JP6223742B2 - 皮膚外用剤、美白剤及びメラノサイト分化誘導抑制剤 - Google Patents

Description

本発明は、特定のアルコール濃度の含水低級アルコールで抽出されるアイヌワカメの抽出物を含有することを特徴とする美白作用に優れた皮膚外用剤、美白剤及びメラノサイト分化誘導抑制剤に関する。

一般にシミ、ソバカス、日焼け等に見られる皮膚の色素沈着は、ホルモンの異常や紫外線の刺激により、皮膚内に存在するメラノサイトがメラニン色素を過剰に生成し、これが皮膚内に沈着することが原因と考えられている。このような色素沈着を防ぐ方法の一つに、メラニンの過剰な生成を抑制する方法が知られている。

一方、メラノサイトには様々な分化段階（神経堤細胞、色素幹細胞、メラノブラスト等）が存在しており、その分化異常により様々な色素異常症やシミが引き起こされる。よって、このメラノサイトの分化自体を制御する因子の開発が根本的な色素異常症及びシミの解決のために重要である。

従来技術としては、水、低級アルコールなどの溶媒で抽出されたアイヌワカメの抽出物を有効成分として含有するメラノサイト分化誘導抑制剤が開示されている（特許文献１）。また、本発明者らは、アイヌワカメに含有している美白作用を有する成分として、下記の（１）〜（３）の特徴をすべて有するβ−１，３−１，６−Ｄ−グルコ−ス誘導体を含有することを見出している。
（１）アイヌワカメ（Ａｌａｒｉａ ｐｒａｅｌｏｎｇａ Ｋｊｅｌｌｍａｎ）に由来する。
（２）１Ｎ水酸化ナトリウム重水溶液を溶媒とする溶液の^１Ｈ ＮＭＲスペクトルが４．７ｐｐｍ及び４．５ｐｐｍの２つのシグナルを有し、その面積比が７：１〜１１：１である。
（３）Ｄ−マンニト−ルが結合しており、該Ｄ−マンニト−ルの含有量は、該グルコース誘導体の全量に対して０．１〜１０重量％である。

さらに、上記β−１，３−１，６−Ｄ−グルコ−ス誘導体が、下記一般式（化１）であらわされる化合物であることも見出しており、これらは皮膚外用剤、美白剤及びメラノサイト分化誘導抑制剤として利用できることを明らかにしている。
ここで、β−１，３結合／β−１，６結合の比は、７〜１１であり、該グルコース誘導体のマンニトールの含有量は、０．１〜１０重量％である。ただし、〔〕の配列は、順不同である。

しかし、上記化合物は、種々のカラムクロマトグラフィーによって精製する必要があり、アイヌワカメから上記化合物を簡便にかつ効率よく大量に調製可能な方法については全く知られていなかった。

特開２０１３−１０３９２７

本発明は上述した実情に鑑み、幹細胞からメラノサイトへの分化誘導抑制活性を有する成分（上記β−１，３−１，６−Ｄ−グルコ−ス誘導体）を多く含む抽出方法や精製方法を見出し、より優れた美白作用を有する皮膚外用剤、美白剤及びメラノサイト分化誘導抑制剤を提供することを目的とする。

上記課題を解決するため鋭意検討を行った結果、特定のアルコール濃度の含水低級アルコールで抽出することにより、β−１，３−１，６−Ｄ−グルコ−ス誘導体が非常に効率よく得られることを見出し、本発明を完成するに至った。

本発明の皮膚外用剤、美白剤及びメラノサイト分化誘導抑制剤によれば、幹細胞からメラノサイトへの分化誘導を顕著に抑制することができ、色素異常症及びシミにおいて、根本的に治療・予防することができる。

アイヌワカメ抽出物のイオン交換樹脂非吸着画分１（製造例１０）のＨＰＬＣクロマトグラムである。矢印で、β−１，３−１，６−Ｄ−グルコ−ス誘導体のピークを示した。

以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に用いるアイヌワカメの抽出物とは、北海道東部で天然に生育し、大量採取可能な海藻であるアイヌワカメ（Ａｌａｒｉａ ｐｒａｅｌｏｎｇａ Ｋｊｅｌｌｍａｎ）より抽出できる。

アイヌワカメはそのまま抽出に用いても良いし、あるいは乾燥や粉砕などの前処理をしても良く、これらの前処理はβ−１，３−１，６−Ｄ−グルコ−ス誘導体の抽出効率を考慮して適宜行うことができる。粉砕のサイズは、特に限定されないが、０．１ｍｍ以上であることが好ましい。さらに好ましくは、０．３〜５ｍｍが良い。

抽出に使用する溶媒としては、アルコール濃度２〜３０重量％の含水低級アルコ−ル類（メタノ−ル、エタノ−ル、１−プロパノ−ル、２−プロパノ−ル、１−ブタノ−ル、２−ブタノ−ル）などであれば良く、好ましくは、アルコール濃度５〜２０重量％の含水低級アルコ−ル類で抽出することが良く、さらに好ましくは、アルコール濃度８〜１５重量％の含水低級アルコ−ル類で抽出することが良い。これらの溶媒は単独で、又は２種以上を混合して用いても良い。溶媒抽出方法は、特に限定されないが、低温での抽出が好ましい。抽出温度としては、４〜３０℃、好ましくは７〜１５℃で抽出することがよい。また、抽出液のまま用いても良いし、抽出液を濃縮したのち、凍結乾燥やスプレードライを行い、乾燥して用いても良い。

好適な例として、例えば、アイヌワカメの乾燥物を粉砕し、０．３〜５ｍｍの粉砕物を用いて、７〜１５℃で１０重量％エタノール抽出することで本発明のアイヌワカメ抽出物を得ることができる。

さらに、本発明のアイヌワカメの抽出物は、上記の抽出物に精製処理を行うことができる。精製処理としては、脱色処理、脱臭処理、限外濾過、ゲル濾過、イオン交換等による精製を行うことができる。特に効果的な精製方法としては、上記の抽出液又は抽出物の水溶液に陰イオン交換樹脂及び／又は陽イオン交換樹脂を用いて精製し、得られた非吸着画分を使用することが好ましい。

陽イオン交換樹脂としては、例えば強酸性陽イオン交換樹脂、弱酸性陽イオン交換樹脂等が、陰イオン交換樹脂としては、例えば強塩基性陰イオン交換樹脂、弱塩基性陰イオン交換樹脂等が挙げられる。処理方法としては、樹脂に抽出液又は抽出物の水溶液が接液すれば良く、より詳しくは、抽出液又は抽出物の水溶液にイオン交換樹脂を投入して撹拌し、得られた非吸着画分を使用する方法や、イオン交換樹脂を充填したカラムに抽出液又は抽出物の水溶液を通液し、得られた非吸着画分を使用する方法が挙げられる。

このようにして得られたアイヌワカメの抽出物の一般式（化１）の含有率は、抽出物の固形分中に１．５〜１５％含有することが好ましく、更には、２．５〜１０％が好ましい。最も好適な例としては、アイヌワカメの乾燥物を粉砕し、０．３〜５ｍｍの粉砕物を用いて、７〜１５℃で１０重量％エタノール抽出し、弱酸性陽イオン交換樹脂と弱塩基性陰イオン交換樹脂を処理後の液のｐＨが３〜８になるように組み合わせた樹脂を投入して撹拌し、非吸着画分を得る方法が最も一般式（化１）の固形分中の含有率を高めることができる。これらの方法を用いることにより、極めて効率よく、一般式（化１）を得ることができる。

このようにして得られた本発明のアイヌワカメの抽出物は、抽出液のまま用いても良いし、抽出液を濃縮したのち、凍結乾燥やスプレードライを行い、乾燥して用いても良く、本発明に係る皮膚外用剤、美白剤及びメラノサイト分化誘導抑制剤の有効成分とすることができる。本発明の皮膚外用剤、美白剤及びメラノサイト分化誘導抑制剤は、アイヌワカメの抽出物を、そのまま使用しても良く、アイヌワカメの抽出物の効果を損なわない範囲内で、外用剤、注射剤、内用剤などに用いられる成分である油脂類、ロウ類、炭化水素類、脂肪酸類、アルコール類、エステル類、界面活性剤、金属石鹸、ｐＨ調整剤、防腐剤、香料、保湿剤、粉体、紫外線吸収剤、増粘剤、色素、酸化防止剤、美白剤、キレート剤、賦形剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、滑沢剤、分散剤、保存料、溶解補助剤、溶剤等の成分を配合することができる。

本発明の皮膚外用剤、美白剤及びメラノサイト分化誘導抑制剤は、化粧品、医薬部外品、医薬品のいずれにも用いることができ、その剤型としては、例えば、化粧水、クリ−ム、乳液、ゲル剤、エアゾール剤、エッセンス、パック、洗浄剤、浴用剤、ファンデ−ション、打粉、口紅、軟膏、パップ剤等の皮膚に適用されるものや、経口用の場合は、散剤、顆粒剤、錠剤、糖衣錠剤、カプセル剤、シロップ剤、丸剤、懸濁剤、液剤、乳剤などが挙げられる。また、注射液、座薬などが挙げられる。

本発明に用いるアイヌワカメの抽出物の配合量は、本発明の皮膚外用剤、美白剤あるいはメラノサイト分化誘導抑制剤全量に対し、固形物に換算して０．００００１重量％以上、好ましくは０．０００１〜１０重量％が良い。０．００００１重量％未満では十分な効果は望みにくい。１０重量％を越えて配合した場合、効果の増強は認められにくく不経済である。また、注射液など外用以外の適用経路の場合は、薬効などを考えて適宜選択すればよい。添加の方法については、予め加えておいても、製造途中で添加しても良く、作業性を考えて適宜選択すれば良い。

次に本発明を詳細に説明するため、実施例として本発明に用いるアイヌワカメの抽出物の製造例、処方例及び実験例を挙げるが、本発明はこれに限定されるものではない。製造例に示す％とは重量％を、実施例に示す配合量の部とは重量部を示す。

製造例１ アイヌワカメの乾燥物の調製
生のアイヌワカメ６００ｇを１２ｋｇのイオン交換水で洗い、６０℃で乾燥させ、アイヌワカメの乾燥物を５００ｇ得た。

製造例２ アイヌワカメの粉砕物１の調製
アイヌワカメの乾燥物（製造例１）５００ｇを粉砕機で粉砕し、０．３〜５ｍｍの粉砕物を採取して、アイヌワカメの粉砕物を３３０ｇ得た。

製造例３ アイヌワカメの粉砕物２の調製
製造例２において、０．３ｍｍ未満の粉砕物を採取して、アイヌワカメの粉砕物を１７０ｇ得た。

製造例４ アイヌワカメの２％エタノール抽出物の調製
アイヌワカメの粉砕物１（製造例２）２０ｇに２％エタノール４００ｇを加え、１０℃で７日間抽出を行った。得られた抽出液を凍結乾燥することで、アイヌワカメの２％エタノール抽出物を５．３ｇ得た。

製造例５ アイヌワカメの５％エタノール抽出物の調製
アイヌワカメの粉砕物１（製造例２）２０ｇに５％エタノール４００ｇを加え、１０℃で７日間抽出を行った。得られた抽出液を凍結乾燥することで、アイヌワカメの５％エタノール抽出物を５．０ｇ得た。

製造例６ アイヌワカメの１０％エタノール抽出物の調製
アイヌワカメの粉砕物１（製造例２）２０ｇに１０％エタノール４００ｇを加え、１０℃で７日間抽出を行った。得られた抽出液を凍結乾燥することで、アイヌワカメの１０％エタノール抽出物を４．７ｇ得た。

製造例７ アイヌワカメの１０％エタノール抽出物２の調製
アイヌワカメの粉砕物２（製造例３）２０ｇに１０％エタノール４００ｇを加え、１０℃で７日間抽出を行った。得られた抽出液を凍結乾燥することで、アイヌワカメの１０％エタノール抽出物を４．６ｇ得た。

製造例８ アイヌワカメの２０％エタノール抽出物の調製
アイヌワカメの粉砕物１（製造例２）２０ｇに２０％エタノール４００ｇを加え、１０℃で７日間抽出を行った。得られた抽出液を凍結乾燥することで、アイヌワカメの２０％エタノール抽出物を５．０ｇ得た。

製造例９ アイヌワカメの３０％エタノール抽出物の調製
アイヌワカメの粉砕物１（製造例２）２０ｇに３０％エタノール４００ｇを加え、１０℃で７日間抽出を行った。得られた抽出液を凍結乾燥することで、アイヌワカメの３０％エタノール抽出物を４．３ｇ得た。

製造例１０ アイヌワカメ抽出物のイオン交換樹脂非吸着画分１の調製
アイヌワカメの１０％エタノール抽出物（製造例６）１ｇを２０ｇの水に溶かし、弱塩基性陰イオン交換樹脂ＤＩＡＩＯＮ ＷＡ−２０（三菱化学）と弱酸性陽イオン交換樹脂ＤＩＡＩＯＮ ＷＫ−４０Ｌ（三菱化学）をそれぞれ１ｇ添加し、３０分撹拌し、濾過により樹脂を除去し、得られた濾液を凍結乾燥することで、非吸着画分を０．４５ｇ得た。

製造例１１ アイヌワカメ抽出物のイオン交換樹脂非吸着画分２の調製
アイヌワカメの１０％エタノール抽出物（製造例６）１ｇを２０ｇの水に溶かし、弱塩基性陰イオン交換樹脂ＤＩＡＩＯＮ ＷＡ−２０（三菱化学）を２ｇ添加し、１５分撹拌し、濾過により樹脂を除去し、得られた濾液を凍結乾燥することで、非吸着画分を０．４４ｇ得た。

製造例１２ アイヌワカメ抽出物のイオン交換樹脂非吸着画分３の調製
アイヌワカメの１０％エタノール抽出物（製造例６）１ｇを２０ｇの水に溶かし、弱酸性陽イオン交換樹脂ＤＩＡＩＯＮ ＷＫ−４０Ｌ（三菱化学）を２ｇ添加し、３０分撹拌し、濾過により樹脂を除去し、得られた濾液を凍結乾燥することで、非吸着画分を０．４３ｇ得た。

製造例１３ アイヌワカメの１０％メタノール抽出物の調製
アイヌワカメの粉砕物１（製造例２）２０ｇに１０％メタノール４００ｇを加え、１０℃で７日間抽出を行った。得られた抽出液を凍結乾燥することで、アイヌワカメの１０％メタノール抽出物を４．３ｇ得た。

製造例１４ アイヌワカメの８％２−プロパノール抽出物の調製
アイヌワカメの粉砕物１（製造例２）２０ｇに８％２−プロパノール４００ｇを加え、１０℃で７日間抽出を行った。得られた抽出液を凍結乾燥することで、アイヌワカメの８％２−プロパノール抽出物を３．８ｇ得た。

比較製造例１ アイヌワカメの熱水抽出物の調製
アイヌワカメの粉砕物１（製造例２）２０ｇに精製水４００ｇを加え、９５〜１００℃で抽出した。得られた抽出液を凍結乾燥することで、アイヌワカメの熱水抽出物を４．２ｇ得た。

比較製造例２ アイヌワカメの５０％エタノール抽出物の調製
アイヌワカメの粉砕物１（製造例２）２０ｇに５０％エタノール４００ｇを加え、常温で７日間抽出した。得られた抽出液を凍結乾燥することで、アイヌワカメの５０％エタノール抽出物を３．９ｇ得た。

処方例１ 化粧水
処方 配合量（部）
１．アイヌワカメの１０％エタノール抽出物（製造例６） ０．１
２．１，３−ブチレングリコ−ル ８．０
３．グリセリン ２．０
４．キサンタンガム ０．０２
５．クエン酸 ０．０１
６．クエン酸ナトリウム ０．１
７．エタノ−ル ５．０
８．パラオキシ安息香酸メチル ０．１
９．ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（４０Ｅ．Ｏ．） ０．１
１０．香料 適量
１１．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分１〜６及び１１と、成分７〜１０をそれぞれ均一に溶解し、両者を混合し濾過して製品とする。

処方例２ クリ−ム
処方 配合量（部）
１．アイヌワカメ抽出物のイオン交換樹脂非吸着画分１（製造例１０） ０．０５
２．スクワラン ５．５
３．オリ−ブ油 ３．０
４．ステアリン酸 ２．０
５．ミツロウ ２．０
６．ミリスチン酸オクチルドデシル ３．５
７．ポリオキシエチレンセチルエ−テル（２０Ｅ．Ｏ．） ３．０
８．ベヘニルアルコ−ル １．５
９．モノステアリン酸グリセリン ２．５
１０．香料 ０．１
１１．パラオキシ安息香酸メチル ０．２
１２．１，３−ブチレングリコ−ル ８．５
１３．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分２〜９を加熱溶解して混合し、７０℃に保ち油相とする。成分１及び１１〜１３を加熱溶解して混合し、７５℃に保ち水相とする。油相に水相を加えて乳化して、かき混ぜながら冷却し、４５℃で成分１０を加え、更に３０℃まで冷却して製品とする。

処方例３ 乳液
処方 配合量（部）
１．アイヌワカメの５％エタノール抽出物（製造例５） ０．１
２．スクワラン ５．０
３．オリーブ油 ５．０
４．ホホバ油 ５．０
５．セタノール １．５
６．モノステアリン酸グリセリン ２．０
７．ポリオキシエチレンセチルエーテル（２０Ｅ．Ｏ．） ３．０
８．ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（２０Ｅ．Ｏ．） ２．０
９．香料 ０．１
１０．プロピレングリコール １．０
１１．グリセリン ２．０
１２．パラオキシ安息香酸メチル ０．２
１３．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分２〜８を加熱溶解して混合し、７０℃に保ち油相とする。成分１及び１０〜１３を加熱溶解して混合し、７５℃に保ち水相とする。油相に水相を加えて乳化して、かき混ぜながら冷却し、４５℃で成分９を加え、更に３０℃まで冷却して製品とする。

処方例４ ゲル剤
処方 配合量（部）
１．アイヌワカメの２％エタノール抽出物（製造例４） １．０
２．アイヌワカメの２０％エタノール抽出物（製造例８） ０．５
３．エタノール ５．０
４．パラオキシ安息香酸メチル ０．１
５．ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（６０Ｅ．Ｏ．） ０．１
６．香料 適量
７．１，３−ブチレングリコール ５．０
８．グリセリン ５．０
９．キサンタンガム ０．１
１０．カルボキシビニルポリマー ０．２
１１．水酸化カリウム ０．２
１２．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分３〜６と、成分１、２及び７〜１２をそれぞれ均一に溶解し、両者を混合して製品とする。

処方例５ パック
処方 配合量（部）
１．アイヌワカメの３０％エタノール抽出物（製造例９） １．０
２．アイヌワカメ抽出物のイオン交換樹脂非吸着画分３（製造例１２） ０．１
３．ポリビニルアルコール １２．０
４．エタノール ５．０
５．１，３−ブチレングリコール ８．０
６．パラオキシ安息香酸メチル ０．２
７．ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（２０Ｅ．Ｏ．） ０．５
８．クエン酸 ０．１
９．クエン酸ナトリウム ０．３
１０．香料 適量
１１．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分１〜１１を均一に溶解し製品とする。

処方例６ ファンデーション
処方 配合量（部）
１．アイヌワカメの１０％エタノール抽出物２（製造例７） １．０
２．ステアリン酸 ２．４
３．ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート（２０Ｅ．Ｏ．） １．０
４．ポリオキシエチレンセチルエーテル（２０Ｅ．Ｏ．） ２．０
５．セタノール １．０
６．液状ラノリン ２．０
７．流動パラフィン ３．０
８．ミリスチン酸イソプロピル ６．５
９．カルボキシメチルセルロースナトリウム ０．１
１０．ベントナイト ０．５
１１．プロピレングリコール ４．０
１２．トリエタノールアミン １．１
１３．パラオキシ安息香酸メチル ０．２
１４．二酸化チタン ８．０
１５．タルク ４．０
１６．ベンガラ １．０
１７．黄酸化鉄 ２．０
１８．香料 適量
１９．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分２〜８を加熱溶解し、８０℃に保ち油相とする。成分１９に成分９をよく膨潤させ、続いて、成分１及び１０〜１３を加えて均一に混合する。これに粉砕機で粉砕混合した成分１４〜１７を加え、ホモミキサーで撹拌し７５℃に保ち水相とする。この油相に水相をかき混ぜながら加え、乳化する。その後冷却し、４５℃で成分１８を加え、かき混ぜながら３０℃まで冷却して製品とする。

処方例７ 浴用剤
処方 配合量（部）
１．アイヌワカメ抽出物のイオン交換樹脂非吸着画分２（製造例１１） １．０
２．炭酸水素ナトリウム ５０．０
３．黄色２０２号（１） 適量
４．香料 適量
５．硫酸ナトリウムにて全量を１００とする
［製造方法］成分１〜５を均一に混合し製品とする。

処方例８ 軟膏
処方 配合量（部）
１．アイヌワカメの２０％エタノール抽出物（製造例８） １．０
２．アイヌワカメ抽出物のイオン交換樹脂非吸着画分１（製造例１０） ５．０
３．ポリオキシエチレンセチルエーテル（３０Ｅ．Ｏ．） ２．０
４．モノステアリン酸グリセリン １０．０
５．流動パラフィン ５．０
６．セタノール ６．０
７．パラオキシ安息香酸メチル ０．１
８．プロピレングリコール １０．０
９．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分３〜６を加熱溶解して混合し、７０℃に保ち油相とする。成分１、２及び７〜９を加熱溶解して混合し、７５℃に保ち水相とする。油相に水相を加えて乳化して、かき混ぜながら３０℃まで冷却して製品とする。

処方例９ 錠剤
処方 配合量（部）
１．アイヌワカメの１０％エタノール抽出物（製造例６） ５．０
２．乾燥コ−ンスタ−チ ２５．０
３．カルボキシメチルセルロ−スカルシウム ２０．０
４．微結晶セルロ−ス ４０．０
５．ポリビニルピロリドン ７．０
６．タルク ３．０
［製造方法］成分１〜４を混合し、次いで成分５の水溶液を結合剤として加えて顆粒成型する。成型した顆粒に成分６を加えて打錠する。１錠０．５２ｇとする。

処方例１０ 飲料
処方 配合量（部）
１．アイヌワカメ抽出物のイオン交換樹脂非吸着画分３（製造例１２） ０．０５
２．ステビア ０．０５
３．リンゴ酸 ５．０
４．香料 ０．１
５．精製水にて全量を１００とする。
［製造方法］成分２及び３を少量の水に溶解する。次いで、成分１、４及び５を加えて混合する。

次に、本発明の効果を詳細に説明するため、実験例を挙げる。

実験例１ β−１，３−１，６−Ｄ−グルコ−ス誘導体（化１）の含量比較
製造例４〜１２、比較製造例１、２によって得られたアイヌワカメの抽出物またはアイヌワカメ抽出物のイオン交換樹脂非吸着画分１０ｍｇに対し、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．９を１ｍＬ添加し、試料溶液を調製した。本試料溶液について、高速液体クロマトグラフィ−（カラム：Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ １００Ｄｉｏｌ，８×３００ｍｍ、カラム温度：４０℃、展開溶媒：０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．９、検出器：示差屈折計、導入量１００μＬ）を使用して測定した。保持時間が１４〜１５分のピークが、β−１，３−１，６−Ｄ−グルコ−ス誘導体であり、下記に示す方法によって得られた、純品のβ−１，３−１，６−Ｄ−グルコ−ス誘導体を用いて定量した。その結果を表１に示す。ＨＰＬＣクロマトグラムの例として、アイヌワカメ抽出物のイオン交換樹脂非吸着画分１（製造例１０）のクロマトグラムを図１に示した。
＜純品のβ−１，３−１，６−Ｄ−グルコ−ス誘導体の精製方法＞
アイヌワカメの乾燥物２０ｇに０．１Ｎ塩酸８００ｍＬを加え、４℃で７日間抽出を行った。抽出後、抽出液を濾過し、得られた濾液を濃縮及び凍結乾燥することで、アイヌワカメのＨＣｌ抽出物を２．９ｇ得た。この抽出物をゲル濾過カラムクロマトグラフィ−（カラム：セファデックスＧ−５０，２×１００ｃｍ）にて分子量約５００〜約１０，０００の画分を集めた。陰イオン交換カラムクロマトグラフィ−（カラム：Ｅｃｔｅｏｌａ Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ，３×５０ｃｍ）にて非吸着画分を集め、さらに、分取高速液体クロマトグラフィ−（カラム：Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ １００Ｄｉｏｌ，８×３０ｃｍ）にて分取し、精製物（アイヌワカメ由来グルコ−ス誘導体）を７ｍｇ得た。

分析の結果、本発明のアイヌワカメの抽出物やそのイオン交換樹脂非吸着画分が熱水抽出物あるいは５０％エタノール抽出物よりβ−１，３−１，６−Ｄ−グルコ−ス誘導体を多く含むことが分かった。

実験例２ 幹細胞からメラノサイトへの分化誘導抑制によるメラニン合成抑制効果の評価
本実験例では、これまでに山根らが報告しているマウス胚性幹細胞（ＥＳ細胞）を用いた幹細胞からメラノサイトへの分化誘導系（Ｙａｍａｎｅ Ｔ．， Ｈａｙａｓｈｉ Ｓ．， Ｍｉｚｏｇｕｃｈｉ Ｍ．， Ｙａｍａｚａｋｉ Ｈ．， Ｋｕｎｉｓａｄａ Ｔ．， Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｄｙｎａｍｉｃｓ， Ｖｏｌ．２１６， Ｉｓｓｕｅ ４−５， ｐｐ．４５０−４５８， １９９９）を用いて、製造例（製造例４〜６、８〜１２）、比較製造例１によって得られたアイヌワカメの抽出物またはアイヌワカメ抽出物のイオン交換樹脂非吸着画分のメラノサイトへの分化誘導抑制効果とそれに伴うメラニン合成の抑制効果について検討した。なお、本実験において、これまでメラニン合成抑制効果が確認されているアルブチンについても同様な実験系を用いて評価した。以下に詳細を説明する。

６ｃｍプラスチックディッシュにマイトマイシンＣ処理を施したＭＥＦ細胞（Ｍｏｕｓｅ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）を培養し、その上にマウスＥＳ細胞を１．０×１０^４〜２．０×１０^４個播種し、３７℃において５％ＣＯ_２インキュベ−タ−にて前培養した。使用した培地は、ＤＭＥＭにＥＳ細胞用添加因子（Ｌ−グルタミン液、２−メルカプトエタノ−ル液、ヌクレオシド液、非必須アミノ酸液及びＥＳＧＲＯ、いずれもｃｈｅｍｉｃｏｎ社製）を推奨濃度で添加した後、ＦＢＳを１５％添加したものを用いた。
次いで、ＳＴ２細胞を２４ｗｅｌｌプレ−ト上でコンフルエントになるまで培養し、そこにＭＥＦ細胞から分離した上述の培養ＥＳ細胞を２５０〜５００個播種した。当該培養物を、分化誘導培地（α−ＭＥＭに１０％ウシ胎児血清、１００ｎＭデキサメタゾン、２０ｐＭ塩基性線維芽細胞増殖因子、１０ｐＭコレラトキシン及び１００ｎｇ／ｍＬエンドセリン３を添加したもの）で培養し、ＥＳ細胞をメラノサイトへ分化誘導した。分化誘導後２４日間で、メラノサイトが出現し、メラニン合成を行う様子が観察された。
本誘導系において、上述の分化誘導培地に製造例（製造例４〜６、８〜１２）、比較製造例１によって得られたアイヌワカメの抽出物またはアイヌワカメ抽出物のイオン交換樹脂非吸着画分をそれぞれ１０μｇ／ｍＬを継続して添加し、２４日間の分化誘導を行った。また、アルブチンについても同様に実験を行った。その後、Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ−８を用いて相対細胞数を定量し、さらに、細胞をＰＢＳ（−）で３回洗浄した後、２ＮＮａＯＨを用いて６０℃で２時間溶解した。溶解物について４７５ｎｍの吸光度を測定し、メラニン合成量を定量した。

これらの試験結果を表２に示した。アイヌワカメのエタノール抽出物（製造例４〜６、８、９）あるいはアイヌワカメ抽出物のイオン交換樹脂非吸着画分（製造例１０〜１２）を添加することにより、細胞数あたりのメラニン合成量が有意に減少し、メラノサイトへの分化が抑制された。さらに、熱水抽出物（比較製造例１）よりもメラノサイト分化抑制効果が高かった。以上より、本発明のアイヌワカメの抽出物が極めて優れた幹細胞からのメラノサイト分化誘導抑制効果及びメラニン合成抑制効果を有することが明らかとなり、本発明のアイヌワカメの抽出物のメラノサイト分化誘導抑制剤及びメラニン合成抑制剤（美白剤）としての効果が認められた。なお、従来の美白作用が確認されているアルブチンは、今回の試験系においてメラノサイト分化誘導抑制効果を示さなかった。

本発明の皮膚外用剤、美白剤及びメラノサイト分化誘導抑制剤によれば、色素異常症及びシミを治療、予防及び改善することができる。例えば、本発明において見出されたアイヌワカメの抽出物を用いることにより、根本からの色素異常症及びシミの解決に繋がる。本発明で見出されたアイヌワカメの抽出物を経口投与、皮膚への直接注入、塗布、貼付等により導入することで、組織に存在する未分化細胞のメラノサイトへの分化を抑制することができる。

Claims (6)

1. アルコールの濃度が２〜３０重量％の含水低級アルコールを用いて抽出したアイヌワカメの抽出物を含有することを特徴とするメラノサイト分化誘導抑制剤。
2. 含水低級アルコールが、含水メタノール、含水エタノール、含水プロパノール、含水ブタノールから１種又は２種以上選択されることを特徴とする請求項１記載のメラノサイト分化誘導抑制剤。
3. アルコールの濃度が２〜３０重量％の含水低級アルコールを用いて抽出したアイヌワカメの抽出物を含む水溶液を陽イオン交換樹脂及び／又は陰イオン交換樹脂に接液させ、得られた非吸着画分を含有することを特徴とする請求項１又は２記載のメラノサイト分化誘導抑制剤。
4. アイヌワカメの抽出物をアルコールの濃度が２〜３０重量％の含水低級アルコールを用いて抽出し、下記一般式で表されるβ−１，３−１，６−Ｄ−グルコ−ス誘導体をアイヌワカメの抽出物の固形分中に１．５％以上含有することを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項記載のメラノサイト分化誘導抑制剤。
   ここで、β−１，３結合／β−１，６結合の比は、７〜１１であり、該グルコース誘導体のマンニトールの含有量は、０．１〜１０重量％である。ただし、〔〕の配列は、順不同である。
5. 請求項１〜４のいずれか一項記載のメラノサイト分化誘導抑制剤を含有することを特徴とする美白剤。
6. 請求項１〜４のいずれか一項記載のメラノサイト分化誘導抑制剤を含有することを特徴とする皮膚外用剤。