photons coming from one of the first excitation beam and the other of the second excitation beam.
  • Two-photon absorption phenomena are thus used (also referred to as “2PEF” for "2-photon excited fluorescence”), which are most commonly used, in particular in the field of multi-photon microscopy.
  • This embodiment is not limiting, and it may for example also consider the implementation of three-photon absorption phenomena (also referred to as “3PEF” for "3-photon excited fluorescence”).
  • 3PEF three-photon absorption phenomena
  • the invention also relates to a multi-photonic imaging system comprising a module according to the invention, and further comprising detection means with at least three channels, each channel being arranged to detect a respective return signal associated with a multi-absorption -photons corresponding.
  • the number of channels depends on the number of chromophores detected (the term "number of chromophores” refers to a number of types of chromophores).
  • the number of chromophores that can be detected depends on the number of photons used by the multi-photon absorption (it is considered that each chromophore can be excited by a distinct wavelength).
  • For a two-photon absorption three combinations are possible (AA photons, BB photons, AB photons) so the system according to the invention comprises three channels.
  • the signals received by each of the channels can be processed to separate for each channel a dedicated return signal and a parasite return signal corresponding to the return signal dedicated to a spectrally adjacent channel.
  • the latter comprises in particular three-channel detection means
  • the multi-photonic imaging system according to the invention forms one of:
  • the invention is not limited to one application in particular, but can be applied to various multi-photon imaging geometries.
  • the invention also relates to a method implemented in a module according to the invention. According to this method, the adjustment of the delay line is adjusted so as to spatially and temporally superimpose the second excitation beam and the excitation portion of the first excitation beam, by detecting the appearance of a corresponding return signal. at the excitation of at least a third of the chromophores by multi-photon absorption, said absorbed photons coming from the first and second excitation beams.
  • the excitation of said at least one of the chromophores assumes simultaneous absorption by said chromophore of at least one photon coming from the first excitation beam and at least one photon coming from the excitation portion of the first beam of excitation. It is therefore necessary that the second excitation beam and the excitation portion of the first excitation beam are spatially and temporally superposed. The adjustment of the delay line is therefore particularly simple to implement.
  • this method implements two-photon absorptions, and three return signals corresponding respectively to:
  • the absorption probability simultaneous one photon of each of the two excitation beams is higher or lower. It follows that the intensity of the corresponding return signal is higher or lower. It is therefore possible to adjust the intensity of said return signal without modifying the intensities of the two other return signals respectively corresponding to the absorption of two photons of the first excitation signal or two photons of the second excitation signal.
  • the relative intensity of the three return signals can be adjusted independently by adjusting respectively:
  • the method according to the invention can be implemented to excite chromophores emitting so-called "fluorescence" return signals at least 50 nm apart from each other, where each return signal is expressed in units of wavelength.
  • FIG. 1 illustrates an embodiment of a module and a system according to the invention
  • FIG. 2 illustrates the first and second excitation beams in the absence of a delay line implementing their spatial and temporal superposition
  • FIGS. 3A to 3D illustrate the multi-photon absorptions implemented in a module and system embodiment according to the invention
  • FIG. 4 illustrates excitation spectra of different fluorescent proteins
  • FIGS. 5A and 5B illustrate various acquisitions that can be obtained thanks to the module and system according to the invention
  • FIG. 6 illustrates excitation spectra of different fluorescent proteins, and the spectral widths of detection of the associated detection channels
  • FIG. 7 illustrates return signals acquired in a system according to the invention, by varying a time delay between the first and second excitation beams.
  • FIGS. 8A to 8D illustrate an optimal spatial overlap test between the first and the second excitation beam.
  • module 1 for a multi-photon imaging system 100.
  • a module 1 for simultaneously imaging three chromophores of a sample through two-photon absorptions.
  • this example is in no way limiting and it may be provided to implement the module and the imaging system according to the invention in the at least three photon absorption frame, in order to simultaneously image four chromophores at the same time. less than one sample.
  • the module 1 comprises a titanium oscillator: sapphire 2 (Ti: S) emitting a first excitation beam 20 at a wavelength ⁇ equal to 820 nm.
  • the titanium oscillator: sapphire 2 is a femtosecond laser, that is to say, emitting a pulsed signal whose pulses have a width of the order of ten or even a hundred femtoseconds.
  • the emission wavelength ⁇ of this oscillator is chosen in particular to be able to excite by multi-photon absorption at least one chromophore of a sample to be studied.
  • the titanium oscillator: sapphire 2 (Ti: S) must be excited by an excitation diode.
  • the module 1 comprises only a single excitation diode.
  • a portion of the first excitation beam 20 is fed to an optical parametric oscillator (OPO) 3 to serve as a pump beam.
  • OPO optical parametric oscillator
  • a dichroic mirror 41 arranged at 45 ° (angle in degrees where 180 ° is ⁇ radians) on the optical path of the first excitation beam 20 upstream of the OPO separates from a part this part called “pumping" of the first excitation beam, and other by a so-called "excitation" part of the first excitation beam.
  • the optical parametric oscillator (OPO) 3 then emits a second excitation beam 30 at a wavelength ⁇ 2 equal to 1180 nm.
  • the emission wavelength ⁇ 2 of this oscillator is chosen in particular to be able to excite by multi-photon absorption at least one chromophore of the sample to be studied.
  • the two emission wavelengths ⁇ and ⁇ 2 of these oscillators are chosen in particular to be able to excite by multi-photon absorption mixing these two wavelengths, at least one chromophore of the sample to be studied.
  • the dichroic mirror 41 arranged at 45 ° on the optical path of the first excitation beam 20 directs the excitation portion of the first excitation beam to a delay line 4 of the module 1 according to the invention.
  • the delay line 4 comprises at least two reflectors 42 defining an additional optical path for the excitation portion of the first excitation beam 20.
  • the delay line further comprises a second dichroic mirror 43, arranged to replace the second excitation beam 30 and the excitation portion of the first excitation beam 20 on the same optical path.
  • the dichroic mirror 43 is arranged at 45.degree. ° on the optical path of the second excitation beam and the excitation portion of the first excitation beam.
  • the second excitation beam passes through the dichroic mirror 43 without being deflected.
  • the excitation portion of the first excitation beam is deflected at 90 ° by the dichroic mirror 43.
  • first excitation beam 20 the part of the first excitation beam 20 which has been brought towards the delay line 4 will simply be called "first excitation beam 20".
  • first excitation beam 20 the part of the first excitation beam 20 which has been brought towards the delay line 4.
  • second excitation beam 30 and the first excitation beam 20 are not superimposed. In fact, these two beams are of course spatially superimposed.
  • Optical elements such as a telescope 90 within the delay line 4 may be provided to provide spatial overlap of the pulses by controlling the size and divergence of the exciting portion of the first beam of the beam. excitation, independently of the second excitation beam.
  • a second telescope 90 ' is also arranged on the optical path of the second excitation beam alone, upstream of the second dichroic mirror 43.
  • Each telescope 90, 90 makes it possible to independently adjust the divergence of each excitation beam, and preferably also independently of the size of these beams.
  • telescopes with three or four lenses can be used.
  • beam conditioning systems are based on active or adaptive optical elements.
  • the invention consists in superimposing in space and in time at least two pulse trains of different wavelengths (first and second excitation beams), in a multiphotonic imaging system such as a multi-photon microscope.
  • the first and second excitation beams 20, 30 are directed towards scanning means 5 in FIG. the plane (xOy), then scanning means 6 along the axis (Oz) corresponding to the axis of the depth of a sample 7.
  • the scanning means 6 also comprise focusing optics for focusing the excitation signals at a desired location in the sample 7.
  • Sample 7 comprises at least three chromophores emitting a fluorescence signal in response to absorption:
  • a dichroic mirror 80 deflects them to a detection stage comprising a respective channel 81, 81 ', 81 "for each of the three fluorescence signals 82, 82', 82".
  • three blue, yellow, red or blue, green, and red fluorescent protein signals can be imaged simultaneously.
  • FIG. 2 illustrates the principle implemented according to the invention.
  • FIG. 2 illustrates the pulse trains as a function of time, and in the absence of a delay line 4, the first excitation beam 20 (thick lines) and the second excitation beam 30 (dashed lines).
  • the delay line makes it possible to cancel the time difference ⁇ t between the two pulse trains.
  • a chromophore absorbing a photon of the first excitation beam 20 and a photon of the second excitation beam 30, producing a return signal at the wavelength, ie 484 nm (yellow)
  • FIG. 3D illustrates the excitation signals used, in particular the virtual excitation signal artificially recreated by means of the invention.
  • the abscissa axis corresponds to a wavelength in nm, the ordinate axis to an arbitrary unit intensity.
  • FIG. 4 illustrates on an abscissa axis corresponding to a wavelength expressed in nm (nanometers):
  • the excitation signals (ordinate axis in arbitrary unit, corresponding to a light intensity), in particular the virtual excitation signal artificially recreated by means of the invention.
  • the excitation signals obtained artificially or not according to the invention correspond to absorption peaks of several fluorescent proteins which will thus be able to be imaged thanks to a module 1 and a multi-photon imaging system 100 according to the invention. invention.
  • Curve 401 corresponds to an eCFP protein (for "Enhanced Cyan
  • Fluorescent Protein that is to say a protein emitting a return signal
  • Curve 402 corresponds to an eYFP protein (for "Enhanced Yellow
  • Fluorescent Protein that is to say a protein emitting a return signal
  • Curve 403 corresponds to a tdTomato protein (a protein emitting a return signal called "fluorescence" bright red).
  • Curve 404 corresponds to a mCherry protein (a protein emitting a return signal called "fluorescence" red cherry).
  • mouse brain tissue labeled with these different proteins could be imaged.
  • Each excitation wavelength (in particular the so-called “virtual" wavelength and corresponding to said central excitation signal) can excite several different types of chromophores. This appears here for the signal at 1100 nm which corresponds to a maximum of absorption for both mCherry and tdTomato proteins.
  • Chromophore names are indicated in parentheses, separated by commas when multiple chromophores can be used.
  • FIGS. 5A and 5B A method for adjusting the delay line 4 according to the invention will now be described with reference to FIGS. 5A and 5B. It can be seen in FIG. 1 that the reflectors 42 of the delay line 4 can be mounted on a motorized translation, so as to be able to adjust the adjustment of said delay line in order to superimpose the two excitation beams 20, 30 as closely as possible.
  • the delay control induced by the delay line 4 on the first excitation beam 20 also provides a means of adjusting the luminous intensity of the return signal obtained by frequency mixing (absorption of two photons, one coming from the first excitation beam and the other from the second excitation beam), independently of the return signals depending only on a single excitation beam.
  • the existence of a third feedback signal obtained by frequency mixing confirms that the first and second excitation signals are spatially and temporally superimposed with a precision equal to the resolution of the multi-photon imaging system 100. We therefore see that the invention offers an "alignment test" particularly simple to implement.
  • the control of the average power of the two excitation beams also makes it possible to control the relative intensities of the three return signals.
  • the intensities of the so-called fluorescent feedback signals are respectively, proportional to:
  • Pi 2 where Pi is the average power of the excitation portion of the first excitation beam 20 (absorption of two photons of the first excitation beam);
  • P 2 2 is the average power of the second excitation beam 30 (absorption of two photons of the second excitation beam);
  • ⁇ is the delay between the two pulse trains respectively of the first and the second excitation beam, downstream of the delay line (absorption of two photons, one of the part d excitation of the first excitation beam and the other of the second excitation beam), and g is the temporal inter-correlation function of the two excitation beams, proportional to exp (-x 2 ) in the case of excitation beams with Gaussian temporal profiles.
  • FIGS. 5A and 5B which each have from right to left: the image obtained by means of the return signal corresponding to a two-photon absorption of the first excitation beam;
  • the imaged sample is a Drosophila with a triple fluorescent markings blue, green and red.
  • the central image shows the presence of a strong return signal corresponding to an absorption of two photons, one of the first excitation beam and the other of the second excitation beam.
  • the central image shows the presence of a very weak return signal corresponding to an absorption of two photons, one of the first excitation beam and the other of the second excitation beam.
  • This result can also be used to compensate for so-called "cross talk" interference effects between the first and the second excitation beam, and which tend to reduce the relative intensity of the return signal corresponding to a two-photon absorption, one of the first excitation beam and the other of the second excitation beam.
  • This principle can also be used to maintain constant over time the absolute intensities of the three return signals as detected, during a depth scan of a sample (thus varying a beam attenuation coefficient). excitation and feedback signals).
  • the acquisitions are obtained with pixels of dimensions 0.8 * 0.8 * 3 pm 3 .
  • three-dimensional images are produced by scanning in the direction of the depth of the sample, for example a three-dimensional image every 45 seconds.
  • Figure 6 has the additional advantage of simultaneous multi-channel detection.
  • the abscissa axis corresponds to a wavelength in nm.
  • the ordinate axis corresponds to a return signal intensity, in arbitrary unit.
  • Curves 601, 602 and 603 correspond to return signal spectra.
  • Curve 601 corresponds to an endo protein emitting a return signal called "fluorescence" blue).
  • Curve 602 corresponds to a GFP (for "green fluorescent protein” protein, that is to say a protein emitting a green fluorescence return signal.
  • Curve 603 corresponds to an RFP protein (for "red fluorescent protein", that is to say a protein emitting a red fluorescent "return” signal.
  • the dotted slots 611, 612, 613 correspond respectively to:
  • the spectral width detected by the detection channel dedicated to the red return signal is the spectral width detected by the detection channel dedicated to the red return signal.
  • the emission being simultaneous, the detection is also simultaneous. For each channel (here more particularly for the channel corresponding to the slot 612), it is therefore possible to separate the contributions of the different return signals.
  • RAI is the normalized (known) contribution of the chromophore A in the C1 and C2 channels
  • RB1 is the normalized (known) contribution of the chromophore A in the C1 or C2 channel
  • Cl and C2 are measured intensities.
  • - A and B are intensities to be determined.
  • FIG. 7 illustrates the return signals 404, 401 and 402 of FIG. 4.
  • the abscissa axis corresponds to the femtosecond delay ⁇ between the second excitation beam and the excitation portion of the first excitation beam, at the output of the delay line.
  • the y-axis corresponds to the intensity in arbitrary units.
  • an additional return signal (corresponding to a multi-photon absorption of photons coming from both the first and the second excitation beam) indicates an optimal setting of the temporal overlap between the first and second excitation beams.
  • FIGS. 8A to 8D more particularly illustrate an optimal spatial overlap test between the second excitation beam, and the excitation portion of the first excitation beam, downstream of the delay line.
  • FIG. 8A illustrates the focusing zones 81 and 82, respectively, of the first and second excitation beams, when the spatial overlap is not achieved between these two beams.
  • Figure 8B shows the image obtained in this case. We obtain two distinct signals, one red and the other blue.
  • FIG. 8C illustrates the focusing zones 181 and 182, respectively, of the first and second excitation beams, when the spatial overlap is made between these two beams.
  • Figure 8D shows the image obtained in this case. A single white signal is obtained, corresponding to the superposition of three distinct signals, red, blue and green.
  • the blue return signal and the red return signal are successively acquired, then the images corresponding to these signals are superimposed on the same image.
  • the images respectively corresponding to the red signal and to the blue signal can be deformed and deformed differently, in particular at the edge of the field of view (these deformations come from the impact, on the corresponding excitation signals, chromatic aberrations displayed by the focusing optics 6).
  • an offset is made between the focusing distance of the first excitation signal and that of the second excitation signal. For this, we seek to detect a blue signal and a red signal from the same focusing plane (the two signals each corresponding to a multi-photon absorption of several photons from the same excitation signal).
  • the time offset between the two excitation signals is canceled, thanks to the delay line.
  • the appearance of a third signal corresponding to a multi-photon absorption of at least one photon of the first excitation signal and at least one photon of the second excitation signal indicates when this offset is canceled.
  • the return signals are always observed in the center of the field of view, where they are not deformed by chromatic aberrations.
  • FIGS. 8A to 8D it is possible to verify at the edge of the field of vision from which angle the chromatic aberrations of the focusing optics become troublesome for a good overlap of the two excitation signals, by using the test illustrated by FIGS. 8A to 8D. More precisely, we gradually move away from the center of the field of view and we spot the disappearance of the third return signal. Thanks to the invention, a final image is obtained grouping the various return signals much closer to reality. Indeed, the absence of the third feedback signal shows that we have reached an area of the field of view corresponding to distorted red and blue images. We can therefore remove this part of the return signal and keep only the return signal unaffected by chromatic aberrations.

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Abstract

La présente invention concerne un module 1 d'excitation multi-couleurs pour un système d'imagerie multi-photonique 100. Un tel module est utilisé pour imager un échantillon 7 comprenant au moins trois chromophores. Le module 1 comprend : une première source de laser femtoseconde 2, émettant un premier faisceau d'excitation 20; une deuxième source laser femtoseconde 3 émettant un deuxième faisceau d'excitation 30. Le premier faisceau d'excitation 20 comprend une partie dite « de pompage », cette partie de pompage servant de faisceau de pompe pour exciter de façon synchrone la deuxième source laser 3, et une partie dite « d'excitation ». Une ligne à retard optique 4 est agencée pour superposer spatialement et temporellement le deuxième faisceau d'excitation 30 et la partie d'excitation du premier faisceau d'excitation, de façon à exciter au moins un troisième des chromophores par absorption multi-photons, lesdits photons absorbés provenant des premier et deuxième faisceaux d'excitation 20,30. L'invention concerne également le système complet d'imagerie multi-photonique 100, ainsi qu'un procédé mis en oeuvre dans ce

Description

« Module d'excitation multi-couleurs pour un système d'imagerie multi- photonique, système et procédé associés »
Domaine technique
La présente invention concerne un module d'excitation multi-couleurs pour un système d'imagerie multi-photonique. On parle de façon équivalente d'imagerie multi-photonique ou non linéaire, notamment de microscopie multi-photonique ou non linéaire.
Le domaine de l'invention est plus particulièrement celui de l'excitation multi-couleur et l'imagerie multi-photonique de fluorescence, c'est-à-dire l'observation de signaux retour dits « de fluorescence » émis par des chromophores présents dans un échantillon, en réponse à l'absorption de lumière d'un faisceau laser excitateur puisé.
Typiquement, l'imagerie multi-photonique utilise une excitation à deux ou trois photons. Elle est particulièrement utile pour observer en profondeur et de façon non destructive les tissus biologiques.
Les chromophores peuvent être présents naturellement dans l'échantillon. On peut également prévoir de les y injecter. On parle également, de façon plus précise, de fluorophores, c'est-à-dire des substances chimiques capables d'émettre de la lumière de fluorescence après excitation.
Les signaux retour sont dits « de fluorescence », puisqu'ils correspondent à une émission lumineuse consécutive à l'excitation d'une molécule (ici par absorption d'au moins deux photons).
Le domaine de l'invention est plus particulièrement mais de manière non limitative celui de la microscopie à deux photons.
La présente invention concerne également un système d'imagerie multi- photonique multi-couleurs comprenant un module d'excitation permettant d'exciter plusieurs chromophores différents, ainsi qu'un procédé mis en œuvre dans ledit module.
Etat de la technique antérieure
On connaît dans l'art antérieur différents modules d'excitation multi- photonique multi-couleurs pour un système d'imagerie multi-photonique, adaptés à exciter au moins trois chromophores distincts. Une première solution consiste à utiliser au moins une source laser accordable pour exciter les chromophores. Un balayage en longueur d'onde d'émission de la source laser accordable permet d'exciter successivement les au moins trois chromophores distincts. On obtient successivement au moins trois images, chaque image correspondant à un chromophore, et on peut superposer ces images.
Le changement de la longueur d'onde d'émission de ladite source laser prend au mieux plusieurs secondes, pour des sources laser impulsionnelles femtosecondes à spectre étroit généralement utilisées dans les systèmes d'imagerie multi-photonique.
Un inconvénient de cette première solution est donc qu'il est impossible de produire simultanément les signaux retour correspondant à chacun desdits au moins trois chromophores.
Cet inconvénient peut être particulièrement limitant lorsqu'il s'agit d'imager des échantillons biologiques dans lesquels se produisent des mouvements rapides, présents à l'échelle de la seconde. La superposition des images est alors difficile voire impossible à exploiter.
Une deuxième solution consiste à utiliser une unique source laser, pour exciter simultanément au moins trois chromophores distincts et présentant des fréquences d'excitation très proches.
Un inconvénient de cette deuxième solution est que la gamme de fréquences d'excitation est restreinte, ce qui réduit la gamme de chromophores aptes à être excités de façon efficace. On ne peut imager simultanément que des ensembles de chromophores proches spectralement (par exemple environ 10 nm entre deux pics d'excitation). Un autre inconvénient de cette deuxième solution est qu'elle ne permet pas de contrôler indépendamment l'efficacité d'excitation des différents chromophores.
Une troisième solution consiste à utiliser une source laser impulsionnelle par chromophore que l'on souhaite exciter simultanément.
Un inconvénient de cette troisième solution est bien entendu son coût prohibitif puisqu'au moins trois sources laser impulsionnelles sont nécessaires. L'objectif de la présente invention est de proposer un module d'excitation multi-photonique multi-couleurs pour un système d'imagerie multi- photonique, permettant d'imager simultanément au moins trois chromophores d'un échantillon, et qui ne présente pas au moins l'un des inconvénients de l'art antérieur.
En particulier, un objectif de la présente invention est de proposer un module pour un système d'imagerie multi-photonique, pour exciter efficacement et imager simultanément au moins trois chromophores d'un échantillon.
Un autre but de la présente invention est de proposer un module simple et peu onéreux pour un système d'imagerie multi-photonique, pour exciter efficacement au moins trois chromophores d'un échantillon.
Un autre objectif de la présente invention est de proposer un module pour un système d'imagerie multi-photonique, pour exciter efficacement au moins trois chromophores d'un échantillon, lesdits trois chromophores présentant des longueurs d'onde d'excitation éloignées les unes des autres, par exemple d'au moins 50 nm.
Enfin, la présente invention a pour but de proposer un système d'imagerie multi-photonique comprenant un tel module, ainsi qu'un procédé mis en œuvre dans ledit module.
Exposé de l'invention
Cet objectif est atteint avec un module pour un système d'imagerie multi-photonique, pour exciter simultanément au moins trois chromophores d'un échantillon, ledit module comprenant :
une première source laser femtoseconde, émettant un premier faisceau d'excitation sous forme d'impulsions présentant un taux de répétition 1/T et une longueur d'onde (centrale) λι apte à exciter l'un premier des chromophores par absorption multi-photons, lesdits photons absorbés provenant du premier faisceau d'excitation ;
une deuxième source laser femtoseconde, émettant un deuxième faisceau d'excitation sous forme d'impulsions à une longueur d'onde (centrale) λ2 apte à exciter l'un deuxième des chromophores par absorption multi-photons, lesdits photons absorbés provenant du deuxième faisceau d'excitation. Le premier faisceau d'excitation comprend une partie dite « d'excitation » servant à exciter l'échantillon, et une partie dite « de pompage », cette partie de pompage servant de faisceau de pompe pour exciter de façon synchrone la deuxième source laser femtoseconde, de façon que la deuxième source laser soit synchrone avec la première source laser, c'est-à-dire de même taux de répétition 1/T.
Le module selon l'invention comprend en outre une ligne à retard optique agencée pour superposer spatialement et temporellement le deuxième faisceau d'excitation et la partie d'excitation du premier faisceau d'excitation, de façon à exciter au moins un troisième des chromophores par absorption multi-photons (à deux couleurs), lesdits photons absorbés provenant des premier et deuxième faisceaux d'excitation .
Pour des raisons de concision, on parle simplement d'absorption de photon(s) provenant du premier faisceau d'excitation, plutôt que d'absorption de photon(s) provenant de la partie d'excitation du premier faisceau d'excitation .
On parle d'excitation « de façon synchrone », puisque l'excitation de la deuxième source laser par une partie du premier faisceau d'excitation fait en sorte que les trains d'impulsions des deux faisceaux d'excitation aient la même cadence.
La deuxième source laser femtoseconde est ainsi formée synchrone avec la première source laser femtoseconde.
Il est ainsi possible de superposer spatialement et temporellement les premier et deuxième faisceaux d'excitation . Par nature, ils sont en effet similaires, à un décalage temporel près. Ce décalage temporel peut être compensé par la ligne à retard optique.
Lorsqu'on parle de superposition spatiale et temporelle, on désigne de préférence une superposition spatiale et temporelle dans l'échantillon étudié.
De préférence, la ligne à retard optique (on parlera simplement de
« ligne à retard » dans la suite) superpose spatialement et temporellement le deuxième faisceau d'excitation et la partie restante du premier faisceau d'excitation qui n'est pas utilisée comme faisceau de pompe pour la deuxième source laser. La ligne à retard peut être agencée en particulier pour ajuster le chemin optique parcouru par la partie d'excitation du premier faisceau d'excitation, de façon à superposer ladite partie d'excitation sur le deuxième faisceau d'excitation à la sortie de la ligne à retard.
Alternativement, la ligne à retard peut être agencée pour ajuster le chemin optique parcouru par le deuxième faisceau d'excitation, de façon à superposer ce faisceau sur la partie d'excitation du premier faisceau d'excitation, à la sortie de la ligne à retard.
La ligne à retard peut comprendre des miroirs montés sur une translation, afin de contrôler un décalage temporel entre le deuxième faisceau d'excitation et la partie d'excitation du premier faisceau d'excitation
Puisque les premier et deuxième faisceaux d'excitation, en sortie de la ligne à retard, sont superposés spatialement et temporellement, on peut exciter simultanément au moins trois chromophores par une excitation mettant en œuvre des absorptions simultanées de photons provenant :
- du premier faisceau d'excitation uniquement ;
- du deuxième faisceau d'excitation uniquement ou ;
- à la fois du premier et deuxième faisceau d'excitation.
Par conséquent, on peut également imager simultanément des signaux retour dits « de fluorescence » correspondants.
On peut ainsi suivre une évolution à l'échelle inférieure à la milliseconde, des signaux retour provenant par exemple d'échantillons biologiques.
Puisque seules deux sources laser sont nécessaires pour imager simultanément au moins trois chromophores, le module selon l'invention est peu onéreux. La ligne à retard supplémentaire n'implique pas de réels surcoûts puisqu'il s'agit d'un élément optique courant du commerce.
Puisque les au moins trois chromophores respectifs peuvent être excités par absorption multi-photons de plusieurs photons provenant :
- du premier faisceau d'excitation uniquement ;
- du deuxième faisceau d'excitation uniquement ou ;
- à la fois du premier et deuxième faisceau d'excitation ;
il est possible d'exciter des chromophores présentant des longueurs d'onde d'absorption très variées (par exemple au moins 50 nm entre deux longueurs d'onde d'excitation) en fonction du choix de la première et la deuxième source laser. On peut par exemple imager rapidement et efficacement des tissus marqués avec plusieurs protéines fluorescentes dont les émissions vont du bleu au rouge.
Une source femtoseconde (fs) produit des impulsions ultra-courtes dont la durée est généralement de l'ordre de quelques quelques centaines de fs ( 1 fs = 10"15 secondes) .
L'excitation simultanée des chromophores permet également leur détection simultanée. On peut ainsi imager les au moins trois chromophores appartenant à un échantillon dans lequel se produisent des mouvements rapides, présents à l'échelle de la seconde, sans être affecté par ces mouvements lors d'une comparaison des images ou signaux obtenus pour chaque chromophore. Selon un mode de réalisation particulièrement avantageux, des moyens de séparation sont agencés en amont de la deuxième source laser femtoseconde, pour séparer le premier faisceau d'excitation en la partie d'excitation et la partie de pompage.
Les termes « amont » et « aval » font référence au sens de propagation du premier faisceau d'excitation .
Les moyens de séparation peuvent comprendre un miroir dichroïque, pour séparer :
- d'une part, la partie de pompage du premier faisceau d'excitation ;
- d'autre part la partie d'excitation du premier faisceau d'excitation .
Le terme « séparer » utilisé ne présuppose en aucun cas des directions de propagation de la partie de pompage d'une part et de la partie d'excitation d'autre part.
La ligne à retard peut alors comprendre en particulier un élément de réunion tel qu'un miroir dichroïque, agencé en aval de la deuxième source laser femtoseconde, pour replacer le faisceau d'excitation retardé sur le même chemin optique que le faisceau d'excitation non retardé.
La ligne à retard est agencée de préférence à l'extérieur de la deuxième source laser femtoseconde. On peut également considérer que la partie d'excitation et la partie de pompage du premier faisceau d'excitation sont au moins partiellement confondues. Le premier faisceau d'excitation traverse la deuxième source laser femtoseconde, faisant alors office de faisceau de pompage. En sortie, il est au moins partiellement réutilisé en tant que faisceau d'excitation . Dans ce cas, on peut s'affranchir desdits moyens de séparation .
La ligne à retard peut alors être située directement à l'intérieur de la deuxième source laser femtoseconde.
Alternativement, la ligne à retard peut être en aval de la deuxième source laser femtoseconde, Dans ce cas, on doit prévoir des moyens pour séparer le premier faisceau d'excitation et le deuxième faisceau d'excitation, en sortie de la deuxième source laser. L'un des deux faisceaux d'excitation est amené à la ligne à retard . Ensuite, on recombine les deux faisceaux d'excitation .
De préférence, la première source laser femtoseconde est formée par un oscillateur, par exemple un laser Titane Saphir (TiS) ou un laser à fibre.
Ce type de laser femtoseconde possède un large spectre d'émission dans le proche infrarouge, souvent centré vers 800 nm .
La deuxième source laser femtoseconde peut être formée par un oscillateur paramétrique optique (OPO) . Un oscillateur paramétrique optique est une source mettant en œuvre des interactions optiques non-linéaires à partir d'un signal de pompe formé ici par une partie du premier faisceau d'excitation, émis par la première source laser femtoseconde. Un avantage des OPO est qu'ils donnent accès à des longueurs d'onde difficilement atteignables (de longueur d'onde supérieure à 1000 nm) avec d'autres types de sources laser. L'OPO étant pompé par le premier faisceau d'excitation femtoseconde, il peut émettre à son tour un deuxième faisceau d'excitation lui aussi femtoseconde.
De préférence, le module selon l'invention est adapté pour exciter des chromophores émettant des signaux retour dits « de fluorescence » espacés d'au moins 50 nm les uns des autres, où chaque signal retour est exprimé en unité de longueur d'onde. Chaque signal retour présente un pic centré sur une longueur d'onde qui est celle prise en compte pour mesurer ledit espacement d'au moins 50 nm. Le module selon l'invention peut comprendre en outre au moins un télescope agencé pour mettre en œuvre un recouvrement spatial, dans l'échantillon, du deuxième faisceau d'excitation et de la partie d'excitation du premier faisceau d'excitation.
L'au moins un télescope est agencé de préférence sur le chemin optique de l'un parmi le deuxième faisceau d'excitation et la partie d'excitation du premier faisceau d'excitation.
Par exemple, le télescope peut faire partie de la ligne à retard.
Avantageusement, on peut prévoir un télescope sur le chemin optique du deuxième faisceau d'excitation seul, et un télescope sur le chemin optique de la partie d'excitation du premier faisceau d'excitation seule.
Le deuxième et le premier faisceau d'excitation présentent des longueurs d'onde différentes. En l'absence de mesure particulière et lorsque ces longueurs d'ondes sont très éloignées l'une de l'autre (par exemple plus de 300 nm), ils pourraient être focalisés chacun à une profondeur différente dans l'échantillon. On ne réaliserait alors pas de recouvrement spatial des deux faisceaux d'excitation dans l'échantillon. On ne pourrait donc pas obtenir un signal retour correspondant à l'absorption d'au moins un photon du premier signal d'excitation et au moins un photon du deuxième signal d'excitation.
L'au moins un télescope permet en particulier de contrôler indépendamment les tailles et les divergences relatives du deuxième faisceau d'excitation et de la partie d'excitation du premier faisceau d'excitation. On peut ainsi corriger un éventuel décalage du deuxième faisceau d'excitation et de la partie d'excitation du premier faisceau d'excitation, dans l'axe de la profondeur de l'échantillon.
Selon un mode de réalisation avantageux du module selon l'invention : la première source laser femtoseconde émet un premier faisceau d'excitation à une longueur d'onde (centrale) λι apte à exciter l'un premier des chromophores par absorption à deux photons, lesdits photons absorbés provenant du premier faisceau d'excitation;
la deuxième source laser émet un deuxième faisceau d'excitation à une longueur d'onde (centrale) λ2 apte à exciter l'un deuxième des chromophores par absorption à deux photons, lesdits photons absorbés provenant du deuxième faisceau d'excitation; et
la ligne à retard optique est agencée pour superposer spatialement et temporellement le deuxième faisceau d'excitation et la partie d'excitation du premier faisceau d'excitation, de façon à exciter un troisième des chromophores par absorption à deux photons, les deux photons provenant pour l'un du premier faisceau d'excitation et pour l'autre du deuxième faisceau d'excitation.
On met ainsi en œuvre des phénomènes d'absorption à deux photons (on parle aussi de « 2PEF » pour « fluorescence excitée à 2 photons »), qui sont les plus couramment utilisés en particulier dans le domaine de la microscopie multi-photonique.
Ce mode de réalisation n'est pas limitatif, et on pourra par exemple envisager également la mise en œuvre de phénomènes d'absorption à trois photons (on parle aussi de « 3PEF » pour « fluorescence excitée à 3 photons »).
L'invention concerne également un système d'imagerie multi-photonique comprenant un module selon l'invention, et comprenant en outre des moyens de détection à au moins trois canaux, chaque canal étant agencé pour détecter un signal retour respectif associé à une absorption multi-photons correspondante.
Le nombre de canaux dépend du nombre de chromophores détectés (l'expression « nombre de chromophores » désigne un nombre de types de chromophores). Le nombre de chromophores pouvant être détectés dépend lui-même du nombre de photons mis en œuvre par l'absorption multi-photons (on considère que chaque chromophore peut être excité par une longueur d'onde distincte). Pour une absorption à deux photons, trois combinaisons sont possibles (photons A-A, photons B-B, photons A-B) donc le système selon l'invention comprend trois canaux. Pour une absorption à trois photons, quatre combinaisons sont possibles (photons A-A-A, photons A-A-B, photons A-B-B, photons B-B-B) donc le système selon l'invention comprend quatre canaux.
Puisque la détection des différents signaux retour est simultanée, dans le cas où la largeur spectrale d'un canal est telle qu'il détecte aussi une partie d'un signal retour spectralement voisin, on peut traiter les signaux reçus par chacun des canaux de façon à séparer pour chaque canal un signal retour dédié et un signal retour parasite correspondant au signal retour dédié à un canal spectralement voisin. Selon un mode de réalisation préféré du système d'imagerie multi- photonique selon l'invention, celui-ci comprend en particulier des moyens de détection à trois canaux,
un premier canal correspondant à une première absorption à deux photons, les deux photons absorbés provenant du premier faisceau d'excitation ;
un deuxième canal correspondant à une deuxième absorption à deux photons, les deux photons absorbés provenant du deuxième faisceau d'excitation ; et
un troisième canal correspondant à une troisième absorption à deux photons, les deux photons absorbés provenant pour l'un du premier faisceau d'excitation et pour l'autre du deuxième faisceau d'excitation.
De préférence, le système d'imagerie multi-photonique selon l'invention forme un système parmi :
- un endoscope ;
- un microscope ;
un microscope à balayage point-par-point ;
un microscope à éclairage multi-points ;
un microscope à éclairage à nappe de lumière ;
- un système d'imagerie macroscopique.
On voit donc que l'invention n'est pas limitée à une application en particulier, mais peut être appliquée à diverses géométries d'imagerie multi- photonique. L'invention concerne également un procédé mis en œuvre dans un module selon l'invention. Selon ce procédé, on ajuste le réglage de la ligne à retard de façon à superposer spatialement et temporellement le deuxième faisceau d'excitation et la partie d'excitation du premier faisceau d'excitation , en détectant l'apparition d'un signal retour correspondant à l'excitation d'au moins un troisième des chromophores par absorption multi-photons, lesdits photons absorbés provenant des premier et deuxième faisceaux d'excitation.
En effet l'excitation dudit au moins troisième des chromophores suppose une absorption simultanée par ledit chromophore d'au moins un photon provenant du premier faisceau d'excitation et d'au moins un photon provenant de la partie d'excitation du premier faisceau d'excitation. Il faut donc pour cela que le deuxième faisceau d'excitation et la partie d'excitation du premier faisceau d'excitation soient superposés spatialement et temporellement. Le réglage de la ligne à retard est donc particulièrement simple à mettre en œuvre.
Selon un mode de réalisation privilégié du procédé selon l'invention, ce procédé met en œuvre des absorptions à deux photons, et on détecte trois signaux retour correspondant respectivement à :
- une absorption à deux photons, les deux photons absorbés provenant du premier faisceau d'excitation ;
une absorption à deux photons, les deux photons absorbés provenant du deuxième faisceau d'excitation ; et
une absorption à deux photons, les deux photons absorbés provenant pour l'un du premier faisceau d'excitation et pour l'autre du deuxième faisceau d'excitation.
Dans ce mode de réalisation privilégié, on peut ajuster l'intensité relative du signal retour correspondant à une absorption à deux photons, les deux photons absorbés provenant pour l'un du premier faisceau d'excitation et pour l'autre du deuxième faisceau d'excitation, en ajustant le réglage de la ligne à retard .
En effet, selon que le deuxième faisceau d'excitation et la partie d'excitation du premier faisceau d'excitation soient parfaitement ou non superposés spatialement et temporellement, la probabilité d'absorptions simultanées d'un photon de chacun des deux faisceaux d'excitation est plus ou moins élevée. Il s'ensuit que l'intensité du signal retour correspondant est plus ou moins élevée. On peut donc ajuster l'intensité dudit signal retour sans modifier les intensités des deux autres signaux retour correspondant respectivement à l'absorption de deux photons du premier signal d'excitation ou deux photons du deuxième signal d'excitation.
En particulier, dans ce même mode de réalisation privilégié, on peut ajuster indépendamment l'intensité relative des trois signaux retour en ajustant respectivement :
l'intensité de sortie de la première source laser femtoseconde ;
l'intensité de sortie de la deuxième source laser femtoseconde ; et le réglage de la ligne à retard.
On voit donc que le mode de réalisation de l'invention associé à des absorptions à deux photons est particulièrement avantageux, puisqu'il permet ces ajustements indépendants de chacun des signaux retours.
Le procédé selon l'invention peut être mis en œuvre pour exciter des chromophores émettant des signaux retour dits « de fluorescence » espacés d'au moins 50 nm les uns des autres, où chaque signal retour est exprimé en unité de longueur d'onde.
Description des figures et modes de réalisation
D'autres avantages et particularités de l'invention apparaîtront à la lecture de la description détaillée de mises en œuvre et de modes de réalisation nullement limitatifs, et des dessins annexés suivants :
- la figure 1 illustre un mode de réalisation de module et de système selon l'invention ;
- la figure 2 illustre les premiers et deuxième faisceaux d'excitation en l'absence de ligne à retard mettant en œuvre leur superposition spatiale et temporelle ;
- les figures 3A à 3D illustrent les absorptions multi-photons mises en œuvre dans un mode de réalisation de module et de système selon l'invention ; - la figure 4 illustre des spectres d'excitation de différentes protéines fluorescentes ;
- les figures 5A et 5B illustrent différentes acquisitions pouvant être obtenues grâce aux module et système selon l'invention ;
- la figure 6 illustre des spectres d'excitation de différentes protéines fluorescentes, et les largeurs spectrales de détection des canaux de détection associés ;
- la figure 7 illustre des signaux retour acquis dans un système selon l'invention, en faisant varier un retard temporel entre les premier et deuxième faisceaux d'excitation ; et
- les figures 8A à 8D illustrent un test de recouvrement spatial optimal entre le premier et le deuxième faisceau d'excitation.
On va tout d'abord décrire, en référence à la figure 1, un premier mode de réalisation de module 1 pour un système d'imagerie multi-photoniquelOO.
Dans toute la suite, on développera l'exemple d'un module 1 selon l'invention, pour imager simultanément trois chromophores d'un échantillon grâce à des absorptions à deux photons. Cependant, cet exemple n'est nullement limitatif et on pourra prévoir de mettre en œuvre le module et le système d'imagerie selon l'invention dans le cadre d'absorption à trois photons au moins, en vue d'imager simultanément quatre chromophores au moins d'un échantillon.
Lorsqu'on parle d'un chromophore, on désigne une substance donnée (et non une molécule individuelle).
Le module 1 selon l'invention comprend un oscillateur titane : saphir 2 (Ti : S) émettant un premier faisceau d'excitation 20 à une longueur d'onde λι égale à 820 nm. L'oscillateur titane : saphir 2 est un laser femtoseconde, c'est-à-dire émettant un signal puisé dont les impulsions présentent une largeur de l'ordre de la dizaine voir la centaine de femtosecondes. La longueur d'onde d'émission λι de cet oscillateur est choisie notamment pour pouvoir exciter par absorption multi-photons au moins un chromophore d'un échantillon à étudier. L'oscillateur titane : saphir 2 (Ti : S) doit être excité par une diode d'excitation. Le module 1 selon l'invention ne comprend qu'une unique diode d'excitation. Une partie du premier faisceau d'excitation 20 est amenée jusqu'à un oscillateur paramétrique optique (OPO) 3 pour servir de faisceau de pompe. Un miroir dichroïque 41 agencé à 45° (angle en degrés où 180° vaut π radians) sur le chemin optique du premier faisceau d'excitation 20 en amont de l'OPO sépare d'une partie cette partie dite « de pompage » du premier faisceau d'excitation, et d'autre par une partie dite « d'excitation » du premier faisceau d'excitation .
L'oscillateur paramétrique optique (OPO) 3 émet alors un deuxième faisceau d'excitation 30 à une longueur d'onde λ2 égale à 1180 nm . La longueur d'onde d'émission λ2 de cet oscillateur est choisie notamment pour pouvoir exciter par absorption multi-photons au moins un chromophore de l'échantillon à étudier.
Les deux longueurs d'onde d'émission λι et λ2 de ces oscillateurs sont choisies notamment pour pouvoir exciter par absorption multi-photons mélangeant ces deux longueurs d'onde, au moins un chromophore de l'échantillon à étudier.
Le miroir dichroïque 41 agencé à 45° sur le chemin optique du premier faisceau d'excitation 20 dirige la partie d'excitation du premier faisceau d'excitation vers une ligne à retard 4 du module 1 selon l'invention .
La ligne à retard 4 comprend au moins deux réflecteurs 42 définissant un chemin optique supplémentaire pour la partie d'excitation du premier faisceau d'excitation 20.
La ligne à retard comprend en outre un deuxième miroir dichroïque 43, agencé pour replacer sur le même chemin optique le deuxième faisceau d'excitation 30 et la partie d'excitation du premier faisceau d'excitation 20. Le miroir dichroïque 43 est agencé à 45° sur le chemin optique du deuxième faisceau d'excitation et de la partie d'excitation du premier faisceau d'excitation . Le deuxième faisceau d'excitation traverse le miroir dichroïque 43 sans être dévié. La partie d'excitation du premier faisceau d'excitation est dévié à 90° par le miroir dichroïque 43.
Dans toute la suite de la description des figures, et pour des raisons de concision, on appellera simplement « premier faisceau d'excitation 20 » la partie du premier faisceau d'excitation 20 qui a été amenée vers la ligne à retard 4. Sur la figure 1, et pour des raisons de lisibilité de la figure, le deuxième faisceau d'excitation 30 et le premier faisceau d'excitation 20 ne sont pas superposés. En réalités, ces deux faisceaux sont bien évidement superposés spatialement.
On peut prévoir des éléments optiques tels qu'un télescope 90 à l'intérieur de la ligne à retard 4, afin d'assurer un recouvrement spatial des impulsions, en contrôlant la taille et la divergence de la partie d'excitation du premier faisceau d'excitation, indépendamment du deuxième faisceau d'excitation .
Dans l'exemple représenté à la figure 1, un deuxième télescope 90' est également agencé sur le chemin optique du deuxième faisceau d'excitation seul, en amont du deuxième miroir dichroïque 43.
Chaque télescope 90, 90' permet d'ajuster de façon indépendante la divergence de chaque faisceau d'excitation, et de préférence de façon indépendante également la taille de ces faisceaux.
On peut utiliser par exemple des télescopes à trois ou quatre lentilles. On pourrait aussi imaginer que ces systèmes de conditionnement des faisceaux soient basés sur des éléments d'optique active ou adaptative. L'invention consiste à superposer dans l'espace et dans le temps au moins deux trains d'impulsions de longueurs d'onde différentes (premier et deuxième faisceaux d'excitation), dans un système d'imagerie multi- photonique tel qu'un microscope multi-photonique.
Grâce à une telle superposition, différents types de chromophores d'un échantillon peuvent émettre simultanément un signal de fluorescence en réponse à l'absorption respectivement de deux photons du premier train d'impulsion, de deux photons du deuxième train d'impulsion, ou de deux photons provenant chacun de l'un des deux trains d'impulsion . On va maintenant décrire, toujours en référence à la figure 1, les éléments du système d'imagerie multi-photoniquelOO selon l'invention, outre le module 1 qui vient d'être décrit.
En sortie deuxième miroir dichroïque 43, les premier et deuxième faisceaux d'excitation 20, 30 sont dirigés vers des moyens de balayage 5 dans le plan (xOy), puis des moyens de balayage 6 selon l'axe (Oz) correspondant à l'axe de la profondeur d'un échantillon 7.
Les moyens de balayage 6 comprennent également des optiques de focalisation pour focaliser les signaux d'excitation à un endroit voulu dans l'échantillon 7.
L'échantillon 7 comprend au moins trois chromophores émettant un signal de fluorescence en réponse à l'absorption :
- de deux photons à 820 nm ;
- de deux photons à 1180 nm ; ou
- d'un photon à 820 nm et un photon à 1180 nm.
Les différents signaux de fluorescence sont émis en réflexion. Un miroir dichroïque 80 les dévie vers un étage de détection comprenant un canal respectif 81, 81', 81" pour chacun des trois signaux de fluorescence 82, 82', 82".
On peut ainsi détecter à la fois les signaux produits par un oscillateur pris individuellement, et le signal produit par mélange de fréquence entre ces deux oscillateurs.
On peut ainsi, avec une chaîne d'excitation comportant deux lasers synchronisés, exciter simultanément trois types de chromophores spectralement très distincts. On peut parler notamment d'imagerie multi- photons multi-couleurs par impulsions synchronisées, ou d'imagerie multi- photons multi-couleurs par combinaison de fréquences.
On peut notamment imager simultanément trois signaux de protéines fluorescentes bleues, jaunes, et rouges ou bleues, vertes, et rouges.
La figure 2 permet d'illustrer le principe mis en œuvre selon l'invention. La figure 2 illustre les trains d'impulsion en fonction du temps, et en l'absence de ligne à retard 4, du premier faisceau d'excitation 20 (traits épais) et du deuxième faisceau d'excitation 30 (traits pointillés). La ligne à retard permet en particulier d'annuler l'écart temporel At entre les deux trains d'impulsions.
On voit que l'invention permet d'exciter simultanément :
- (voir figure 3A) un chromophore absorbant deux photons du premier faisceau d'excitation 20, produisant un signal retour à la longueur d'onde λι/2, soit 410 nm (bleu) dans l'exemple développé ici ; - (voir figure 3C) un chromophore absorbant deux photons du deuxième faisceau d'excitation 30, produisant un signal retour à la longueur d'onde Â2/2, soit 590 nm (rouge) dans l'exemple développé ici ;
- (voir figure 3B) un chromophore absorbant un photon du premier faisceau d'excitation 20 et un photon du deuxième faisceau d'excitation 30, produisant un signal retour à la longueur d'onde , soit 484 nm (jaune)
dans l'exemple développé ici, ce qui correspondrait à une absorption de deux photons d'un faisceau d'excitation central à la longueur d'onde 968 nm . On parle dont ici d'un troisième faisceau d'excitation, virtuel .
La figure 3D illustre les signaux d'excitation utilisés, notamment le signal d'excitation virtuel recréé artificiellement grâce à l'invention . L'axe des abscisses correspond à une longueur d'onde en nm, l'axe des ordonnées à une intensité en unité arbitraire. La figure 4 illustre sur un axe des abscisses correspondant à une longueur d'onde exprimée en nm (nanomètres) :
- le spectre d'excitation (axe des ordonnées en unité arbitraire, correspondant à une puissance absorbée) de différentes protéines fluorescentes ; et
- les signaux d'excitation (axe des ordonnées en unité arbitraire, correspondant à une intensité lumineuse), notamment le signal d'excitation virtuel recréé artificiellement grâce à l'invention .
On voit que les signaux d'excitation obtenus artificiellement ou non selon l'invention correspondent à des pics d'absorption de plusieurs protéines fluorescentes qui vont ainsi pouvoir être imagées grâce à un module 1 et un système d'imagerie multi-photoniquelOO selon l'invention .
La courbe 401 correspond à une protéine eCFP (pour « Enhanced Cyan
Fluorescent Protein », c'est-à-dire une protéine émettant un signal retour dit
« de fluorescence » bleu cyan) .
La courbe 402 correspond à une protéine eYFP (pour « Enhanced Yellow
Fluorescent Protein », c'est-à-dire une protéine émettant un signal retour dit
« de fluorescence » jaune) . La courbe 403 correspond à une protéine tdTomato (une protéine émettant un signal retour dit « de fluorescence » rouge vif) .
La courbe 404 correspond à une protéine mCherry (une protéine émettant un signal retour dit « de fluorescence » rouge cerise) .
On a pu par exemple imager un tissu cérébral de souris marqué par ces différentes protéines. On peut parler de « technique brainbow » pour désigner cette technique de marquage.
Chaque longueur d'onde d'excitation (notamment la longueur d'onde dite « virtuelle » et correspondant audit signal d'excitation central) peut exciter plusieurs types de chromophores différents. Cela apparaît ici pour le signal à 1100 nm qui correspond à un maximum d'absorption à la fois pour les protéines mCherry et tdTomato.
On peut citer dans le tableau ci-dessous différents groupes de trois chromophores pouvant être imagés simultanément grâce à un module 1 et un système d'imagerie multi-photonique 100 selon l'invention .
Les noms des chromophores sont indiqués entre parenthèses, séparés par des virgules lorsque plusieurs chromophores peuvent être utilisés.
Figure imgf000020_0001
On va maintenant décrire en référence aux figure 5A et 5B un procédé de réglage de la ligne à retard 4 selon l'invention . On voit à la figure 1 que les réflecteurs 42 de la ligne à retard 4 peuvent être montés sur une translation motorisée, de façon à pouvoir ajuster le réglage de ladite ligne à retard pour superposer au mieux les deux faisceaux d'excitation 20, 30.
Le contrôle du retard induit par la ligne à retard 4 sur le premier faisceau d'excitation 20 fournit également un moyen d'ajuster l'intensité lumineuse du signal retour obtenu par mélange de fréquence (absorption de deux photons, l'un provenant du premier faisceau d'excitation et l'autre provenant du deuxième faisceau d'excitation), indépendamment des signaux retour ne dépendant que d'un seul faisceau d'excitation . En outre, l'existence d'un troisième signal retour obtenu par mélange de fréquence confirme que les premier et deuxième signaux d'excitation sont spatialement et temporellement superposés avec une précision égale à la résolution du système d'imagerie multi-photoniquelOO. On voit donc que l'invention offre un « test d'alignement » particulièrement simple à mettre en œuvre.
Le contrôle de la puissance moyenne des deux faisceaux d'excitation permet en outre de contrôler les intensités relatives des trois signaux retour.
Les intensités des signaux retour dits de fluorescences sont en effet respectivement, proportionnelles à :
- Pi2, où Pi est la puissance moyenne de la partie d'excitation du premier faisceau d'excitation 20 (absorption de deux photons du premier faisceau d'excitation) ;
- P2 2, où P2 est la puissance moyenne du deuxième faisceau d'excitation 30 (absorption de deux photons du deuxième faisceau d'excitation) ;
- 2PiP2g(x) où τ est le délai entre les deux trains d'impulsions respectivement du premier et du deuxième faisceau d'excitation, en aval de la ligne à retard (absorption de deux photons, l'un de la partie d'excitation du premier faisceau d'excitation et l'autre du deuxième faisceau d'excitation), et g est la fonction d'inter-corrélation temporelle des deux faisceaux d'excitation, proportionnelle à exp(-x2) dans le cas des faisceaux d'excitation à profils temporels gaussiens.
Ce principe est illustré aux figures 5A et 5B qui présentent chacune de droite à gauche : - l'image obtenue grâce au signal retour correspondant à une absorption de deux photons du premier faisceau d'excitation ;
- l'image obtenue grâce au signal retour correspondant à une absorption de deux photons, l'un du premier faisceau d'excitation et l'autre du deuxième faisceau d'excitation ; et
- l'image obtenue grâce au signal retour correspondant à une absorption de deux photons du deuxième faisceau d'excitation.
L'échantillon imagé est un drosophile avec un triple marquage fluorescent bleu, vert et rouge.
A la figure 5A, les impulsions du premier et du deuxième faisceau d'excitation sont parfaitement synchronisées par la ligne à retard (τ = 0 fs).
L'image centrale montre alors la présente d'un fort signal retour correspondant à une absorption de deux photons l'un du premier faisceau d'excitation et l'autre du deuxième faisceau d'excitation.
A la figure 5B, les impulsions du premier et du deuxième faisceau d'excitation sont non parfaitement synchronisées (τ = 350 fs).
L'image centrale montre alors la présente d'un très faible signal retour correspondant à une absorption de deux photons l'un du premier faisceau d'excitation et l'autre du deuxième faisceau d'excitation.
On peut également utiliser ce résultat pour compenser des effets d'interférence dits de « cross talk » entre le premier et le deuxième faisceau d'excitation, et qui tendent à diminuer l'intensité relative du signal retour correspondant à une absorption de deux photons, l'un du premier faisceau d'excitation et l'autre du deuxième faisceau d'excitation.
On peut également utiliser ce principe pour maintenir constantes au cours du temps les intensités absolues des trois signaux de retour tels que détectés, lors d'un balayage en profondeur d'un échantillon (faisant par conséquent varier un coefficient d'atténuation des faisceaux d'excitation et des signaux retour).
Les acquisitions sont obtenues avec des pixels de dimensions 0,8*0,8*3 pm3. On réalise par exemple des images en trois dimensions grâce à un balayage dans le sens de la profondeur de l'échantillon, par exemple une image en trois dimensions toutes les 45 secondes. La figure 6 présente un avantage supplémentaire d'une détection simultanée multi-canal.
L'axe des abscisses correspond à une longueur d'onde en nm.
L'axe des ordonnées correspond à une intensité de signal retour, en unité arbitraire.
Les courbes 601, 602 et 603 correspondent à des spectres de signal retour.
La courbe 601 correspond à une protéine endo émettant un signal retour dit « de fluorescence » bleu).
La courbe 602 correspond à une protéine GFP (pour « green fluorescent protein », c'est-à-dire une protéine émettant un signal retour dit « de fluorescence » vert.
La courbe 603 correspond à une protéine RFP (pour « red fluorescent protein », c'est-à-dire une protéine émettant un signal retour dit « de fluorescence » rouge.
Les créneaux en pointillés 611, 612, 613 correspondent respectivement :
- à la largeur spectrale détectée par le canal de détection dédié au signal de retour bleu ;
- à la largeur spectrale détectée par le canal de détection dédié au signal de retour vert ;
- à la largeur spectrale détectée par le canal de détection dédié au signal de retour rouge.
L'émission étant simultanée, la détection l'est également. On peut donc, pour chaque canal (ici plus particulièrement pour le canal correspondant au créneau 612), séparer les contributions des différents signaux retour.
Pour séparer les contributions de deux chromophores A et B dans des canaux Cl et C2, on résout l'équation linéaire suivante :
Figure imgf000023_0001
- RAI, respectivement RA2, est la contribution normalisée (connue) du chromophore A dans le canal Cl respectivement C2, et
- RB1, respectivement RB2, est la contribution normalisée (connue) du chromophore A dans le canal Cl respectivement C2,
- Cl et C2sont des intensités mesurées. - A et B sont des intensités à déterminer.
La figure 7 illustre les signaux retour 404, 401 et 402 de la figure 4.
L'axe des abscisses correspond au retard τ en femtosecondes entre le deuxième faisceau d'excitation et la partie d'excitation du premier faisceau d'excitation, en sortie de la ligne à retard.
L'axe des ordonnées correspond à l'intensité en unité arbitraire.
Comme vu précédemment, on illustre ainsi le fait que l'apparition d'un signal retour supplémentaire (correspondant à une absorption multi-photons de photons provenant à la fois du premier et du deuxième faisceau d'excitation) indique un réglage optimal du recouvrement temporel entre les premier et deuxième faisceaux d'excitation.
Les figures 8A à 8D illustrent plus particulièrement un test de recouvrement spatial optimal entre le deuxième faisceau d'excitation, et la partie d'excitation du premier faisceau d'excitation, en aval de la ligne à retard. On se place dans l'exemple particulier d'une absorption à deux photons avec émission :
- d'un signal retour rouge correspondant à l'absorption de deux photons du même faisceau d'excitation ;
- d'un signal retour bleu correspondant à l'absorption de deux photons du même faisceau d'excitation ; et
- le cas échéant d'un signal retour vert correspondant à l'absorption d'un photon du premier signal d'excitation et un photon du deuxième signal d'excitation.
La figure 8A illustre les zones de focalisation 81 et 82 respectivement du premier et du deuxième faisceau d'excitation, lorsque le recouvrement spatial n'est pas réalisé entre ces deux faisceaux.
La figure 8B montre l'image obtenue dans ce cas. On obtient deux signaux distincts, l'un rouge et l'autre bleu.
La figure 8C illustre les zones de focalisation 181 et 182 respectivement du premier et du deuxième faisceau d'excitation, lorsque le recouvrement spatial est réalisé entre ces deux faisceaux. La figure 8D montre l'image obtenue dans ce cas. On obtient un seul signal blanc, correspondant à la superposition trois signaux distincts, rouge, bleu et vert.
On voit ainsi que l'observation de l'image obtenue permet de régler de façon optimale le recouvrement spatial entre le premier et le deuxième faisceau d'excitation .
Selon l'art antérieur, on acquiert successivement le signal retour bleu et le signal retour rouge, puis on superpose sur une même image les images correspondantes à ces signaux. Cependant, en raison d'éventuelles aberrations chromatiques des optiques de focalisation 6, les images correspondant respectivement au signal rouge et au signal bleu peuvent être déformées et déformées différemment, en particulier en bord de champ de vision (ces déformations proviennent de l'impact, sur les signaux d'excitation correspondant, des aberrations chromatiques que présentent les optiques de focalisation 6) . En pratique, on se place au centre du champ de vision . Ensuite on annule, en réglant les télescopes 90 et 90', un décalage entre la distance de focalisation du premier signal d'excitation et celle du deuxième signal d'excitation . Pour cela, on cherche à détecter un signal bleu et un signal rouge provenant d'un même plan de focalisation (les deux signaux correspondant chacun à une absorption multi-photons de plusieurs photons provenant du même signal d'excitation) .
Ensuite, on annule le décalage temporel entre les deux signaux d'excitation, grâce à la ligne à retard . L'apparition d'un troisième signal correspondant à une absorption multi-photons d'au moins un photon du premier signal d'excitation et au moins un photon du deuxième signal d'excitation indique quand ce décalage est annulé. Pour cette étape, on observe toujours les signaux retour au centre du champ de vision, là où ils ne sont pas déformés par des aberrations chromatiques.
En peut enfin vérifier en bord de champ de vision à partir de quel angle les aberrations chromatiques des optiques de focalisation deviennent gênantes pour un bon recouvrement des deux signaux d'excitation, en utilisant le test illustré par les figures 8A à 8D. Plus précisément, on s'éloigne petit à petit du centre du champ de vision et on repère la disparition du troisième signal retour. Grâce à l'invention, on obtient une image finale regroupant les différents signaux retour bien plus proche de la réalité. En effet, l'absence du troisième signal retour montre que l'on a atteint une zone du champ de vision correspondant à des images rouges et bleues déformées. On peut donc supprimer cette partie du signal retour et ne conserver que le signal retour non affecté par des aberrations chromatiques.
Bien sûr, l'invention n'est pas limitée aux exemples qui viennent d'être décrits et de nombreux aménagements peuvent être apportés à ces exemples sans sortir du cadre de l'invention.
En particulier toutes les caractéristiques, formes, variantes et modes de réalisation décrits précédemment sont combinables entre eux selon diverses combinaisons dans la mesure où ils ne sont pas incompatibles ou exclusifs les uns des autres.

Claims

REVENDICATIONS
1. Module (1) pour un système d'imagerie multi-photonique (100), pour exciter simultanément au moins trois chromophores d'un échantillon, ledit module (1) comprenant :
une première source laser femtoseconde (2), émettant un premier faisceau d'excitation (20) sous forme d'impulsions présentant un taux de répétition 1/T et une longueur d'onde λι apte à exciter l'un premier des chromophores par absorption multi-photons, lesdits photons absorbés provenant du premier faisceau d'excitation ;
une deuxième source laser femtoseconde, émettant un deuxième faisceau d'excitation (30) sous forme d'impulsions à une longueur d'onde λ2 apte à exciter l'un deuxième des chromophores par absorption multi-photons, lesdits photons absorbés provenant du deuxième faisceau d'excitation ;
caractérisé en ce que :
le premier faisceau d'excitation (20) comprend une partie dite « d'excitation » servant à exciter l'échantillon, et une partie dite « de pompage », cette partie de pompage servant de faisceau de pompe pour exciter de façon synchrone la deuxième source laser femtoseconde (3) , de façon que la deuxième source laser soit synchrone avec la première source laser (3), c'est-à-dire de même taux de répétition 1/T, et
- une ligne à retard optique (4) est agencée pour superposer spatialement et temporellement le deuxième faisceau d'excitation ( 30) et la partie d'excitation du premier faisceau d'excitation (20), de façon à exciter au moins un troisième des chromophores par absorption multi-photons, lesdits photons absorbés provenant des premier et deuxième faisceaux d'excitation (20, 30).
2. Module (1) selon la revendication 1, caractérisé par des moyens de séparation (41) agencés en amont de la deuxième source laser femtoseconde (3), pour séparer le premier faisceau d'excitation (20) en la partie d'excitation et la partie de pompage.
3. Module (1) selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que la première source laser femtoseconde (2) est formée par un laser Titane Saphir (TiS) ou un laser à fibre.
4. Module (1) selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la deuxième source de laser femtoseconde (3) est formée par un oscillateur paramétrique optique (OPO).
5. Module (1) selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'il est adapté pour exciter des chromophores émettant des signaux retour dits « de fluorescence » espacés d'au moins 50 nm les uns des autres, où chaque signal retour est exprimé en unité de longueur d'onde.
6. Module (1) selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que qu'il comprend en outre au moins un télescope agencé pour mettre en œuvre un recouvrement spatial, dans l'échantillon, du deuxième faisceau d'excitation (30) et de la partie d'excitation du premier faisceau d'excitation (20).
7. Module (1) selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que
la première source laser femtoseconde (2) émet un premier faisceau d'excitation (20) à une longueur d'onde λι apte à exciter l'un premier des chromophores par absorption à deux photons, lesdits photons absorbés provenant du premier faisceau d'excitation;
la deuxième source laser femtoseconde (3) émet un deuxième faisceau d'excitation (30) à une longueur d'onde λ2 apte à exciter l'un deuxième des chromophores par absorption à deux photons, lesdits photons absorbés provenant du deuxième faisceau d'excitation; et
la ligne à retard optique (4) est agencée pour superposer spatialement et temporellement le deuxième faisceau d'excitation (30) et la partie d'excitation du premier faisceau d'excitation (20), de façon à exciter un troisième des chromophores par absorption à deux photons, les deux photons provenant pour l'un du premier faisceau d'excitation (20) et pour l'autre du deuxième faisceau d'excitation (30).
8. Système d'imagerie multi-photonique (100) comprenant un module (1) selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce qu'il comprend en outre des moyens de détection à au moins trois canaux (81, 81', 81"), chaque canal étant agencé pour détecter un signal retour respectif associé à une absorption multi-photons correspondante.
9. Système d'imagerie multi-photonique (100) selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il comprend en particulier des moyens de détection à trois canaux,
un premier canal (81 ; 81' ; 81") correspondant à une première absorption à deux photons, les deux photons absorbés provenant du premier faisceau d'excitation (20);
un deuxième canal (81" ; 81 ; 81') correspondant à une deuxième absorption à deux photons, les deux photons absorbés provenant du deuxième faisceau d'excitation (30); et
un troisième canal (81' ; 81", 81) correspondant à une troisième absorption à deux photons, les deux photons absorbés provenant pour l'un du premier faisceau d'excitation (20) et pour l'autre du deuxième faisceau d'excitation (30).
10. Système d'imagerie multi-photonique (100) selon la revendication 8 ou 9, caractérisé en ce qu'il forme un système parmi :
- un endoscope ;
- un microscope ;
un microscope à balayage point-par-point ;
un microscope à éclairage multi-points ;
- un microscope à éclairage à nappe de lumière ;
un système d'imagerie macroscopique.
11. Procédé mis en œuvre dans un module selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que l'on ajuste le réglage de la ligne à retard (4) de façon à superposer spatialement et temporellement le deuxième faisceau d'excitation (30) et la partie d'excitation du premier faisceau d'excitation (20), en détectant l'apparition d'un signal retour correspondant à l'excitation d'au moins un troisième des chromophores par absorption multi- photons, lesdits photons absorbés provenant des premier et deuxième faisceaux d'excitation (20, 30).
12. Procédé selon la revendication 11, caractérisé qu'il met en œuvre des absorptions à deux photons et en ce que l'on détecte trois signaux retour correspondant respectivement à :
- une absorption à deux photons, les deux photons absorbés provenant du premier faisceau d'excitation (20);
une absorption à deux photons, les deux photons absorbés provenant du deuxième faisceau d'excitation (30); et
une absorption à deux photons, les deux photons absorbés provenant pour l'un du premier faisceau d'excitation (20) et pour l'autre du deuxième faisceau d'excitation (30).
13. Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que l'on ajuste l'intensité relative du signal retour correspondant à une absorption à deux photons, les deux photons absorbés provenant pour l'un du premier faisceau d'excitation (20) et pour l'autre du deuxième faisceau d'excitation (30), en ajustant le réglage de la ligne à retard (4).
14. Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que l'on ajuste indépendamment l'intensité relative des trois signaux retour en ajustant respectivement :
l'intensité de sortie de la première source laser femtoseconde (2) ;
l'intensité de sortie de la deuxième source laser femtoseconde (3) ; et le réglage de la ligne à retard (4).
15. Procédé selon l'une quelconque des revendications 11 à 14, caractérisé en ce qu'il est mis en œuvre pour exciter des chromophores émettant des signaux retour dits « de fluorescence » espacés d'au moins 50 nm les uns des autres, où chaque signal retour est exprimé en unité de longueur d'onde.
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