JP6225798B2 - 分析装置及び分析方法 - Google Patents

Description

本発明は、抗体、抗原等の生体物質を分析するための分析装置及び分析方法に関する。

疾病に関連付けられた特定の抗原または抗体をバイオマーカーとして検出することで、疾病の発見や治療の効果等を定量的に分析する免疫検定法（immunoassay）が知られている。酵素により標識された抗原または抗体を検出するＥＬＩＳＡ法（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay）は、免疫検定法の一つであり、コスト等のメリットから広く普及している。ＥＬＩＳＡ法は、前処理、抗原抗体反応、Ｂ／Ｆ（bond/free）分離、酵素反応等を合計した時間が、数時間から１日程度であり、長時間を要する。

これに対して、光ディスクに固定された抗体と試料中の抗原を結合させ、抗原と抗体を有する粒子とを結合させ、光ヘッドで走査することにより、ディスク上に捕捉された粒子を短時間に計数する技術が提案されている（特許文献１）。また、光ディスクのトラッキング構造が形成される面に生体試料や粒子を付着させ、光ピックアップで信号の変化を検出する技術が提案されている（特許文献２）。

特開平５−５７４１号公報 特表２００２−５３０７８６号公報

しかしながら、特許文献１及び２に記載の技術は、粒子の種類及び配置等により、粒子に対応した検出信号が得られず、粒子の計数結果が不正確となる可能性がある。さらに、例えば粒子が、複数の抗原を有するエキソソーム等の検出対象を標識する場合等には、基板に固定された検出対象と粒子との数が対応しない場合がある。このように、従来技術では検出対象に対する定量性が悪化するおそれがある。
上記問題点を鑑み、本発明は、検出対象に対する定量性を向上できる分析装置及び分析方法を提供することを目的とする。

本発明の第１の態様は、基板の表面に検出対象が固定され、前記検出対象に前記検出対象を標識する粒子が結合している基板を、前記粒子の直径よりも長い波長を有するレーザ光を用いて光学的に走査する光走査部と、前記光走査部が前記基板を走査することにより前記光走査部から取得される検出信号に含まれるパルス波及び前記パルス波のパルス幅を検出するパルス検出部と、前記パルス検出部において第１基準値未満のパルス幅をそれぞれ有する２つのパルス波が２回連続して検出され、前記２つのパルス波の間隔が所定の間隔未満であるとき、１個の前記検出対象に２個の前記粒子が結合している状態であると判断して、前記検出対象の数を１として計数する計数部とを備えることを特徴とする分析装置である。

本発明の第２の態様は、光走査部が、基板の表面に検出対象が固定され、前記検出対象に前記検出対象を標識する粒子が結合している基板を、前記粒子の直径よりも長い波長を有するレーザ光を用いて光学的に走査し、パルス検出部が、前記光走査部が前記基板を走査することにより前記光走査部から取得される検出信号に含まれるパルス波及び前記パルス波のパルス幅を検出し、前記パルス検出部において第１基準値未満のパルス幅をそれぞれ有する２つのパルス波が２回連続して検出され、前記２つのパルス波の間隔が所定の間隔未満であるとき、計数部が、１個の前記検出対象に２個の前記粒子が結合している状態であると判断して、前記検出対象の数を１として計数することを特徴とする分析方法である。

本発明の分析装置及び分析方法によれば、検出信号のパルス幅に応じて、加算する数を変更することにより、検出対象に対する定量性を向上できる。

本発明の実施の形態に係る分析装置の基本的な構成を説明する模式的なブロック図である。 （ａ）〜（ｆ）は、本発明の実施の形態に係る分析装置の基板に抗体、抗原、ビーズを固定する方法の一例を説明する模式的な基板の拡大断面図である。 基板において、１個のエキソソームに２個のビーズ６６が結合する様子を示す模式的な図である。 基板を走査するときのスポット位置と信号強度との特性を隣接するビーズの数毎に示すシミュレーション結果である。 本発明の実施の形態に係る分析装置の基板を走査する際のスポット位置と信号強度との特性を隣接するビーズの数毎に示す図である。 本発明の実施の形態に係る分析装置の記憶部が記憶する基準値の決定方法を説明する図である。 本発明の実施の形態に係る分析装置の記憶部が記憶する基準値の決定方法を説明する図である。 本発明の実施の形態に係る分析装置の動作を示すフローチャートである。 本発明の実施の形態に係る分析装置の動作を説明する図である。 本発明の実施の形態に係る分析装置の動作を説明する図である。 本発明の実施の形態に係る分析装置におけるバイオマーカー濃度とビーズ計数結果との特性を従来装置と比較する図である。

次に、図面を参照して、本発明の実施の形態を説明する。以下の図面の記載において、同一または類似の部分には同一または類似の符号を付し、重複する説明を省略している。

（分析装置）
本発明の実施の形態の分析装置は、図１に示すように、基板１００と、基板１００を回転させるモータ２と、基板１００を光学的に走査する光走査部３と、モータ２及び光走査部３を制御する制御部５とを備える。

基板１００は、例えば、コンパクトディスク（ＣＤ）、デジタルバーサタイルディスク（ＤＶＤ）、ブルーレイディスク（ＢＤ）等の光ディスクと同等の寸法を有する円盤状である。基板１００は、表面に光走査部３が走査可能なトラック構造を有する。トラック構造は、グルーブ、ランド、ピット等からなり、内周側から外周側にスパイラル状に形成される。基板１００は、例えば、一般の光ディスクに用いられるポリカーボネート樹脂やシクロオレフィンポリマー等の疎水性を有する樹脂材料からなる。また、基板１００表面には必要に応じて、薄膜形成やシランカップリング剤などによる表面処理を施すこともできる。

基板１００は、図２に示すように、検出対象の生体物質である抗原６２と特異的に結合する抗体６１が表面に固定される。抗原６２が、表面に抗原６２と特異的に結合する抗体６５が固定されたビーズ（粒子）６６によって標識されることにより、抗原６２及びビーズ６６は、基板１００の表面に対して相対的に固定される。抗原６２は、抗体６１及び抗体６５と特異的に結合することにより、疾病等の指標となるバイオマーカーとして用いられる。

図２（ａ）に示すように、基板１００は、予め、表面に抗体６１が固定される。抗体６１は、疎水結合や共有結合により基板１００の表面に結合される。抗体６１は、アビジン等の物質を介して基板１００の表面に固定されてもよい。次に、図２（ｂ）に示すように、抗原６２を含む試料液６３が基板１００の表面に滴下される。抗原６２は、ブラウン運動により試料液６３中を移動することにより抗体６１と接触し、抗原抗体反応により、抗体６１と特異的に結合する。図２（ｃ）に示すように、基板１００に滴下された試料液６３を、純水等を用いてスピン洗浄することにより、抗体６１と結合しない余剰の抗原６２を含む試料液６３が除去される。

図２（ｄ）に示すように、ビーズ６６を含む緩衝液６４が基板１００の表面に滴下される。緩衝液６４は、試料液６３が残存するまま基板１００に滴下されてもよい。ビーズ６６の表面に固定された抗体６５は、抗原抗体反応により、抗原６２と特異的に結合する。次に、ビーズ６６は、抗原６２と結合することにより、抗原６２を標識する。

ビーズ６６は、例えば、フェライト等の磁性材料を内包するポリスチレン等の合成樹脂により略球形に形成される。ビーズ６６の直径は、数十ｎｍ〜数百ｎｍ程度であり、例えば直径２００ｎｍである。ビーズ６６は、緩衝液６４が滴下される際に基板１００の反対側に磁石が配置されることにより、迅速に基板１００の表面に集合され、抗原６２との反応を促進することができる。また、抗原６２とビーズ６６とが同時に投入されることにより、基板１００に固定された抗原６２を標識するまでの時間を数分程度に短縮することができる。

抗体６１及び抗体６５とは、抗原６２と特異的に結合する特異性生体物質であればよく、それぞれが別の部位と結合する組み合わせを選択する。例えば、複数種類の抗原６２が表面に発現しているエキソソーム等の膜小胞を検出対象とする場合は、抗体６１及び抗体６５は異なる種類とすることにより、２種類の抗原６２を有する生体試料を検出することができる。これに限らず、エキソソーム等は通常の抗原とは異なり、表面に同種のたんぱく質である抗原が複数存在していることから、抗体６１及び抗体６５は、同じ種類とされてもよい。

図２（ｅ）に示すように、基板１００に滴下された緩衝液６４を、純水等を用いて洗浄することにより、抗原６２と結合しない余剰のビーズ６６を含む緩衝液６４が除去される。図２（ｆ）に示すように、基板１００が光走査部３により光学的に走査され、ビーズ６６が検出されることにより、ビーズ６６に標識された抗原６２を分析することができる。

光走査部３は、図１に示すように、レーザ発振器３１と、コリメータレンズ３２と、ビームスプリッタ３３と、アクチュエータ３４と、対物レンズ３５と、集光レンズ３６と、光検出部３７とを備える。光走査部３は、基板１００を光学的に走査する光ピックアップである。

レーザ発振器３１は、制御部５の制御に応じて、コリメータレンズ３２に向けてレーザ光を射出する。レーザ発振器３１は、例えば、波長がＢＤの再生用と同一の４０５ｎｍであり、出力が１ｍＷ程度のレーザ光を射出する半導体レーザ発振器である。コリメータレンズ３２は、レーザ発振器３１から射出されたレーザ光を平行にする。ビームスプリッタ３３は、コリメータレンズ３２により平行にされたレーザ光を対物レンズ３５に向けて反射する。

対物レンズ３５は、制御部５の制御に応じたアクチュエータ３４の駆動により、ビームスプリッタ３３を経由したレーザ光を、抗体６１が固定された基板１００の表面に集光してスポットＳを結像する。対物レンズ３５は、例えば開口数が０．８５である。対物レンズ３５に集光されたレーザ光は、基板１００において反射し、ビームスプリッタ３３に入射する。入射したレーザ光は、ビームスプリッタ３３を透過し、集光レンズ３６を介して光検出部３７に入射する。集光レンズ３６は、基板１００において反射したレーザ光を光検出部３７に集光させる。光検出部３７は、例えばフォトダイオードからなり、基板１００から反射したレーザ光の光量に対応する検出信号を制御部５に出力する。

制御部５は、回転制御部２１を介して、モータ２の駆動を制御する。モータ２は、制御部５の制御により、線速度一定（ＣＬＶ）方式で基板１００を回転させる。線速度は、例えば４．９２ｍ／ｓである。

制御部５は、光学系制御部４を介して、レーザ発振器３１及びアクチュエータ３４の駆動を制御する。アクチュエータ３４は、制御部５の制御により、回転する基板１００の表面をスパイラル状に走査するように、光走査部３を基板１００の半径方向に移動させる。その他、制御部５は、光検出部３７から出力された検出信号から、フォーカスエラー（ＦＥ）やトラッキングエラー（ＴＥ）を等のエラーを検出する。制御部５は、検出したエラーに応じて、基板１００の表面を適正に走査するようにアクチュエータ３４等を制御する。

制御部５は、パルス検出部５１と、記憶部５２と、計数部５０とを備える。パルス検出部５１には、光検出部３７により出力された検出信号が入力される。パルス検出部５１は、光走査部３から取得される検出信号に含まれるパルス波及びパルス波のパルス幅を検出する。パルス検出部５１は、デジタルシグナルプロセッサ（ＤＳＰ）等の信号処理装置から構成される。記憶部５２は、半導体メモリ等の記憶装置から構成される。記憶部５２は、パルス検出部５１が検出するパルス波及びパルス幅に対する基準値等を記憶する。

計数部５０は、パルス検出部５１により検出されたパルス波と、記憶部５２が記憶する基準値に基づいて、基板１００の表面に固定された検出対象の個数を計数する。計数部５０は、中央演算処理装置（ＣＰＵ）等から構成される。計数部５０は、第１カウンタ５０１と、第２カウンタ５０２と、対象カウンタ５０３とを論理構造として有する。

第１カウンタ５０１は、パルス検出部５１により検出されたパルス波のパルス幅Ｔａを測定する。第２カウンタ５０２は、パルス検出部５１により検出されたパルス波のパルス幅Ｔａに応じて、次に検出されるパルス波との間のパルス間隔Ｔｂを測定する。対象カウンタ５０３は、第１カウンタ５０１及び第２カウンタ５０２の測定結果と、記憶部５２に記憶される基準値とに基づいて、ビーズ６６の個数を計数することにより、検出対象の個数を計数する。

仮に、図２（ｄ）に示す例において、ビーズ６６が複数の抗原６２を表面に有するエキソソーム等の生体物質を標識するとする。一般に、癌の早期発見等、微量のエキソソーム検出を想定する場合、液中のビーズ６６の量は、エキソソームの量と比較して過剰に投入される。エキソソームは、一般に５０ｎｍ〜１５０ｎｍ程度の様々な直径を有する。一方、ビーズ６６の直径は２００ｎｍ程度である。

よって、例えば図３に示すように、表面の抗原６２の１つが基板１００上の抗体６１に結合した１個のエキソソーム６２０に、２個のビーズ６６が結合することがある。すなわち、ビーズ６６を光学的に検出することによりエキソソーム６２０を検出する場合、互いに隣接する２個のビーズ６６に対応する２つのパルス波は、２個のビーズ６６の各抗体６５にそれぞれ標識された２つの抗原６２を有する１個のエキソソーム６２０である確率が極めて高い。なお図３は、基板１００の上面に貫通孔を有するウェル１１が配置され、ウェル１１の貫通孔と基板１００とが、液体が滴下される容器を構成する例を示している。

本発明の実施の形態に係る分析装置は、検出信号及び記憶部５２に記憶される基準値等に基づいて、検出されたパルス波が、互いに隣接する２個のビーズ６６によるものか否かを判断する。そして、互いに隣接する２個のビーズ６６によるものと判断されたパルス波のパターンが検出された場合、対応する走査範囲に存在するエキソソーム６２０の個数を１として計数することにより、検出対象であるエキソソーム６２０の定量性が向上される。

−基準値−
図４に示す３つの検出信号ＤＳ１〜ＤＳ３は、基板１００上のビーズ１個を想定した凸ピット１個、ビーズ２個を想定した隣接した凸ピット２個、隣接ビーズ３個を想定した隣接した凸ピット３個をそれぞれ走査する際の検出信号をシミュレーションした結果である。横軸はある区間における先頭のビーズ６６に対するスポットＳの位置、縦軸は検出信号をビーズ６６が存在しないときの検出信号で正規化した信号強度である。検出信号ＤＳ１〜ＤＳ３は、孤立する１個のビーズ６６から、２個、３個とビーズ６６の個数が増加する従い、パルス幅が大きくなると考えられた。

しかしながら、実際には、図５に示すように、互いに隣接する２個のビーズ６６を走査する際の実際の検出信号Ｄ２は、パルス幅が、孤立するビーズ６６を走査する際の検出信号Ｄ１よりもそれぞれ小さく、互いに同程度の２つのパルス波を含む。なお、３個のビーズ６６が互いに隣接する場合の検出信号も同様に、検出信号Ｄ２のパルス幅とほぼ等しく、検出信号Ｄ２よりパルス間隔が大きい２つのパルス波を含む。

このように、ビーズ６６の直径が走査するレーザ光の波長の１／２程度であり、隣接する複数のビーズ６６が存在する場合、ビーズ６６の計数結果が不正確になる可能性がある。発明者は、以上のような、一般の光ディスクのピットと異なる、光の波長以下の大きさの構造体（粒子）に対する光の作用を、有限差分時間領域（ＦＤＴＤ）法によりマクスウェル方程式を時間と空間変数に関して解くことにより明らかにした。

さらに、互いに隣接する２個のビーズ６６が基板１００上に存在する場合、２個のビーズ６６は、１個のエキソソーム６２０を標識している可能性が高い。本発明の実施の形態に係る分析装置によれば、後述するように、ビーズ６６の配置に応じた検出信号のパルス幅Ｔａ、パルス間隔Ｔｂ、及び記憶部５２に記憶される基準値に基づいて、エキソソーム６２０の個数を高精度に計数することができる。

記憶部５２は、図６に示すように、光走査部３が互いに隣接する２個のビーズ６６を走査する場合の検出信号Ｄ２の２つのパルス波の第１パルス幅Ｔ１と、第１パルス幅Ｔ１に応じて決定される第１基準値Ｔ２とを予め記憶する。第１基準値Ｔ２は、例えば、第１パルス幅Ｔ１と所定値の和である。第１パルス幅Ｔ１に加算される所定値は、検出信号が有するジッタ値とすればよい。第１パルス幅Ｔ１に加算される所定値は、ジッタ値の１００％〜１３０％程度としてもよい。その他、第１基準値Ｔ２は、第１パルス幅Ｔ１の所定の比率としてもよい。第１基準値Ｔ２の比率は、例えば第１パルス幅Ｔ１の１００％〜１３０％程度である。

記憶部５２は、図７に示すように、光走査部３が他のビーズ６６から孤立するビーズ６６を走査する場合の検出信号Ｄ１の第２パルス幅Ｔ３と、第２パルス幅Ｔ３に応じて決定される第２基準値Ｔ４とを予め記憶する。第２基準値Ｔ４は、例えば、第２パルス幅Ｔ３と所定値の和である。第２パルス幅Ｔ３に加算される所定値は、検出信号が有するジッタ値とすればよい。第２パルス幅Ｔ３に加算される所定値は、ジッタ値の１００％〜１３０％程度としてもよい。その他、第２基準値Ｔ４は、第２パルス幅Ｔ３の所定の比率としてもよい。第２基準値Ｔ４の比率は、例えば第２パルス幅Ｔ３の１００％〜１３０％程度である。

さらに、記憶部５２は、図６に示すように、光走査部３が互いに隣接する２個のビーズ６６を走査する場合の検出信号Ｄ２に含まれる２つのパルス波のパルス間隔Ｔ５と、パルス間隔Ｔ５に応じて決定される第３基準値Ｔ６とを予め記憶する。第３基準値Ｔ６は、例えば、パルス間隔Ｔ５と所定値の和である。パルス間隔Ｔ５に加算される所定値は、検出信号が有するジッタ値とすればよい。パルス間隔Ｔ５に加算される所定値は、ジッタ値の１００％〜１３０％程度としてもよい。その他、第３基準値Ｔ６は、パルス間隔Ｔ５の所定の比率としてもよい。第３基準値Ｔ６の比率は、例えば第パルス間隔Ｔ５の１００％〜１３０％程度である。

（分析方法）
図８のフローチャートを用いて、本発明の実施の形態に係る分析装置において、光走査部３が基板１００を光学的に走査し、計数部５０が基板１００に固定されたエキソソーム６２０を検出対象として計数することにより分析する方法を説明する。

まず、オペレータの操作により、制御部５の制御に応じた回転制御部２１及び光学系制御部４が、モータ２及び光走査部３の駆動をそれぞれ開始する。抗原抗体反応等により抗原６２及びビーズ６６が表面に固定された基板１００は、モータ２により線速度一定に回転され、光走査部３により光学的に走査される。光走査部３は、レーザ発振器３１から射出され基板１００の表面において反射したレーザ光を、光検出部３７において検出する。光検出部３７は、検出したレーザ光の光量に応じた検出信号をパルス検出部５１に出力する。

ステップＳ１において、パルス検出部５１は、光検出部３７から出力された検出信号を取得し、取得した検出信号の立ち下がりを検出する。パルス検出部５１は、ビーズ６６が走査される際の検出信号のピーク値の１／２程度の強度に設定された閾値を予め保持し、検出信号が閾値を下回る時点を検出信号の立ち下がりとして検出する。

次に、ステップＳ２において、第１カウンタ５０１は、図９に示すように、ステップＳ１において立ち下がりが検出された時点から、時間Ｔａの測定を開始する。

次に、ステップＳ３において、パルス検出部５１は、光検出部３７から取得した検出信号の立ち上がりを検出する。パルス検出部５１は、ビーズ６６が走査される際の検出信号のピーク値の１／２程度の強度に設定された閾値を予め保持し、検出信号が閾値を上回る時点を検出信号の立ち上がりとして検出する。

次に、ステップＳ４において、第１カウンタ５０１は、ステップＳ１において立ち下がりが検出された時点からステップＳ３において立ち上がりが検出された時間までの時間Ｔａを確定し、リセットする。対象カウンタ５０３は、第１カウンタ５０１により確定された時間Ｔａを取得し、ステップＳ１〜Ｓ３において検出されたパルス波のパルス幅（半値幅）Ｔａとして保持する。

次に、ステップＳ５において、対象カウンタ５０３は、記憶部５２から第１基準値Ｔ２を読み出し、ステップＳ４において保持したパルス幅Ｔａが第１基準値Ｔ２未満であるか否かを判定する。対象カウンタ５０３は、パルス幅Ｔａが第１基準値Ｔ２未満である場合、ステップＳ６に処理を進め、パルス幅Ｔａが第１基準値Ｔ２以上である場合、ステップＳ１１に処理を進める。

ステップＳ５においてパルス幅Ｔａが第１基準値Ｔ２未満である場合、ステップＳ６において、対象カウンタ５０３は、隣接フラグがハイ（Ｈｉｇｈ：１）であるか否かを判定する。隣接フラグは、対象カウンタ５０３において、第２カウンタ５０２に連動して設定されるフラグである。対象カウンタ５０３は、ステップＳ６において隣接フラグがハイである場合、ステップＳ７に処理を進め、隣接フラグがロー（Ｌｏｗ：０）である場合、ステップＳ１４に処理を進める。

仮に、図９に示す例において、検出信号Ｄ２がパルス検出部５１に入力され、１回目のパルス波の立ち上がりをステップＳ３においてパルス検出部５１が検出したとする。この場合、ステップＳ６において隣接フラグはローであり、計数部５０は、ステップＳ１４に処理を進める。

ステップＳ１４において、第２カウンタ５０２は、ステップＳ３において立ち上がりが検出された時点から、時間Ｔｂの測定を開始する。対象カウンタ５０３は、第２カウンタ５０２に連動して、ステップＳ３において立ち上がりが検出された時点から隣接フラグをハイに設定し、ステップＳ１０に処理を進める。

ステップＳ１０において、制御部５は、予め設定された基板１００のトラック範囲の光走査部３による走査が終了したか否かを判定する。制御部５は、走査が終了している場合、処理を終了し、未だ走査が終了していない場合、ステップＳ１に処理を戻す。

仮に、図９に示す例において、検出信号Ｄ２がパルス検出部５１に入力され、２回目のパルス波の立ち上がりをステップＳ３においてパルス検出部５１が検出したとする。この場合、ステップＳ６において隣接フラグはハイであり、計数部５０は、ステップＳ７に処理を進める。

ステップＳ７において、第２カウンタ５０２は、ステップＳ３において１回目の立ち上がりが検出された時点から次のステップＳ３において２回目の立ち上がりが検出された時間までの時間Ｔｂを確定した後、リセットする。対象カウンタ５０３は、第２カウンタ５０２により確定された時間Ｔｂを取得し、２回のステップＳ１〜Ｓ３において検出された２つのパルス波のパルス間隔Ｔｂとして保持し、隣接フラグをローに設定する。

次に、ステップＳ８において、対象カウンタ５０３は、記憶部５２から第３基準値Ｔ６を読み出し、ステップＳ７において保持したパルス間隔Ｔｂが第３基準値Ｔ６未満であるか否かを判定する。対象カウンタ５０３は、パルス間隔Ｔｂが第３基準値Ｔ６未満である場合、ステップＳ９に処理を進め、パルス間隔Ｔｂが第３基準値Ｔ６以上である場合、ステップＳ１５に処理を進める。

ステップＳ８においてパルス間隔Ｔｂが第３基準値Ｔ６未満である場合、ステップＳ９において、対象カウンタ５０３は、光走査部３が互いに隣接する２個のビーズ６６を走査したと判断し、エキソソーム６２０の個数を１として計数し、ステップＳ１０に処理を進める。すなわち、図９に示す例において、検出信号Ｄ２がパルス検出部５１に入力された場合、ビーズ６６の個数は２となるが、互いに隣接する２個のビーズ６６は１個のエキソソーム６２０と結合している可能性が極めて高いことから、エキソソーム６２０の個数を１として計数する。このように、対象カウンタ５０３は、第３基準値Ｔ６未満のパルス間隔Ｔｂを有する２つのパルス波が２回連続して検出されると、検出対象であるエキソソーム６２０の個数を１として計数する。

ステップＳ８においてパルス間隔Ｔｂが第３基準値Ｔ６以上である場合、ステップＳ１５において、対象カウンタ５０３は、第３基準値Ｔ６以上のパルス幅を有するパルス波を、異物、凝集塊等に起因するノイズであると判断し、計数に際して無視する。すなわち、互いに隣接する３個以上のビーズ６６は、基板１００上において、すべて複数のエキソソーム６２０と結合する必要があり、出現の可能性が極めて低い。よって、ノイズである可能性が極めて高い第３基準値Ｔ６以上のパルス幅を有するパルス波を、計数に際して無視する。

ステップＳ５においてパルス幅Ｔａが第１基準値Ｔ２以上である場合、ステップＳ１１において、対象カウンタ５０３は、記憶部５２から第２基準値Ｔ４を読み出し、ステップＳ４において保持したパルス幅Ｔａが第２基準値Ｔ４未満か否かを判定する。対象カウンタ５０３は、パルス幅Ｔａが第２基準値Ｔ４未満である場合、ステップＳ１２に処理を進め、パルス幅Ｔａが第２基準値Ｔ４以上である場合、ステップＳ１３に処理を進める。

仮に、図１０に示すように、検出信号Ｄ１がパルス検出部５１に入力され、パルス波の立ち上がりをステップＳ３においてパルス検出部５１が検出したとする。この場合、ステップＳ５においてパルス幅Ｔａが第１基準値Ｔ２以上、ステップＳ９においてパルス幅Ｔａが第２基準値Ｔ４未満であり、計数部５０は、ステップＳ１２に処理を進める。

ステップＳ１２において、対象カウンタ５０３は、光走査部３が他のビーズ６６から孤立する１個のビーズ６６を走査したと判断し、エキソソーム６２０の個数を１として計数する。孤立する１個のビーズ６６は、基板１００上において、１個のエキソソーム６２０と結合している可能性が高い。このように、対象カウンタ５０３は、第１基準値Ｔ２以上第２基準値Ｔ４未満のパルス幅Ｔａをパルス波が検出されると、エキソソーム６２０の個数を１として計数する。また、対象カウンタ５０３は、隣接フラグをローに設定し、ステップＳ１０に処理を進める。

ステップＳ１１においてパルス幅Ｔａが第２基準値Ｔ４以上である場合、ステップＳ１３において、対象カウンタ５０３は、第２基準値Ｔ４以上のパルス幅を有するパルス波を、異物、凝集塊等に起因するノイズであると判断し、計数に際して無視する。また、対象カウンタ５０３は、隣接フラグをローに設定し、ステップＳ１０に処理を進める。

また、１回目のステップＳ１〜Ｓ３において第１基準値Ｔ２未満のパルス幅Ｔａを有するパルス波が検出された次に、２回目のステップＳ１〜Ｓ３において第１基準値Ｔ２以上第２基準値Ｔ４未満のパルス幅Ｔａを有するパルス波が検出されたとする。この場合、対象カウンタ５０３は、先に検出されたパルス波を異物等に起因するノイズであると判断し、計数に際して無視する。

以上のように、対象カウンタ５０３は、検出信号に第１基準値Ｔ２未満のパルス幅Ｔａを有するパルス波が２回連続して検出されると、１を加算していくことにより、エキソソーム６２０の個数を計数する。また、対象カウンタ５０３は、検出信号に第１基準値Ｔ２以上第２基準値Ｔ４未満のパルス幅Ｔａをパルス波が検出されると１を加算していくことにより、ビーズ６６の個数を計数する。

（比較例）
図１１を用いて、本発明の実施の形態に係る分析装置によるビーズ６６の計数結果と、従来方法による計数結果との比較例を説明する。横軸は、検出対象となるバイオマーカー（エキソソーム６２０）の濃度であり、縦軸はビーズ６６の計数結果である。本発明の実施の形態に係る分析装置による計数結果を曲線Ｐ１に、従来方法による計数結果を曲線Ｐ２に示す。

曲線Ｐ１に対して、曲線Ｐ２はバイオマーカーの濃度に関わらず計数結果が少なくなっている。曲線Ｐ１及び曲線Ｐ２に沿う破線のように、理想的にはバイオマーカー含有量が０であれば計数結果も０となるべきである。しかしながら、抗原抗体反応を用いた検出方法では、基板１００上に、抗原抗体反応による結合の他に非特異吸着が生じる。このため、バイオマーカーの濃度が０であっても、非特異吸着により基板１００の表面に固定されたビーズ６６が計数されてしまう。

曲線Ｐ１，Ｐ２において、曲線Ｐ１，Ｐ２のバイオマーカー濃度がそれぞれ０（図１１における最左端のプロット）の誤差上限Ｑ１，Ｑ２をバックグラウンドノイズという。このバックグラウンドノイズと各プロットにおける誤差下限との接点（交点）をそれぞれ最小検出感度Ｒ１，Ｒ２という。従来方法による計数結果は、ビーズ６６のカウント数そのものであり、実験（分析）を行うたびに異なるため、ばらつきも大きくなる。本発明の実施の形態に係る分析装置による計数結果は、ビーズカウント数＝エキソソーム数であるため、実験（分析）を繰り返してもばらつきは小さくなる。その結果、本発明の実施の形態に係る分析装置の最小検出感度Ｒ１は、従来方法の最小検出感度Ｒ２に比べて向上しており、バイオマーカー検出の感度が向上していることが分かる。よって、本発明の実施の形態に係る分析装置によれば、疾病等の検出感度を向上することができる。

従来方法では、２個のビーズ６６に標識された１個のエキソソーム６２０を２個として計数してしまうため、真値とのばらつきが大きな計数結果となるおそれがあった。例えば、ノイズレベルＱを基準と考える場合、従来方法は、濃度が基準に達していない検体に対して誤診断を行う危険性を有する。

例えば、１万個のエキソソーム６２０について、１個のビーズ６６と結合するエキソソーム６２０が８千個、２個のビーズ６６と結合するエキソソーム６２０が２千個あったとすると、エキソソーム６２０の計数結果は、本発明の実施の形態の方法では１万個、従来方法による方法では１万２千個となる。また、１個のビーズ６６と結合するエキソソーム６２０が５千個、２個のビーズ６６と結合するエキソソーム６２０が５千個あったとすると、エキソソーム６２０の計数結果は、本発明の実施の形態の方法では１万個、従来方法による方法では１万５千個となる。さらに、１個のビーズ６６と結合するエキソソーム６２０が２千個、２個のビーズ６６と結合するエキソソーム６２０が８千個あったとすると、エキソソーム６２０の計数結果は、本発明の実施の形態の方法では１万個、従来方法による方法では１万８千個となる。このように、１個のビーズ６６と結合するエキソソーム６２０の個数と、２個のビーズ６６と結合するエキソソーム６２０の個数の割合は、分析を行うたびに異なる。

本発明の実施の形態に係る分析装置は、基板１００上にビーズ６６が隣接して固定される場合であっても、検出信号のパルス幅に応じて、ビーズ６６の配置を考慮してエキソソーム６２０の個数を計数する。よって、本発明の実施の形態に係る分析装置によれば、ビーズ６６の配置により検出信号に不規則なパルス波が検出された場合であっても、エキソソーム６２０の個数を高精度に計数することが可能となり、検出対象に対する定量性を向上することができる。

また、本発明の実施の形態に係る分析装置によれば、第１基準値Ｔ２、第２基準値Ｔ４及び第３基準値Ｔ６が、検出信号のジッタ値を考慮されて決定されることにより、パルス幅Ｔａの類別に際してジッタの影響を低減することができ、エキソソーム６２０の個数をさらに高精度に計数することができる。

（その他の実施の形態）
上記のように、本発明を実施の形態によって記載したが、この開示の一部をなす論述及び図面は本発明を限定するものであると理解すべきではない。この開示から当業者には様々な代替実施の形態、実施例及び運用技術が明らかとなろう。

例えば、既に述べた実施の形態において、検出対象である生体物質と、検出対象と特異的に結合する特異性生体物質との組み合わせは、エキソソーム６２０の抗原６２と、抗体６１及びビーズ６６に固定された抗体６５との組み合わせに限るものでない。特異的に結合する組み合わせは、例えば、リガンドと受容体（酵素タンパク質、レクチン、ホルモン等）との組み合わせ、互いに相補的な塩基配列を有する核酸の組み合わせ等であってもよい。

さらに、基板１００表面にシリコーンゴム等で作製された井戸型のウェルを設置し、そのウェル内のみの領域において、対象の抗体６１、抗原６２、ビーズ６６などの反応、未反応物の洗浄を行うことで、スピン洗浄、乾燥などのプロセスを簡略化でき、基板１００の面積が許す範囲で複数のウェルを同一半径上に設置することにより、複数検体の同時計測も可能である。

また、本発明は、既に述べた実施の形態に係る通知装置の機能をコンピュータに実行させるためのプログラムを含む。プログラムは、記録媒体から読み取られコンピュータに取り込まれてもよく、電気通信回線を介して伝送されてコンピュータに取り込まれてもよい。

その他、上述の構成を相互に応用した構成等、本発明はここでは記載していない様々な実施の形態等を含むことは勿論である。したがって、本発明の技術的範囲は上記の説明から妥当な特許請求の範囲に係る発明特定事項によってのみ定められるものである。

２ モータ
３ 光走査部
４ 光学系制御部
５ 制御部
２１ 回転制御部
３１ レーザ発振器
３２ コリメータレンズ
３３ ビームスプリッタ
３４ アクチュエータ
３５ 対物レンズ
３６ 集光レンズ
３７ 光検出部
５０ 計数部
５１ パルス検出部
５２ 記憶部
６１ 抗体
６２ 抗原
６３ 試料液
６４ 緩衝液
６５ 抗体
６６ ビーズ（粒子）
１００ 基板
５０１ 第１カウンタ
５０２ 第２カウンタ
５０３ 対象カウンタ
６２０ エキソソーム（検出対象）

Claims (8)

1. 基板の表面に検出対象が固定され、前記検出対象に前記検出対象を標識する粒子が結合している基板を、前記粒子の直径よりも長い波長を有するレーザ光を用いて光学的に走査する光走査部と、
   前記光走査部が前記基板を走査することにより前記光走査部から取得される検出信号に含まれるパルス波及び前記パルス波のパルス幅を検出するパルス検出部と、
   前記パルス検出部において第１基準値未満のパルス幅をそれぞれ有する２つのパルス波が２回連続して検出され、前記２つのパルス波の間隔が所定の間隔未満であるとき、１個の前記検出対象に２個の前記粒子が結合している状態であると判断して、前記検出対象の数を１として計数する計数部と、
   を備えることを特徴とする分析装置。
2. 前記計数部は、前記パルス検出部において前記第１基準値以上かつ第２基準値未満のパルス幅を有するパルス波が検出されたとき、１個の前記検出対象に１個の前記粒子が結合している状態であると判断して、前記検出対象の数を１として計数することを特徴とする請求項１に記載の分析装置。
3. 前記計数部は、前記パルス検出部において、前記第１基準値未満のパルス幅を有する第１パルス波が検出され、前記第１パルス波に続けて第２パルス波が検出され、前記第１パルス波と前記第２パルス波との間隔が前記所定の間隔以上であるとき、前記第１及び第２のパルス波を前記検出対象の数として計数しないことを特徴とする請求項１または２に記載の分析装置。
4. 前記計数部は、前記パルス検出部において、前記第１基準値未満のパルス幅を有する第１パルス波が検出され、前記第１パルス波に続けて前記第１基準値以上前記第２基準値未満のパルス幅を有するパルス波が検出されたとき、前記第１パルス波を前記検出対象の数として計数しないことを特徴とする請求項２に記載の分析装置。
5. 前記計数部は、前記パルス検出部において前記第２基準値以上のパルス幅を有するパルス波が検出されたとき、前記第２基準値以上のパルス幅を有するパルス波を前記検出対象の数として計数しないことを特徴とする請求項２または４に記載の分析装置。
6. 前記第１基準値は、前記光走査部が１個の前記検出対象に２個の前記粒子が結合している状態の２個の前記粒子を走査したときに、前記パルス検出部において検出されるパルス波が有する第１パルス幅に所定値を加算したパルス幅であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の分析装置。
7. 前記第２基準値は、前記光走査部が１個の前記検出対象に１個の前記粒子が結合している状態の前記粒子を走査したときに、前記パルス検出部において検出されるパルス波が有する第２パルス幅に所定値を加算したパルス幅であることを特徴とする請求項２、４、５のいずれか１項に記載の分析装置。
8. 光走査部が、基板の表面に検出対象が固定され、前記検出対象に前記検出対象を標識する粒子が結合している基板を、前記粒子の直径よりも長い波長を有するレーザ光を用いて光学的に走査し、
   パルス検出部が、前記光走査部が前記基板を走査することにより前記光走査部から取得される検出信号に含まれるパルス波及び前記パルス波のパルス幅を検出し、
   前記パルス検出部において第１基準値未満のパルス幅をそれぞれ有する２つのパルス波が２回連続して検出され、前記２つのパルス波の間隔が所定の間隔未満であるとき、計数部が、１個の前記検出対象に２個の前記粒子が結合している状態であると判断して、前記検出対象の数を１として計数する
   ことを特徴とする分析方法。

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