JP6197039B2 - ハイスループット多重検出用システム、装置及び方法 - Google Patents
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Description
本出願は、2012年8月24日に出願された米国仮特許出願第61/692,895号、及び2013年3月13日に出願された米国仮特許出願第61/779,299号に対する米国特許法第119条(e)による優先権に対する権利を有し、これらは全て、参照として全体が本明細書に組み込まれる。
本発明は、国立衛生研究所(NIH)により与えられた、NIH UO1 CA164252、NIH 4R00 CA136759、NIH U54CA143868、NIH RO1 GM084201、及びNIH U54 CA143798による政府の支援によりなされた。政府は本発明に一定の権利を有する。
;Cheong et al., 2009, Sci Signal 2(75):pl2;Love et al., 2006, Nat Biotechnol 24(6):703-7;
Lee et al., 2012, Integr Biol(Camb)4(4):381-90;
Rowat et al., 2009, Proc Natl Acad Sci USA 106(43):18149-54;Lecault et al., 2011, Nat.Methods 8(7):581-6)。プロトタイプ型マイクロチップにより、多重化タンパク質分泌試験法の可能性が立証され、臨床診断及び治療モニタリングにおける単一細胞分泌プロファイリングの緊急の必要性を指摘する患者からの表現型が類似の免疫細胞におけるかなりの多機能不均一性が明らかになった(Shin et al., 2011, Biophys J 100(10):2378-86;Ma et al., 2011, Nat Med 17(6):738-43)。しかし、これらのマイクロチップは、十分な処理量又は多重性が不足し、又は洗練された操作を必要とし、細胞生物学及び細胞機能の臨床評価における広範な応用を妨げている。この方法では、単一細胞における高度な多重化タンパク質分析を実施することができない。例えば、これまで、単一細胞レベルでの分泌タンパク質のハイコンテント(>1000細胞)及び高多重化(>35タンパク質)測定を実施するのに有用な技術は存在していない。
したがって、単一細胞からの多数の化合物の多重分析のための装置及び方法が当該技術分野において必要である。本発明は、この未だ満たされていない要求を満たす。
一態様においては、流体は、重力のみにより、個々のマイクロウェルに流入する。
別段の定義がない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似又は同等の任意の方法及び材料は、本発明の実施又は試験に使用することができるが、好ましい方法及び材料を記載する。
本明細書で用いられる場合、以下の各用語は、この節でそれと関連する意味を有する。
本発明は、全体としてハイスループット単一細胞分析のためのシステム、装置及び方法に関する。特定の態様においては、本発明は、単一細胞から分泌される多くの種類の化合物の定量的多重検出に使用される。本発明は、そうでないと、従来の集団を基準とする試験では隠れてしまう、細胞集団内の単一細胞の表現型を特定するための有効なメカニズムを提供する。例えば、本発明は、表現型的にまれな、又は診断的に価値がある単一細胞の特定を可能にする。一態様においては、本発明は、刺激又は負荷により、単一細胞の多機能性の特定及び定量を可能にする。特定の態様においては、本発明は、細胞集団中の潜在的に有害な単一細胞の特定を可能にする。単一細胞から分泌される化合物を分析する能力により、細胞集団中の細胞の表現型の可変性の評価が可能になる。
一態様においては、本発明の装置は、捕捉剤アレイとインターフェース形成しているマイクロウェルアレイを含む。典型的な装置の図を図21に示し、装置及びその要素の典型的概略図は図1及び図22に示す。図22に示すように、装置100は、捕捉剤アレイ20と連結したマイクロウェルアレイ10を有する。装置100は、捕捉剤の完全なセット21を個々のマイクロウェル11と連結し、複数のインターフェース101を形成する。各インターフェース101は、個々のマイクロウェル11及び捕捉アレイのセット21を有し、これは、マイクロウェル11内に存在する多数の化合物の多重検出を実施するために使用される。したがって、マイクロウェルアレイ10及び捕捉剤アレイ20は、個々のマイクロウェルからのハイスループット検出及び分析を可能にするために正確に連結するように構成されている。一態様においては、装置は、捕捉剤のセットに連結した、約1,000〜100,000個のマイクロウェルを有する。マイクロウェルアレイ10及び捕捉剤アレイ20の更なる記載を以下に提供する。
特定の態様においては、本発明の装置はマイクロウェルアレイを有する。マイクロウェルアレイは、細胞及び細胞が分泌した化合物を、各ウェルの限定的空間内に捕捉及び拘束し、それによって、実施の間の細胞の逸脱を防止する。更に、マイクロウェルアレイは、分泌される化合物の放出に関しては細胞が正常に機能することを可能にする。一態様においては、細胞は生きたままであり(すなわち、固定されず)、マイクロウェル内で正常に機能する。
特定の態様においては、本発明の装置は捕捉剤アレイを有する。捕捉剤アレイは、複数の捕捉剤のセットを有し、各捕捉剤のセットは、化合物の多重検出に好ましい複数の捕捉剤の全てを有する。本明細書の他の場所に記載したように、各セットは、1個のマイクロウェルの内容物にアクセス可能なように構成されている。特定の態様においては、捕捉剤アレイは、捕捉剤セットの繰り返しを有する。
一態様においては、本発明は、単一細胞により分泌される化合物の多重検出用システムを含む。特定の態様においては、システムは、本明細書の他の場所に詳細に説明した装置を有する。すなわち、一態様においては、システムは、上述したマイクロウェルアレイ及び捕捉剤アレイを有する装置を有している。
本発明は、少量の試料中の関心のある多種類の化合物を同時に検出する方法を提供する。例えば、一態様においては、本発明は、本明細書の他の場所で説明したように、マイクロウェル中に収容されている単一細胞由来のタンパク質の多重検出を可能にする。特定の態様においては、この方法は、細胞の集団からのプロファイルよりも好ましい単一細胞由来の個別化プロファイルの決定を可能にする。個々の細胞からのプロファイルを識別する能力は、全集団内に隠れている、特定の細胞の表現型を決定するのに役立つ。例えば、これは、他の方法では検出が困難であるか又はほとんど不可能な組織試料中のがん性細胞、悪性細胞、又は転移性細胞の検出に有用である。特定の態様においては、方法は、集団をベースとする試験よりも多くの情報を提供する、平均的な単一細胞のパラメータを計算する能力を提供する。このような解析は、例えば、亜集団及び/又はグループ化した表現型の特定に使用することができる。単一細胞多重化パラメータによってグループ化された、個々の細胞の亜集団を単離することは、組織試料中の悪性がん細胞及び応答免疫細胞の重要な活性群の分離に役立ち得る。したがって、本発明の多重化能力によれば、表現型サブタイプの単離又は特定が可能になる。例えば、方法は、集団内の所定の表現型の相対量を特定する。更に、このような解析によれば、分泌された化合物又は細胞性生成物の相互相関の定量、集団又はチップ全体の化合物の分布統計の作成、及び試験を行った集団の全体にわたる単一細胞レベルで発現する多機能性の評価(これらに限定されない)が可能になる。
本発明は、単一細胞プロファイルを明らかにするための方法を提供する。例えば、一態様においては、本発明は、単一細胞からのプロテオミクスプロファイルを決定する方法を提供する。他の態様においては、本発明は、単一細胞からのゲノムプロファイルを決定する方法を提供する。他の態様においては、本発明は、単一細胞からのセクレトーム(すなわち、分泌されるタンパク質及び化合物)を決定する方法を提供する。他の態様においては、本発明は、単一細胞からのプロテオミクス、ゲノム、及び/又はセクレトームを統合したプロファイルを決定する方法を提供する。更に、本発明の方法は、大量の単一細胞のプロファイルを同時に決定するハイスループット法を提供する。
分泌されたタンパク質は、ヒトの健康及び疾患においてさまざまな細胞機能を表す。高い程度の細胞の不均一性のため、更に重要なことには、個々の細胞の多機能性のため、単一細胞由来の一連のタンパク質を同時に測定し、平行して多く(1000個超)の単一細胞を迅速に試験する、まだ満たされていない要求がある。本明細書の開示は、数千の単一細胞の高度な多重タンパク質検出を平行して行うための高密度の捕捉剤マイクロアレイを組み合わせた多くのサブナノリットルマイクロチャンバーから構成される、簡単な生物学的解析試験プラットホームである。このプラットホームは、細胞株、及び患者由来の初代細胞等の複雑な生物試料の両方について試験された。単一細胞のセクレトーム的特徴間の明らかな不均一性を、遊走性等の細胞の物理的挙動に直接相関させることができることが初めて観察された。ELISpot及び先端ミクロ技術によって可能な試験のような最先端のタンパク質分泌試験と比較し、本明細書に開示されたアプローチは、ハイスループット及び高多重度の両方を提供する。また、患者の細胞機能及び免疫の有益な監視のための潜在的に革新的な手段となる、操作の容易さ、サンプル消費量の少なさ、及び標準化されたデータ分析等の臨床医に優しい多くの特徴を有している。本明細書に示されるデータの更なる説明は、全体として本明細書に組み入れられるLu et al., 2013, Anal Chem,85(4):2518-2556に見いだすことができる。
例で使用される材料及び方法を以下に説明する。
PDMSレプリカの鋳型は、深堀り反応イオンエッチング(DRIE)法によりエッチングしたシリコンマスターである。これは、PDMSの離型を容易にするために、クロロトリメチルシラン(Aldrich)の蒸気で一晩前処理した。PDMSプレポリマー及び硬化剤(RTV615, Momentive)を完全に混合し(部分A及びBを10:1の割合で)、シリコンマスター上に注いだ。真空乾燥機1hにより気泡を除去し、80℃のオーブンで2hr、PDMSを硬化させた。硬化後、PDMS層を鋳型から離し、入り口部及び出口部の穴をあけた。装置を、エタノール及び2−プロパノール中で超音波処理することによって洗浄し、ポリ−L−リジンマイクロアレイスライド(Erie Scientific)と結合させた。その後、アセンブリを、オーブン中、80℃で2時間焼き、結合を強化した。抗体フローパターニング用PDMSマイクロチップは、それぞれ20種までの抗体をパターニングすることができる、20個の分離されたマイクロチャンネルを有している。PDMSフローパターニングマイクロチップにおける、一連のラインの典型的な幅及びピッチは、それぞれ25μm、50μmである。
サブナノリットルマイクロチャンバーアレイの鋳型は、DRIE法によりエッチングしたシリコンマスターである。これは、PDMSの離型を容易にするために、クロロトリメチルシラン(Aldrich)の蒸気で一晩前処理した。単一細胞捕捉のためのサブナノリットル微少流体チャンバーアレイチップは、ソフトリソグラフィ技術を用いて、PDMS(RTV615, Momentive、部分A及びBを10:1の割合で)から製造した。真空乾燥機1時間により気泡を除去し、80℃のオーブンで2時間、PDMSを硬化させた。サブナノリットルマイクロチャンバーアレイチップは、カラムあたり約550個のマイクロウェルを有し、14個のカラムに5044個の細胞捕捉チャンバーを有している。結果として得られるマイクロウェルアレイの異なる空間的位置に、自動的マイクロウェル及び細胞認識のために、リソグラフィーマスクに、画像「マーカー」が含まれている。
ヒトA549細胞株を、10%ウシ胎児血清(FBS、ATCC)を補充したF12/K培地中で培養した。ヒトU937細胞株は、ATCC(アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、ATCC)から購入し、10%ウシ胎児血清(FBS、ATCC)を補充したRPMI1640培地(Gibco, Invitrogen)中で培養した。U937細胞懸濁液、各100μLを、1μLの20μg/mLホルボール12−ミリスタート−13−アセテート(Fisher)を用いて分化させ、1mLの1mg/mLのリポ多糖類(Calbiochem)を負荷して、その懸濁液をPDMSマイクロウェルアレイ上にピペッティングする前にToll様受容体4(TLR4)シグナル伝達を活性化した。
ヒトの試料は、髄膜種の個人から得た。患者の一次組織を、最初にメスで刻み、次いで1倍のTrypLE Select(Invitrogen)に入れた。火造りのガラスピペットで組織を粉砕し、37℃で5分間インキュベートした。細胞懸濁液を、火造りのガラスピペットで再度粉砕し、37℃で更に5minインキュベートした。次いで、細胞懸濁液を40μmの細胞ろ過器(BD Falcon)でろ過し、DMEM−F12(Gibco, Invitrogen)で洗浄した。次いで、懸濁液を300RCFで5min遠心分離した。沈殿を、DMEM−F12に再度懸濁した。次いで、赤血球溶解溶液(Miltenyi Biotec)を使用して赤血球を取り除き、300RCFで5min遠心分離した。次いで、細胞を、DMEM−F12に106細胞/mLに再懸濁した。
単一細胞捕捉実験を実施する前に、PDMSマイクロウェルアレイ及び捕捉剤アレイスライドグラスを、3%BSA溶液(Sigma)で、それぞれ2hrブロッキングし、その後新鮮な細胞培地で洗浄した。捕捉直前に、細胞を新鮮な培地に懸濁した。PDMSマイクロウェルアレイを上向きに配置し、薄層がPDMSマイクロウェルアレイの表面に残存するまで細胞培地溶液を除去した。細胞懸濁液(50〜200μL)をマイクロウェルアレイにピペットで移し、細胞がマイクロウェル内に落ちるように、10min沈ませた。抗体スライドグラスを、細胞捕捉チャンバー上に捕捉剤アレイが乗っているようにPDMSマイクロウェルアレイの上部に配置した。次いで、PDMSマイクロウェルアレイ及びスライドグラスをネジで堅く固定し、バネを用いて圧力を配した。単一細胞がマイクロアレイ中に捕捉され、アセンブリを24時間インキュベートし、細胞分泌が起こるようにした。捕捉された細胞を24時間インキュベートした後、ネジをはずして捕捉剤アレイスライドグラスを除去し、ELISAイムノアッセイ法を実施し、結果を測定し、Genepixスキャナー及びソフトウェアにより解析した。
細胞集団試験は、Spotbot 3 microarrayer(Arrayit)を用いてポリ−L−リジンスライドグラスにスポットした、カスタム印刷抗体マイクロアレイにより実施した。同じ抗体パターンを有する12個の同一のサブグループを各スライドグラス上に印刷した。印刷後、抗体スライドグラスを湿箱(75%相対湿度で飽和NaClを含む)中に5時間維持した。細胞集団試験の前に、スライドグラスをPDMSマイクロウェルスラブに結合し、3%BSA溶液で2時間ブロッキングした。次いで、細胞培養上清を種々のマイクロウェル中に加え、1時間インキュベートした。インキュベーションに続き、ELISA免疫試験法を実施し、結果を検出し、Genepixスキャナー及びソフトウェアにより解析した。
ELISA法は、単一細胞により分泌されたサイトカインを検出可能なシグナルに変換するために実施した。ビオチン化検出抗体(表1)の混合物をスライドグラスにピペットを用いて移し、室温で45minインキュベートし、サンドイッチ免疫試験を完了し、次いで3%BSA溶液で洗浄した。APC色素標識ストレプトアビジン(eBioscience、200μL、5μg/mL)をスライドグラスに加え、更に45minインキュベートした。次いで、スライドグラスを3%BSAで再度洗浄し、3%BSAで0.5hrブロッキングした。BSAによるブロッキングに続き、スライドグラスをDPBS、DPBS、DI水、DI水に順に浸漬し、最後に風乾した。
FITC及びAPCチャンネルの蛍光スキャン画像を得るために、Genepix 4000B及び4200Aスキャナー(Molecular Devices)を使用した。蛍光シグナルの収集には、2色のチャンネル488(青)及び635(赤)を使用した。画像は、マイクロウェルアレイ鋳型を積載及び整列し、その後蛍光強度値を抽出することにより、GenePix proソフトウェア(Molecular Devices)を使用して解析した。蛍光の結果は、GenePix Proにおける画像解析手段により抽出した。次いで、蛍光の結果を光学的画像化により解析したサブナノリットルのマイクロチャンバーアレイチップの各チャンバーに対応させた。
アセンブリを、自動化顕微鏡試料台(Prior)で画像化し、各マイクロウェル中の細胞の数及び位置を記録する光学的画像を得た。自動化されたチップ全体の光学的画像を、Nikon Diaphot SA光学顕微鏡(Nikon)と連結したPaxcam(Paxit!)で撮影し、Paxitソフトウェア(Paxit!)を用いてつなぎ合わせた。画像形成後、アセンブリを37℃のインキュベータ中に24hr置き、細胞を分泌させた。24時間インキュベートした後、細胞を再度画像化し、細胞機能を観察する。OpenCV(Intel)を使用して、自分で開発したソフトウェアは細胞を自動計数するために書かれ、細胞数は、それぞれの細胞チャンバーに抽出された蛍光データと一緒に対応づけした。
全ての蛍光スキャンしたアレイを、各セット中の全てのフィーチャについてバックグラウンドを引いた蛍光シグナル平均値を抽出するために、Genepixソフトウェアで処理した。自分で開発したMatlab(Math Works)コードを、蛍光データの自動化抽出及び散布図の生成のために作製した。Excel(Microsoft)及びOriginPro8(OriginLab)を、抽出したデータを編集するために使用した。ヒートマップ及び教師なしのクラスタリングを、ソフトウェアCluster/Treeview(Eisen Laboratory)を使用して、抽出したデータから生成した。統計解析は、Excel、OriginPro8、及びR(R Development Core Team)で実施した。
本明細書で説明するものは、並行して千個超の単一細胞から14種のサイトカインを同時検出するためのサブナノリットルのマイクロチャンバーアレイと、高密度捕捉剤アレイとを統合する、ハイスループット単一細胞セクレトーム解析プラットホームである。チップは、洗練された流体の取り扱い又はかさばる装置を必要としない、簡単な試験「キット」により実施することができる。この装置の有用性は、ヒト細胞株、及び患者の新鮮な腫瘍から分離した一次細胞の分泌の解析について証明されている。結果は、集団の単一細胞のセクレトームの特徴間に明らかな不均一性があり、試験を行った種々のタンパク質間で得られた相関関係がそれらの機能的分類と一致していることを示している。この技術は、研究及び臨床診断の両方で即時使用を見いだし得る真の実用的かつ有益な手段をもたらす、細胞捕捉、定量、自動化データ解析及びかさ高い流体操作システムの排除の単純化されたスキーム(Balaban et al., 2004, Science 305(5690):1622-5)を用いた、抗体バーコードをベースとするタンパク質分泌測定技術(Ma et al., 2011, Nat Med 17(6):738-43)についての以前の研究から発展している。
単一細胞セクレトーム解析装置は、2つの別々の部分:表面結合免疫試験のための高密度捕捉剤アレイガラス基板、及び単一細胞の捕捉のためのサブナノリットルマイクロチャンバーアレイから構成される(図1A)。捕捉剤アレイスライドは、30個のフィーチャの繰り返しを有し、それぞれは、ポリ−L−リジン被覆表面に固定された、種々の抗体の20個の帯を有する。抗体を含む帯は幅が20μmであり、全体のアレイのピッチサイズが1mmである。マイクロチャンバーアレイは、ポリジメチルシロキサン(PDMS)(Unger et al., 2000, Science 288(5463):113-6)からソフトリソグラフィ(Unger et al., 2000, Science 288(5463):113-6)により製造された1層のマイクロチップであり、生物学的微少流体工学で広く使用されている光学的に透明なシリコンエラストマーである。マクロチャンバーアレイは、5440個の長方形のマイクロチャンバーを有し、それぞれは、長さ、幅及び深さが、それぞれ1.8mm、20μm及び15μmである。これら2つの部分は別々に製造され、捕捉剤アレイスライドが使い捨て試験片として働き、マイクロチャンバーアレイが再利用可能な装置として働くように、試験の際に組み合わされた。このプラットホームを使用するために、単一細胞懸濁液の1滴(約106細胞/mL)をマイクロチャンバーアレイチップ表面に、直接ピペットで乗せる。細胞は重力によってマイクロチャンバー内に落下し、その後、捕捉剤アレイスライドが、線がマイクロチャンバーの長さに直交するようにマイクロチャンバーの上部に抗体側を下に配置させる。マイクロチャンバーは、フィーチャの少なくとも1つのセットを含み、それによって正確な配置の必要性を排除するのに十分長く設計されている。最終的に、このアセンブリは、4つのバネで調整されたねじを有する2個の透明なプラスチック板で固定され(図6)、単一細胞分泌測定のための従来の組織培養器内に配置される。個々の細胞から分泌されたタンパク質は、捕捉剤アレイによって捕捉され、ビオチン化検出抗体、その後、蛍光プローブ(例えば、Cy5)と連結したストレプトアビジンとインキュベートすることによって読み出される。プロトタイプ単一細胞プロテオミクスチップ(Ma et al., 2011, Nat Med 17(6):738-43)と比較し、この装置は、洗練された微少流体制御システム又はあらゆる操作するためのかさばる装置を必要としないため、最小限の工学のバックグラウンドを有する研究者及び臨床医による広範な使用にも受け入れられる。
捕捉剤アレイにより試験されるタンパク質を図2Aに記載する。単一細胞から分泌される、これらの特定のタンパク質の評価は、細胞プロセスの一連におけるそれらの機能のために特に重要である(Raman et al., 2007, Cancer Lett 256(2):137-65;Wu et al., 2012, PLoS Comput Biol 8:el002355;Zou, 2005, Nat Rev Cancer 5(4):263-74;Dranoff 2004, Nat Rev Cancer 4(1):11-22)。それらには、広範囲の免疫学的又は病態生理学的プロセスで必要なサイトカイン、ケモカイン及び増殖因子が含まれる。単一細胞から分泌される、これらのタンパク質の評価は、細胞性免疫及び細胞−細胞シグナル伝達ネットワークの研究において重要である。単一細胞由来のこれらのタンパク質を同時に測定するために、捕捉抗体を、高密度捕捉剤アレイとして基板表面に固定する。単一細胞解析を実施する前に組み換えタンパク質を用いて試験を検証した。個々の組換えタンパク質を、4対数範囲の濃度にわたって新鮮な細胞培養培地に注入し、交差反応性、検出限界(LOD)及びダイナミックレンジを評価するために抗体の全パネルにさらした。5%超の交差反応性(5ng/mLのタンパク質濃度で)を有する抗体を除外又は交換する。最終的な抗体対のパネルを、表1に要約したように得た。滴定曲線(図2B)は、3桁の規模の典型的な測定範囲の多重化アレイにおけるこれらのタンパク質の定量的測定の可能性を証明する。LODは400pg/mLから10pg/mL未満の範囲であり、抗体対の親和性に依存した。マイクロチャンバーの容積(約0.54nL)及び代表的な検出感度(約10ng/mL)に基づき、マイクロチャンバー中の捕捉剤アレイにより検出することのできるタンパク質量は5.4agのオーダーであり、これは、約160分子に等しい。したがって、プラットホームは、単一細胞から分泌されるタンパク質を検出する感度(通常、約102〜5のコピー数)を有する。
最初に、単一細胞セクレトーム解析チップを、神経膠芽腫多形細胞株(U87)由来の14種のタンパク質を測定するために使用した。この実験においては、単一細胞が1278個のマイクロチャンバーに捕捉され、10個以下の細胞を、各マイクチャンバー内に捕捉した。捕捉剤アレイのフローパターニングの際、FITC−BSA(0.5mg/mL)を、常にチャンネル1に流入させ、位置参照及び内部の質/均一性対照の両方として役立つ、蛍光シグナルの連続的ラインを形成した。スキャンした蛍光画像の代表的領域に示すように(図3A及び図9A)、青色のFITC−BSA参照ライン及びタンパク質分泌レベルに対応する赤色のパターン化したシグナルが容易に見える。同図に示すのは、積載された細胞の、14個のマイクロチャンバーの明視野像、対応する蛍光アレイ画像、及び2つのオーバーレイである。24時間のインキュベーション後に観察される主要なタンパク質(FGF、VEGF、MIF、IL−6、IL−8、及びMCP−1)は、主として、炎症誘発性タンパク質又は化学誘因性タンパク質である。
フローサイトメトリーに基づく単一細胞解析はタンパク質の多重測定を可能にするが、測定されたタンパク質プロファイルを、細胞の挙動及び遊走特性等の活性と直接関連させることはできない。本明細書に記載のプラットホームは、捕捉細胞を計数するために細胞のライブ画像化を利用するので、細胞挙動の同時測定と、同じ細胞の対応するタンパク質プロファイルを後で関連づけることが可能になる。本明細書において、単一細胞セクレトーム解析チップに積載した肺がん細胞(A549)の遊走は、インキュベーション前及びインキュベーション24時間後の移動距離を測定することにより測定した(図4A)。これらの細胞はチャンネルの壁に接着し、異なる速度で移動することが見られた。結果を、細胞移動距離の増加によって選別した単一細胞セクレトームプロファイルを示すヒートマップに要約する(図16)。サイトカインレベルのP値解析は、低運動性細胞(同じ範囲の下20%)に対し高運動性細胞(全観察範囲の上20%)で実施した。大部分の細胞は移動しないが、高度に移動する細胞は、統計的にIL−8の高発現と関連している(P<0.01)(図4B)。MCP−1の分泌と細胞の移動との相関関係はそれほど有意でない(図4c、d)。IL−6は、散布図において細胞運動性と負に関連しているように見えるが、試験を用いた統計的相関関係を示さない。これらのタンパク質は、異なるがんにおける運動性及び転移の可能性の増大に関連しており(Singh et al., 1994, Cancer Res 54(12):3242-7;Li et al., 2003, J Immunol 170(6):3369-76;Waugh and Wilson, 2008, Clin Cancer Res 14(21):6735-41)、単一細胞IL−8分泌の試験を通し、転移と関連する個々の細胞のセクレトームの特徴を研究することが可能である。簡単に言えば、プラットホームは、初めて、細胞機能、基礎となる分子メカニズムの理解の向上をもたらすことができ、単一の生きた細胞のタンパク質のセクレトーム特徴及び表現型特性(例えば、遊走性)の同時測定を示している。
複雑な生物試料に由来する細胞の多重化された分泌物を測定するためにプラットホームの有用性を拡張するために、本発明者らの装置を、悪性脳腫瘍、神経膠芽腫多重型(患者1及び2)又は髄膜腫(患者3)の3名の患者由来の新鮮な原発性腫瘍組織の測定にも適用した(表2)。外科的に切除した腫瘍組織の一部(<0.2g)を氷冷したリン酸緩衝食塩水で洗浄し、小さい断片に刻んだ後、コラゲナーゼを使用して単一細胞懸濁液に解離した(図5A)。細胞を遠心沈殿し、約106細胞/mLの密度で培地に再懸濁した。組織を得て1時間以内に、単一細胞懸濁液を、ピペットにより、単一細胞セクレトーム解析装置に積載する。細胞に12時間サイトカインを分泌させた後、アレイ上のパターンを、検出抗体を用いて現像し、スキャンした。生の蛍光画像(図5B、患者1)は、細胞株からスキャンした画像と比較し、優れたタンパク質シグナル、及び類似のバックグラウンドを示す。抗体アレイは、図5bに示すように、14種のタンパク質を含む。この実験においては、単一細胞を1058個のマイクロチャンバーが捕捉し、マイクロチャンバー内に0〜22個の細胞が捕捉された。個々のそれぞれのチャンネルから分泌した各サイトカインの蛍光強度を定量し、その後、単一細胞分泌プロファイルのヒートマップを作製した(図5C)。単一細胞分泌プロファイルの教師なしの階層的クラスタリングは、活性の異なる3種の別々の集団の細胞を示した。細胞の1つのクラスター(図5C、青色のクラスター)は通常は、より活性であり、より広い範囲のタンパク質を分泌し、恐らくより侵襲的な表現型に対応するが、緑色によって示される細胞は、最低レベルのサイトカイン産生を示し、腫瘍幹細胞/前駆細胞のような、より静止状態の表現型を表す可能性がある(Wicha et al., 2006, Cancer Res 66(4):1883-90)。オレンジ色により示される大きい画分は機能的表現型の多様性である。患者2からの結果(図5D)は、腫瘍タンパク質としてMIF及びIL−8であるという、患者1からの結果との類似性を示すが、炎症性サイトカインの産生のかなりの減少及び高レベルのEGFという点で異なるパターンを示す。第2層タンパク質は、全て、明らかな細胞不均一性を示す。図17及び図18は、タンパク質の相対濃度及び細胞集団における分布を示す、個々のタンパク質のヒストグラム及び散布図を示す。
単一細胞プロテオミクス解析は、一般に、核酸についてのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)のようなタンパク質の同等の増幅法がないため、単一細胞からの遺伝子解析よりもはるかに困難である。フローサイトメトリー解析における最近の進歩は、単一細胞由来のタンパク質マーカーの34重の測定を可能にするが、ほとんどのタンパク質は、表面受容体又は細胞質タンパク質である(Bendall et al., 2011, Science 332(6030):687-96)。細胞内サイトカイン染色(ICS)は、「分泌」タンパク質の間接的な評価を可能にするが、おそらく単一細胞の限定された容積内での多数の抗体からの非特異的結合の増大のため現在では、測定することのできるサイトカインの数は現実には10未満に限定されている。更に、ICSを使用して検出された化合物の数が増加すると、個々の標識間のスペクトルの重なりのために、正確さが低下し、ノイズが増大する。更に、タンパク質の分泌とは異なり、細胞機能の直接的な測定ではない。したがって、多重化タンパク質分泌測定は、単一細胞の機能的分析のミッシングピースである。遺伝的に均一な細胞でさえ、非常に不均一である可能性があることはますます明らかになってきており、それらの生物学の研究において、多くの答えがない問題をもたらす(Bendall et al., 2011, Science 332(6030):687-96)。単一細胞の分泌プロファイルを調べることにより、腫瘍の不均一性について、シグナルが平均化され全ての限定的情報が失われる集団における細胞のシグナルパターンを調べるよりも、更に明らかにすることができ、単一細胞の分泌を調べる必要性が強調される(Bendall and Nolan, 2012, Nat Biotechnol 30(7):639-47;Michor and Polyak, 2010, Cancer Prev Res 3(11):1361-4)。
関心のある45種までの化合物の存在を試験するための検出可能な標識の空間的位置及び色を使用する、本発明の装置の一態様の開発が本明細書に開示される。別々に標識された二次抗体の使用は、同時に検出可能な関心のある化合物の数を非常に増大させる能力を可能にする。
また、コントロールとして15番目のラインを使用していることが含まれている。
この試験で使用される抗体を、以下の表3に示す。
その変形であるFLUOROSpotを含むELISpotが、単一細胞由来の免疫エフェクタータンパク質の真の分泌を測定するために広く使用されている唯一の技術であり、そのため未だ、細胞性免疫を評価するための前臨床及び臨床手段の主軸となっている。しかし、それは1種又は2種のタンパク質しか測定できず、最小限の生物学的情報を提供する。したがって、それは、機能的多様性の完全な像を捕えられず、又は最も強力な多機能性の集団を特定することができないので、免疫細胞の質及び保護能力を示すことができない。単一細胞由来のタンパク質の一連を測定し得る技術は非常に望まれており、免疫多様性から、腫瘍内不均一性、多機能性、細胞間コミュニケーションネットワークにまで及ぶ重要な生物学的及び医学的問題の一連に対処するのに役立つであろう。このような技術は、以下の全ての要求を満たす必要がある。(i)単一細胞の感受性(タンパク質は単一細胞から分離され、感度よく測定することができる)、(ii)高多重度(タンパク質の大きいパネル(35以上)を同時に測定することができる)、(iii)ハイコンテント(何千もの単一細胞を並行して解析することができる)。サブナノリットルのチャンバーをベースとする単一細胞タンパク質分泌試験において、空間的多重化及びスペクトル多重化を組み合わせた新規技術が本明細書に開示されている。これは、従来のELISpot試験を使用するたったの1〜2種類のタンパク質と比較し、45種類の分泌タンパク質の同時定量を可能にし、これは、単一細胞プロテオミクス試験では、多重能力の最高記録である。このプラットホームは、3種のToll様受容体(TLR)をそれぞれ活性化する、病原性リガンドのLPS、ポリIC及びPAM3に対するヒトマクロファージ細胞を調べるために適用された。単一細胞多重タンパク質プロファイルは、予想外に大きな細胞間変動性及び3段階の応答を示し、これは、viSNEを使用する圧縮クラスター解析により更に確認された。viSNEは、t-Distributed Stochastic Neighbor Embedding(t-SNE)アルゴリズムに基づく、最近開発された解析法であり、高次元の単一細胞のデータの可視化、クラスター化を可能にし、細胞間の表現型不均一性を明らかにする強力な手段である(全体が本明細書に参照として組み入れられる、Amir et al., 2013, Nature Biotechnology, 31:545-552)。3種の機能的細胞のサブセットが同定され、応答は、初期状態と強く関連している。最初の集団は減少するか、無活動の状態に戻った。第2の集団は、そのエフェクター機能については大きく変化しないままである。第3の集団は、サイトカインの産生増大と強く相関し、非常に多機能性であると思われる。この3段階の応答は、マクロファージ細胞株及び初代単球由来マクロファージの両方で優勢であり、病原性リガンドに対する細胞性免疫の質(多機能性)及び範囲(画分)を決定する本質的な非遺伝的不均一性であると思われる。本明細書の研究は、深い機能的表現型、及び既存の技術によって調査することのできないパーターベーゲン(perturbagen)に対する不均一な応答を示す、単一細胞多重化タンパク質プロファイリングの能力を実証する。このプラットホームは、例えば、免疫系又は腫瘍微少環境における細胞の不均一性を評価するために、前臨床試験及び臨床試験の両方で大きな可能性を有している。
これらの実験で使用した材料及び方法を以下に説明する。
PDMSレプリカの鋳型は、深堀り反応イオンエッチング(DRIE)法によりエッチングしたシリコンマスターである。これは、PDMSの離型を容易にするために、クロロトリメチルシラン(Aldrich)の蒸気で一晩前処理した。PDMSプレポリマー及び硬化剤(RTV615, Momentive)を完全に混合し(部分A及びBを10:1の割合で)、シリコンマスター上に注いだ。真空乾燥機1時間により気泡を除去し、80℃のオーブンで2時間、PDMSを硬化させた。硬化後、PDMS層を鋳型から離し、入り口部及び出口部の穴をあけた。装置を、エタノール及び2−プロパノール中で超音波処理することによって洗浄し、ポリ−L−リジンマイクロアレイスライド(Erie Scientific)と結合させた。その後、アセンブリを、オーブン中、80℃で2時間焼き、結合を強化した。抗体フローパターニング用PDMSマイクロチップは、それぞれ20種までの溶液をパターニングすることができる、20個の分離されたマイクロチャンネルを有している。PDMSフローパターニングマイクロチップにおける、一連のラインの典型的な幅及びピッチは、それぞれ25μm、50μmである。
マイクロチャンバーアレイの鋳型は、DRIE法によりエッチングしたシリコンマスターである。これは、PDMSの離型を容易にするために、クロロトリメチルシラン(Aldrich)の蒸気で一晩前処理した。単一細胞捕捉のための微少流体チャンバーアレイチップは、ソフトリソグラフィ技術を用いて、PDMS(RTV615, Momentive、部分A及びBを10:1の割合で)から製造した。真空乾燥機1時間により気泡を除去し、80℃のオーブンで2時間、PDMSを硬化させた。
供給業者に提供された手順書に従い、488nmのグループ及び532nmのグループの検出抗体を、それぞれAlexa Fluor488及びAlexa fluor532色素と共有的に結合した。635nmのグループの検出抗体は、すべてビオチンを用いてタグ化し、これらは、ビオチンとストレプトアビジン/アビジンの結合を通してフルオロフォアAPC又はCy5結合ストレプトアビジン又はアビジンを用いて読み出すことができる。
ヒトU937細胞株は、ATCC(アメリカンタイプカルチャーコレクション,ATCC)から購入し、10%ウシ胎児血清を補充したRPMI1640培地(Gibco, Invitrogen)中で培養した。50ng/mLホルボール12−ミリステート13−アセタート(Fisher)を用い、48時間でU937細胞を分化させた。その後、培地を変え、正常培地に36時間置換した。単一細胞の実験のために、トリプシンを用いて細胞を集めた。懸濁液をPDMSマイクロウェルアレイにピペットで移す直前に、100ng/mLのリポ多糖類(Calbiochem)を細胞に負荷し、Toll様受容体4(TLR4)(又はPAM3、ポリICのような他の活性化試薬)のシグナル伝達を活性化した。
細胞を集め、対照及び処置細胞を106の密度で、組織培養ペトリ皿に播種する。2時間後、分泌阻害剤、Brefeldin A(Biolegend)を加えた。次いで、細胞を22時間インキュベートし、細胞内フローサイトメトリーのために細胞を集めた。製造業者の説明書に従い、細胞を固定し、染色した。
単一細胞捕捉実験を実施する前に、PDMSマイクロウェルアレイ及び抗体含有スライドグラスを、それぞれ3%BSA溶液(Sigma)で2時間ブロッキングし、その後、新鮮な培地で洗浄した。細胞捕捉の直前に細胞を新鮮な培地に懸濁した。PDMSマイクロアレイを上向きに配置し、薄層がPDMSマイクロウェルアレイ上に残存するまで、細胞培養培地溶液を除去した。細胞懸濁液をマイクロウェルアレイにピペットで移し(50〜200μL)、細胞がマイクロウェル内に落下するように10分間沈降させた。抗体スライドグラスを、細胞捕捉チャンバーに抗体が面するようにPDMSマイクロウェルアレイの上部においた。次いで、PDMSマイクロウェルアレイ及びスライドグラスを、ネジでしっかりと固定した。単一細胞は、このようにマイクロウェルアレイ内に捕捉され、細胞がタンパク質を分泌できるようにアセンブリをインキュベートした。捕捉された細胞を24時間インキュベートした後、ネジをはずして抗体スライドグラスを除去し、ELISA免疫試験手順を実施し、Genepixスキャナー及びソフトウェアを用いて結果を検出及び解析した。
細胞集団試験は、ポリ−L−リジンスライドグラス上にSpotbot 3 microarrayer(Arrayit)をスポットした、カスタム印刷抗体マイクロアレイで実施した。同じ抗体パターンを有した12の同一サブグループを、各スライドグラス上に印刷した。印刷後、抗体スライドグラスを、湿箱(75%相対湿度で、飽和NaCl溶液を含む)中に5時間維持した。細胞集団試験の前に、スライドグラスをPDMSマイクロウェルスラブと結合し、3%BSA溶液で2時間ブロッキングした。次いで、細胞培養上清を種々のマイクロウェルに加え、1時間インキュベートした。インキュベーション後、ELISA免疫試験手順を実施し、Genepixスキャナー及びソフトウェアを用いて結果を検出及び解析した。
ELISA法を行い、検出可能なシグナルへの単一細胞により分泌されるサイトカインの変換を行った。ビオチン化検出抗体の混合物(表3)をピペットでスライドグラスに移し、室温で1hrインキュベートし、サンドイッチ免疫試験を完了させ、その後、3%BSA溶液で洗浄した。APC色素で標識したストレプトアビジン(eBioscience、200μL、5μg/mL)をスライドグラスに加え、更に30minインキュベートした。次いで、スライドグラスを再度3%BSAで洗浄し、3%BSAで0.5hrブロッキングした。BSAブロッキングに続き、スライドグラスをDPBS、DPBS、DI水、DI水に順次浸漬し、その後、最終的に風乾した。
Genepix 4200Aスキャナー(Molecular Devices)を、FITC及びAPCチャンネルの蛍光画像をスキャンするために使用した。3色のチャンネル、488(青色)、532(緑色)及び635(赤色)を、蛍光シグナルを収集するために使用した。画像は、マイクロウェルアレイ鋳型を積載及び整列し、次いで蛍光強度値を抽出することにより、GenePix Proソフトウェア(Molecular Devices)を用いて解析した。蛍光の結果は、GenePix Pro内の画像解析手段を用いて抽出した。次いで、蛍光の結果を、光学的画像化により解析したサブナノリットルマイクロチャンバーアレイの各チャンバーと対応させた。
アセンブリを、自動化顕微鏡ステージを用いて、Nikon Eclipse Ti顕微鏡で画像化し、各マイクロウェル内の細胞の数及び位置を記録した光学的画像(暗視野及び斜光像)を得た。暗視野像は、各マイクロチャンバーの位置及び配列を定義するために使用され、斜光像は、細胞数及びその位置を定義するために使用される。画像は、いずれも、自動化細胞計測を実現するために、各画像の閾値を定義することにより、Nikonソフトウェア(NIS-Elements Ar Microscope Imaging Software)で処理することができる。細胞数は、その後、それぞれの細胞チャンバーに抽出された蛍光データと照合される。
蛍光スキャンした全てのスライドを、Genepixソフトウェアで処理し、各セット内の全てのフィーチャの平均的蛍光シグナルを抽出した。自分で開発したMatlab(Math Works)コードを、蛍光データの自動化抽出及び散布図の生成のために作製した。Excel(Microsoft)及びOriginPro8(OriginLab)を、抽出したデータを編集するために使用した。ヒートマップ及び教師なしのクラスタリングを、ソフトウェアCluster/Treeview(Eisen Laboratory)を使用して、抽出したデータから生成した。統計解析は、R(R Development Core Team)で実施した。
実験は、本明細書に記載の45重の単一細胞タンパク質分泌プロファイリングプラットホームを使用して実施した(図43)。細胞懸濁液をPDMSマイクロウェルアレイチップ表面にピペットを用いて移動し、細胞を重力によりマイクロチャンバー内に落下させた。次いで、フローパターン形成した45重の抗体固定化スライドグラスを、マイクロチャンバーの上部に下向きに配置し、抗体フィーチャがマイクロチャンバーに対して垂直になるようにした。この処理の間に、0個から数十個の細胞がマイクロチャンバー内に捕捉される。捕捉された細胞数はポアソン分布に一致する。最終的に、このアセンブリは、6本のネジで2つの透明なプラスチック板に固定される。電動位相差顕微鏡が、アセンブリを画像化し、各マイクロチャンバー内の細胞数及び位置を記録するために使用される。次いで、それを、細胞にタンパク質を分泌させるために、組織培養インキュベータ中に24時間配置する。この間に個々の細胞から分泌するタンパク質を抗体で捕捉し、対応する検出抗体との反応により検出可能なシグナルに変換し、その後、最終的に蛍光スキャナーにより読み出す。各単一細胞に対応させて蛍光シグナルを定量し、ヒートマップ、散布図又はVISNEによって示すように解析する。
Claims (35)
- 複数の閉鎖インターフェースを含む、細胞から分泌された化合物の多重検出用装置であって、
各閉鎖インターフェースが、(a)細胞を含むように構成されたマイクロチャンバーと、(b)空間的に同定可能な少なくとも10分離フィーチャを含む基板とを含み、
少なくとも10分離フィーチャが、1分離フィーチャあたり、少なくとも2種の固定化捕捉抗体を含み、
各固定化捕捉抗体が、対象とする異なるタンパク質を認識し、
ここで、マイクロチャンバー及び基板が、連結して複数の閉鎖インターフェースを形成し、各閉鎖インターフェースは、各マイクロチャンバーに積載した細胞および細胞から分泌された化合物が前記少なくとも10分離フィーチャの全てにアクセス可能であり、それによって固定化捕捉抗体の全てにアクセス可能であるようにマイクロチャンバー及び基板を含む、前記装置。 - 少なくとも10分離フィーチャが、1分離フィーチャあたり、少なくとも3種の固定化捕捉抗体を含む、請求項1に記載の装置。
- 閉鎖インターフェースが、平行に配置されている、請求項1に記載の装置。
- 分離フィーチャが、閉鎖インターフェース内で、平行に配置されている、請求項1に記載の装置。
- 装置が、200マイクロチャンバー/cm2〜20,000マイクロチャンバー/cm2を含む、請求項1に記載の装置。
- 装置が、100〜100,000マイクロチャンバーを含む、請求項1に記載の装置。
- 基板上の少なくとも1分離フィーチャが、5〜100種の捕捉抗体を含む、請求項1に記載の装置。
- 各マイクロチャンバーが、100μm〜2000μmの長さ、10μm〜100μmの幅、および、10μm〜100μmの深さを有する、請求項1に記載の装置。
- 各分離フィーチャが、5μm〜50μmの幅を有する、請求項1に記載の装置。
- 分離フィーチャが、互いに5μm〜50μm離れている、請求項1に記載の装置。
- 分離フィーチャの各々が、少なくとも3種の固定化捕捉抗体を含む、請求項1に記載の装置。
- 分離フィーチャが、マイクロチャンネルである、請求項1に記載の装置。
- 分離フィーチャが、クロスフローパターニング技術により製造される、請求項1に記載の装置。
- 分離フィーチャが、マイクロスケールプリンティング技術により製造される、請求項1に記載の装置。
- マイクロスケールプリンティング技術が、マイクロスポッティングまたはインジェクトプリンティングである、請求項14に記載の装置。
- 装置が、少なくとも1閉鎖インターフェースのマイクロチャンバー内に、少なくとも1個の細胞を含む、請求項1に記載の装置。
- マイクロチャンバーが、少なくとも1個の細胞から分泌されたタンパク質を含む、請求項16に記載の装置。
- タンパク質が、基板の分離フィーチャの捕捉抗体に結合する、請求項17に記載の装置。
- 単一細胞から分泌されたタンパク質を同定するための方法であって、方法は以下:
(a)複数の閉鎖インターフェースを含む装置を提供すること、
ここで、各閉鎖インターフェースが、細胞を含むマイクロチャンバーと、空間的に同定可能な少なくとも10分離フィーチャを含む基板とを含み、
前記少なくとも10分離フィーチャのうちの少なくとも2分離フィーチャが、1分離フィーチャあたり、少なくとも2種の固定化捕捉抗体を含み、
各固定化捕捉抗体が、対象とする異なるタンパク質を認識し、
ここで、マイクロチャンバー及び基板が、連結して複数の閉鎖インターフェースを形成し、各閉鎖インターフェースは、各マイクロチャンバーに積載した細胞および細胞から分泌された化合物が前記少なくとも10分離フィーチャの全てにアクセス可能であり、それによって固定化捕捉抗体の全てにアクセス可能であるようにマイクロチャンバー及び基板を含み;
(b)細胞からのタンパク質の分泌と、細胞から分泌されたタンパク質の、基板の分離フィーチャ上に固定化された捕捉抗体への結合とをもたらす条件下で、閉鎖インターフェースをインキュベートすること、それによって、細胞から分泌されて抗体上に捕捉されたタンパク質を含み、かつ、閉鎖インターフェースに対応する、基板の領域が形成される;
(c)検出抗体の捕捉タンパク質への結合をもたらす条件下で、検出抗体の存在下で(b)の基板をインキュベートすること、
ここで、各検出抗体が、異なる捕捉タンパク質を認識し、
前記少なくとも10分離フィーチャのうちの少なくとも2分離フィーチャが、1分離フィーチャあたり、少なくとも2種の検出抗体に関連し、
分離フィーチャ中の検出抗体の各々が、同じ分離フィーチャ中の他のすべての検出抗体とはスペクトル的に異なる標識を含む;ならびに、
(d)(a)の閉鎖インターフェースに対応する基板の領域から、捕捉タンパク質に結合する検出抗体を検出すること、それによって、対応する閉鎖インターフェース内に含まれる細胞から分泌されたタンパク質が同定される、
を含む、前記方法。 - 閉鎖インターフェースが、平行に配置されている、請求項19に記載の方法。
- 分離フィーチャが、閉鎖インターフェース内で、平行に配置されている、請求項19に記載の方法。
- 装置が、200マイクロチャンバー/cm2〜20,000マイクロチャンバー/cm2を含む、請求項19に記載の方法。
- 装置が、100〜100,000マイクロチャンバーを含む、請求項19に記載の方法。
- 基板が、10〜100分離フィーチャを含む、請求項19に記載の方法。
- 基板上の少なくとも1分離フィーチャが、5〜100種の捕捉抗体を含む、請求項19に記載の方法。
- 各マイクロチャンバーが、100μm〜2000μmの長さ、10μm〜100μmの幅、および、10μm〜100μmの深さを有する、請求項19に記載の方法。
- 各分離フィーチャが、5μm〜50μmの幅を有する、請求項19に記載の方法。
- 分離フィーチャが、互いに5μm〜50μm離れている、請求項19に記載の方法。
- 分離フィーチャの各々が、少なくとも3種の固定化捕捉抗体を含む、請求項19に記載の方法。
- 分離フィーチャが、マイクロチャンネルである、請求項19に記載の方法。
- 分離フィーチャが、クロスフローパターニング技術により製造される、請求項19に記載の方法。
- 分離フィーチャが、マイクロスケールプリンティング技術により製造される、請求項19に記載の方法。
- マイクロスケールプリンティング技術が、マイクロスポッティングまたはインジェクトプリンティングである、請求項32に記載の方法。
- 単一細胞から分泌されたタンパク質を同定するための方法であって、方法は以下:
(a)複数の閉鎖インターフェースを含む装置を提供すること、
ここで、各閉鎖インターフェースが、細胞を含むマイクロチャンバーと、空間的に同定可能な少なくとも10分離フィーチャを含む基板とを含み、
少なくとも10分離フィーチャが、1分離フィーチャあたり、少なくとも2種の固定化捕捉抗体を含み、
各固定化捕捉抗体が、対象とする異なるタンパク質を認識し、
ここで、マイクロチャンバー及び基板が、連結して複数の閉鎖インターフェースを形成し、各閉鎖インターフェースは、各マイクロチャンバーに積載した細胞および細胞から分泌された化合物が前記少なくとも10分離フィーチャの全てにアクセス可能であり、それによって固定化捕捉抗体の全てにアクセス可能であるようにマイクロチャンバー及び基板を含み;
(b)細胞からのタンパク質の分泌と、細胞から分泌されたタンパク質の、基板の分離フィーチャ上に固定化された捕捉抗体への結合とをもたらす条件下で、閉鎖インターフェースをインキュベートすること、それによって、細胞から分泌されて抗体上に捕捉されたタンパク質を含み、かつ、閉鎖インターフェースに対応する、基板の領域が形成される;
(c)検出抗体の捕捉タンパク質への結合をもたらす条件下で、検出抗体の存在下で(b)の基板をインキュベートすること、
ここで、各検出抗体が、異なる捕捉タンパク質を認識し、
少なくとも10分離フィーチャが、1分離フィーチャあたり、少なくとも2種の検出抗体と関連づけられ、
分離フィーチャ中の検出抗体の各々が、同じ分離フィーチャ中の他のすべての検出抗体とはスペクトル的に異なる標識を含む;ならびに、
(d)(a)の閉鎖インターフェースに対応する基板の領域から、捕捉タンパク質に結合する検出抗体を検出すること、
それによって、対応する閉鎖インターフェース内に含まれる細胞から分泌されたタンパク質が同定される、
を含む、前記方法。 - 少なくとも10分離フィーチャが、1分離フィーチャあたり、少なくとも3種の固定化捕捉抗体を含む、請求項34に記載の方法。
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