JP6189379B2 - 抗原提示細胞ターゲティングワクチン - Google Patents

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Description

本発明は、概して、免疫の分野、特に、新規な抗ＣＤ４０ベースのワクチンに関する。
本発明の範囲を限定することなく、背景技術は、抗原提示に関連して記載される。ワクチン及び抗原提示のための方法の１つの例は、ＣＤ４０に結合するカルボキシ末端ドメインに連結されたアミノ末端抗原をコードするＤＮＡワクチンについてLedbetter et al.に発行された米国特許第７，１１８，７５１号明細書において教示される。手短に言えば、抗原特異的体液性免疫応答及び細胞性免疫応答を改善するために、細胞表面受容体に対して１又は２以上の抗原をターゲティングするワクチンが、教示される。細胞表面受容体に結合するドメインに連結された抗原（複数可）は、内部移行され、細胞内区画（intracellular compartment）の中に抗原（複数可）が運搬され、ここで、抗原（複数可）は、ペプチドに消化され、ＭＨＣ分子上にロードされる。ペプチド抗原に特異的なＴ細胞は、活性化され、免疫応答の増強に至る。ワクチンは、少なくとも１つの受容体に結合するドメインに連結された抗原（複数可）又は少なくとも１つの受容体に結合するドメインに連結された抗原（複数可）をコードするＤＮＡプラスミドを含んでいてもよい。本発明の好ましい実施形態は、ＣＤ４０受容体に対してＨＩＶ−１ ｅｎｖ抗原をターゲティングし、ＣＤ４０陽性細胞に対する抗原のデリバリー及びＴ細胞に対してＨＩＶ−１ ｅｎｖ抗原を提示する細胞上のＣＤ４０受容体の選択的な活性化がもたらされる。
他の例は、アンタゴニスト抗ＣＤ４０モノクローナル抗体及びそれらの使用方法についてLi et al.によって提出された米国特許出願第２００８０２５４０２６号において見つけられる。手短に言えば、ＣＤ４０発現細胞上でのＣＤ４０シグナル伝達の刺激によって媒介される疾患を治療するための療法において使用するための組成物及び方法が開示され、提供される。方法は、治療有効量のアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合断片をそれを必要とする患者に投与するステップを含む。アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合断片は、著しいアゴニスト活性はないが、抗体がヒトＣＤ４０発現細胞上のＣＤ４０抗原に結合する場合に、アンタゴニスト活性を示す。抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合断片のアンタゴニスト活性は、Ｂ細胞などのヒトＣＤ４０発現細胞の増殖及び／又は分化を有利に阻害する。
他の例は、微生物ＴＬＲアゴニスト、ＣＤ４０アゴニスト又は４−１ＢＢアゴニストを含み、抗原も含んでよいアジュバントの組合せ並びに細胞性免疫を相乗的に増強するためのその使用についてDeluciaによって提出された米国特許出願第２００８０２４１１３９号において教示される。手短に言えば、この出願は、完全なウイルス、細菌、若しくは酵母、又は膜、スフェロプラスト（spheroplast）、サイトプラスト（cytoplast）、若しくは赤血球ゴースト（ghost）などのその部分等、少なくとも１つの微生物ＴＬＲアゴニスト、ＣＤ４０アゴニスト又は４−１ＢＢアゴニストを含み、抗原も含んでよいアジュバントの組合せであって、３つの成分がすべて、異なっていてもよい又は同じ組換え微生物若しくは組換えウイルスを含んでいてもよい、アジュバントの組合せを教示し、これらが開示される。癌及びＨＩＶ感染症などの様々な慢性疾患の治療のためのこれらの免疫アジュバントの使用もまた、提供される。
Bernett et al.によって提出された米国特許出願第２００８０１９９４７１号は、最適化ＣＤ４０抗体及び最適化ＣＤ４０抗体を使用するための方法に関する。手短に言えば、この出願は、ＣＤ４０をターゲティングする抗体を教示し、抗体は、親抗体に関する少なくとも１つの修飾を含み、修飾により、親抗体と比較して、ＦｃγＲに対する親和性が改変される又はエフェクター機能が改変される。本発明の抗体を使用するための方法もまた、開示される。
最後に、Tripp et al.によって提出された米国特許出願第２００８０１８１９１５号は、呼吸器合胞体ウイルスについてのＣＤ４０リガンドアジュバントに関する。手短に言えば、この出願は、宿主において、ＲＳＶに対する免疫応答を増強するための方法及びアジュバントを教示し、方法及びアジュバントは、ＣＤ４０結合タンパク質の供給源を含む。好ましくは、ＣＤ４０結合タンパク質は、ＣＤ４０Ｌであり、供給源は、ＣＤ４０Ｌコード領域に作用可能に連結されたプロモーターを含むベクターである。本発明のアジュバント及び方法によってもたらされる、免疫応答の増強は、Ｔｈ１サイトカインの発現の増加及び抗体の産生の増加の両方を含む。
米国特許第７，１１８，７５１号明細書 米国特許出願第２００８０２５４０２６号 米国特許出願第２００８０２４１１３９号 米国特許出願第２００８０１９９４７１号 米国特許出願第２００８０１８１９１５号
一実施形態では、本発明は、式：抗体（Ａｂ）−ペプチドリンカー（ＰＬ）−抗原（Ａｇ）ｘ、Ａｂ−（ＰＬ−Ａｇ）ｘ；Ａｂ−（Ａｇ−ＰＬ）ｘ；Ａｂ−（ＰＬ−Ａｇ−ＰＬ）ｘ；Ａｂ−（Ａｇ−ＰＬ−Ａｇ）ｘ；Ａｂ−（ＰＬ−Ａｇ）ｘ−ＰＬ；又はＡｂ−（Ａｇ−ＰＬ）ｘ−Ａｇを含み、Ａｂは、抗体又はその断片であり、ＰＬは、少なくとも１つのグリコシル化部位を含む少なくとも１つのペプチドリンカーであり、Ａｇは、少なくとも１つの抗原であり、且つ、ｘは、１〜２０の整数であり、グリコシル化部位を有していない同じ融合タンパク質よりも溶液中でより大きな安定性を有する、融合タンパク質である。一態様では、Ａｇは、ウイルス抗原、腫瘍抗原、感染症抗原、自己免疫抗原、毒素、又はその組合せから選択される。他の態様では、Ａｇは、ペプチドコンカテマーである。他の態様では、ＰＬは、ペプチドコンカテマーである。他の態様では、−（ＰＬ−Ａｇ）ｘ、−（Ａｇ−ＰＬ）ｘ、−（ＰＬ−Ａｇ−ＰＬ）ｘ、又は−（Ａｇ−ＰＬ−Ａｇ）ｘは、Ａｂ重鎖又はその断片のカルボキシ末端に配置される。他の態様では、Ａｇは、宿主において、体液性免疫応答及び／又は細胞性免疫応答を誘導する。一態様では、Ａｂは、抗ＣＤ４０＿１２Ｅ１２．３Ｆ３（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９８５４）、抗ＣＤ４０＿１２Ｂ４．２Ｃ１０（寄託番号ＨＳ４４６、ＡＴＣＣ受託番号＿＿＿＿＿＿）、及び抗ＣＤ４０＿１１Ｂ６．１Ｃ３（寄託番号ＨＳ４４０、ＡＴＣＣ受託番号＿＿＿＿＿＿）の可変領域を少なくとも含む。
一態様では、Ａｇは、グルタミン酸デカルボキシラーゼ６５（ＧＡＤ ６５）、天然ＤＮＡ、ミエリン塩基性タンパク質、ミエリンプロテオリピドタンパク質、アセチルコリン受容体成分、チログロブリン、及び甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）受容体から選択される、自己免疫疾患に関与する抗原と関連する自己免疫疾患又は自己免疫障害から選択される。他の態様では、Ａｇは、細菌、ウイルス、寄生虫、及び真菌抗原から選択される感染症抗原から選択される。他の態様では、ｘは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、又は１９を含む。他の態様では、融合タンパク質は、少なくとも１つのＰＬによって隔てられる異なる抗原に由来する２又は３以上のＡｇを含む。他の態様では、融合タンパク質は、アラニン及びセリンを含む、少なくとも１つのＰＬによって隔てられる２又は３以上のＡｇを含む。他の態様では、Ａｂは、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｃ、又はＳｃＦｖから選択される抗体断片である。
一態様では、Ａｂは、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスII、ＣＤ１、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２９、ＣＤ３１、ＣＤ４０、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ５８、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＭＲＦ−４４、ＣＭＲＦ−５６、ＤＣＩＲ、ＤＣ−ＡＳＰＧＲ、ＣＬＥＣ−６、ＣＤ４０、ＢＤＣＡ−２、ＭＡＲＣＯ、ＤＥＣ−２０５、マンノース受容体、ランゲリン、ＤＥＣＴＩＮ−１、Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＩＦＮ−γ受容体及びＩＬ−２受容体、ＩＣＡＭ−１、Ｆｃγ受容体、Ｔ細胞受容体、又はレクチンに特異的に結合する。他の態様では、Ａｂは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、若しくはＩｇＭ又はそのアイソタイプである。他の態様では、Ａｂは、ヒト抗体又はヒト化抗体である。他の態様では、ＰＬは、アラニン及びセリンを含む。他の態様では、ＰＬは、SSVSPTTSVHPTPTSVPPTPTKSSP（配列番号１１）；PTSTPADSSTITPTATPTATPTIKG（配列番号１２）；TVTPTATATPSAIVTTITPTATTK（配列番号１３）；又はTNGSITVAATAPTVTPTVNATPSAA（配
列番号１４）から選択される。
本発明の他の実施形態は、抗体軽鎖又はその断片をコードする第１のポリヌクレオチド及び抗体重鎖又はその断片をコードする第２のポリヌクレオチドを含む融合タンパク質をコードする核酸発現ベクターであって、融合タンパク質は、以下の式：Ａｂ−（ＰＬ−Ａｇ）ｘ又はＡｂ−（Ａｇ−ＰＬ）ｘを含み、Ａｂは、抗体又はその断片であり、ＰＬは、少なくとも１つのグリコシル化部位を含む少なくとも１つのペプチドリンカーであり、Ａｇは、少なくとも１つの抗原であり、且つｘは、１〜２０の整数であり、融合タンパク質は、グリコシル化部位を有していない同じ融合タンパク質よりも溶液中でより大きな安定性を有する。一態様では、（ＰＬ−Ａｇ）ｘ又は（Ａｇ−ＰＬ）ｘは、Ａｂ重鎖又はその断片のカルボキシ末端に配置される。他の態様では、第１及び第２のポリヌクレオチドは、単一発現ベクター上にある。他の態様では、Ａｇは、細菌、ウイルス、寄生虫、及び真菌抗原から選択される感染症抗原から選択される。他の態様では、ｘは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、又は１９を含む。別の態様では、融合タンパク質は、少なくとも１つのＰＬによって隔てられる異なる抗原に由来する２又は３以上のＡｇを含む。他の態様では、融合タンパク質は、アラニン及びセリンを含む、少なくとも１つのＰＬによって隔てられる２又は３以上のＡｇを含む。他の態様では、Ａｂは、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｃ、又はＳｃＦｖから選択される抗体断片である。他の態様では、Ａｂは、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスII、ＣＤ１、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２９、ＣＤ３１、ＣＤ４０、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ５８、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＭＲＦ−４４、ＣＭＲＦ−５６、ＤＣＩＲ、ＤＣ−ＡＳＰＧＲ、ＣＬＥＣ−６、ＣＤ４０、ＢＤＣＡ−２、ＭＡＲＣＯ、ＤＥＣ−２０５、マンノース受容体、ランゲリン、ＤＥＣＴＩＮ−１、Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＩＦＮ−γ受容体及びＩＬ−２受容体、ＩＣＡＭ−１、Ｆｃγ受容体、Ｔ細胞受容体、又はレクチンに特異的に結合する。他の態様では、Ａｂは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、若しくはＩｇＭ又はそのアイソタイプである。他の態様では、Ａｂは、ヒト抗体又はヒト化抗体である。他の態様では、ＰＬは、アラニン及びセリンを含み、及び／又はＰＬは、SSVSPTTSVHPTPTSVPPTPTKSSP（配列番号１１）；PTSTPADSSTITPTATPTATPTIKG（配列番号１２）；TVTPTATATPSAIVTTITPTATTKP（配列番号１３）；又はTNGSITVAATAPTVTPTVNATPSAA（配列番号１４）から選択される。他の態様では、第１及び第２のポリヌクレオチドは、恒常的プロモーターの下流にある。
本発明の他の実施形態は、式：ＮＨ２−Ａｂ−（ＰＬ−Ａｇ）ｘ−ＣＯＯＨ又はＮＨ２−Ａｂ−（Ａｇ−ＰＬ）ｘ−ＣＯＯＨを含み、Ａｂは、抗体又はその断片であり、ＰＬは、少なくとも１つのグリコシル化部位を含む少なくとも１つのペプチドリンカーであり、Ａｇは、少なくとも１つの免疫原性抗原であり、且つｘは、１〜２０の整数であり、融合タンパク質は、可溶性でない又は安定していないＡｂ−Ａｇタンパク質のみと比較して、溶液中で安定し、可溶性である、安定し、分泌可能な融合タンパク質である。
他の実施形態は、抗原ペプチドを安定化するための方法であって、不安定な若しくは不溶性の１又は２以上の抗原ペプチドを融合タンパク質の中に組み込むステップを含み、融合タンパク質は、以下の構造：Ａｂ−（ＰＬ−Ａｇ）ｘ又はＡｂ−（Ａｇ−ＰＬ）ｘを有し、Ａｂは、抗体又はその断片であり、ＰＬは、少なくとも１つのグリコシル化部位を含む少なくとも１つのペプチドリンカーであり、Ａｇは、少なくとも１つの抗原であり、且つ、ｘは、１〜２０の整数であり、融合タンパク質は、溶液中で安定し、可溶性であり、Ａｂ−Ａｇは、可溶性でなく、安定していない、方法である。
本発明の他の実施形態は、抗体軽鎖をコードする第１のポリヌクレオチド及び抗体重鎖融合タンパク質をコードする第２のポリヌクレオチドを含み、融合タンパク質は、以下の式：Ａｂ−（ＰＬ−Ａｇ）ｘ又はＡｂ−（Ａｇ−ＰＬ）ｘを含み、Ａｂは、抗体又はその断片であり、ＰＬは、少なくとも１つのグリコシル化部位を含む少なくとも１つのペプチドリンカーであり、Ａｇは、少なくとも１つの抗原であり、且つ、ｘは、１〜２０の整数であり、融合タンパク質は、グリコシル化部位を有していない融合タンパク質よりも溶液中でより大きな安定性を有する、核酸発現ベクターを含む宿主細胞である。他の実施形態では、宿主細胞は、式：Ａｂ−（ＰＬ−Ａｇ）ｘ；Ａｂ−（Ａｇ−ＰＬ）ｘ；Ａｂ−（ＰＬ−Ａｇ−ＰＬ）ｘ；Ａｂ−（Ａｇ−ＰＬ−Ａｇ）ｘ；Ａｂ−（ＰＬ−Ａｇ）ｘ−ＰＬ；又はＡｂ−（Ａｇ−ＰＬ）ｘ−Ａｇを含む融合タンパク質を産生する発現ベクターであって、Ａｂは、抗体又はその断片であり、ＰＬは、少なくとも１つのグリコシル化部位を含む少なくとも１つのペプチドリンカーであり、Ａｇは、少なくとも１つの抗原であり、且つ、ｘは、１〜２０の整数である発現ベクターを含み、融合タンパク質は、グリコシル化部位を有していない同じ融合タンパク質よりも溶液中でより大きな安定性を有する。
本発明はまた、式：Ａｂ−（ＰＬ−Ａｇ）ｘ；Ａｂ−（Ａｇ−ＰＬ）ｘ；Ａｂ−（ＰＬ−Ａｇ−ＰＬ）ｘ；Ａｂ−（Ａｇ−ＰＬ−Ａｇ）ｘ；Ａｂ−（ＰＬ−Ａｇ）ｘ−ＰＬ；又はＡｂ−（Ａｇ−ＰＬ）ｘ−Ａｇを含む式を有する抗体を含む医薬組成物であって、Ａｂは、抗体又はその断片であり、ＰＬは、少なくとも１つのグリコシル化部位を含む少なくとも１つのペプチドリンカーであり、Ａｇは、少なくとも１つの抗原であり、且つ、ｘは、１〜２０の整数である医薬組成物をも含み、融合タンパク質は、グリコシル化部位を有していない同じ融合タンパク質よりも溶液中でより大きな安定性を有する。
本発明の他の実施形態は、式：Ａｂ−（ＰＬ−Ａｇ）ｘ−（ＰＬｙ−Ａｇｚ）ｎ；又はＡｂ−（Ａｇ−ＰＬ）ｘ−（ＰＬｙ−Ａｇｚ）ｎを含み、Ａｂは、抗体又はその断片であり、ＰＬは、少なくとも１つのグリコシル化部位を含む少なくとも１つのペプチドリンカーであり、Ａｇは、少なくとも１つの抗原であり、且つ、ｘは、１〜２０の整数であり、ｎは０〜１９であり、ｙ又はｚは０〜１０であり、グリコシル化部位を有していない同じ融合タンパク質よりも溶液中でより大きな安定性を有する融合タンパク質である。
他の実施形態は、ＣＤ４０に特異的に結合する配列番号６、７、８、９、１０、１６、１７、１８、１９、２０、３６、３７、９６、９７、９８、９９、１１０、１１１、１１２、１１８、１１９、１３４、１３６、１３８、１４６、及び１４７のうちの少なくとも１つから選択される重鎖並びにＣＤ４０に特異的に結合する軽鎖を含む、単離精製ワクチンである。一態様では、抗体は、さらにヒト化抗体として定義される。
本発明の他の実施形態は、式：Ａｂ（ＰＬ−Ａｇ）ｘ；Ａｂ−（Ａｇ−ＰＬ）ｘ；Ａｂ−（ＰＬ−Ａｇ−ＰＬ）ｘ；Ａｂ−（Ａｇ−ＰＬ−Ａｇ）ｘ；Ａｂ−（ＰＬ−Ａｇ）ｘ−ＰＬ；又はＡｂ−（Ａｇ−ＰＬ）ｘ−Ａｇを含み、Ａｂは、抗体又はその断片であり、ＰＬは、少なくとも１つのグリコシル化部位を含む少なくとも１つのペプチドリンカーであり、Ａｇは、少なくとも１つの抗原であり、且つ、ｘは、１〜２０の整数である、融合タンパク質である。一態様では、融合タンパク質は、グリコシル化部位を有していないＰＬよりも溶液中でより大きな安定性を有する。他の態様では、Ａｇは、アデノウイルス、レトロウイルス、ピコルナウイルス、ヘルペスウイルス、ロタウイルス、ハンタウイルス、コロナウイルス、トガウイルス、フラビウイルス、ラブドウイルス、パラミクソウイルス、オルソミクソウイルス、ブンヤウイルス、アレナウイルス、レオウイルス、パピローマウイルス、パルボウイルス、ポックスウイルス、ヘパドナウイルス、又は海綿状ウイルス（spongiform virus）に由来するペプチドを含む。他の態様では、Ａｇは、ＨＩＶ、ＣＭＶ、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、インフルエンザ；麻疹、ポリオ、痘瘡、風疹；呼吸器合胞体ウイルス、単純ヘルペスウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、エプスタイン−バーウイルス、日本脳炎ウイルス、狂犬病ウイルス、インフルエンザウイルス、又は感冒ウイルスのうちの少なくとも１つに由来するペプチドを含む。
他の態様では、Ａｇは、Ｎｅｆ（６６〜９７）：VGFPVTPQVPLRPMTYKAAVDLSHFLKEKGGL（配列番号１）；Ｎｅｆ（１１６〜１４５）：HTQGYFPDWQNYTPGPGVRYPLTFGWLYKL（配列番号２）；Ｇａｇ ｐ１７（１７〜３５）：EKIRLRPGGKKKYKLKHIV（配列番号３）；Ｇａｇ ｐ１７〜ｐ２４（２５３〜２８４）：NPPIPVGEIYKRWIILGLNKIVRMYSPTSILD（配列番号４）；又はＰｏｌ ３２５〜３５５（ＲＴ １５８〜１８８）：AIFQSSMTKILEPFRKQNPDIVIYQYMDDLY（配列番号５）から選択される。他の態様では、Ａｇは、１９〜３２の残基である。他の態様では、Ａｇは、ＭＨＣクラスＩ分子との関連において提示されるＨＩＶ−１ Ｎｅｆタンパク質、Ｇａｇタンパク質、及びＥｎｖタンパク質において同定される細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ，cytotoxic T lymphocyte）エピトープから選択される。他の態様では、Ａｇは、ＨＩＶ ｇｐ１２０、ｇｐ４１、Ｇａｇ、ｐ１７、ｐ２４、ｐ２、ｐ７、ｐ１、ｐ６、Ｔａｔ、Ｒｅｖ、ＰＲ、ＲＴ、ＩＮ、Ｖｉｆ、Ｖｐｒ、Ｖｐｘ、Ｖｐｕ、及びＮｅｆから選択される。他の態様では、ｘは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、又は１９を含む。他の態様では、Ａｇは、異なるペプチドリンカーによって隔てられる、異なる抗原に由来するウイルスペプチドを含む。他の態様では、Ａｇは、アラニン及びセリンを含む少なくとも１つのＰＬによって隔てられる。他の態様では、融合タンパク質は、配列番号２１、２２、２３、２４、２５、２６、又は３６から選択される。他の態様では、融合タンパク質は、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドベクター、配列番号２１、２２、２３、２４、２５、２６、又は３６を含むポリヌクレオチドベクターを含む細胞から単離される。他の態様では、Ａｂは、配列番号３７及び３８を含む。
他の態様では、融合タンパク質は、融合タンパク質を発現するポリヌクレオチドベクターを含む細胞から単離され、Ａｂ部分は、配列番号３９及び４０を含む。他の態様では、Ａｇは、配列番号５２〜５６、５８〜６０、６１〜６９、７０〜７２、又は７３〜７７の少なくとも１つから選択される。他の態様では、Ａｇは、１７〜６０の残基である。他の態様では、Ａｇは、８、１０、１２、１４、１５、１６、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５〜６０残基長である。他の態様では、Ａｇは、少なくとも１つのリポペプチドを含む。他の態様では、Ａｇは、カルボキシ末端にあり、カルボキシ末端（Ｐａｌｍ）−ＮＨ２基をさらに含む。他の態様では、ＰＬは、SSVSPTTSVHPTPTSVPPTPTKSSP（配列番号１１）；PTSTPADSSTITPTATPTATPTIKG（配列番号１２）；TVTPTATATPSAIVTTITPTATTKP（配列番号１３）；又はTNGSITVAATAPTVTPTVNATPSAA（配列番号１４）から選択される。他の態様では、ＰＬは、アラニン及びセリンを含む。
本発明の他の実施形態は、抗ＣＤ４０抗体又はその断片及び抗ＣＤ４０抗体のカルボキシ末端に１又は２以上のウイルスペプチドを含む融合タンパク質を含むウイルス抗原デリバリーベクターであり、２又は３以上のウイルスペプチドが存在する場合、ウイルスペプチドは、少なくとも１つの潜在的なグリコシル化部位を含む１又は２以上のペプチドリンカーによって隔てられる。他の態様では、抗原デリバリーベクターは、抗ＣＤ４０抗体又はその断片及び抗ＣＤ４０抗体の軽鎖、重鎖、又は軽鎖及び重鎖の両方のカルボキシ末端にある２又は３以上のウイルスペプチドであり、２又は３以上のウイルスペプチドは、少なくとも１つの潜在的なグリコシル化部位を含む１又は２以上のペプチドリンカーによって隔てられる。
本発明の他の実施形態は、ウイルスペプチドを安定化するための方法であって、不安定な若しくは不溶性の１又は２以上のウイルスペプチドを抗体と共に融合タンパク質の中に組み込むステップを含み、抗体及びウイルスペプチドは、１又は２以上のグリコシル化部位を含む、１又は２以上のペプチドリンカーによって隔てられる方法である。他の実施形態は、Ｔ細胞応答を増強するための方法であって、式：Ａｂ−（ＰＬ−Ａｇ）ｘ又はＡｂ−（Ａｇ−ＰＬ）ｘを含む、有効量のワクチンを用いてワクチン接種の必要のある対象を免疫するステップを含み、Ａｂは、抗体又はその断片であり、ＰＬは、少なくとも１つのグリコシル化部位を含む少なくとも１つのペプチドリンカーであり、Ａｇは、少なくとも１つのウイルス抗原であり、且つｘは、１〜２０の整数である、方法である。一態様では、融合タンパク質は、グリコシル化部位を有していない同一の融合タンパク質よりも溶液中でより大きな安定性を有する。他の態様では、少なくとも１つのウイルス抗原は、アデノウイルス、レトロウイルス、ピコルナウイルス、ヘルペスウイルス、ロタウイルス、ハンタウイルス、コロナウイルス、トガウイルス、フラビウイルス、ラブドウイルス、パラミクソウイルス、オルソミクソウイルス、ブンヤウイルス、アレナウイルス、レオウイルス、パピローマウイルス（papilomavirus）、パルボウイルス、ポックスウイルス、ヘパドナウイルス、又は海綿状ウイルスに由来するペプチドを含む。他の態様では、少なくとも１つのウイルス抗原は、ＨＩＶ、ＣＭＶ、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、インフルエンザ；麻疹、ポリオ、痘瘡、風疹；呼吸器合胞体ウイルス、単純ヘルペスウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、エプスタイン−バーウイルス、日本脳炎ウイルス、狂犬病ウイルス、インフルエンザウイルス、又は感冒ウイルスのうちの少なくとも１つに由来するペプチドを含む。
一態様では、Ａｇは、Ｎｅｆ（６６〜９７）：VGFPVTPQVPLRPMTYKAAVDLSHFLKEKGGL（配列番号１）；Ｎｅｆ（１１６〜１４５）：HTQGYFPDWQNYTPGPGVRYPLTFGWLYKL（配列番号２）；Ｇａｇ ｐ１７（１７〜３５）：EKIRLRPGGKKKYKLKHIV（配列番号３）；Ｇａｇ ｐ１７〜ｐ２４（２５３〜２８４）：NPPIPVGEIYKRWIILGLNKIVRMYSPTSILD（配列番号４）；及び／又はＰｏｌ ３２５〜３５５（ＲＴ １５８〜１８８）：AIFQSSMTKILEPFRKQNPDIVIYQYMDDLY（配列番号５）から選択される。他の態様では、Ａｇは、１９〜３２の残基であり、ＭＨＣクラスＩ分子との関連において提示されるＨＩＶ−１ Ｎｅｆタンパク質、Ｇａｇタンパク質、及びＥｎｖタンパク質において同定される細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ，cytotoxic T lymphocyte）エピトープから選択される。他の態様では、Ａｇは、ＨＩＶ ｇｐ１２０、ｇｐ４１、Ｇａｇ、ｐ１７、ｐ２４、ｐ２、ｐ７、ｐ１、ｐ６、Ｔａｔ、Ｒｅｖ、ＰＲ、ＲＴ、ＩＮ、Ｖｉｆ、Ｖｐｒ、Ｖｐｘ、Ｖｐｕ、及びＮｅｆから選択される。他の態様では、ｘは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、又は１９を含む。他の態様では、Ａｇは、異なるウイルスに由来する２又は３以上のウイルス抗原を含む。他の態様では、ＰＬは、アラニン及びセリンを含む。他の態様では、ワクチンは、配列番号２１、２２、２３、２４、２５、２６、又は３６から選択される。他の態様では、Ａｂは、配列番号３７及び３８を含む。他の態様では、Ａｇは、配列番号５２〜５６、５８〜６０、６１〜６９、７０〜７２、又は７３〜７７の少なくとも１つから選択される。他の態様では、Ａｇは、１７〜６０の残基である。他の態様では、Ａｇは、８、１０、１２、１４、１５、１６、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５〜６０残基長である。他の態様では、Ａｇは、８、１０、１２、１４、１５、１６、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５〜６０残基長である。他の態様では、Ａｇは、リポペプチドを含む。他の態様では、Ａｇは、カルボキシ末端にあり、カルボキシ末端（Ｐａｌｍ）−ＮＨ２基を含む。他の態様では、ＰＬは、SSVSPTTSVHPTPTSVPPTPTKSSP（配列番号１１）；PTSTPADSSTITPTATPTATPTIKG（配列番号１２）；TVTPTATATPSAIVTTITPTATTKP（配列番号１３）；又はTNGSITVAATAPTVTPTVNATPSAA（配列番号１４）から選択される。
本発明の他の実施形態は、ＨＩＶペプチド特異的ＩＦＮγ産生Ｔ細胞を作製するための方法であって、抗体のカルボキシ末端にある１若しくは２以上のＨＩＶペプチドと共に抗ＣＤ４０抗体又はその断片を含む融合タンパク質を用いて対象を免疫するステップ及び対象から末梢血単核細胞を単離するステップを含み、単離された末梢単核細胞は、抗ＨＩＶ ＩＦＮγ産生Ｔ細胞が豊富であり、抗ＣＤ４０抗体は、配列番号３７及び３８又はその断片を含む、方法である。一態様では、対象は、ＨＩＶ感染症を有することが疑われている患者である。他の態様では、融合タンパク質は、２又は３以上のＨＩＶペプチドを含み、且つペプチドは、１又は２以上のペプチドリンカーによって隔てられる。他の態様では、融合タンパク質は、２又は３以上のＨＩＶペプチドを含み、且つペプチドは、グリコシル化配列を含む１又は２以上のペプチドリンカーによって隔てられる。他の態様では、融合タンパク質は、２又は３以上のＨＩＶペプチドを含み、且つペプチドは、アラニン及びセリンを含む１又は２以上のペプチドリンカーによって隔てられる。他の態様では、１又は２以上のＨＩＶペプチドは、少なくとも１つのリポペプチドを含む。他の態様では、１又は２以上のＨＩＶペプチドは、カルボキシ末端（Ｐａｌｍ）−ＮＨ２基を含む。他の態様では、１又は２以上のＨＩＶペプチドは、１９〜３２のアミノ酸長であり、異なるＭＨＣクラスＩ分子との関連におけるＨＩＶ−１ Ｎｅｆタンパク質、Ｇａｇタンパク質、及びＥｎｖタンパク質において同定される細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）エピトープから選択される。他の態様では、１又は２以上のＨＩＶペプチドは、ＨＩＶ ｇｐ１２０、ｇｐ４１、Ｇａｇ、ｐ１７、ｐ２４、ｐ２、ｐ７、ｐ１、ｐ６、Ｔａｔ、Ｒｅｖ、ＰＲ、ＲＴ、ＩＮ、Ｖｉｆ、Ｖｐｒ、Ｖｐｘ、Ｖｐｕ、及びＮｅｆから選択される。他の態様では、１又は２以上のウイルスペプチドは、Ｎｅｆ（６６〜９７）：VGFPVTPQVPLRPMTYKAAVDLSHFLKEKGGL（配列番号１）；Ｎｅｆ（１１６〜１４５）：HTQGYFPDWQNYTPGPGVRYPLTFGWLYKL（配列番号２）；Ｇａｇ ｐ１７（１７〜３５）：EKIRLRPGGKKKYKLKHIV（配列番号３）；Ｇａｇ ｐ１７〜ｐ２４（２５３〜２８４）：NPPIPVGEIYKRWIILGLNKIVRMYSPTSILD（配列番号４）；及び／又はＰｏｌ ３２５〜３５５（ＲＴ １５８〜１８８）：AIFQSSMTKILEPFRKQNPDIVIYQYMDDLY（配列番号５）のうちの少なくとも１つから選択される。
本発明の他の実施形態は、少なくとも１つのアラニン及び少なくとも１つのセリンを含むＰＬによって隔てられる抗体のカルボキシ末端にある１又は２以上のウイルスペプチドと共に抗ＣＤ４０抗体又はその断片を含む融合タンパク質である。一態様では、１又は２以上のウイルスペプチドは、ＨＩＶペプチドである。他の態様では、１又は２以上のウイルスペプチドは、Ｎｅｆ（６６〜９７）：VGFPVTPQVPLRPMTYKAAVDLSHFLKEKGGL（配列番号１）；Ｎｅｆ（１１６〜１４５）：HTQGYFPDWQNYTPGPGVRYPLTFGWLYKL（配列番号２）；Ｇａｇ ｐ１７（１７〜３５）：EKIRLRPGGKKKYKLKHIV（配列番号３）；Ｇａｇ ｐ１７〜ｐ２４（２５３〜２８４）：NPPIPVGEIYKRWIILGLNKIVRMYSPTSILD（配列番号４）；及び／又はＰｏｌ ３２５〜３５５（ＲＴ １５８〜１８８）：AIFQSSMTKILEPFRKQNPDIVIYQYMDDLY（配列番号５）のうちの少なくとも１つから選択される。
本発明はまた、融合タンパク質を作製するための方法であって、式：Ａｂ−（ＰＬ−Ａｇ）ｘ又はＡｂ−（Ａｇ−ＰＬ）ｘを有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む核酸構築物を発現ベクターの中に挿入するステップであって、Ａｂは、抗体又はその断片であり、ＰＬは、少なくとも１つのグリコシル化部位を含む少なくとも１つのペプチドリンカーであり、Ａｇは、少なくとも１つのウイルス抗原であり、且つｘは、１〜２０の整数であるステップ及び融合タンパク質の発現を可能にするのに十分な条件下でベクターを培養するステップを含む方法をも含む。一態様では、融合タンパク質は、グリコシル化部位を有していない同一の融合タンパク質よりも溶液中でより大きな安定性を有する。他の態様では、少なくとも１つのウイルス抗原は、アデノウイルス、レトロウイルス、ピコルナウイルス、ヘルペスウイルス、ロタウイルス、ハンタウイルス、コロナウイルス、トガウイルス、フラビウイルス、ラブドウイルス、パラミクソウイルス、オルソミクソウイルス、ブンヤウイルス、アレナウイルス、レオウイルス、パピローマウイルス、パルボウイルス、ポックスウイルス、ヘパドナウイルス、又は海綿状ウイルスに由来するペプチドを含む。他の態様では、少なくとも１つのウイルス抗原は、ＨＩＶ、ＣＭＶ、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、インフルエンザ；麻疹、ポリオ、痘瘡、風疹；呼吸器合胞体ウイルス、単純ヘルペスウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、エプスタイン−バーウイルス、日本脳炎ウイルス、狂犬病ウイルス、インフルエンザウイルス、又は感冒ウイルスのうちの少なくとも１つに由来するペプチドを含む。他の態様では、融合タンパク質は、Ａｂの軽鎖、Ａｂの重鎖、又はＡｂの軽鎖及び重鎖の両方である。他の態様では、Ａｇは、Ｎｅｆ（６６〜９７）：VGFPVTPQVPLRPMTYKAAVDLSHFLKEKGGL（配列番号１）；Ｎｅｆ（１１６〜１４５）：HTQGYFPDWQNYTPGPGVRYPLTFGWLYKL（配列番号２）；Ｇａｇ ｐ１７（１７〜３５）：EKIRLRPGGKKKYKLKHIV（配列番号３）；Ｇａｇ ｐ１７〜ｐ２４（２５３〜２８４）：NPPIPVGEIYKRWIILGLNKIVRMYSPTSILD（配列番号４）；及び／又はＰｏｌ ３２５〜３５５（ＲＴ １５８〜１８８）：AIFQSSMTKILEPFRKQNPDIVIYQYMDDLY（配列番号５）から選択される。
本発明の他の実施形態は、インビトロにおいて抗原特異的Ｔ細胞を増大させるための方法であって、ＨＩＶ患者からＰＢＭＣを単離するステップ；単離されたＰＢＭＣを、有効量のαＣＤ４０．ＬＩＰＯ５ ＨＩＶペプチドワクチンと共にインキュベートするステップ；有効量のＩＬ−２の存在下においてＰＢＭＣを増大させるステップ；細胞を採取するステップ；及び抗ＨＩＶ特異的Ｔ細胞の存在を決定するために細胞によるサイトカイン産生を評価するステップを含む方法を含む。他の実施形態は、ＨＩＶ患者からＰＢＭＣを単離するステップ；単離されたＰＢＭＣを、有効量のαＣＤ４０．ＬＩＰＯ５ ＨＩＶペプチドワクチンと共にインキュベートするステップ；有効量のＩＬ−２の存在下においてＰＢＭＣを増大させるステップ；細胞を採取するステップ；及び抗ＨＩＶ特異的Ｔ細胞の存在を決定するために細胞によるサイトカイン産生を評価するステップを含む方法によって作製されるＨＩＶ抗原特異的Ｔ細胞である。他の実施形態は、αＣＤ４０．ＬＩＰＯ５ ＨＩＶペプチドワクチンを樹状細胞にロードするステップを含む、治療用ワクチンを作製するための方法であって、ＨＩＶ患者の単球を単離するステップ；ＩＦＮα及びＧＭ−ＣＳＦを用いて単球を樹状細胞に分化させるステップ；並びに分化した樹状細胞を、αＣＤ４０．ＬＩＰＯ５ ＨＩＶペプチドに曝露するステップを含み、ロードされた樹状細胞は、インビトロにおいて、自己由来ＨＩＶペプチド特異的Ｔ細胞を刺激することができる方法である。
本発明はまた、αＣＤ４０．ＬＩＰＯ５ ＨＩＶペプチドワクチンを樹状細胞にロードするステップを含む方法であって、ＨＩＶ患者の単球を単離するステップ；ＩＦＮα及びＧＭ−ＣＳＦを用いて単球を樹状細胞に分化させるステップ；並びに分化した樹状細胞を、αＣＤ４０．ＬＩＰＯ５ ＨＩＶペプチドに曝露するステップを含み、ロードされた樹状細胞は、インビトロにおいて、自己由来ＨＩＶペプチド特異的Ｔ細胞を刺激することができる方法によって作製される治療用ワクチンをも含む。他の実施形態は、配列番号２１、２２、２３、２４、２５、２６、又は３６のうちの少なくとも１つを含むポリペプチドを含む治療用ワクチンである。他の実施形態は、式：Ａｂ−（ＰＬ−Ａｇ）ｘ；Ａｂ−（Ａｇ−ＰＬ）ｘ；Ａｂ−（ＰＬ−Ａｇ−ＰＬ）ｘ；Ａｂ−（Ａｇ−ＰＬ−Ａｇ）ｘ；Ａｂ−（ＰＬ−Ａｇ）ｘ−ＰＬ；又はＡｂ−（Ａｇ−ＰＬ）ｘ−Ａｇを含む融合タンパク質を含む治療用ワクチンであって、Ａｂは、抗体又はその断片であり、ＰＬは、少なくとも１つのグリコシル化部位を含む少なくとも１つのペプチドリンカーであり、Ａｇは、少なくとも１つのウイルス抗原であり、且つｘは、１〜２０の整数である治療用ワクチンである。
本発明の他の実施形態は、式：Ａｂ−（ＰＬ−Ａｇ）ｘ；Ａｂ−（Ａｇ−ＰＬ）ｘ；Ａｂ−（ＰＬ−Ａｇ−ＰＬ）ｘ；Ａｂ−（Ａｇ−ＰＬ−Ａｇ）ｘ；Ａｂ−（ＰＬ−Ａｇ）ｘ−ＰＬ；又はＡｂ−（Ａｇ−ＰＬ）ｘ−Ａｇを含む融合タンパク質であって、Ａｂは、抗体又はその断片であり、ＰＬは、少なくとも１つのグリコシル化部位を含む少なくとも１つのペプチドリンカーであり、Ａｇは、少なくとも１つの癌抗原であり、且つｘは、１〜２０の整数である融合タンパク質を含む。一態様では、融合タンパク質は、グリコシル化部位を有していない同じ融合タンパク質よりも溶液中でより大きな安定性を有する。他の態様では、Ａｇは、ＣＥＡ、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ，prostate specific antigen）、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ、ＭＡＧＥ １〜４、６、及び１２、ＭＵＣ関連タンパク質（ムチン）（ＭＵＣ−１、ＭＵＣ−２など）、ＧＭ２ガングリオシド及びＧＤ２ガングリオシド、ｒａｓ、ｍｙｃ、チロシナーゼ、ＭＡＲＴ（黒色腫抗原）、ＭＡＲＣＯ−ＭＡＲＴ、サイクリンＢ１、サイクリンＤ、Ｐｍｅｌ １７（ｇｐ１００）、Ｎ−アセチルグルコサミントランスフェラーゼ（acetylglucoaminyltransferase）ＶイントロンＶ配列（ＧｎＴ−ＶイントロンＶ配列，GnT-V intron V sequence）、前立腺Ｃａ ｐｓｍ、前立腺血清抗原（ＰＳＡ，prostate serum antigen）、ＰＲＡＭＥ（黒色腫抗原）、β−カテニン、黒色腫遍在性突然変異遺伝子産物（ＭＵＭ−１−Ｂ，melanoma ubiquitous mutated gene product）、ＧＡＧＥ（黒色腫抗原）１、ＢＡＧＥ（黒色腫抗原）２〜１０、ｃ−ＥＲＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）、エプスタイン−バーウイルス核抗原（ＥＢＮＡ，Epstein-Barr Virus nuclear antigen）１〜６、ｇｐ７５、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ，human papilloma virus）Ｅ６及びＥ７、ｐ５３、肺抵抗性タンパク質（ＬＲＰ，lung resistance protein）、Ｂｃｌ−２、並びにＫｉ−６７から選択される腫瘍関連抗原から選択される。他の態様では、Ａｇは、白血病及びリンパ腫、星状細胞腫若しくは膠芽腫などの神経性の腫瘍、黒色腫、乳癌、肺癌、頭頸部癌、胃腸腫瘍、胃癌、結腸癌、肝臓癌、膵臓癌、子宮頸癌、子宮癌、卵巣癌、膣癌、精巣癌、前立腺癌、若しくは陰茎癌などの尿生殖器の腫瘍、骨腫瘍、血管腫瘍、又は唇、鼻咽頭、咽頭及び口腔、食道、直腸、胆嚢、胆管、喉頭、肺及び気管支、膀胱、腎臓、脳及び神経系の他の部分、甲状腺の癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、並びに白血病に由来する抗原を含む腫瘍関連抗原から選択される。
他の態様では、Ａｇは、MWVPVVFLTLSVTWIGAAPLILSRIVGGWECEKHSQPWQVLVASRGRAVCGGVLVHPQWV (配列番号７４); LTAAHCIRNKSVILLGRHSLFHPEDTGQVFQVSHSFPHPLYDMSLLKNRFLRPGDDSSHD (配列番号７５); LMLLRLSEPAELTDAVKVMDLPTQEPALGTTCYASGWGSIEPEEFLTPKKLQCVDLHVIS (配列番号７６); NDVCAQVHPQKVTKFMLCAGRWTGGKSTCSGDSGGPLVCNGVLQGITSWGSEPCALPERP (配列番号７７);又はSLYTKVVHYRKWIKDTIVANP (配列番号７８)、及びその断片のうちの少なくとも１つから選択される。他の態様では、Ａｇは、IMDQVPFSV (配列番号１１３); ITDQVPFSV (配列番号１１４); YLEPGPVTV (配列番号１１５); YLEPGPVTA (配列番号１１６); KTWGQYWQV (配列番号１１７); DTTEPATPTTPVTTPTTTKVPRNQDWLGVSRQLRTKAWNRQLYPEWTEAQRLDCWRGGQVSLKVSNDGPTLIGANASFSIALNFPGSQKVLPDGQVIWVNNTIINGSQVWGGQPVYPQETDDACIFPDGGPCPSGSWSQKRSFVYVWKTWGQYWQVLGGPVSGLSIGTGRAMLGTHTMEVTVYHRRGSQSYVPLAHSSSAFTITDQVPFSVSVSQLRALDGGNKHFLRNQ (配列番号１２２); PLTFALQLHDPSGYLAEADLSYTWDFGDSSGTLISRAXVVTHTYLEPGPVTAQVVLQAAIPLTSCGSSPVPAS (配列番号１２４); GTTDGHRPTAEAPNTTAGQVPTTEVVGTTPGQAPTAEPSGTTSVQVPTTEVISTAPVQMPTAESTGMTPEKVPVSEVMGTTLAEMSTPEATGMTPAEVSIVVLSGTTAA (配列番号１２６); QVTTTEWVETTARELPIPEPEGPDASSIMSTESITGSLGPLLDGTATLRLVKRQVPLDCVLYRYGSFSVTLDIVQ (配列番号１２８);及びGIESAEILQAVPSGEGDAFELTVSCQGGLPKEACMEISSPGCQPPAQRLCQPVLPSPACQLVLHQILKGGSGTYCLNVSLADTNSLAVVSTQLIVPGILLTGQEAGLGQ (配列番号１３０)、及びその断片のうちの少なくとも１つから選択される。
他の態様では、Ａｇは、MEMKILRALNFGLGRPLPLHFLRRASKIGEVDVEQHTLAKYLMELTMLDY（配列番号１３２）；及びDWLVQVQMKFRLLQETMYMTVSIIDRFMQNNCVPKK（配列番号１３３）のうちの少なくとも１つから選択される。他の態様では、Ａｇは、MEHQLLCCEVETIRRAYPDANLLNDRVLRAMLKAEETCAPSVSYFKCV (配列番号１４１); QKEVLPSMRKIVATWMLEVCEEQKCEEEVFPLAMNYLDRFLSLEPVKKSRLQLLGATCMFVASKMKETIPLTAEKLCIYTDNSIRPEELLQMELL (配列番号１４２); LVNKLKWNLAAMTPHDFIEHFLSKMPEAEENKQIIRKHAQTFVALCATDVKFISNPPSMV (配列番号１４３);及びAAGSVVAAVQGLNLRSPNNFLSYYRLTRFLSRVIKCDPDCLRACQEQIEALLESSLRQAQQNMDPKAAEEEEEEEEEVDLACTPTDVRDVDI (配列番号１４４)、及びその断片のうちの少なくとも１つから選択される。他の態様では、Ａｇは、１９〜３２のアミノ酸長である。他の態様では、Ａｇは、１７〜６０アミノ酸長であり、且つＰＳＡ又はサイクリン１において同定される細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）エピトープから選択される。他の態様では、ｘは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、又は１９を含む。他の態様では、Ａｇは、ＰＬによって隔てられる異なる癌抗原に由来する２又は３以上の癌ペプチドを含む。他の態様では、Ａｇは、アラニン及びセリンを含む少なくとも１つのＰＬによって隔てられる。他の態様では、Ａｇは、配列番号７４〜７８、７９〜８６、８７〜９２、９３〜９５、１１３〜１１７、１２２〜１３０、１３２〜１３３、及び１４１〜１４４から選択される。他の態様では、Ａｂは、配列番号３８及び３９を含む。他の態様では、Ａｂは、配列番号４０及び４１を含む核酸発現ベクターによって発現される。他の態様では、ＰＬは、SSVSPTTSVHPTPTSVPPTPTKSSP（配列番号１１）；PTSTPADSSTITPTATPTATPTIKG（配列番号１２）；TVTPTATATPSAIVTTITPTATTKP（配列番号１３）；又はTNGSITVAATAPTVTPTVNATPSAA（配列番号１４）から選択される。他の態様では、ＰＬは、アラニン及びセリンを含む。
本発明の他の実施形態は、抗ＣＤ４０抗体又はその断片並びに抗ＣＤ４０抗体の軽鎖、重鎖、又は軽鎖及び重鎖の両方のカルボキシ末端にある２又は３以上の癌ペプチドを発現する抗原デリバリーベクターを含み、２又は３以上の癌ペプチドが存在する場合、癌ペプチドは、少なくとも１つのグリコシル化部位を含む１又は２以上のペプチドリンカーによって隔てられる。一態様では、１又は２以上のペプチドリンカーは、SSVSPTTSVHPTPTSVPPTPTKSSP（配列番号１１）；PTSTPADSSTITPTATPTATPTIKG（配列番号１２）；TVTPTATATPSAIVTTITPTATTKP（配列番号１３）；又はTNGSITVAATAPTVTPTVNATPSAA（配列番号１４）から選択される。
本発明の他の実施形態は、抗ＣＤ４０抗体又はその断片並びに抗ＣＤ４０抗体のカルボキシ末端に１又は２以上の癌ペプチドを含む抗ＣＤ４０融合タンパク質を含み、２又は３以上の癌ペプチドが存在する場合、癌ペプチドは、少なくとも１つのグリコシル化部位を含む１又は２以上のリンカーペプチドによって隔てられる。一態様では、抗体断片は、Ｆｖ断片、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｃ断片、又はＳｃＦｖ断片から選択される。他の態様では、Ａｇは、配列番号７４〜７８、７９〜８６、８７〜９２、９３〜９５、１１３〜１１７、１２２〜１３０、１３２〜１３３、及び１４１〜１４４から選択される。
本発明の他の実施形態は、癌ペプチドを安定化するための方法であって、不安定な若しくは不溶性の１又は２以上の癌ペプチドを抗体と共に融合タンパク質の中に組み込むステップを含み、抗体及び癌ペプチドは、１又は２以上のグリコシル化部位を含む、１又は２以上のペプチドリンカーによって隔てられる方法である。他の態様では、融合タンパク質は、２又は３以上の癌ペプチドを含み、且つ癌ペプチドは、１又は２以上のペプチドリンカーによって隔てられる。他の態様では、融合タンパク質は、２又は３以上の癌ペプチドを含み、且つペプチドは、１又は２以上のペプチドリンカーによって隔てられる。他の態様では、融合タンパク質は、２又は３以上の癌ペプチドを含み、且つペプチドは、アラニン及びセリンを含む１又は２以上のリンカーによって隔てられる。他の態様では、癌ペプチドは、ＣＥＡ、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ、ＭＡＧＥ １〜４、６、及び１２、ＭＵＣ関連タンパク質（ムチン）（ＭＵＣ−１、ＭＵＣ−２など）、ＧＭ２ガングリオシド及びＧＤ２ガングリオシド、ｒａｓ、ｍｙｃ、チロシナーゼ、ＭＡＲＴ（黒色腫抗原）、ＭＡＲＣＯ−ＭＡＲＴ、サイクリンＢ１、サイクリンＤ、Ｐｍｅｌ １７（ｇｐ１００）、ＧｎＴ−ＶイントロンＶ配列（Ｎ−アセチルグルコサミントランスフェラーゼＶイントロンＶ配列）、前立腺Ｃａ ｐｓｍ、前立腺血清抗原（ＰＳＡ）、ＰＲＡＭＥ（黒色腫抗原）、β−カテニン、ＭＵＭ−１−Ｂ（黒色腫遍在性突然変異遺伝子産物）、ＧＡＧＥ（黒色腫抗原）１、ＢＡＧＥ（黒色腫抗原）２〜１０、ｃ−ＥＲＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）、ＥＢＮＡ（エプスタイン−バーウイルス核抗原）１〜６、ｇｐ７５、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｅ６及びＥ７、ｐ５３、肺抵抗性タンパク質（ＬＲＰ）、Ｂｃｌ−２、並びにＫｉ−６７から選択される腫瘍関連抗原から選択される。他の態様では、Ａｇは、白血病及びリンパ腫、星状細胞腫若しくは膠芽腫などの神経性の腫瘍、黒色腫、乳癌、肺癌、頭頸部癌、胃腸腫瘍、胃癌、結腸癌、肝臓癌、膵臓癌、子宮頸癌、子宮癌、卵巣癌、膣癌、精巣癌、前立腺癌、若しくは陰茎癌などの尿生殖器の腫瘍、骨腫瘍、血管腫瘍、又は唇、鼻咽頭、咽頭及び口腔、食道、直腸、胆嚢、胆管、喉頭、肺及び気管支、膀胱、腎臓、脳及び神経系の他の部分、甲状腺の癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、並びに白血病に由来する抗原を含む腫瘍関連抗原から選択される。
他の態様では、Ａｇは、MWVPVVFLTLSVTWIGAAPLILSRIVGGWECEKHSQPWQVLVASRGRAVCGGVLVHPQWV (配列番号７４); LTAAHCIRNKSVILLGRHSLFHPEDTGQVFQVSHSFPHPLYDMSLLKNRFLRPGDDSSHD (配列番号７５); LMLLRLSEPAELTDAVKVMDLPTQEPALGTTCYASGWGSIEPEEFLTPKKLQCVDLHVIS (配列番号７６); NDVCAQVHPQKVTKFMLCAGRWTGGKSTCSGDSGGPLVCNGVLQGITSWGSEPCALPERP (配列番号７７);又はSLYTKVVHYRKWIKDTIVANP (配列番号７８)のうちの少なくとも１つから選択される。
他の態様では、Ａｇは、IMDQVPFSV (配列番号１１３); ITDQVPFSV (配列番号１１４); YLEPGPVTV (配列番号１１５); YLEPGPVTA (配列番号１１６); KTWGQYWQV (配列番号１１７); DTTEPATPTTPVTTPTTTKVPRNQDWLGVSRQLRTKAWNRQLYPEWTEAQRLDCWRGGQVSLKVSNDGPTLIGANASFSIALNFPGSQKVLPDGQVIWVNNTIINGSQVWGGQPVYPQETDDACIFPDGGPCPSGSWSQKRSFVYVWKTWGQYWQVLGGPVSGLSIGTGRAMLGTHTMEVTVYHRRGSQSYVPLAHSSSAFTITDQVPFSVSVSQLRALDGGNKHFLRNQ (配列番号１２２); PLTFALQLHDPSGYLAEADLSYTWDFGDSSGTLISRAXVVTHTYLEPGPVTAQVVLQAAIPLTSCGSSPVPAS (配列番号１２４); GTTDGHRPTAEAPNTTAGQVPTTEVVGTTPGQAPTAEPSGTTSVQVPTTEVISTAPVQMPTAESTGMTPEKVPVSEVMGTTLAEMSTPEATGMTPAEVSIVVLSGTTAA (配列番号１２６); QVTTTEWVETTARELPIPEPEGPDASSIMSTESITGSLGPLLDGTATLRLVKRQVPLDCVLYRYGSFSVTLDIVQ (配列番号１２８);及びGIESAEILQAVPSGEGDAFELTVSCQGGLPKEACMEISSPGCQPPAQRLCQPVLPSPACQLVLHQILKGGSGTYCLNVSLADTNSLAVVSTQLIVPGILLTGQEAGLGQ (配列番号１３０)、及びその断片のうちの少なくとも１つから選択される。
他の態様では、Ａｇは、MEMKILRALNFGLGRPLPLHFLRRASKIGEVDVEQHTLAKYLMELTMLDY（配列番号１３２）；及びDWLVQVQMKFRLLQETMYMTVSIIDRFMQNNCVPKK（配列番号１３３）のうちの少なくとも１つから選択される。
他の態様では、Ａｇは、MEHQLLCCEVETIRRAYPDANLLNDRVLRAMLKAEETCAPSVSYFKCV (配列番号１４１); QKEVLPSMRKIVATWMLEVCEEQKCEEEVFPLAMNYLDRFLSLEPVKKSRLQLLGATCMFVASKMKETIPLTAEKLCIYTDNSIRPEELLQMELL (配列番号１４２); LVNKLKWNLAAMTPHDFIEHFLSKMPEAEENKQIIRKHAQTFVALCATDVKFISNPPSMV (配列番号１４３);及びAAGSVVAAVQGLNLRSPNNFLSYYRLTRFLSRVIKCDPDCLRACQEQIEALLESSLRQAQQNMDPKAAEEEEEEEEEVDLACTPTDVRDVDI (配列番号１４４)、及びその断片のうちの少なくとも１つから選択される。他の態様では、Ａｇは、１９〜３２のアミノ酸長である。他の態様では、Ａｇは、１７〜６０のアミノ酸長であり、且つＰＳＡ又はサイクリン１において同定される細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）エピトープから選択される。他の態様では、ｘは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、又は１９を含む。他の態様では、融合タンパク質は、異なるペプチドリンカーによって隔てられる、異なる抗原に由来する癌ペプチドを含む。他の態様では、融合タンパク質は、アラニン及びセリンを含む１又は２以上のペプチドリンカーによって隔てられる２又は３以上の癌ペプチドを含む。他の態様では、抗体は、配列番号３８及び３９を含む。他の態様では、融合タンパク質は、配列番号４０及び４１を含む核酸発現ベクターによって発現される。他の態様では、ペプチドリンカーは、SSVSPTTSVHPTPTSVPPTPTKSSP (配列番号１１); PTSTPADSSTITPTATPTATPTIKG (配列番号１２); TVTPTATATPSAIVTTITPTATTKP (配列番号１３);又はTNGSITVAATAPTVTPTVNATPSAA (配列番号１４)から選択される。
本発明の他の実施形態は、Ｔ細胞応答を増強するための方法であって、抗ＣＤ４０抗体又はその部分及び抗ＣＤ４０抗体のカルボキシ末端に連結された１又は２以上の癌ペプチドを含む融合タンパク質を含む、有効量のワクチンを用いてワクチン接種の必要のある対象を免疫するステップを含む方法を含む。他の態様では、癌ペプチドは、ＣＥＡ、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ、ＭＡＧＥ １〜４、６、及び１２、ＭＵＣ（ムチン）（例えば、ＭＵＣ−１、ＭＵＣ−２など）、ＧＭ２ガングリオシド及びＧＤ２ガングリオシド、ｒａｓ、ｍｙｃ、チロシナーゼ、ＭＡＲＴ（黒色腫抗原）、ＭＡＲＣＯ−ＭＡＲＴ、サイクリンＢ１、サイクリンＤ、Ｐｍｅｌ １７（ｇｐ１００）、ＧｎＴ−ＶイントロンＶ配列（Ｎ−アセチルグルコサミントランスフェラーゼＶイントロンＶ配列）、前立腺Ｃａ ｐｓｍ、前立腺血清抗原（ＰＳＡ）、ＰＲＡＭＥ（黒色腫抗原）、β−カテニン、ＭＵＭ−１−Ｂ（黒色腫遍在性突然変異遺伝子産物）、ＧＡＧＥ（黒色腫抗原）１、ＢＡＧＥ（黒色腫抗原）２〜１０、ｃ−ＥＲＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）、ＥＢＮＡ（エプスタイン−バーウイルス核抗原）１〜６、ｇｐ７５、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｅ６及びＥ７、ｐ５３、肺抵抗性タンパク質（ＬＲＰ）、Ｂｃｌ−２、並びにＫｉ−６７から選択される腫瘍関連抗原から選択される。他の態様では、癌ペプチドは、白血病及びリンパ腫、星状細胞腫若しくは膠芽腫などの神経性の腫瘍、黒色腫、乳癌、肺癌、頭頸部癌、胃腸腫瘍、胃癌、結腸癌、肝臓癌、膵臓癌、子宮頸癌、子宮癌、卵巣癌、膣癌、精巣癌、前立腺癌、若しくは陰茎癌などの尿生殖器の腫瘍、骨腫瘍、血管腫瘍、又は唇、鼻咽頭、咽頭及び口腔、食道、直腸、胆嚢、胆管、喉頭、肺及び気管支、膀胱、腎臓、脳及び神経系の他の部分、甲状腺の癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、並びに白血病に由来する抗原を含む腫瘍関連抗原から選択される。
本発明の他の実施形態は、抗ＣＤ４０抗原融合タンパク質を作製するための方法であって、宿主細胞において抗ＣＤ４０抗体又はその断片を含む融合タンパク質を発現させるステップであって、融合タンパク質は、抗ＣＤ４０抗体又はその断片のカルボキシ末端に１又は２以上の癌ペプチドを含み、２又は３以上の癌ペプチドは、１又は２以上のリンカー、グリコシル化部位を含む少なくとも１つのリンカーによって隔てられるステップ；及び融合タンパク質を単離するステップを含む方法を含む。他の態様では、宿主において発現された融合タンパク質は、さらに単離され、且つ精製される。他の態様では、宿主は、真核細胞である。他の態様では、癌ペプチドは、ＣＥＡ、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ、ＭＡＧＥ １〜４、６、及び１２、ＭＵＣ関連タンパク質（ムチン）（ＭＵＣ−１、ＭＵＣ−２など）、ＧＭ２ガングリオシド及びＧＤ２ガングリオシド、ｒａｓ、ｍｙｃ、チロシナーゼ、ＭＡＲＴ（黒色腫抗原）、ＭＡＲＣＯ−ＭＡＲＴ、サイクリンＢ１、サイクリンＤ、Ｐｍｅｌ １７（ｇｐ１００）、ＧｎＴ−ＶイントロンＶ配列（Ｎ−アセチルグルコサミントランスフェラーゼＶイントロンＶ配列）、前立腺Ｃａ ｐｓｍ、前立腺血清抗原（ＰＳＡ）、ＰＲＡＭＥ（黒色腫抗原）、β−カテニン、ＭＵＭ−１−Ｂ（黒色腫遍在性突然変異遺伝子産物）、ＧＡＧＥ（黒色腫抗原）１、ＢＡＧＥ（黒色腫抗原）２〜１０、ｃ−ＥＲＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）、ＥＢＮＡ（エプスタイン−バーウイルス核抗原）１〜６、ｇｐ７５、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｅ６及びＥ７、ｐ５３、肺抵抗性タンパク質（ＬＲＰ）、Ｂｃｌ−２、並びにＫｉ−６７から選択される腫瘍関連抗原から選択される。他の態様では、癌ペプチドは、白血病及びリンパ腫、星状細胞腫若しくは膠芽腫などの神経性の腫瘍、黒色腫、乳癌、肺癌、頭頸部癌、胃腸腫瘍、胃癌、結腸癌、肝臓癌、膵臓癌、子宮頸癌、子宮癌、卵巣癌、膣癌、精巣癌、前立腺癌、若しくは陰茎癌などの尿生殖器の腫瘍、骨腫瘍、血管腫瘍、又は唇、鼻咽頭、咽頭及び口腔、食道、直腸、胆嚢、胆管、喉頭、肺及び気管支、膀胱、腎臓、脳及び神経系の他の部分、甲状腺の癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、並びに白血病に由来する抗原を含む腫瘍関連抗原から選択される。他の態様では、癌ペプチドは、MWVPVVFLTLSVTWIGAAPLILSRIVGGWECEKHSQPWQVLVASRGRAVCGGVLVHPQWV (配列番号７４); LTAAHCIRNKSVILLGRHSLFHPEDTGQVFQVSHSFPHPLYDMSLLKNRFLRPGDDSSHD (配列番号７５); LMLLRLSEPAELTDAVKVMDLPTQEPALGTTCYASGWGSIEPEEFLTPKKLQCVDLHVIS (配列番号７６); NDVCAQVHPQKVTKFMLCAGRWTGGKSTCSGDSGGPLVCNGVLQGITSWGSEPCALPERP (配列番号７７);又はSLYTKVVHYRKWIKDTIVANP (配列番号７８)のうちの少なくとも１つから選択される。
他の態様では、癌ペプチドは、IMDQVPFSV (配列番号１１３); ITDQVPFSV (配列番号１１４); YLEPGPVTV (配列番号１１５); YLEPGPVTA (配列番号１１６); KTWGQYWQV (配列番号１１７); DTTEPATPTTPVTTPTTTKVPRNQDWLGVSRQLRTKAWNRQLYPEWTEAQRLDCWRGGQVSLKVSNDGPTLIGANASFSIALNFPGSQKVLPDGQVIWVNNTIINGSQVWGGQPVYPQETDDACIFPDGGPCPSGSWSQKRSFVYVWKTWGQYWQVLGGPVSGLSIGTGRAMLGTHTMEVTVYHRRGSQSYVPLAHSSSAFTITDQVPFSVSVSQLRALDGGNKHFLRNQ (配列番号１２２); PLTFALQLHDPSGYLAEADLSYTWDFGDSSGTLISRAXVVTHTYLEPGPVTAQVVLQAAIPLTSCGSSPVPAS (配列番号１２４); GTTDGHRPTAEAPNTTAGQVPTTEVVGTTPGQAPTAEPSGTTSVQVPTTEVISTAPVQMPTAESTGMTPEKVPVSEVMGTTLAEMSTPEATGMTPAEVSIVVLSGTTAA (配列番号１２６); QVTTTEWVETTARELPIPEPEGPDASSIMSTESITGSLGPLLDGTATLRLVKRQVPLDCVLYRYGSFSVTLDIVQ (配列番号１２８);及びGIESAEILQAVPSGEGDAFELTVSCQGGLPKEACMEISSPGCQPPAQRLCQPVLPSPACQLVLHQILKGGSGTYCLNVSLADTNSLAVVSTQLIVPGILLTGQEAGLGQ (配列番号１３０)、及びその断片のうちの少なくとも１つから選択される。
他の態様では、癌ペプチドは、MEMKILRALNFGLGRPLPLHFLRRASKIGEVDVEQHTLAKYLMELTMLDY（配列番号１３２）；及びDWLVQVQMKFRLLQETMYMTVSIIDRFMQNNCVPKK（配列番号１３３）のうちの少なくとも１つから選択される。
他の態様では、癌ペプチドは、MEHQLLCCEVETIRRAYPDANLLNDRVLRAMLKAEETCAPSVSYFKCV (配列番号１４１); QKEVLPSMRKIVATWMLEVCEEQKCEEEVFPLAMNYLDRFLSLEPVKKSRLQLLGATCMFVASKMKETIPLTAEKLCIYTDNSIRPEELLQMELL (配列番号１４２); LVNKLKWNLAAMTPHDFIEHFLSKMPEAEENKQIIRKHAQTFVALCATDVKFISNPPSMV (配列番号１４３);及びAAGSVVAAVQGLNLRSPNNFLSYYRLTRFLSRVIKCDPDCLRACQEQIEALLESSLRQAQQNMDPKAAEEEEEEEEEVDLACTPTDVRDVDI (配列番号１４４)、及びその断片のうちの少なくとも１つから選択される。
本発明の他の実施形態は、インビトロにおいて抗原特異的Ｔ細胞を増大させるための方法であって、癌患者から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離するステップ；単離されたＰＢＭＣを、免疫原性量のαＣＤ４０−（ＰＬ−Ａｇ）ｘ又はαＣＤ４０−（Ａｇ−ＰＬ）ｘワクチンと共にインキュベートするステップであって、Ａｇは、腫瘍関連抗原であり、且つｘは、整数１〜２０であるステップ；有効量のＩＬ−２の存在下においてＰＢＭＣを増大させるステップ；細胞を採取するステップ；及び抗癌特異的Ｔ細胞の存在を決定するために細胞によるサイトカイン産生を評価するステップを含む方法を含む。
本発明の他の実施形態は、癌患者から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離するステップ；単離されたＰＢＭＣを、免疫原性量のαＣＤ４０−（ＰＬ−Ａｇ）ｘ又はαＣＤ４０−（Ａｇ−ＰＬ）ｘワクチンと共にインキュベートするステップであって、Ａｇは、腫瘍関連抗原であり、且つｘは、整数１〜２０であるステップ；有効量のＩＬ−２の存在下においてＰＢＭＣを増大させるステップ；細胞を採取するステップ；及び腫瘍関連抗原特異的Ｔ細胞の存在を決定するために細胞によるサイトカイン産生を評価するステップを含む方法によって作製される腫瘍関連抗原特異的Ｔ細胞を含む。
本発明の他の実施形態は、式：Ａｂ−（ＰＬ−Ａｇ）ｘ；Ａｂ−（Ａｇ−ＰＬ）ｘ；Ａｂ−（ＰＬ−Ａｇ−ＰＬ）ｘ；Ａｂ−（Ａｇ−ＰＬ−Ａｇ）ｘ；Ａｂ−（ＰＬ−Ａｇ）ｘ−ＰＬ；又はＡｂ−（Ａｇ−ＰＬ）ｘ−Ａｇを含む融合タンパク質であって、Ａｂは、抗体又はその断片であり、ＰＬは、少なくとも１つのグリコシル化部位を含む少なくとも１つのペプチドリンカーであり、Ａｇは、少なくとも１つの癌抗原であり、且つｘは、１〜２０の整数である融合タンパク質を含む治療用ワクチンを含む。
本発明の特徴及び利点についてのより完全な理解のために、ここでは、添付の図面に加えて、発明を実施するための形態について言及する。
トランスフェクト２９３Ｆ細胞から分泌され、還元ＳＤＳ．ＰＡＧＥ及びクーマシーブリリアントブルー染色によって分析した、様々なＨＩＶペプチドに融合された、プロテインＡアフィニティー精製組換え抗体を示す図である（レーン１〜５）。 トランスフェクト２９３Ｆ細胞から分泌され、次いで還元ＳＤＳ．ＰＡＧＥ及びクーマシーブリリアントブルー染色によって分析した、様々なＨＩＶペプチドに融合された、プロテインＡアフィニティー精製組換え抗体を示す図である（レーン１及び２）。 トランスフェクト２９３Ｆ細胞から分泌され、次いで還元ＳＤＳ．ＰＡＧＥ及びクーマシーブリリアントブルー染色によって分析した、様々なＨＩＶペプチドストリング（peptide string）に融合された、プロテインＡアフィニティー精製組換え抗体を示す図である（レーン１〜５）。 トランスフェクト２９３Ｆ細胞から分泌され、次いで還元ＳＤＳ．ＰＡＧＥ及びクーマシーブリリアントブルー染色によって分析した、様々なＨＩＶペプチドストリングに融合された、プロテインＡアフィニティー精製組換え抗体を示す図である（レーン１〜６）。 αＣＤ４０．ＬＩＰＯ５ ＨＩＶペプチド融合組換え抗体（αＣＤ４０．ＬＩＰＯ５ ｒＡｂ）が、ＰＢＭＣ培養物との関連において抗原特異的Ｔ細胞の増大を誘導する効力をアッセイするためにインビトロにおいて使用するプロトコールを示す図である。 様々な濃度の抗ＣＤ４０．ＬＩＰＯ５ペプチドストリングワクチンと共にインキュベートした、ＨＩＶ患者に由来するＰＢＭＣにおけるＨＩＶペプチド特異的ＩＦＮγ産生を示す図である。Ｃは、コントロールグループであり、これらは、ワクチンを受けず、それぞれのペプチドに対する培養物のベースラインの応答を確定する。 ８人のＨＩＶ患者に由来する５つのペプチド領域に対するαＣＤ４０．ＬＩＰＯ５ペプチドワクチン応答の概要を示す図である。 αＣＤ４０．ＬＩＰＯ５ ＨＩＶペプチドワクチンが、多数のサイトカインを分泌することができるＨＩＶペプチド特異的Ｔ細胞の増大−ワクチンにおいて望ましい特徴を誘導することを示す図である。また、αＣＤ４０．ＬＩＰＯ５ ＨＩＶペプチドワクチンが、多数のサイトカインの産生によって特徴づけられる、ｇａｇ２５３、ｎｅｆ６６、ｎｅｆ１１６、及びｐｏｌ３２５ペプチド特異的応答を誘導することを示す図でもある（患者Ａ５）。 ＤＣによる、ターゲティングによる取り込み及びそれらの表面ＭＨＣ複合体上へのペプチドエピトープの提示から結果として生じる抗原特異的Ｔ細胞の増大を指示するためのその能力についてαＣＤ４０．ＬＩＰＯ５ ＨＩＶペプチドワクチンを試験するためのプロトコールを示す図である。 様々な用量のαＣＤ４０．ＬＩＰＯ５ ＨＩＶペプチドワクチンを用いて治療したＤＣ−Ｔ細胞共培養物からの、ＨＩＶペプチドに応じたサイトカイン分泌を示す図である（患者Ａ１０）。 αＣＤ４０．ＬＩＰＯ５ ＨＩＶペプチドワクチンを用いて治療した患者Ａ４に由来するＰＢＭＣが、抗原特異的Ｔ細胞の増大を誘導し、ｇａｇ２５３領域に対して特異性を有するが、可動性リンカー配列に対して特異性を有していないことを示す図である。 太字で可動性リンカー領域を、下線を引いて結合配列を、且つ灰色の影付きでＨＩＶペプチド領域を示すαＣＤ４０．ＬＩＰＯ５ ＨＩＶペプチドワクチン重鎖配列を示す図である。αＣＤ４０．ＬＩＰＯ５ ＨＩＶペプチドワクチンを用いて治療した患者Ａ３に由来するＰＢＭＣが、抗原特異的Ｔ細胞の増大を誘導し、ｇａｇ２５３、ｎｅｆ６６、及びｎｅｆ１１６領域に対して特異性を有するが、可動性リンカー配列に対して特異性を有していないことを示す図である。 ３０ｎＭの３つの異なるＨＩＶ５ペプチドＤＣターゲティングワクチンと共にインキュベートしたＨＩＶ患者Ａ１７ ＰＢＭＣから誘起されたＨＩＶ抗原特異的Ｔ細胞応答を示す図である。 ＰＢＭＣが異なるＨＩＶ患者（Ａ２）に由来する以外は、図１２Ｂ−１及びＢ−２において示す研究に類似する研究を示す図である。 １５の異なるＨＩＶペプチド応答［３人の患者においてサンプリングした５つのペプチド領域］を示す図であり、抗ＣＤ４０．ＨＩＶ５ｐｅｐワクチンが、広範囲のＨＩＶペプチド特異的ＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ応答の誘導について、抗ＤＣＩＲ．ＨＩＶ５ｐｅｐ、抗ＬＯＸ−１．ＨＩＶ５ｐｅｐ、及び非ＬＩＰＯ５ミックスより優れていたことが分かった。 抗ＣＤ４０ ｍＡｂ：ＩＬ−４ＤＣの内部移行を示す図である。ＩＬ−４ＤＣは、５００ｎｇ／ｍｌの抗ＣＤ４０−Ａｌｅｘａ ５６８と共に処理した。 抗ＣＤ４０−ＨＡ１を用いてターゲティングしたＤＣによるＣＤ４及びＣＤ８ Ｔ細胞増殖を示す図である。２ｕｇ／ｍｌの抗ＣＤ４０−ＨＡ又はコントロールＩｇ−ＨＡ１をロードした５×１０ｅ３ ＩＦＮＤＣは、７日間、ＣＦＳＥ標識自己由来ＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞（２×１０ｅ５）と共に共培養した。次いで、細胞は、抗ＣＤ４抗体又は抗ＣＤ８抗体を用いて染色した。細胞増殖は、ＣＦＳＥ希釈液を測定することによって試験した。 ＣＤ４＋Ｔ増殖に対するＨＡ１融合タンパク質の力価測定を示す図である。融合タンパク質をロードしたＩＦＮＤＣ（５Ｋ）は、７日間、ＣＦＳＥ標識ＣＤ４＋Ｔ細胞（２００Ｋ）と共に共培養した。 抗ＣＤ４０−ＨＡ１を用いてターゲティングしたＩＦＮＤＣがＨＡ１特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞を活性化することを示す図である。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、５ｕＭの示されるペプチドをロードしたＤＣを用いて再度刺激し、次いで、細胞内ＩＦＮγを染色した。 抗ＣＤ４０−ＨＡ１を用いてターゲティングしたＩＦＮＤＣがＨＡ１特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞を活性化することを示す図である。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、３６時間、示されるペプチドをロードしたＤＣを用いて再度刺激し、次いで、培養上清は、ＩＦＮγの測定のために分析した。 ＣＤ４０のターゲティングが、ＭＡＲＴ−１特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞へのクロスプライミング（cross-priming）の増強をもたらすことを示す図である。融合タンパク質をロードしたＩＦＮＤＣ（５Ｋ／ウェル）は、１０日間、精製ＣＤ８＋Ｔ細胞と共に共培養した。細胞は、抗ＣＤ８及びテトラマーを用いて染色した。細胞は、健常ドナーに由来する（ＨＬＡ−Ａ＊０２０１＋）。 ＣＤ４０のターゲティングが、ＭＡＲＴ−１特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞へのクロスプライミングの増強をもたらすことを示す図である（異なる健常ドナーに由来する細胞を使用する８回の反復実験の概要）。 抗ＣＤ４０−ＭＡＲＴ−１を用いてターゲティングしたＩＦＮＤＣを用いて誘導されたＣＤ８＋ＣＴＬが機能的であることを示す図である。融合タンパク質を用いてターゲティングしたＩＦＮＤＣと共に共培養したＣＤ８＋Ｔ細胞は、１０ｕＭペプチドエピトープをロードしたＴ２細胞と混合した。 抗ＣＤ４０−Ｆｌｕ Ｍ１を用いてターゲティングしたＩＦＮＤＣを用いて誘導されたＣＤ８＋ＣＴＬが機能的であることを示す図である。融合タンパク質を用いてターゲティングしたＩＦＮＤＣと共に共培養したＣＤ８＋Ｔ細胞は、１．０ｎＭペプチドエピトープをロードしたＴ２細胞と混合した。 ＰＳＡ（前立腺特異的抗原）に連結された抗ＣＤ４０１２Ｅ１２から構成されるワクチンが、ナイーブＴ細胞集団からの増大を誘導する能力を試験するためのプロトコールの概略を示す図である。ＰＳＡ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＰＳＡエピトープの広範囲のアレイに相当する。手短に言えば、健常ドナーに由来する単球のＩＦＮα及びＧＭ−ＣＳＦを用いる培養に由来するＤＣをワクチンと共にインキュベートする。翌日、細胞を、新鮮な培地中に置き、同じドナーに由来する純粋なＣＤ４＋Ｔ細胞を追加する。数日後に、ＰＳＡペプチドを追加し、４時間後に、培養上清中に分泌されたγＩＦＮレベルを決定する。 多くのＰＳＡペプチドが、強力なγＩＦＮ産生応答を誘導し、抗ＣＤ４０１２Ｅ１２及び類似する抗ＣＤ４０作用物質が、抗原をＤＣに効率的にデリバリーすることができることを示し、抗原の多数のエピトープに対する免疫応答のプライミングをもたらすことを示す図である。 抗ＣＤ４０−ＰＳＡを用いてターゲティングされたＤＣが、ＰＳＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘導することを示す図である。ＩＦＮＤＣは、ＰＳＡを有する１ｕｇ ｍＡｂ融合タンパク質を用いてターゲティングした。精製自己由来ＣＤ８＋Ｔ細胞を１０日間、共培養した。細胞は、抗ＣＤ８及びＰＳＡ（KLQCVDLHV）−テトラマーを用いて染色した。細胞は、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１陽性健常ドナーに由来する。結果により、抗ＣＤ４０がＰＳＡをＤＣに有効にデリバリーし、これは、次に、ＰＳＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の増大を誘導することが実証される。 スキーム（左）並びにドナー２についてのペプチドのプール及びコントロールのＴ細胞によるＩＦＮγ産生を示す図である。２ｕｇ／ｍｌの抗ＣＤ４０サイクリンＤ１をロードした５×１０ｅ３ ＩＦＮＤＣは、８日間、精製自己由来ＣＤ４＋Ｔ細胞（２×１０ｅ５）と共に共培養した。次いで、細胞は、ブレフェルジンＡの存在下において、５時間、サイクリンＤ１に由来する５ｕＭの個々のペプチドを用いて再度刺激した。細胞は、細胞内ＩＦＮγ発現を測定するために染色した。 ペプチドの精査並びにドナー２についての図２５において示されるペプチドのプール及びコントロールから得られたＴ細胞によるＩＦＮγ産生を示す図である。２ｕｇ／ｍｌの抗ＣＤ４０サイクリンＤ１をロードした５×１０ｅ３ ＩＦＮＤＣは、８日間、精製自己由来ＣＤ４＋Ｔ細胞（２×１０ｅ５）と共に共培養した。次いで、細胞は、ブレフェルジンＡの存在下において、５時間、サイクリンＤ１に由来する５ｕＭの個々のペプチドを用いて再度刺激した。細胞は、細胞内ＩＦＮγ発現を測定するために染色した。 抗ＣＤ４０−ＭＡＲＴ−１ペプチド抗体の発現及び構築物のデザインを示す図である。 ＭＡＲＴ−１についてのＣＤ４＋及びＣＤ８＋免疫優性エピトープの概要を示す図である。 抗ＣＤ４０ｇｐ１００ペプチド抗体の発現及び構築物のデザインを示す図である。 さらなる抗ＣＤ４０ｇｐ１００ペプチド抗体のデザインを示す図である。 さらなる抗ＣＤ４０ｇｐ１００ペプチド抗体の発現及び構築物のデザインを示す図である。 ｇｐ１００についてのＣＤ４＋及びＣＤ８＋免疫優性エピトープの概要を示す図である。 さらなる抗ＣＤ４０ｇｐ１００ペプチド抗体の発現及び構築物のデザインを示す図である。 抗体Ｈ鎖又はコヒージョン（cohesion）のＣ末端に融合された完全長サイクリンＢ１が哺乳動物２９３Ｆ細胞から分泌されないことを示す図である。 抗体Ｈ鎖又はコヒージョンのＣ末端に融合された完全長サイクリンＢ１が哺乳動物２９３Ｆ細胞から分泌されないことを示す図である。 知られている又は予測される構造ドメイン領域に基づくサイクリンＢ１セグメンテーション戦略を示す図である。 サイクリンＤ１セグメントｐ２ではなくｐ１、ｐ３、及びｐ４が、Ｈ鎖Ｃ末端に対する直接的な融合物として十分に発現することを示す図である。 可動性リンカー配列との様々な組合せにおける、Ｈ鎖Ｃ末端に対する直接的な融合物としての様々なサイクリンＤ１セグメントの相対的な発現レベルを示す図である。 ワクチンとしての様々なＨ鎖サイクリンＤ１セグメント構築物の概要及びそれらの相対的な発現力（expressibility）を示す図である。 ＤＣターゲティング抗体Ｈ鎖のＣ末端に融合された完全長サイクリンＤ１は、分泌組換え抗体としての発現が非常に不十分であることを示す図である。
本発明の様々な実施形態の作製及び使用を下記に詳細に議論するが、本発明は、種々様々の特定の状況で具現することができる、多くの適用可能な発明概念を提供することを十分に理解するべきである。本明細書において議論される特定の実施形態は、本発明を作製し、且つ使用するための特定の方法を単に例証するものであり、本発明の範囲を定めるものではない。
本発明についての理解を容易にするために、多くの用語を下記に定義する。本明細書において定義される用語は、本発明に関する当業者らによって一般的に理解される意味を有する。本明細書において、用語を単数で記載している場合であっても、単数の要素のみを指すように意図するのではなく、そのうちの特定の例が例証のために使用されてもよい概括的な分類を含む。本明細書における術語は、本発明の特定の実施形態を記載するために使用されるが、それらの使用は、請求項において概説されるもの以外は、本発明を定めるものではない。
本発明はまた、抗体（即ち「Ａｂ」）又はその断片のバリアント及びその他の修飾、例えば抗ＣＤ４０融合タンパク質を含む（抗体は、用語「免疫グロブリン」と同義的に使用される）。本明細書において使用される場合、用語「抗体又はその断片」は、完全な抗体又は抗体の断片、例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｃ、及び一本鎖Ｆｖ断片（ＳｃＦｖ）又は例えばＣＤ４０に特異的に結合する免疫グロブリンの任意の生物学的に有効な断片を含む。ヒト起源に由来する抗体又はヒト化抗体は、ヒトにおいて免疫原性が低下しており又はそれがなく、非ヒト抗体と比較して少ない数の免疫原性エピトープを有する又はそれを有していない。抗体及びそれらの断片は、ヒトにおいてレベルが低下した抗原性を有するように又は抗原性を有しないように一般に選択されるであろう。
本明細書において使用される場合、用語「Ａｇ」又は「抗原」は、免疫グロブリン分子の抗原結合領域に結合することができる又は免疫応答、例えば主要組織適合抗原（ＭＨＣ，Major Histocompatibility Antigen）細胞タンパク質上への抗原の提示によるＴ細胞媒介性免疫応答を誘導することができる物質を指す。本明細書において使用される場合、「抗原」は、ペプチド、小分子、炭水化物、脂質、核酸、又はその組合せであってもよい抗原決定基、ハプテン、及び免疫原を含むが、これらに限定されない。熟練した免疫学者は、Ｔ細胞への提示のために処理される抗原を議論する場合に、用語「抗原」が、ＭＨＣによってＴ細胞受容体に提示されるＴ細胞エピトープである抗原のそれらの部分（例えばペプチド断片）を指すことを認識するであろう。「抗原」、抗体の可変ドメインの相補性決定領域（軽及び重）に結合する抗原の部分に特異的な抗体の形態におけるＢ細胞媒介性免疫応答との関連において使用される場合、結合部分は、直鎖状の又は立体的なエピトープであってもよい。本発明との関連において、抗原という用語は、両方の状況に対して使用される、すなわち、抗体は、タンパク質抗原（ＣＤ４０）に特異的なだけではなく、ＭＨＣによるＴ細胞への提示のための１又は２以上のペプチドエピトープを運搬する。ある場合には、本発明のワクチン又は融合タンパク質によってデリバリーされる抗原は、内部移行され、例えば、抗体又は融合タンパク質の１又は２以上の部分の切断によって、提示前に抗原提示細胞によって処理される。
本明細書において使用される場合、用語「抗原ペプチド」は、Ｂ細胞又はＴ細胞によって特異的に認識されるポリペプチド抗原のその部分を指す。Ｂ細胞は、抗体産生を介して外来性の抗原決定基に対して応答するが、Ｔリンパ球は、媒介細胞性免疫である。したがって、抗原ペプチドは、抗体によって又はＭＨＣとの関連においてＴ細胞受容体によって認識される抗原の部分である。
本明細書において使用される場合、用語「エピトープ」は、免疫グロブリンに特異的に結合することができる又は主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ，Major Histocompatibility Complex）タンパク質（例えばクラスＩ若しくはクラスII）によってＴ細胞受容体に提示することができる任意のタンパク質決定基を指す。エピトープ決定基は、Ｔ細胞受容体に対してある種のアミノ酸側鎖基を提示し、例えば、溝、ペプチド側鎖基、及びＴ細胞受容体の特異的な電荷特性のために溝中に、ある種の他の残基を有するＭＨＣ分子の溝の中に適合する５〜３０アミノ酸長の、一般に短いペプチドである。一般に、解離定数が１ｍＭ、１００ｎＭ、又はさらに１０ｎＭである場合、抗体は、抗原に特異的に結合する。
本明細書において使用される場合、用語「ベクター」は、２つの異なる状況において使用される。ワクチンに関連して用語「ベクター」を使用する場合、ベクターは、ワクチンの抗原部分を誘導する又はデリバリーするために使用される非抗原性部分を表すために使用される。例えば、抗体又はその断片は、免疫応答を誘導する抗原に結合してもよい又はそれと融合タンパク質を形成してもよい。細胞ワクチンについては、抗原のデリバリー及び／又は提示のためのベクターは、抗原提示細胞であり、これは、抗原がロードされる細胞によってデリバリーされる。ある場合には、細胞ベクター自体もまた、抗原（複数可）を処理し、Ｔ細胞に提示し、抗原特異的免疫応答を活性化してもよい。核酸との関連において使用される場合、「ベクター」は、宿主細胞において、１又は２以上の所望の遺伝子又はポリヌクレオチド配列をデリバリーすることができ、好ましくは、発現させることができる構築物を指す。ベクターの例は、ウイルスベクター、ネイキッドＤＮＡ発現ベクター又はネイキッドＲＮＡ発現ベクター、陽イオン性縮合剤と関連したＤＮＡ発現ベクター又はＲＮＡ発現ベクター、リポソーム中に封入されたＤＮＡ発現ベクター又はＲＮＡ発現ベクター、及びプロデューサー細胞などのある種の真核細胞を含むが、これらに限定されない。
本発明の組成物及び方法は、抗体又はその断片及びペプチドリンカー又は「ＰＬ」が安定した及び／又は可溶性のタンパク質を生成する種々様々のペプチド及び／又はタンパク質と共に使用することができる。
本明細書において使用される場合、組成物及び方法は、式：Ａｂ−（ＰＬ−Ａｇ）ｘ又はＡｂ−（Ａｇ−ＰＬ）ｘを含む抗原デリバリーベクターであって、Ａｂは、抗体又はその断片であり、ＰＬは、少なくとも１つのグリコシル化部位を含む少なくとも１つのペプチドリンカーであり、Ａｇは、少なくとも１つのウイルス抗原であり、且つｘは、１〜２０の整数である抗原デリバリーベクターを使用する。本発明で使用するための抗体の１つの例は、抗ＣＤ４０＿１２Ｅ１２．３Ｆ３（ＡＴＣＣ受託番号（accession number）ＰＴＡ−９８５４）、抗ＣＤ４０＿１２Ｂ４．２Ｃ１０（寄託番号ＨＳ４４６、ＡＴＣＣ受託番号＿＿＿＿）、及び抗ＣＤ４０＿１１Ｂ６．１Ｃ３（寄託番号（submission number）ＨＳ４４０、ＡＴＣＣ受託番号＿＿＿＿）の少なくとも可変領域を含む。
本明細書において使用される場合、用語「安定した」及び「不安定な」は、タンパク質を指す場合、その３次元構造及び／若しくは活性を維持する（安定した）又はその３次元構造及び／若しくは活性を直ちに若しくは次第に失う（不安定な）ペプチド又はタンパク質を表すために使用される。本明細書において使用される場合、用語「不溶性の」は、細胞中で産生される場合（例えば真核細胞若しくは原核細胞中で又はインビトロにおいて発現させた組換えタンパク質）、変性条件又は変性作用物質（例えば、それぞれ、熱又は化学的な変性剤）の使用がない限り、溶液中で可溶性ではないタンパク質を指す。本明細書において教示される抗体又はその断片及びリンカーは、それらのペプチドとの抗体融合タンパク質を、不溶性の及び／又は不安定なものから安定した及び／又は可溶性のタンパク質に変えることが分かった。不安定性に対する安定性の他の例は、同じ溶液中で測定された場合に、安定したコンホメーションを有するタンパク質のドメインが、タンパク質の不安定なドメインよりも高い融解温度（Ｔｍ，melting temperature）を有する場合である。ドメインは、Ｔｍの差異が、同じ溶液中で測定された場合に、少なくとも約２℃、より好ましくは約４℃、より好ましくは約７℃、より好ましくは約１０℃、より好ましくは約１５℃、より好ましくは約２０℃、より好ましくは約２５℃、最も好ましくは約３０℃である場合、他のドメインと比較して、安定している。
本明細書において使用される場合、「ポリヌクレオチド」又は「核酸」は、一重又は二重鎖形態をしたデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドの鎖を指す（天然ヌクレオチドの既知のアナログを含む）。二重鎖核酸配列は、相補的配列を含むであろう。ポリヌクレオチド配列は、１又は２以上のリンカーと融合タンパク質を形成する、免疫グロブリンの可変及び／又は定常領域ドメインをコードしてもよい。本発明で使用するために、マルチクローニングサイト（ＭＣＳ，multiple cloning site）は、リンカーの間の発現用ペプチドのインフレームの挿入を可能にするために抗体の重鎖及び／又は軽鎖のカルボキシ末端の位置の中に設計されてもよい。本明細書において使用される場合、用語「単離ポリヌクレオチド」は、ゲノム、ｃＤＮＡ、又は合成起源のもの又はそのいくつかの組合せのポリヌクレオチドを指す。その起源により、「単離ポリヌクレオチド」は、（１）「単離ポリヌクレオチド」が自然界において見つけられるポリヌクレオチドのすべて若しくは一部と関連していない、（２）それが自然界において連結されていないポリヌクレオチドに作動可能に連結されている、又は（３）より大きな配列の一部として自然界に存在しない。当業者は、式Ａｂ−（ＰＬ−Ａｇ）ｘ又はＡｂ−（Ａｇ−ＰＬ）ｘを有するベクターをデザインし、且つ実現するために、関連する部分が参照によって本明細書に組み込まれるCurrent Protocols in Molecular Biology, 2007 by John Wiley and Sonsにおいて教示されるものなどの、当技術分野において知られている技術を使用することによって核酸レベルで操作することができることを認識するであろう。手短に言えば、Ａｂ、Ａｇ、及びＰＬをコードする核酸配列は、発現ベクターであってもよいベクターにおけるポリメラーゼ連鎖反応、オリゴヌクレオチド又はポリメラーゼ連鎖反応断片の酵素による挿入を使用して挿入することができる。抗体軽鎖、重鎖、又は両方のカルボキシ末端での（ＰＬ−Ａｇ）ｘ又は（Ａｇ−ＰＬ）ｘの挿入を容易にするために、マルチクローニングサイト（ＭＣＳ）は抗体配列を有する配列中に設計されてもよい。
本明細書において使用される場合、用語「ポリペプチド」は、アミノ酸のポリマーを指し、特定の長さの産物を指さず、したがって、ペプチド、オリゴペプチド、及びタンパク質は、ポリペプチドの定義内に含まれる。この用語はまた、ポリペプチドの発現後修飾、例えばグリコシル化、アセチル化、リン酸化、及びその他同種のものをも指さない又はそれをも除外する。例えば、アミノ酸の１又は２以上のアナログ（例えば、非天然アミノ酸などを含む）を含有するポリペプチド、置換された連結を有するポリペプチド、及び天然に存在する及び天然に存在しない、当技術分野において知られている他の修飾が定義内に含まれる。用語「ドメイン」又は「ポリペプチドドメイン」は、フォールドして、その本来のコンホメーションで単一の球状の領域になり、且つ個別の結合特性又は機能的特性を示してもよいポリペプチドの配列を指す。
指定の核酸配列「に由来する」ポリペプチド又はアミノ酸配列は、配列においてコードされるポリペプチドのアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列又はその部分を有するポリペプチドを指し、部分は、配列においてコードされるポリペプチドと免疫学的に同一であると見なせる少なくとも３〜５のアミノ酸、好ましくは、少なくとも４〜７のアミノ酸、より好ましくは、少なくとも８〜１０のアミノ酸、より好ましくは、少なくとも１１〜１５のアミノ酸からなる。この術語はまた、指定の核酸配列から発現したポリペプチドをも含む。
本明細書において使用される場合、「薬学的に許容される担体」は、本発明の免疫グロブリン（Ｉｇ）融合タンパク質と組み合わせられた場合に、Ｉｇが生物学的活性を保持することを可能にし、対象の免疫系と一般に非反応性である任意の物質を指す。例として、リン酸緩衝生理食塩水、水、油／水エマルションなどのエマルション、及び様々なタイプの湿潤剤などの標準的な医薬担体を含むが、これらに限定されない。リン酸緩衝食塩水又は通常の（０．８５％）食塩水であってもよい、ある種の希釈剤が、例えばエアロゾル投与又は非経口投与のために、本発明と共に使用されてもよい。
本発明は、配列中に、超可変領域ＣＤＲ１Ｌ、ＣＤＲ２Ｌ、及びＣＤＲ３Ｌを含み、ＣＤＲ１Ｌは、アミノ酸配列SASQGISNYLN（配列番号４１）を有し、ＣＤＲ２Ｌは、アミノ酸配列YTSILHS（配列番号４２）を有し、ＣＤＲ３Ｌは、アミノ酸配列QQFNKLPPT（配列番号４３）を有し、これらのアミノ酸配列は、配列番号３８において示される、少なくとも１つの免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含むＣＤ４０結合分子、及びその直接的な等価物を提供する。
したがって、本発明は、配列中に、超可変領域ＣＤＲ１Ｈ、ＣＤＲ２Ｈ、及びＣＤＲ３Ｈを含み、ＣＤＲ１Ｈは、アミノ酸配列GFTFSDYYMY（配列番号４４）を有し、ＣＤＲ２Ｈは、アミノ酸配列YINSGGGSTYYPDTVKG（配列番号４５）を有し、ＣＤＲ３Ｈは、アミノ酸配列RGLPFHAMDY（配列番号４６）を有し、これらのアミノ酸配列は、配列番号３９において示される、少なくとも１つの免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む抗原結合部位を含むＣＤ４０結合分子、及びその直接的な等価物を提供する。
一態様では、本発明は、上記に定義される重鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む単離免疫グロブリン軽鎖を含む単一ドメインＣＤ４０結合分子を提供する。他の態様では、本発明は、上記に定義される重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む単離免疫グロブリン重鎖を含む単一ドメインＣＤ４０結合分子を提供する。
他の態様では、本発明はまた、ＣＤ４０結合分子が、ａ）配列中に、超可変領域ＣＤＲ１Ｌ、ＣＤＲ２Ｌ、及びＣＤＲ３Ｌを含み、ＣＤＲ１Ｌは、アミノ酸配列SASQGISNYLN（配列番号４１）を有し、ＣＤＲ２Ｌは、アミノ酸配列YTSILHS（配列番号４２）を有し、ＣＤＲ３Ｌは、アミノ酸配列QQFNKLPPT（配列番号４３）を有し、これらのアミノ酸配列は、配列番号１において示される、免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（ＶＬ）、ｂ）配列中に、超可変領域ＣＤＲ１Ｈ、ＣＤＲ２Ｈ、及びＣＤＲ３Ｈを含み、ＣＤＲ１Ｈは、アミノ酸配列GFTFSDYYMY（配列番号４４）を有し、ＣＤＲ２’は、アミノ酸配列YINSGGGSTYYPDTVKG（配列番号４５）を有し、ＣＤＲ３Ｈは、アミノ酸配列RGLPFHAMDY（配列番号４６）を有し、これらのアミノ酸配列は、配列番号３８において示される、免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む少なくとも１つの抗原結合部位を含む、重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）可変ドメインの両方を含むＣＤ４０結合分子、及びその直接的な等価物を提供する。
その他に示されない限り、いかなるポリペプチド鎖も、Ｎ末端で始まり、Ｃ末端で終わるアミノ酸配列を有するものとして本明細書において記載される。抗原結合部位がＶＨ及びＶＬの両方のドメインを含む場合、これらは、同じポリペプチド分子上に置かれてもよい又は好ましくは、それぞれのドメインは、異なる鎖上にあってもよく、ＶＨドメインは、免疫グロブリン重鎖又はその断片の一部であり、ＶＬは、免疫グロブリン軽鎖又はその断片の一部である。
本発明の抗体によってターゲティングされる抗原についての非限定的な例は、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスII、ＣＤ１、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２９、ＣＤ３１、ＣＤ４０、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ５８、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＭＲＦ−４４、ＣＭＲＦ−５６、ＤＣＩＲ、ＤＣ−ＡＳＰＧＲ、ＣＬＥＣ−６、ＣＤ４０、ＢＤＣＡ−２、ＭＡＲＣＯ、ＤＥＣ−２０５、マンノース受容体、ランゲリン、ＤＥＣＴＩＮ−１、Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＩＦＮ−γ受容体及びＩＬ−２受容体、ＩＣＡＭ−１、Ｆｃγ受容体、Ｔ細胞受容体、レクチン、又は他の免疫細胞受容体から選択される細胞表面マーカーを含むが、これらに限定されない。特定の一実施例では、本発明の抗体部分によってターゲティングされる抗原は、抗原提示細胞、例えば樹状細胞、ランゲルハンス細胞、マクロファージ、及びＢ細胞によって特異的に発現される。
本明細書において使用される場合、用語「ＣＤ４０結合分子」は、単独で又は本明細書において教示される１若しくは２以上のＶＬ及びＶＨ ＣＤＲ、いくつかの場合では、２、３、４、５、若しくは６つすべてのＣＤＲを有する他の分子と関連してＣＤ４０抗原に結合することができる任意の分子を指す。結合反応は、例えば、他の分子のＣＤ４０への結合若しくは任意の種類の結合をブロックすることによって決定するためのバイオアッセイ又は特異性が無関係であるが、アイソタイプが同じ抗体、例えば抗ＣＤ２５抗体若しくは抗ＣＤ８０抗体が使用されるネガティブコントロール試験に関連しての活性アッセイ（例えば免疫応答の活性化、低下、若しくは修飾）を含む標準的な方法（定質的アッセイ）によって示されてもよい。
本発明はまた、１０〜３０のアミノ酸、好ましくは１５〜２５のアミノ酸を通常含むペプチドリンカーによって共有結合された、抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメインを有する一本鎖抗体に作製できる。そのため、そのような構造は、重鎖及び軽鎖の定常部分を含まず、小さなペプチドスペーサーは、完全な定常部分ほど抗原性ではないはずであると考えられる。
本明細書において使用される場合、用語「キメラ抗体」は、重鎖若しくは軽鎖又はその両方の定常領域がヒト起源であるが、重鎖及び軽鎖の両方の可変ドメインが非ヒト（例えばマウス、ハムスター、若しくはラット）起源のものである又はヒト起源のものであるが、異なるヒト抗体に由来する抗体を指す。
本明細書において使用される場合、用語「ＣＤＲ移植抗体」は、超可変相補性決定領域（ＣＤＲ）が、非ヒト（例えばマウス）抗体又は異なるヒト抗体などのドナー抗体に由来するが、免疫グロブリンのすべての又は実質的にすべての他の部分（例えば可変ドメインの保存領域、つまりフレームワーク領域）が、アクセプター抗体に由来する（ヒト化抗体の場合には、ヒト起源の抗体）、抗体を指す。ＣＤＲ移植抗体は、フレームワーク領域中に、例えば超可変領域に隣接するフレームワーク領域の部分においてドナー配列の少数のアミノ酸を含んでいてもよい。
本明細書において使用される場合、用語「ヒト抗体」は、例えば、関連する部分が参照によって本明細書に組み込まれる欧州特許第０５４６０７３ Ｂ１号、米国特許第５，５４５，８０６号明細書、米国特許第５，５６９，８２５号明細書、米国特許第５，６２５，１２６号明細書、米国特許第５，６３３，４２５号明細書、米国特許第５，６６１，０１６号明細書、米国特許第５，７７０，４２９号明細書、欧州特許第０ ４３８４７４ Ｂ１号、及び欧州特許第０ ４６３１５１ Ｂ１号において概括的な用語で記載されるように、重鎖及び軽鎖の両方の定常領域及び可変領域がすべてヒト起源のものであり又は必ずしも同じ抗体に由来しないが、ヒト起源の配列と実質的に同一であり、且つマウス、ハムスター、又はラットの免疫グロブリン可変部分及び定常部分の遺伝子がそれらのヒト対応物と交換された、マウスによって産生された抗体を含む、抗体を指す。
本発明のＣＤ４０結合分子は、抗ＣＤ４０＿１２Ｅ１２．３Ｆ３、抗ＣＤ４０＿１１Ｂ６．１Ｃ３、又は抗ＣＤ４０＿１２Ｂ４．２Ｃ１０抗体から得られるＣＤＲを含むヒト化抗体とすることができる。キメラ抗体の１つの例は、ヒト起源である重鎖及び軽鎖の両方の可変ドメイン、例えば、配列番号１４８及び配列番号１４９の一部である抗ＣＤ４０＿１２Ｅ１２．３Ｆ３抗体、配列番号１５０及び配列番号１５１若しくは配列番号１５２における抗ＣＤ４０＿１２Ｂ４．２Ｃ１０、並びに／又は抗ＣＤ４０＿１１Ｂ６．１Ｃ３、配列番号１５３及び配列番号１５４又はその組合せの可変ドメインを含む。定常領域ドメインはまた、好ましくは、例えば"Sequences of Proteins of Immunological Interest", Kabat E. A. et al, US Department of Health and Human Services, Public Health Service, National Institute of Healthにおいて記載されるように、適したヒト定常領域ドメインを含む。核酸配列は、例えば配列番号８及び９中に見つけることができる。
超可変領域は、任意の種類のフレームワーク領域、例えばヒト起源のフレームワーク領域と結合させてもよい。適したフレームワーク領域は、Ｋａｂａｔ Ｅ． Ａ．において記載された。１つの重鎖フレームワークは、例えば、配列番号１４９の一部である抗ＣＤ４０＿１２Ｅ１２．３Ｆ３抗体、抗ＣＤ４０＿１２Ｂ４．２Ｃ１０−配列番号１５１若しくは配列番号１５２、及び／又は抗ＣＤ４０＿１１Ｂ６．１Ｃ３−配列番号１５４、又はその組合せ、例えばＦＲ１Ｌ、ＦＲ２Ｌ、ＦＲ３Ｌ、及びＦＲ４Ｌ領域の重鎖フレームワークである。同様に、配列番号１４８は、ＦＲ１Ｈ、ＦＲ２Ｈ、ＦＲ３Ｈ、及びＦＲ４Ｈ領域の配列を含む抗ＣＤ４０＿１２Ｅ１２．３Ｆ３（又は抗ＣＤ４０＿１２Ｂ４．２Ｃ１０及び抗ＣＤ４０＿１１Ｂ６．１Ｃ３、それぞれ配列番号１５０及び１５３についての等価物）の重鎖フレームワークを示す。ＣＤＲは、参照によって本明細書に組み込まれる、フレームワーク領域、関連する部分、及びフレームワーク配列を含む新しいヒト可変鎖フレームワーク領域及びヒト化抗体を教示するRybak et al.に対して発行された７，４５６，２６０において記載されるものなどのように、ヒト抗体フレームワークに追加されてもよい。遺伝子レベルで移植を達成するために、本発明はまた、ＶＬ及びＶＨ領域並びに完全抗体及びそのヒト化バージョンについての基礎となる核酸配列を含む。本発明の核酸配列は、それぞれ抗ＣＤ４０抗体軽鎖及び重鎖である配列番号１５５及び１５６、並びに同じアミノ酸配列について多様なコドン使用頻度を含む核酸配列と、核酸又はアミノ酸レベルで８５、９０、９５、又は１００％の配列同一性を有する保存的変異とを含む。同様に、ＣＤＲは、個々に、グループで、又は２、３、４、若しくは５つ又は全部で、核酸又はアミノ酸レベルで８５、９０、９５、又は１００％の配列同一性を有していてもよい。
すべてのヒトにおいて天然に存在するタンパク質に対して産生されたモノクローナル抗体は、典型的に、非ヒト系において、例えばマウスにおいて開発されており、そのため典型的に、非ヒトタンパク質である。この直接的な結果として、ハイブリドーマによって産生される異種抗体は、ヒトに投与された場合、異種免疫グロブリンの定常部分によって主に媒介される、望ましくない免疫応答を誘導する。異種抗体は、宿主免疫応答を誘導する傾向があり、それによって、長期間にわたってそれらを投与することができないので、そのような抗体の使用が限定される。そのため、ヒトに投与された場合に実質的な同種応答を誘導しないであろう一本鎖抗体、単一ドメイン抗体、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体、又はとりわけヒト抗体を使用するのが特に有用である。本発明は、実質的に同一の特性を有する元々のタンパク質の単に対立形質である、１つの、少数の、又はさらにいくつかのアミノ酸の欠失、付加、又は置換などのアミノ酸配列の小さな変化を有する抗体を含む。
その受容体へのＣＤ４０の結合の阻害は、本文において以下に記載されるアッセイを含む様々なアッセイにおいて好都合に試験されてもよい。用語「同じ程度まで」によって、参照分子及び等価分子が、統計的基礎に基づいて、上記に言及されるアッセイのうちの１つにおいて本質的に同一のＣＤ４０結合阻害曲線を示すことを意味する。例えば、使用されるアッセイは、本発明の結合分子によるＣＤ４０の結合の競合的阻害のアッセイであってもよい。
一般に、ヒト抗ＣＤ４０抗体は、（ａ）位置１のアミノ酸から始まり位置１０７のアミノ酸で終わる配列番号１において示されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有する可変ドメイン及びヒト軽鎖の定常部分を含む少なくとも１つの軽鎖；並びに（ｂ）配列番号２において示されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有する可変ドメイン及びヒト重鎖の定常部分を含む少なくとも１つの重鎖を含む。ヒト重鎖の定常部分は、γ１、γ２、γ３、γ４、μ、β２、又はδ若しくはε型、好ましくはγ型であってもよいのに対して、ヒト軽鎖の定常部分は、κ又はλ型（λ１、λ２、及びλ３サブタイプを含む）であってもよいが、好ましくはκ型である。可変ドメイン及び定常ドメインの一般的な位置のアミノ酸配列は、当技術分野においてよく知られており、一般に、Ｋａｂａｔの命名法に従う。
本発明のＣＤ４０結合分子は、組換えＤＮＡ技術によって産生されてもよい。これを考慮して、結合分子をコードする１又は２以上のＤＮＡ分子は、構築され、適切なコントロール配列下に置かれ、発現に適した宿主生物の中に移入されなければならない。
したがって、非常に一般的な方法では、（ｉ）本発明の単一ドメインＣＤ４０結合分子、本発明の一本鎖ＣＤ４０結合分子、本発明のＣＤ４０結合分子の重鎖若しくは軽鎖又はその断片をコードするＤＮＡ分子；及び（ii）組換え法による本発明のＣＤ４０結合分子の産生のための本発明のＤＮＡ分子の使用が提供される。
現在の技術水準は、本明細書において提供される情報、つまり、超可変領域のアミノ酸配列及びそれらをコードするＤＮＡ配列を考慮すれば、当業者が本発明のＤＮＡ分子を合成することができるようなものである。可変ドメイン遺伝子を構築するための方法は、例えば、関連する部分が参照によって本明細書に組み込まれる欧州特許第ＥＰＡ ２３９ ４００号中に記載されている。手短に言えば、ＭＡｂの可変ドメインをコードする遺伝子が、クローニングされる。フレームワーク及び超可変領域をコードするＤＮＡセグメントが、決定され、フレームワーク領域をコードするＤＮＡセグメントが結合部で適した制限部位と一緒に融合されるように、超可変領域をコードするＤＮＡセグメントが、取り出される。制限部位は、標準的な手順によってＤＮＡ分子の突然変異誘導によって適切な位置に生成されてもよい。二重鎖合成ＣＤＲカセットは、配列番号１及び３又は２及び４中に示される配列（それぞれアミノ酸配列及び核酸配列）に従ってＤＮＡ合成によって調製される。フレームワークの結合部でそれらをライゲーションすることができるように、これらのカセットは、付着末端と共に提供されることが多い。
本発明のＣＤ４０結合分子をコードするＤＮＡ構築物を得るために産生ハイブリドーマ細胞系からｍＲＮＡを入手する必要はない。例えば、関連する部分が参照によって本明細書に組み込まれるＰＣＴ出願国際公開第９０／０７８６１号は、遺伝子のヌクレオチド配列に関して書かれた情報のみを考慮しての、組換えＤＮＡ技術による抗体の産生のための十分な教示を提供する。手短に言えば、方法は、所望のＤＮＡ配列を提供するために、多くのオリゴヌクレオチドの合成、ＰＣＲ法によるそれらの増幅、及びそれらのスプライシングを含む。
適したプロモーター又は重鎖及び軽鎖定常部分をコードする遺伝子を含む発現ベクターは、公的に入手可能である。したがって、一度、本発明のＤＮＡ分子が調製されれば、それは、適切な発現ベクター中に好都合に移入されてもよい。例えば、国際公開第８８／１６４９号において記載されるように、一本鎖抗体をコードするＤＮＡ分子もまた、標準的な方法によって調製されてもよい。以上を考慮すると、記載要件の十分性の基準に従う必要のあるハイブリドーマ又は細胞系寄託物はない。
例えば、ＣＤ４０に特異的に結合する第１及び第２のＤＮＡ構築物が、作製される。手短に言えば、第１のＤＮＡ構築物は、軽鎖又はその断片をコードし、且つａ）フレームワーク及び超可変領域を交互に含む可変ドメインをコードする第１の部分であって、超可変領域は、配列ＣＤＲ１Ｌ、ＣＤＲ２Ｌ、及びＣＤＲ３Ｌであり、これらのアミノ酸配列は、配列番号１において示され、可変ドメインの第１のアミノ酸をコードするコドンから始まり、可変ドメインの最後のアミノ酸をコードするコドンで終わる第１の部分並びにｂ）重鎖の定常部分の第１のアミノ酸をコードするコドンから始まり、定常部分又はその断片の最後のアミノ酸をコードするコドンで終わり、終止コドンが続く、軽鎖定常部分又はその断片をコードする第２の部分を含む。
第１の部分は、配列番号１中に示されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有する可変ドメインをコードする。第２の部分は、ヒト重鎖の定常部分、より好ましくはヒトγ１鎖の定常部分をコードする。この第２の部分は、ゲノム起源のＤＮＡ断片（イントロンを含む）又はｃＤＮＡ断片（イントロンを有していない）であってもよい。
第２のＤＮＡ構築物は、重鎖又はその断片をコードし、且つａ）フレームワーク及び超可変領域を交互に含む可変ドメインをコードする第１の部分であって、超可変領域は、ＣＤＲ１Ｈ並びにＣＤＲ２Ｈ及びＣＤＲ３Ｈであってもよく、これらのアミノ酸配列は、配列番号２において示され、可変ドメインの第１のアミノ酸をコードするコドンから始まり、可変ドメインの最後のアミノ酸をコードするコドンで終わる第１の部分並びにｂ）軽鎖の定常部分の第１のアミノ酸をコードするコドンから始まり、定常部分又はその断片の最後のアミノ酸をコードするコドンで終わり、終止コドンが続く、重鎖定常部分又はその断片をコードする第２の部分を含む。
第１の部分は、配列番号２中に示されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有する可変ドメインをコードする。第１の部分は、位置１のヌクレオチドから始まり、位置３２１のヌクレオチドで終わる配列番号２中に示されるヌクレオチド配列を有する。また、好ましくは、第２の部分は、ヒト軽鎖の定常部分、より好ましくはヒトκ鎖の定常部分をコードする。
本発明はまた、ＣＤＲ１Ｌ、ＣＤＲ２Ｌ、ＣＤＲ３Ｌ、ＣＤＲ１Ｈ、ＣＤＲ２Ｈ、若しくはＣＤＲ３Ｈ又はフレームワーク、典型的に少数のみ（例えばＦＲ１〜４Ｌ若しくはＨ）の１又は２以上の残基が、例えば、対応するＤＮＡ配列の部位特異的突然変異誘導によって、配列番号３７及び配列番号３８中に示される残基から変化している、ＣＤ４０結合分子をも含む。本発明は、そのような変化したＣＤ４０結合分子をコードするＤＮＡ配列を含む。特に、本発明は、ＣＤＲ１Ｌ、ＣＤＲ２Ｌ、及び／又はＣＤＲ３Ｌの１又は２以上の残基が配列番号３７中に示される残基から変化しており、且つＣＤＲ１Ｈ、ＣＤＲ２Ｈ、及び／又はＣＤＲ３Ｈの１又は２以上の残基が配列番号３８中に示される残基から変化している、ＣＤ４０結合分子を含む。
それぞれのＤＮＡ構築物は、適した制御配列の制御下に、特に、適したプロモーターの制御下に置かれる。任意の種類のプロモーターが、使用されてもよい、ただし、ＤＮＡ構築物が発現のための移入されるであろう宿主生物にそれがふさわしいことを条件とする。しかしながら、発現が哺乳動物細胞中で起こる場合、免疫グロブリン遺伝子プロモーターは、Ｂ細胞中で使用されてもよい。第１及び第２の部分は、イントロンによって隔てられてもよく、エンハンサーは、第１及び第２の部分の間のイントロン中に好都合に配置されてもよい。転写されるが、翻訳されないそのようなエンハンサーの存在は、効率的な転写を支援してもよい。特定の実施形態では、第１及び第２のＤＮＡ構築物は、例えば重鎖ヒト遺伝子のエンハンサーを含む。
所望の抗体は、細胞培養物又はトランスジェニック動物において産生されてもよい。適したトランスジェニック動物は、適した制御配列下に置かれた第１及び第２のＤＮＡ構築物を卵の中にマイクロインジェクトすること、適切な偽妊娠しているメスの中にそのように調製された卵に移入すること、及び所望の抗体を発現している子孫を選択することを含む標準的な方法によって得られてもよい。
本発明はまた、上記に記載されるＤＮＡ構築物の少なくとも１つを含む、原核細胞系又は真核細胞系において複製することができる発現ベクターを提供する。次いで、ＤＮＡ構築物を含有するそれぞれの発現ベクターは、適した宿主生物の中に移入される。ＤＮＡ構築物が２つの発現ベクター上に別々に挿入される場合、それらは、別々に移入されてもよく、つまり、細胞当たり１種類のベクターとして移入されてもよく又は同時移入されてもよく、この後者が可能性として好ましい。適した宿主生物は、細菌、酵母、又は哺乳動物細胞系であってもよく、この後者が好ましい。より好ましくは、哺乳動物細胞系は、リンパ起源のもの、例えば骨髄腫Ｂ細胞、ハイブリドーマＢ細胞、通常の不死化Ｂ細胞であり、これは、好都合に、いかなる内因的な抗体重鎖も軽鎖も発現しない。
抗体鎖が細胞培養物中で産生される場合、ＤＮＡ構築物は、最初に、単一の発現ベクター又は２つの異なるが適合する発現ベクターの中に挿入され、後者が可能性として好ましい。哺乳動物細胞における発現については、ＣＤ４０結合分子のコード配列は、ＣＤ４０結合分子の高レベルの発現を可能にする又は促進する遺伝子座内の宿主細胞ＤＮＡの中に統合されることが好ましい。
本発明のさらなる態様では、（ｉ）上記に定義される発現ベクターを用いて形質転換される生物を培養するステップ及び（ii）培養からＣＤ４０結合分子を回収するステップを含む、ＣＤ４０結合分子の産物のプロセスが提供される。
本発明に従って、抗ＣＤ４０＿１２Ｅ１２．３Ｆ３、抗ＣＤ４０＿１２Ｂ４．２Ｃ１０、及び／又は抗ＣＤ４０＿１１Ｂ６．１Ｃ３抗体は、ヒトＣＤ４０の抗原性エピトープに対して結合特異性を有するように思われることが分かった。そのため、このエピトープに対する抗体、例えば抗ＣＤ４０＿１２Ｅ１２．３Ｆ３抗体が、樹状細胞（ＤＣ）の中に抗原を効率的にデリバリーすることができることは最も驚くべきことである。成熟ヒトＣＤ４０の抗原性エピトープに対して結合特異性を有する抗体、特に、キメラ抗体及びＣＤＲ移植抗体並びにとりわけヒト抗体並びにＤＣ抗原ローディングのためのそのような抗体の使用は、新規であり、且つ本発明の範囲内に含まれる。
本発明の抗ＣＤ４０抗体を治療適応に使用するために、適切な投薬量は、もちろん、例えば、用いられることとなる、本明細書において開示される抗体、宿主、投与のモード、並びに治療されている状態の性質及び重症度に依存して変動するであろう。しかしながら、予防的な使用において、良好な結果は、体重１キログラム当たり約０．０５ｍｇ〜約１０ｍｇ、より通常では、体重１キログラム当たり約０．１ｍｇ〜約５ｍｇの投薬量で一般に見出される。予防的な使用のための投薬の頻度は、通常、１週間当たり約１回〜３カ月ごとに約１回の範囲、より通常では、２週間ごとに約１回〜１０週間ごとに約１回、例えば４〜８週間ごとに１回の範囲にあるであろう。本発明の抗ＣＤ４０抗体は、非経口的に、静脈内に、例えば、肘前静脈若しくは他の末梢静脈の中に、筋肉内に、又は皮下に投与することができる。
本発明の医薬組成物は、従来の方法で、例えば凍結乾燥形態で製造されてもよい。即時の投与については、それは、適した水性担体、例えば注射用の滅菌水又は滅菌緩衝生理的食塩水中に溶解される。注入による、どちらかと言うとボーラス注入としての投与のために、より大量の溶液を作製することが望ましいと考えられる場合、製剤の時に食塩水の中にヒト血清アルブミン又は患者自身のヘパリン化血を組み込むことが有利である。過剰なそのような生理学的に不活性なタンパク質の存在は、輸液と共に使用される容器及び管材料の壁への吸着による抗体の損失を予防する。アルブミンが使用される場合、適した濃度は、生理食塩水の０．５〜４．５重量％である。
本発明の一実施形態は、本発明のヒト化抗体を含む免疫複合体、例えば、１又は２以上のエフェクター分子、抗原（複数可）、及び／又は検出可能な標識（複数可）に連結されたヒト化抗ＣＤ４０抗体を提供する。好ましくは、エフェクター分子は、例えば、１又は２以上のＴ細胞エピトープ、毒素、小分子、サイトカイン若しくはケモカイン、酵素、又は放射標識を含む、１又は２以上のペプチドなどの治療用分子である。
例示的な毒素は、シュードモナス外毒素又はジフテリア毒素を含むが、これらに限定されない。小分子の例は、タキソール、ドキソルビシン、エトポシド、及びブレオマイシン（bleiomycin）などの化学療法化合物を含むが、これらに限定されない。例示的なサイトカインは、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、並びにＩＬ−１２、ＩＬ−１７、及びＩＬ−２５を含むが、これらに限定されない。例示的な酵素は、ＲＮアーゼ、ＤＮアーゼ、プロテアーゼ、キナーゼ、及びカスパーゼを含むが、これらに限定されない。例示的な放射性同位体は、３２Ｐ及び１２５Ｉを含むが、これらに限定されない。
本明細書において使用される場合、用語「エピトープ」は、免疫応答を刺激することができる分子又は物質を指す。一実施例では、エピトープは、ポリペプチド及びポリペプチドをコードする核酸を含むが、これらに限定されない。ポリペプチドへの核酸の発現は、ポリペプチドが処理され、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子上に提示される場合、免疫応答を刺激することができる。一般に、エピトープは、それらがＴ細胞受容体及びそれぞれのＴ細胞アクセサリー分子と相互作用することができるように、細胞の表面上に提示され、クラスＩ又はクラスII ＭＨＣの結合溝に非共有結合するペプチドを含む。
抗原のタンパク質分解性のプロセシング。ＭＨＣによって抗原提示細胞上に表出されるエピトープは、より大きなペプチド又はタンパク質抗原前駆物質の切断ペプチド又は切断産物である。ＭＨＣ Ｉエピトープについては、タンパク質抗原は、細胞中に存在するプロテアソームによって消化されることが多い。細胞内プロテアソーム消化により、次いでＭＨＣタンパク質にロードされる、長さが約３〜２３アミノ酸のペプチド断片が産生される。細胞内又は細胞外環境のさらなるタンパク質分解性の活性により、これらの断片をさらに切り、且つ処理することができる。ＭＨＣクラスIIエピトープのプロセシングは、一般に、リソソーム／エンドソームコンパートメントに由来する細胞内プロテアーゼを介して生じる。本発明は、一実施形態では、それに対する免疫応答の増強が求められるペプチドを抗原提示細胞に直接、誘導する、抗ＣＤ４０抗体（又はその断片）に付着している、前処理されたペプチドを含む。
免疫原性化合物として潜在的に有効なエピトープを同定するために、ＭＨＣ結合のみの予測は、有用であるが、不十分である場合が多い。本発明は、抗原提示細胞及びレスポンダーＴ細胞の特定の供給源に対して求められる免疫応答に最も至るであろう、抗原内のエピトープを特異的に同定するための方法を含む。
本発明は、患者自身の抗原提示細胞及びＴ細胞のレパートリーを使用して所望の免疫応答を最ももたらすであろう、エピトープの同定のために迅速で容易なアッセイを可能にする。本発明の組成物及び方法は、いかなるタンパク質配列にも適用可能であり、ＭＨＣに結合することができ、抗原に応答するであろうＴ細胞に適切に提示されるエピトープを使用者が同定することを可能にする。したがって、本発明は、いかなる特定の標的又は病状にも限定されないが、その代わりに、いかなる有用な供給源に由来するＭＨＣエピトープ（複数可）をも包含する。
本明細書において使用される場合、用語「ベニヤ（veneered）」は、非ヒト抗体の特異性をヒトフレームワークの中に「移植する」ために、非ヒト抗体（例えばマウス、ラット、又はハムスター）から得られた抗原結合部位又はＣＤＲが、ヒト重鎖及び軽鎖保存構造フレームワーク領域（ＦＲ）の中に例えば、軽鎖又は重鎖のポリヌクレオチド中に置かれる、ヒト化抗体フレームワークを指す。ベニヤ抗体を発現する１又は２以上のポリヌクレオチド発現ベクターは、非ヒト抗体の抗原特異性を示し、且つそれらの発現、安定性、可溶性、又はその組合せを増強するであろう翻訳後修飾を受ける組換えヒト抗体の発現のために、哺乳動物細胞にトランスフェクトすることができる。
抗原
本発明で使用するためのウイルス抗原の例は、ＨＩＶ、ＨＣＶ、ＣＭＶ、アデノウイルス、レトロウイルス、ピコルナウイルスなどを含むが、これらに限定されない。非限定的な例は、ｇａｇ、ｐｏｌ、及びｅｎｖ遺伝子の遺伝子産物、Ｎｅｆタンパク質、逆転写酵素、並びに他のＨＩＶ成分などのヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）抗原に由来するレトロウイルス抗原などのレトロウイルス抗原；Ｂ型肝炎ウイルスのＳ、Ｍ、及びＬタンパク質、Ｂ型肝炎ウイルスのプレＳ抗原、並びにＣ型肝炎ウイルスＲＮＡなどの、他の肝炎、例えばＡ型、Ｂ型、Ｃ型肝炎ウイルス成分などの肝炎ウイルス抗原；赤血球凝集素及びノイラミニダーゼなどのインフルエンザウイルス抗原並びに他のインフルエンザウイルス成分；麻疹ウイルス融合タンパク質などの麻疹ウイルス抗原及び他の麻疹ウイルス成分；タンパク質Ｅ１及びＥ２などの風疹ウイルス抗原並びに他の風疹ウイルス成分；ＶＰ７ｓｃなどのロタウイルス抗原及び他のロタウイルス成分；エンベロープ糖タンパク質Ｂなどのサイトメガロウイルス抗原及び他のサイトメガロウイルス抗原成分；ＲＳＶ融合タンパク質、Ｍ２タンパク質などの呼吸器合胞体ウイルス抗原及び他の呼吸器合胞体ウイルス抗原成分；前初期タンパク質、糖タンパク質Ｄなどの単純ヘルペスウイルス抗原及び他の単純ヘルペスウイルス抗原成分；ｇｐＩ、ｇｐIIなどの帯状疱疹ウイルス抗原及び他の帯状疱疹ウイルス抗原成分；タンパク質Ｅ、Ｍ−Ｅ、Ｍ−Ｅ−ＮＳ１、ＮＳ１、ＮＳ１−ＮＳ２Ａ、８０％Ｅなどの日本脳炎ウイルス抗原及び他の日本脳炎ウイルス抗原成分；狂犬病糖タンパク質、狂犬病核タンパク質などの狂犬病ウイルス抗原及び他の狂犬病ウイルス抗原成分。ウイルス抗原のさらなる例については、Fundamental Virology, Second Edition, eds. Fields, B. N. and Knipe, D. M. (Raven Press, New York, 1991)を参照されたい。少なくとも１つのウイルス抗原は、アデノウイルス、レトロウイルス、ピコルナウイルス、ヘルペスウイルス、ロタウイルス、ハンタウイルス、コロナウイルス、トガウイルス、フラビウイルス、ラブドウイルス、パラミクソウイルス、オルソミクソウイルス、ブンヤウイルス、アレナウイルス、レオウイルス、パピローマウイルス、パルボウイルス、ポックスウイルス、ヘパドナウイルス、又は海綿状ウイルスに由来するペプチドであってもよい。ある特定の非限定的な実施例では、少なくとも１つのウイルス抗原は、ＨＩＶ、ＣＭＶ、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、インフルエンザ、麻疹、ポリオ、痘瘡、風疹；呼吸器合胞体ウイルス、単純ヘルペスウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、エプスタイン−バーウイルス、日本脳炎ウイルス、狂犬病ウイルス、インフルエンザウイルス、及び／又は感冒ウイルスのうちの少なくとも１つから得られるペプチドである。
一態様では、１又は２以上の抗原ペプチドは、Ｎｅｆ（６６〜９７）：VGFPVTPQVPLRPMTYKAAVDLSHFLKEKGGL（配列番号１）；Ｎｅｆ（１１６〜１４５）：HTQGYFPDWQNYTPGPGVRYPLTFGWLYKL（配列番号２）；Ｇａｇ ｐ１７（１７〜３５）：EKIRLRPGGKKKYKLKHIV（配列番号３）；Ｇａｇ ｐ１７〜ｐ２４（２５３〜２８４）：NPPIPVGEIYKRWIILGLNKIVRMYSPTSILD（配列番号４）；又はＰｏｌ ３２５〜３５５（ＲＴ １５８〜１８８）：AIFQSSMTKILEPFRKQNPDIVIYQYMDDLY（配列番号５）のうちの少なくとも１つから選択される。一態様では、融合タンパク質ペプチドは、SSVSPTTSVHPTPTSVPPTPTKSSP（配列番号１１）；PTSTPADSSTITPTATPTATPTIKG（配列番号１２）；TVTPTATATPSAIVTTITPTATTKP（配列番号１３）；又はTNGSITVAATAPTVTPTVNATPSAA（配列番号１４）から選択される１又は２以上のリンカーによって隔てられる。
本発明の抗ＣＤ４０抗原ワクチンを使用してデリバリーされてもよい抗原性の標的は、ウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原、又は寄生虫抗原などの抗原をコードする遺伝子を含む。病原体は、トリパノソーマ、サナダムシ、回虫、蠕虫、マラリア原虫を含む。胎児抗原又は前立腺特異的抗原などの腫瘍マーカーは、このようにターゲティングされてもよい。他の例は、ＨＩＶ ｅｎｖタンパク質及びＢ型肝炎表面抗原を含む。ワクチン接種の目的のための本発明によるベクターの投与は、それに対する強い免疫応答が所望されるであろう導入遺伝子の長期的な発現を可能にするために、ベクター関連抗原が、十分に非免疫原性であることを必要とする。いくつかの場合では、個人のワクチン接種は、年１回又は２年に１回などのように、希にのみ必要とされてもよく、感染病原体からの長期的な免疫性の防御を提供する。ベクターにおいて使用するための及び究極的に本発明での抗原としての生物、アレルゲン、並びに核酸配列及びアミノ酸配列の特定の例は、関連する部分、特に本発明で使用されてもよい生物及び特異的配列を対応させる表が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第６，５４１，０１１号明細書において見出される。
本明細書において開示される抗ＣＤ４０抗原ワクチンで使用するための細菌抗原は、例えば、百日咳毒素、線維状赤血球凝集素、ペルタクチン、ＦＩＭ２、ＦＩＭ３、アデニル酸シクラーゼ、及び他の百日咳細菌抗原成分などの細菌抗原；ジフテリア毒素又はトキソイドなどのジフテリア（diptheria）細菌抗原及び他のジフテリア細菌抗原成分；破傷風毒素又はトキソイドなどの破傷風細菌抗原及び他の破傷風細菌抗原成分；Ｍタンパク質などのストレプトコッカス細菌抗原及び他のストレプトコッカス細菌抗原成分；リポ多糖などのグラム陰性桿菌細菌抗原及び他のグラム陰性細菌抗原成分、ミコール酸、熱ショックタンパク質６５（ＨＳＰ６５，heat shock protein 65）、３０ｋＤａ主要分泌タンパク質、抗原８５Ａなどのマイコバクテリウム・ツベルクローシス（Mycobacterium tuberculosis）細菌抗原及び他のミコバクテリウムの抗原成分；ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）細菌抗原成分；ニューモリシン、肺炎球菌莢膜多糖などの肺炎球菌細菌抗原及び他の肺炎球菌細菌抗原成分；莢膜多糖などのヘモフィルス・インフルエンザエ（haemophilus influenza）細菌抗原及び他のヘモフィルス・インフルエンザエ細菌抗原成分；炭疽菌防御抗原などの炭疽菌細菌抗原及び他の炭疽菌細菌抗原成分；ｒｏｍｐＡなどのリケッチア細菌抗原及び他のリケッチア細菌抗原成分を含むが、これらに限定されない。本明細書において記載される細菌抗原と共に、他の細菌抗原、マイコバクテリウム抗原、マイコプラズマ抗原、リケッチア抗原、又はクラミジア抗原もまた含まれる。部分的な又は完全な病原体はまた、ヘモフィルス・インフルエンザエ（haemophilus influenza）；熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）；髄膜炎菌（neisseria meningitidis）；ストレプトコッカス・ニューモニエ（streptococcus pneumoniae）；ナイセリア・ゴノレー（neisseria gonorrhoeae）；サルモネラ血清型チフス；赤痢菌；ビブリオ・コレラエ（vibrio cholerae）；デング熱；脳炎；日本脳炎；ライム病；ペスト菌；西ナイルウイルス；黄熱；ツラレミア；肝炎（ウイルス；細菌）；呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ，respiratory syncytial virus）；ＨＰＩＶ １及びＨＰＩＶ ３；アデノウイルス；痘瘡；アレルギー、並びに癌であってもよい。
本発明の組成物及び方法で使用するための真菌抗原は、例えば、カンジダ菌類抗原成分；熱ショックタンパク質６０（ＨＳＰ６０，heat shock protein 60）などのヒストプラズマ菌類抗原及び他のヒストプラズマ菌類抗原成分；莢膜多糖などのクリプトコッカス菌類抗原及び他のクリプトコッカス菌類抗原成分；小球抗原（spherule antigen）などのコクシジオイデス菌類抗原及び他のコクシジオイデス菌類抗原成分；並びにトリコフィチンなどの白癬菌類抗原及び他のコクシジオイデス菌類抗原成分を含むが、これらに限定されない。
原生動物抗原及び他の寄生虫抗原の例は、メロゾイト表面抗原、スポロゾイト表面抗原、スポロゾイト周囲抗原、生殖母細胞／生殖体表面抗原、血液段階抗原（blood-stage antigen）ｐｆ １５５／ＲＥＳＡ、及び他のマラリア原虫抗原成分などの熱帯熱マラリア原虫抗原；ＳＡＧ−１、ｐ３０、及び他のトキソプラズマ抗原成分などのトキソプラズマ抗原；グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、パラミオシン、及び他の住血吸虫抗原成分などの住血吸虫抗原；ｇｐ６３、リポホスホグリカン、及びその関連タンパク質などのリーシュマニア主要抗原及び他のリーシュマニア抗原並びに他のリーシュマニア抗原成分；並びに７５〜７７ｋＤａ抗原、５６ｋＤａ抗原、及び他のトリパノソーマ抗原成分などのトリパノソーマ・クルージ（trypanosoma cruzi）抗原を含むが、これらに限定されない。
本発明の抗ＣＤ４０抗原ワクチンを使用してターゲティングすることができる抗原は、一般に、内部移行の見込み、免疫細胞特異性のレベル、ターゲティングされる免疫細胞の種類、免疫細胞成熟度、及び／又は活性化のレベル並びにその他同種のものを含む多くの因子に基づいて選択されるであろう。本実施形態では、抗体は、単一特異性抗体又は１つの抗ＣＤ４０結合ドメイン及び第２の抗原、例えば、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスII、Ｂ７−２、ＣＤ１８、ＣＤ２９、ＣＤ３１、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ５４、ＣＤ５８、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＭＲＦ−４４、ＣＭＲＦ−５６、ＤＣＩＲ、及び／又はＤｅｃｔｉｎ−１並びにその他同種のものなどの樹状細胞についての細胞表面マーカーに対する１つの結合ドメインを含むが、いくつかの場合では、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ５６、及び／又はＣＤ５７が存在しない二重特異性抗体であってもよい。抗原提示細胞についての細胞表面マーカーの例は、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスII、ＣＤ４５、Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＩＦＮ−γ受容体及びＩＬ−２受容体、ＩＣＡＭ−１、並びに／又はＦｃγ受容体を含むが、これらに限定されない。Ｔ細胞についての細胞表面マーカーの例は、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ２０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＣＤ４５、及びＨＬＡ−ＤＲを含むが、これらに限定されない。
デリバリーのための細胞表面上の標的抗原は、腫瘍抗原のそれらの特性を含み、典型的に、腫瘍組織の細胞の細胞表面、細胞質、核、細胞小器官、及びその他同種のものに由来するであろう。本発明の抗体部分の腫瘍標的の例は、限定されることなく、白血病及びリンパ腫などの血液癌、星状細胞腫若しくは膠芽腫などの神経性の腫瘍、黒色腫、乳癌、肺癌、頭頸部癌、胃癌又は結腸癌などの胃腸腫瘍、肝臓癌、膵臓癌、子宮頸癌、子宮癌、卵巣癌、膣癌、精巣癌、前立腺癌、若しくは陰茎癌などの尿生殖器の腫瘍、骨腫瘍、血管腫瘍、又は唇、鼻咽頭、咽頭及び口腔、食道、直腸、胆嚢、胆管、喉頭、肺及び気管支、膀胱、腎臓、脳及び神経系の他の部分、甲状腺の癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、並びに白血病に由来する抗原を含む。
本発明を使用して、単独で又は抗原提示のための免疫細胞と組み合わせてデリバリーされてもよい抗原の例は、腫瘍タンパク質、例えば突然変異癌遺伝子；腫瘍と関連するウイルスタンパク質；並びに腫瘍ムチン及び糖脂質を含む。抗原は、腫瘍と関連するウイルスタンパク質であってもよく、上記に示したウイルスのクラスに由来するものになるであろう。ある種の抗原は、腫瘍に特有のものであってもよい（腫瘍前駆細胞によって通常発現されないタンパク質である、あるサブセット）又は腫瘍前駆細胞中で通常発現されるが、腫瘍の突然変異特性を有するタンパク質であってもよい。他の抗原は、活性又は細胞内分布の改変、例えば、腫瘍抗原を生じる、遺伝子の突然変異を有する通常のタンパク質の突然変異バリアント（複数可）を含む。
抗ＣＤ４０融合タンパク質ワクチンにおいて使用される腫瘍抗原の特定の非限定的な例は、例えばＣＥＡ、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ、ＭＡＧＥ １〜４、６、及び１２、ＭＵＣ（ムチン）（例えばＭＵＣ−１、ＭＵＣ−２など）、ＧＭ２ガングリオシド及びＧＤ２ガングリオシド、ｒａｓ、ｍｙｃ、チロシナーゼ、ＭＡＲＴ（黒色腫抗原）、Ｐｍｅｌ １７（ｇｐ１００）、Ｎ−アセチルグルコサミントランスフェラーゼＶイントロンＶ配列（ＧｎＴ−ＶイントロンＶ配列）、前立腺Ｃａ ｐｓｍ、ＰＲＡＭＥ（黒色腫抗原）、β−カテニン、黒色腫遍在性突然変異遺伝子産物（ＭＵＭ−１−Ｂ）、ＧＡＧＥ（黒色腫抗原）１、ＭＡＧＥ、ＢＡＧＥ（黒色腫抗原）２〜１０、ｃ−ＥＲＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）、ＤＡＧＥ、エプスタイン−バーウイルス核抗原（ＥＢＮＡ）１〜６、ｇｐ７５、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｅ６及びＥ７、ｐ５３、肺抵抗性タンパク質（ＬＲＰ）、Ｂｃｌ−２、Ｋｉ−６７、サイクリンＢ１、ｇｐ１００、サバイビン（Survivin）、並びにＮＹＥＳＯ−１を含む。
さらに、免疫原性分子は、自己免疫疾患、主として、関連する標的器官、組織、又は細胞によって発現される分子に特異的な抗体の活性による病態、例えばＳＬＥ又はＭＧの開始及び／又は蔓延に関与する自己抗原とすることができる。そのような疾患において、関連する自己抗原に対する進行中の抗体媒介性（つまりＴｈ２型）免疫応答を、細胞性（つまりＴｈ１型）免疫応答の方へ誘導することが望ましい可能性がある。その代わりに、適切な自己抗原に対するＴｈ１応答を予防的に誘導することによって、関連する自己免疫疾患を有していないが、それに対して感受性であることが疑われている対象における自己抗原に対するＴｈ２応答の発生を予防すること又はそのレベルを減少させることが望ましい可能性がある。所望の自己抗原は、限定されることなく、（ａ）ＳＬＥに関して、Ｓｍｉｔｈタンパク質、ＲＮＰリボ核タンパク質、並びにＳＳ−Ａ及びＳＳ−Ｂタンパク質；並びに（ｂ）ＭＧに関して、アセチルコリン受容体を含む。１又は２以上の種類の自己免疫応答に関与する他の種々の抗原の例は、例えば黄体形成ホルモン、卵胞刺激ホルモン、テストステロン、成長ホルモン、プロラクチン、及び他のホルモンなどの内因的なホルモンを含む。
自己免疫疾患、アレルギー、及び移植片拒絶に関与する抗原は、本発明の組成物及び方法において使用することができる。任意の１又は２以上の以下の自己免疫疾患又は自己免疫障害に関与する抗原は、本発明において使用することができる：糖尿病、真性糖尿病、関節炎（関節リウマチ、若年性関節リウマチ、変形性関節症、乾癬性関節炎を含む）、多発性硬化症、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、自己免疫性甲状腺炎、皮膚炎（アトピー性皮膚炎及び湿疹性皮膚炎を含む）、乾癬、シェーグレン症候群に次ぐ乾性角結膜炎を含むシェーグレン症候群、円形脱毛症、節足動物咬傷反応によるアレルギー応答、クローン病、アフタ性潰瘍、虹彩炎、結膜炎、角結膜炎、潰瘍性大腸炎、喘息、アレルギー喘息、皮膚エリテマトーデス、強皮症、膣炎、直腸炎、薬疹、らいリバーサル反応、癩性結節性紅斑、自己免疫性ぶどう膜炎、アレルギー性脳脊髄炎、急性壊死性出血性脳症（acute necrotizing hemorrhagic encephalopathy）、特発性両側性進行性感音難聴、再生不良性貧血、赤芽球ろう、特発性血小板減少症、多発軟骨炎、ウェゲナー肉芽腫症、慢性活動性肝炎、スティーブンス−ジョンソン症候群、特発性スプルー、扁平苔癬、クローン病、グレーブス眼症、サルコイドーシス、原発性胆汁性肝硬変、後部ぶどう膜炎、並びに間質性肺線維症。自己免疫疾患に関与する抗原の例は、グルタミン酸デカルボキシラーゼ６５（ＧＡＤ ６５，glutamic acid decarboxylase 65）、天然ＤＮＡ、ミエリン塩基性タンパク質、ミエリンプロテオリピドタンパク質、アセチルコリン受容体成分、チログロブリン、及び甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ，thyroid stimulating hormone）受容体を含んでいる。
アレルギーに関与する抗原の例は、スギ花粉抗原、ブタクサ花粉抗原、ドクムギ花粉抗原などの花粉抗原、チリダニ抗原及びネコ抗原などの動物由来抗原、組織適合性抗原、並びにペニシリン及び他の治療薬を含む。移植片拒絶に関与する抗原の例は、心臓、肺、肝臓、膵臓、腎臓、及び神経の移植片成分などの、移植片レシピエントに移植されることとなる移植片の抗原性成分を含む。抗原は、自己免疫疾患を治療するのに有用な改変ペプチドリガンドであってもよい。
エフェクタータンパク質の機能的な利点に実質的に影響しない方法で、任意のタンパク質エフェクター分子の配列が改変されてもよいことが当業者らによって十分に理解されるであろう。例えば、グリシン及びアラニンは、典型的に、アスパラギン酸及びグルタミン酸並びにアスパラギン及びグルタミンと同様に交換可能であると考えられる。当業者は、エフェクター配列の多くの異なる変異が、本来のエフェクターとほぼ同じ活性を有するエフェクターをコードするであろうと認識するであろう。エフェクター分子及び抗体は、上記に記載されるように、化学的又は組換え手段によってコンジュゲートされてもよい。化学的修飾は、例えば、タンパク質化学の当技術分野においてよく知られている方法によって、直接又は連結化合物を通して、エフェクター分子及び抗体を互いに連結するための誘導体化を含む。共有結合及び非共有結合の結合手段の両方は、本発明のヒト化抗体で使用されてもよい。
抗体にエフェクター分子を付着させるための手順は、抗体に付着することとなる成分の化学構造によって変わるであろう。ポリペプチドは、典型的に、エフェクター分子の結合をもたらすための、抗体上の適した官能基との反応に利用可能である様々な官能基；例えばカルボン酸基（ＣＯＯＨ）、遊離アミン基（−−ＮＨ２）、又はスルフヒドリル（−−ＳＨ）基を含有する。その代わりに、抗体は、例えば、Pierce Chemical Company、Rockford Illから入手可能なものなどの多くのリンカー分子のいずれかの付着によって、さらなる反応性の官能基に曝露する又は付着させるために誘導体化することができる。
リンカーは、抗体及びエフェクター分子の両方に対して共有結合を形成することができる。適したリンカーは、当業者らによく知られており、直鎖若しくは分岐鎖炭素リンカー、ヘテロ環式炭素リンカー、又はペプチドリンカーを含むが、これらに限定されない。抗体及びエフェクター分子がポリペプチドである場合、リンカーは、それらの側鎖を通して構成アミノ酸に結合されてもよい（例えばシステインに対するジスルフィド結合を通して）。しかしながら、好ましい実施形態では、リンカーは、末端アミノ酸のアルファ炭素アミノ基及びカルボキシル基に連結されるであろう。
いくつかの状況において、免疫複合体がその標的部位に到達した場合に、抗体からエフェクター分子を遊離することが望ましい。そのため、これらの状況において、免疫複合体は、標的部位の近くで切断可能な連結を含むであろう。抗体からエフェクター分子を放出するためのリンカーの切断は、標的細胞の内部で又は標的部位の近くで免疫複合体がさらされる酵素活性又は条件によって促されてもよい。標的部位が腫瘍である場合、腫瘍部位に存在する条件下で切断可能なリンカーが、使用されてもよい（例えば腫瘍関連酵素又は酸性ｐＨに曝露される場合）。
エフェクター分子及び本発明の抗体の例示的な化学的修飾はまた、よく知られている方法による、循環系における滞留の時間を延長し、且つ免疫原性を低下させるための、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いる誘導体化を含む（例えばLisi, et al., Applied Biochem. 4:19 (1982)；Beauchamp, et al., Anal Biochem. 131:25 (1982)；及びGoodson, et al., Bio/Technology 8:343 (1990)を参照されたい）。
本発明は、能動及び受動免疫実施形態の両方で使用するためのワクチンを企図する。ワクチンとしての使用に適していると提唱される免疫原性組成物は、最も容易には、本明細書において開示される方法において調製される免疫原性Ｔ細胞刺激ペプチドから直接、調製されてもよい。最終のワクチン接種物質は、望まれない低分子量分子を取り出すために広範囲に透析される及び／又は所望の媒体へのより迅速な製剤のために凍結乾燥される。本発明のある実施形態では、本発明の組成物及び方法は、細胞ワクチンを製造するために使用される、例えば、抗体の抗原デリバリー抗ＣＤ４０結合部分は、抗原提示細胞に抗原（複数可）を誘導するために使用され、これは、次いで、提示のためにＭＨＣタンパク質上に抗原を「ロードする」。そのため、細胞ワクチンは、抗原ロード抗原提示細胞を生成するために本発明の組成物を使用してロードされた抗原提示細胞である。
ワクチンが抗ＣＤ４０結合タンパク質自体、例えば、完全抗体又はその断片である場合、次いで、これらの「活性成分」は、当技術分野、例えば、関連する部分が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第４，６０８，２５１号明細書；第４，６０１，９０３号明細書；第４，５９９，２３１号明細書；第４，５９９，２３０号明細書；及び第４．５７８，７７０号明細書において理解される方法を使用して、作製して、ワクチンにすることができる。典型的に、そのようなワクチンは、注射剤として、例えば、注射前の液体中での再懸濁に適した溶液若しくは懸濁液又は固体形態として調製される。調製物はまた、乳化されてもよい。活性免疫原性成分は、薬学的に許容され、活性成分と適合する添加剤と混合されることが多い。適した添加剤は、例えば水、食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール、又はその他同種のもの及びその組合せである。さらに、所望の場合、ワクチンは、湿潤剤若しくは乳化剤、ｐＨ緩衝剤、又はワクチンの有効性を増強するアジュバントなどの少量の補助物質を含有してもよい。
ワクチンは、投薬製剤と適合する方法で、且つ治療的に有効で、免疫原性となるであろう量で投与される。投与されることとなる量は、例えば、免疫応答を生成する個人の免疫系の能力を含めて、治療されることとなる対象に依存する。投与するのに必要な細胞又は活性成分の正確な量は、医師の判断に依存する。しかしながら、適した投薬範囲は、細胞ワクチンについて約数千の細胞（〜数百万の細胞）である。次いで、標準的なエピトープ又はエピトープデリバリーワクチンについては、ワクチンは、ワクチン接種当たりの数百マイクログラムの活性成分であってもよい。最初の投与及びブースター注射に適した投与計画は、多様であるが、最初の投与、それに続く二次の接種又は他の投与によって代表される。
適用の方法は、広く変動してもよいが、本明細書におけるある実施形態は、最も、静脈内に又は腫瘍若しくは感染の部位に直接デリバリーされるであろう。それとは関係なく、ワクチンの投与のための従来の方法のうちのいずれも適用可能である。ワクチンの投薬量は、投与経路に依存し、宿主のサイズに従って変動するであろう。
多くの場合では、ワクチンの複数回の投与、例えば、毎週又は１週間おきに提供される４〜６回のワクチン接種が望ましいであろう。通常のワクチン接種レジメンは、２〜１２週間の間隔又は３〜６週間の間隔で行われることが多いであろう。１〜５年、通常３年の間隔の定期的なブースターは、防御レベルの免疫応答を維持するのに又は寛解若しくは再感染の見込みに際して望ましい可能性がある。免疫の過程の後に、最も一般的にインビトロにおいて行われる、例えばＴ細胞活性化、サイトカイン分泌、又はさらに抗体産生についてのアッセイが続けられてもよい。これらの免疫応答アッセイは、よく知られており、種々様々の特許において、また本明細書において教示されるように見出される。
本発明のワクチンは、核酸ベクターが使用されるか、最終精製タンパク質、又は最終ワクチン形態が使用されるかに依存して、１又は２以上の「単位用量」で提供されてもよい。単位用量は、その投与、つまり適切な経路及び治療レジメンと関連して所望の応答をもたらすように計算される、治療用組成物の所定の量を含有するとして定義される。投与されることとなる量並びに特定の経路及び製剤は、当業者らの技術の範囲内にある。治療されることとなる対象、特に、対象の所望の免疫系及び防御の状態もまた、評価されてもよい。単位用量は、単回注射として投与する必要はないが、一定期間にわたる持続注入を含んでいてもよい。本発明の単位用量は、体重１ｋｇ当たりのＤＮＡ（又は体重１ｋｇ当たりのタンパク質）を単位として好都合に記載されてもよく、約０．０５、０．１０、０．１５、０．２０、０．２５、０．５、１、１０、５０、１００、１，０００ｍｇ以上の範囲の、体重１ｋｇ当たりのＤＮＡ又はタンパク質が投与される。
同様に、デリバリーされる抗ＣＤ４０抗原ワクチンの量は、体重１ｋｇ当たり約０．２〜約８．０ｍｇで変動し得る。したがって、特定の実施形態では、０．４ｍｇ、０．５ｍｇ、０．８ｍｇ、１．０ｍｇ、１．５ｍｇ、２．０ｍｇ、２．５ｍｇ、３．０ｍｇ、４．０ｍｇ、５．０ｍｇ、５．５ｍｇ、６．０ｍｇ、６．５ｍｇ、７．０ｍｇ、及び７．５ｍｇのワクチンが、インビボにおいて個人にデリバリーされてもよい。投与されることとなるワクチンの投薬量は、治療されている対象の体重及び健康状態並びに投与経路及び治療の頻度に大いに依存する。リポソームデリバリーベクター又はウイルスデリバリーベクターにあらかじめ結合されたネイキッドポリヌクレオチドを含む医薬組成物は、１μｇ〜１ｍｇのポリヌクレオチドから１μｇ〜１００ｍｇのタンパク質の範囲の量で投与されてもよい。したがって、特定の組成物は、１μｇ、５μｇ、１０μｇ、２０μｇ、３．０μｇ、４０μｇ、５０μｇ、６０μｇ、７０μｇ、８０μｇ、１００μｇ、１５０μｇ、２００μｇ、２５０μｇ、５００μｇ、６００μｇ、７００μｇ、８００μｇ、９００μｇ、１ｍｇ、１．５ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、２０ｍｇ、３０ｍｇ、４０ｍｇ、５０ｍｇ、６０ｍｇ、７０ｍｇ、８０ｍｇ、９０ｍｇ、又は１００ｍｇのベクターに独立して結合された約１μｇ、５μｇ、１０μｇ、２０μｇ、３０μｇ、４０μｇ、５０μｇ、６０μｇ、７０μｇ、８０μｇ、１００μｇ、１５０μｇ、２００μｇ、２５０μｇ、５００μｇ、６００μｇ、７００μｇ、８００μｇ、９００μｇ、又は１，０００μｇポリヌクレオチド又はタンパク質を含んでいてもよい。
本発明の抗体は、検出可能な標識に共有結合又は非共有結合されてもよい。そのような使用に適した検出可能な標識は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的、又は化学的方法によって検出可能な任意の組成物を含む。本発明において有用な標識は、磁気ビーズ（例えばＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標））、蛍光色素（例えばフルオレセインイソチオシアネート、Ｔｅｘａｓレッド、ローダミン、緑色蛍光タンパク質、及びその他同種のもの）、放射標識（例えば３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、又は３２Ｐ）、酵素（例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、及びＥＬＩＳＡにおいて一般的に使用される他のもの）、並びにコロイド金又は色ガラス又はプラスチック（例えばポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスなど）ビーズなどの比色定量標識を含む。
そのような標識を検出するための方法は、当業者らによく知られている。したがって、例えば、放射標識は、写真フィルム又はシンチレーションカウンターを使用して検出されてもよく、蛍光マーカーは、放射される照射を検出するために光検出器を使用して検出されてもよい。酵素による標識は、典型的に、基質と共に酵素を提供し、且つ基質に対する酵素の作用によって産生される反応産物を検出することによって検出され、比色定量標識は、単に色標識を視覚化することによって検出される。
本発明の抗体及び／又は免疫複合体組成物は、静脈内投与又は体腔の中への投与などの非経口投与に特に有用である。投与のための組成物は、薬学的に許容される担体、好ましくは水性担体中で溶解された抗体及び／又は免疫複合体の溶液を一般的に含むであろう。様々な水性担体、例えば緩衝食塩水及びその他同種のものを使用することができる。これらの溶液は、滅菌で、望ましくない物質が一般にない。これらの組成物は、従来のよく知られている滅菌技術によって滅菌されてもよい。組成物は、ｐＨ調整剤及び緩衝剤、毒性調整剤、並びにその他同種のもの、例えば酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウム、及びその他同種のものなどの、生理学的条件に近づけるのに必要とされる、薬学的に許容される補助物質を含有してもよい。これらの製剤中の融合タンパク質の濃度は、広く変動し得、選択される投与の特定のモード及び患者の必要に従って、体液容量、粘性、体重、及びその他同種のものに基づいて主として選択されるであろう。
したがって、静脈内投与のための本発明の典型的な医薬免疫複合体組成物は、１日当たり１人の患者当たり約０．１〜１０ｍｇとなるであろう。１日当たり１人の患者当たり０．１〜約１００ｍｇまでの投薬量が使用されてもよい。投与可能な組成物を調製するための実際の方法は、当業者らに知られているであろう又は明白であろう、また、REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCE, 19TH ED., Mack Publishing Company, Easton, Pa.(1995)などの刊行物においてより詳細に記載されている。
本発明の組成物は、治療処置のために投与することができる。治療上の適用では、組成物は、疾患及びその合併症を治す又は部分的に阻止するのに十分な量で、疾患に罹患している患者に投与される。これを達成するのに適切な量は、「治療有効用量」として定義される。この使用に有効な量は、疾患の重症度及び患者の健康の全身状態に依存するであろう。化合物の有効量は、症状（複数可）の主観的な軽減又は臨床医若しくは他の有資格観察者によって示される客観的に同定可能な改善のいずれかをもたらす量である。
組成物の単回又は複数回の投与は、患者によって必要とされ、且つ忍容される投薬量及び頻度に依存して投与される。いかなる場合も、組成物は、患者を有効に治療するのに十分な量の本発明のタンパク質を提供するはずである。好ましくは、投薬量は、１回投与されるが、治療結果が達成されるまで又は副作用が療法の中止の根拠となるまで定期的に適用されてもよい。一般に、用量は、患者に対して容認できない毒性をもたらすことなく、疾患の症状又は徴候を治療する又は回復させるのに十分である。
本発明の免疫複合体組成物の放出制御非経口製剤は、植込錠、油性注射液として、又は粒子系として作製することができる。タンパク質デリバリー系の概観については、参照によって本明細書に組み込まれるBanga, A. J., THERAPEUTIC PEPTIDES AND PROTEINS: FORMULATION, PROCESSING, AND DELIVERY SYSTEMS, Technomic Publishing Company, Inc., Lancaster, Pa., (1995)を参照されたい。粒子系は、マイクロスフェア、マイクロ粒子、マイクロカプセル、ナノカプセル、ナノスフェア、及びナノ粒子を含む。マイクロカプセルは、中心のコアとして治療用タンパク質を含有する。マイクロスフェアでは、治療薬は、粒子の全体にわたって分散している。約１μｍよりも小さな粒子、マイクロスフェア、及びマイクロカプセルは、一般に、それぞれ、ナノ粒子、ナノスフェア、及びナノカプセルと呼ばれる。ナノ粒子のみが静脈内に投与されるように、キャピラリーは、約５μｍの直径を有する。マイクロ粒子は、典型的に、直径が約１００μｍであり、皮下に又は筋肉内に投与される。
ポリマーは、本発明の免疫複合体組成物のイオン放出制御に使用することができる。薬剤デリバリー制御において使用するための様々な分解性及び非分解性ポリマーマトリックスは、当技術分野において知られている（Langer, R., Accounts Chem. Res. 26:537-542 (1993)）。例えば、ブロックコポリマー及びｐｏｌｏｘａｍｅｒ ４０７（登録商標）は、低温で粘着性で、さらに流動性の液体として存在するが、体温で半流動性ゲルを形成し、ヒドロキシアパタイトは、タンパク質の放出制御のためのマイクロ担体として使用されてきた及び／又はリポソームは、脂質カプセル剤の薬剤ターゲティング及び放出制御に使用されてもよい。治療用タンパク質のデリバリー制御のための多数のさらなる系が知られている。例えば、これらのそれぞれの関連する部分が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第５，０５５，３０３号明細書、第５，１８８，８３７号明細書、第４，２３５，８７１号明細書、第４，５０１，７２８号明細書、第４，８３７，０２８号明細書、第４，９５７，７３５号明細書及び第５，０１９，３６９号明細書、第５，０５５，３０３号明細書；第５，５１４，６７０号明細書；第５，４１３，７９７号明細書；第５，２６８，１６４号明細書；第５，００４，６９７号明細書；第４，９０２，５０５号明細書；第５，５０６，２０６号明細書、第５，２７１，９６１号明細書；第５，２５４，３４２号明細書、並びに第５，５３４，４９６号明細書を参照されたい。
本発明の免疫複合体の様々な使用の中に、融合タンパク質の毒性作用によって排除され得る特異的なヒト細胞によって引き起こされる様々な疾患状態が含まれる。例えば、本明細書において開示されるヒト化抗ＣＤ４０＿１２Ｅ１２．３Ｆ３（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９８５４）抗体、抗ＣＤ４０＿１２Ｂ４．２Ｃ１０（ＡＴＣＣ受託番号＿＿＿＿＿＿、寄託番号ＡＢ１３−２２．１２Ｂ４．２Ｃ１０（ＨＳ４４６））抗体、及び抗ＣＤ４０＿１１Ｂ６．１Ｃ３（ＡＴＣＣ受託番号＿＿＿＿＿＿、寄託番号ＡＢ１３−２２．１１Ｂ６．１Ｃ３（ＨＳ４４０））抗体については、免疫複合体のための好ましい１つの適用は、ＣＤ４０を発現する悪性細胞の治療である。
他の実施形態では、本発明は、１又は２以上のＴ細胞エピトープ又はＢ細胞エピトープとコンジュゲートされた又はそれとの融合タンパク質の形態をした、抗原、例えばＣＤ４０又はその免疫反応性断片のデリバリーのためのキットを提供する。本明細書において使用される「生物学的試料」は、抗原を含有する生物学的組織又は体液の試料である。そのような試料は、生検材料に由来する組織、血液、及び血液細胞（例えば白血球）を含むが、これらに限定されない。好ましくは、細胞は、リンパ球、例えば樹状細胞である。生物学的試料はまた、組織学的目的のために採取される凍結切片などの組織の切片をも含む。生物学的試料は、多細胞真核生物、好ましくは、ラット、マウス、雌ウシ、イヌ、モルモット、又はウサギなどの哺乳動物、より好ましくは、マカク、チンパンジー、又はヒトなどの霊長動物から典型的に得られる。最も好ましくは、試料は、ヒトに由来する。本発明の抗体はまた、例えば、インビボにおける画像診断のための診断ツールとして、インビボにおいて使用されてもよい。
キットは、典型的に、１又は２以上の抗原についてのコード配列が挿入されてもよいカルボキシ末端にある１又は２以上のフレームワーク部分又はマルチクローニングサイトと共に、本発明の抗体（又はその断片）をコードする核酸配列を含むであろう。いくつかの実施形態では、抗体は、ｓｃＦｖ断片又はｄｓＦｖ断片などのヒト化抗ＣＤ４０ Ｆｖ断片となるであろう。さらに、キットは、典型的に、本発明の抗体の使用のための方法を開示する説明書を含むであろう（例えば、自己由来樹状細胞とすることができる樹状細胞を用いる免疫前の樹状細胞へのローディングのための）。キットはまた、キットがデザインされる特定の適用を容易にするためにさらなる成分を含んでいてもよい。したがって、例えば、キットは、標識を検出するための方法をさらに含有していてもよい（例えば、酵素による標識のための酵素基質、蛍光標識を検出するためのフィルターセット、ヒツジ抗マウスＨＲＰなどの適切な二次標識、又はその他同種のもの）。キットは、特定の方法の実施に日常的に使用される緩衝液及び他の試薬をさらに含んでいてもよい。そのようなキット及び適切な内容物は、当業者らによく知られている。
本発明のための使用の他のセットでは、本発明の抗体によってターゲティングされた免疫複合体は、培養物中の細胞の集団から、ターゲティングされた細胞を取り除くために使用することができる。例えば、Ｔ細胞の特異的な集団が好ましい場合、本発明の免疫複合体は、進行中の免疫応答の逆効果を有するＴ細胞の集団を豊富にするために使用されてもよい。したがって、例えば、癌、ウイルス、又は他の病原体に対する免疫応答を引き起こすであろう抗原について、ターゲティング成分として、本発明の抗体を使用して抗原をロードした樹状細胞を患者に提供することによって、癌を有する患者から培養された細胞から癌細胞を取り除くことができる。同様に、免疫複合体は、調節性Ｔ細胞の集団を増加させる又は免疫応答を、細胞毒性Ｔ細胞応答に向けて若しくはそれを避けて駆動する又はさらにＢ細胞応答を駆動するために使用することができる。
抗ＣＤ４０−ＨＩＶペプチドワクチン
５つの１９〜３２アミノ酸長配列を、様々なＭＨＣクラスＩ分子との関連において、ＨＩＶ−１ Ｎｅｆ、Ｇａｇ、及びＥｎｖタンパク質中で同定される多数の細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）エピトープから選択した。ＣＴＬ応答は、マウス、霊長動物、及びヒトにおいてリポペプチドワクチンによって効率的に誘導することができることが報告されている。次いで、５つのＨＩＶペプチドは、（Ｐａｌｍ）−ＮＨ２基によってＣ末端の位置で修飾した、また、５つのＨＩＶペプチド配列は、科学文献において［例えばCharacterization of a multi-lipopeptides mixture used as an HIV-1 vaccine candidate (1999)
Klinguer et al., Vaccine, Volume 18, 259-267］且つ特許出願において［Cytotoxic T lymphocyte-inducing lipopeptides and use as vaccines. Gras-Masse H. et al.、欧州特許第ＥＰ０４９１６２８号（1992-06-24）；米国特許第５８７１７４６号明細書（1999-02-16）］十分に記載されている。
非常に望ましいＨＩＶワクチンは、上記のＨＩＶペプチドに融合された組換え抗樹状細胞受容体抗体から構成されるであろう。本発明は、タンパク質及びＨＩＶワクチンを効率的に産生するための組成物及び方法を含む。
下記に示される配列は、５つの選択されたＨＩＶペプチドのアミノ酸配列であり、それぞれのＨＩＶタンパク質内のアミノ酸位置を括弧内に示す。
Ｎｅｆ（６６〜９７）は、VGFPVTPQVPLRPMTYKAAVDLSHFLKEKGGL（配列番号１）である。
Ｎｅｆ（１１６〜１４５）は、HTQGYFPDWQNYTPGPGVRYPLTFGWLYKL（配列番号２）である。
Ｇａｇ ｐ１７（１７〜３５）は、EKIRLRPGGKKKYKLKHIV（配列番号３）である。
Ｇａｇ ｐ１７〜ｐ２４（２５３〜２８４）は、NPPIPVGEIYKRWIILGLNKIVRMYSPTSILD（配列番号４）である。
Ｐｏｌ ３２５〜３５５（ＲＴ １５８〜１８８）は、AIFQSSMTKILEPFRKQNPDIVIYQYMDDLY（配列番号５）である。
下記の配列は、ｈＩｇＧ４重鎖（Ｈ）−ＨＩＶ ｇａｇ１７融合タンパク質であり、Ｇａｇ ｐ１７（１７〜３５）領域は太字で示す。下線を引いたＡＳ残基は、結合配列である。
［ｍＡｎｔｉ−ＤＣＩＲ＿９Ｅ８＿Ｈ−ＬＶ−ｈＩｇＧ４Ｈ−Ｃ−Ｐｅｐ−ｇａｇ１７］Ｃ６５５は、

である。
下記の配列は、Ｈ鎖−ＨＩＶ ｇａｇ２５３融合タンパク質であり、Ｇａｇ ｐ１７〜ｐ２４（２５３〜２８４）領域は太字で示す。下線を引いたＡＳ残基は、結合配列である。
［ｍＡｎｔｉ−ＤＣＩＲ＿９Ｅ８＿Ｈ−ＬＶ−ｈＩｇＧ４Ｈ−Ｃ−Ｐｅｐ−ｇａｇ２５３］Ｃ６５６は、

である。
下記の配列は、Ｈ鎖−ＨＩＶ ｎｅｆ１１６融合タンパク質であり、Ｎｅｆ（１１６〜１４５）の領域は太字で示す。下線を引いたＡＳ残基は、結合配列である。
［ｍＡｎｔｉ−ＤＣＩＲ＿９Ｅ８＿Ｈ−ＬＶ−ｈＩｇＧ４Ｈ−Ｃ−Ｐｅｐ−ｎｅｆ１１６］Ｃ６８０は、

である。
下記の配列は、Ｈ鎖−ＨＩＶ ｎｅｆ６６融合タンパク質であり、Ｎｅｆ（６６〜９７）の領域は太字で影付きで示す。下線を引いたＡＳ残基は、結合配列である。
［ｍＡｎｔｉ−ＤＣＩＲ＿９Ｅ８＿Ｈ−ＬＶ−ｈＩｇＧ４Ｈ−Ｃ−Ｐｅｐ−ｎｅｆ６６］Ｃ６７９は、

である。
下記の配列は、Ｈ鎖−ＨＩＶ ｐｏｌ１５８融合タンパク質であり、Ｐｏｌ ３２５〜３５５（ＲＴ １５８〜１８８）領域は太字で示す。下線を引いたＡＳ残基は、結合配列である。
［ｍＡｎｔｉ−ＤＣＩＲ＿９Ｅ８＿Ｈ−ＬＶ−ｈＩｇＧ４Ｈ−Ｃ−Ｐｅｐ−ｐｏｌ１５８］Ｃ６６７は、

である。
図１は、トランスフェクト２９３Ｆ細胞から分泌され、還元ＳＤＳ．ＰＡＧＥ及びクーマシーブリリアントブルー染色によって分析した、様々なＨＩＶペプチドに融合された、プロテインＡアフィニティー精製組換え抗体を示す（レーン１〜５）。様々なＣ末端のＨＩＶペプチドコード領域に融合されたＨ鎖についての発現ベクターは、続く精製のために上清を採取する３日前に、一過性の２９３Ｆ細胞の中に対応する軽鎖（Ｌ）プラスミドと共にコトランスフェクトした。細胞数及びＤＮＡ量は、トランスフェクションの間、一定であった。プロテインＡアフィニティーマトリックスを過剰に使用したので、ＳＤＳ．ＰＡＧＥ分析により、様々なワクチン構築物の産生収量及びＨ鎖の完全性の両方を確定する。レーン１、４、及び５（上部バンド）は、ＨＩＶ ｇａｇ１７、ｎｅｆ６６、及びｐｏｌ１５８ペプチドに直接融合されたＨ鎖を十分に分泌することができることを示す。レーン２は、ＨＩＶ ｇａｇ２５３ペプチドに直接融合されたＨ鎖の発現が不十分であることを示す。レーン３は、ＨＩＶ ｎｅｆ１１６ペプチドに直接融合されたＨ鎖が全く発現させられないことを示す。
驚いたことに、可動性の潜在的にグリコシル化されるペプチド間コード領域リンカー配列の使用が、完全な組換え抗体−ＨＩＶペプチド融合タンパク質の分泌を改善することが分かった。
使用される可動性リンカー配列は、セルロソームアンカースキャフォルディンＢ前駆物質（cellulosomal anchoring scaffoldin B precursor）［バクテロイデス・セルロソルベンス（Bacteroides cellulosolvens）］に由来し、これらは、関連する部分が参照によって本明細書に組み込まれる、同時出願中の米国特許出願第６１／０８１，２３４号において本発明者らによって記載されている。
下記に示す配列は、４つの選択されたペプチドリンカー配列の２５アミノ酸長配列である。下線を引いた配列は、予測されるＮ結合型グリコシル化部位である。
Ｆｌｅｘ１は、SSVSPTTSVHPTPTSVPPTPTKSSP（配列番号１１）である。
Ｆｌｅｘ２は、PTSTPADSSTITPTATPTATPTIKG（配列番号１２）である。
Ｆｌｅｘ３は、TVTPTATATPSAIVTTITPTATTKP（配列番号１３）である。
Ｆｌｅｘ４は、TNGSITVAATAPTVTPTVNATPSAA（配列番号１４）である。
これらの配列［リンカーは太字で、コヒージョンから得られた領域は下線を引いて示す］は、細菌タンパク質＞ｇｉ｜５０６５６８９９｜ｇｂ｜ＡＡＴ７９５５０．１｜セルロソームアンカースキャフォルディンＢ前駆物質［バクテロイデス・セルロソルベンス］のコヒーシン（cohesin）間ドメインスペーサーに由来する。

。
下記の配列は、重鎖（Ｈ）−ＨＩＶ ｇａｇ１７−ｎｅｆ６６−ｎｅｆ１１６ペプチド融合タンパク質であり、ＨＩＶ ｇａｇ１７、ｎｅｆ６６、ｎｅｆ１１６ペプチド配列は太字とする。下線を引いたＡＳ残基は、結合配列である。
［ｍＡｎｔｉ−ＤＣＩＲ＿９Ｅ８＿Ｈ−ＬＶ−ｈＩｇＧ４Ｈ−Ｃ−ｇａｇ１７−ｎｅｆ６６−ｎｅｆ１１６］Ｃ６９４は、

である。
下記の配列は、Ｈ鎖−ＨＩＶ ｇａｇ１７−ｎｅｆ１１６ペプチド融合タンパク質であり、ＨＩＶ ｇａｇ１７及びｎｅｆ１１６ペプチド配列［イタリック体］は、スペーサーｆ１［太字で示す］を介して連結される。下線を引いたＡＳ残基は、結合配列である。
［ｍＡｎｔｉ−ＤＣＩＲ＿９Ｅ８＿Ｈ−ＬＶ−ｈＩｇＧ４Ｈ−Ｃ−ｇａｇ１７−ｆ１−ｎｅｆ１１６］Ｃ６９２は、

である。
図２は、トランスフェクト２９３Ｆ細胞から分泌され、次いで還元ＳＤＳ．ＰＡＧＥ及びクーマシーブリリアントブルー染色によって分析した、様々なＨＩＶペプチドに融合された、プロテインＡアフィニティー精製組換え抗体を示す（レーン１及び２）。様々なＣ末端のＨＩＶペプチドコード領域に融合されたＨ鎖についての発現ベクターは、続く精製のために上清を採取する３日前に、一過性の２９３Ｆ細胞の中に対応するＬ鎖プラスミドと共にコトランスフェクトした。レーン１及び２（上部バンド）は、ｇａｇ１７−ｎｅｆ６６−ｎｅｆ１１６のＨＩＶペプチドストリングに直接融合されたＨ鎖を十分に分泌することができることを示す。可動性スペーサーｆ１によって隔てられたｇａｇ１７及びｎｅｆ１１６のＨＩＶペプチドストリングを含有するＨ鎖産物（レーン２）もまた、十分に発現される。したがって、ＨＩＶ ｎｅｆ１１６ペプチドは、Ｈ鎖のみに直接融合された場合、分泌産物として発現されないが、ある種の他のペプチド及び可動性ストリングに関連して追加された場合に、十分に発現することができる。ｇａｇ１７−ｎｅｆ６６−ｎｅｆ１１６［８９残基］を有するＨ鎖よりもｇａｇ１７−ｆ１−ｎｅｆ１１６［８２残基］に直接融合されたＨ鎖の移動が遅いことに注意されたい。これは、可動性リンカーｆ１がグリコシル化されており、おそらく、また、ｇａｇ１７−ｎｅｆ６６−ｎｅｆ１１６融合抗体に対して、分泌ｇａｇ１７−ｆ１−ｎｅｆ１１６融合抗体の産生を増強することをも示唆する。
下記の配列は、Ｈ鎖−ｇａｇ１７−ｇａｇ２５３−ｎｅｆ６６のＨＩＶペプチドストリングの融合タンパク質であり、それぞれのＨＩＶペプチド配列［イタリック体で影付き］は、ペプチド間スペーサーｆ［太字で示す］によって隔てられる。この場合、セルロソームアンカースキャフォルディンＢ前駆物質［太字のイタリック体で下線を引いたバクテロイデス・セルロソルベンス領域］に由来する２７アミノ酸長リンカーｆｌｅｘ−ｖ１（ｖ１）［太字のイタリック体で示す］は、Ｈ鎖Ｃ末端及びＨＩＶペプチド可動性スペーサーストリングの間に挿入した。下線を引いたＡＳ残基は、結合配列である。
［ｍＡｎｔｉ−ＤＣＩＲ＿９Ｅ８＿Ｈ−ＬＶ−ｈＩｇＧ４Ｈ−Ｃ−Ｆｌｅｘ−ｖ１−Ｐｅｐ−ｇａｇ１７−ｆ１−ｇａｇ２５３−ｆ２−ｎｅｆ６６］Ｃ７１１は、

である。
下記の配列は、Ｈ鎖−ｐｏｌ１５８−ｇａｇ１７−ｎｅｆ６６−ｎｅｆ１１６−ｇａｇ２５３のＨＩＶペプチドストリングの融合タンパク質であり、ペプチド配列は、灰色の影付きである。下線を引いたＡＳ残基は、結合配列である。
［ｍＡｎｔｉ−ＤＣＩＲ＿９Ｅ８＿Ｈ−ＬＶ−ｈＩｇＧ４Ｈ−Ｃ−Ｐｅｐ−ｐｏｌ１５８−ｇａｇ１７−ｎｅｆ６６−ｎｅｆ１１６−ｇａｇ２５３］Ｃ７１３は、

である。
図３は、トランスフェクト２９３Ｆ細胞から分泌され、次いで還元ＳＤＳ．ＰＡＧＥ及びクーマシーブリリアントブルー染色によって分析した、様々なＨＩＶペプチドストリングに融合された、プロテインＡアフィニティー精製組換え抗体を示す（レーン１〜５）。様々なＣ末端のＨＩＶペプチドコード領域に融合されたＨ鎖についての発現ベクターは、続く精製のために上清を採取する３日前に、一過性の２９３Ｆ細胞の中に対応するＬ鎖プラスミドと共にコトランスフェクトした。レーン１、２、及び３（上部バンド）は、可動性リンカーｆｌｅｘ−ｖ１を介してＨ鎖に融合された４つのＨＩＶペプチド−可動性スペーサーが、十分に分泌され得ることを示す。しかしながら、Ｈ鎖に直接融合された４つのＨＩＶペプチドのストリングは、全く発現されない（レーン４、上部バンド）。また、レーン５（上部バンド）は、Ｈ鎖に直接融合された５つのＨＩＶペプチドのストリングも全く発現されないことを示す。この結果は、可動性リンカー及びＨＩＶペプチドコード配列のある種の組合せ及び関連が、組換え抗体−ＨＩＶペプチド融合タンパク質の分泌を増強することができることを示唆する（レーン１、２、及び３）。
下記の配列は、Ｈ鎖−ｇａｇ１７−ｇａｇ２５３−ｎｅｆ６６−ｎｅｆ１１６−ｐｏｌ１５８のＨＩＶペプチドストリングの融合タンパク質であり、それぞれのＨＩＶペプチド配列［イタリック体で影付き］は、ペプチド間スペーサーｆ［太字で示す］によって隔てられる。可動性リンカーｆｌｅｘ−ｖ１（ｖ１）［太字イタリック体で示す］は、Ｈ鎖Ｃ末端及びＨＩＶペプチド可動性スペーサーストリングの間に挿入した。下線を引いたＡＳ残基は、結合配列である。
［ｍＡｎｔｉ−ＤＣＩＲ＿９Ｅ８＿Ｈ−ＬＶ−ｈＩｇＧ４Ｈ−Ｃ−ｈＩｇＧ４Ｈ−Ｆｌｅｘ−ｖ１−Ｐｅｐ−ｇａｇ１７−ｆ１−ｇａｇ２５３−ｆ２−ｎｅｆ１１６−ｆ３−ｎｅｆ６６−ｆ４−ｐｏｌ１５８］Ｃ８２５は、

である。
図４は、トランスフェクト２９３Ｆ細胞から分泌され、次いで還元ＳＤＳ．ＰＡＧＥ及びクーマシーブリリアントブルー染色によって分析した、様々なＨＩＶペプチドストリングに融合された、プロテインＡアフィニティー精製組換え抗体を示す（レーン１〜６）。様々なＣ末端のＨＩＶペプチドコード領域に融合されたＨ鎖についての発現ベクターは、続く精製のために上清を採取する３日前に、一過性の２９３Ｆ細胞の中に対応するＬ鎖プラスミドと共にコトランスフェクトした。レーン１、３、及び５（上部バンド）は、可動性リンカーｆｌｅｘ−ｖ１を介してＨ鎖に融合された４つのＨＩＶペプチド−可動性スペーサーのストリングが、十分に分泌され得ることを示す。レーン２及び６（上部バンド）は、可動性リンカーｆｌｅｘ−ｖ１を介してＨ鎖に融合された５つのＨＩＶペプチド−可動性スペーサーのストリングの発現が不十分であることを示す。しかしながら、ＨＩＶペプチドコード配列のある種の組合せ及び関連が、組換え抗体−ＨＩＶペプチド融合タンパク質の分泌を増強する（レーン３及び４）。したがって、可動性リンカーｆｌｅｘ−ｖ１を介して５つのＨＩＶペプチド−可動性スペーサーのストリングに融合されたＨ鎖は、ある種の他のペプチド及び可動性ストリングに関連して追加された場合に、十分に発現することができる（レーン４）。
本発明は、組換え抗ＤＣ受容体抗体−ＨＩＶペプチド融合ワクチンの効率的な分泌に特に有利である、可動性の潜在的にグリコシル化されるペプチド間コード領域リンカー配列及びそのようなＨＩＶペプチドコード領域の組合せのための組成物及び方法を含む。
タンパク質工学の好ましいドメイン間リンカー配列としてのセルロース分解細菌に由来する構造間ドメインリンカー配列、特に十分に予測されるグリコシル化部位を有するものの使用。これらの配列の望ましい特性は、ｉ）固有の可動性、それによって、それらの正確なフォールディングを大いに助けるはずである、連結ドメインの分離を容易にし、コンホメーション依存性の抗原エピトープへのＢ細胞受容体到達を維持すること；ii）グリコシル化、それによって、完全な産生融合タンパク質の分泌及び可溶性を助け、また、培地プロテアーゼからリンカー配列を保護すること、である。
ＨＩＶペプチドコード領域のある種の組合せは、分泌を促進し、ＨＩＶペプチドコード配列の間に挿入されたその特定の可動性リンカー配列もまた、完全なＨＩＶペプチドストリングワクチンの分泌を助けることができる。これは、他の好ましいペプチド抗原について類似する問題を解決するために適用することもできる原理である。
好ましいリンカー及び抗原コード配列のＤＮＡ配列。結合配列コドン及び終止コドンは太字で示す。

［ｍＡｎｔｉ−ＤＣＩＲ＿９Ｅ８＿Ｈ−ＬＶ−ｈＩｇＧ４Ｈ−Ｃ−ｈＩｇＧ４Ｈ−Ｆｌｅｘ−ｖ１−Ｐｅｐ−ｇａｇ１７−ｆ１−ｇａｇ２５３−ｆ２−ｎｅｆ１１６−ｆ３−ｎｅｆ６６−ｆ４−ｐｏｌ１５８］Ｃ８２５：
好ましいリンカー及び抗原コード配列のＤＮＡ配列。結合配列コドンは太字で示す。
本発明は、ＨＩＶペプチド及び可動性リンカー配列をコードする構築物を構築するための組成物及び方法を含む。Ｈ鎖発現ベクターは、典型的に、Ｈ鎖Ｃ末端残基コドンに又は［ｆｌｅｘ−ｖ１ベクターについては］ｆｌｅｘ−ｖ１配列のＣ末端コドンに追加されたNhe I部位［g｜ctagc］を有する。可動性リンカー配列又はＨＩＶペプチド配列は、Ｎ末端の可動性リンカー又はＨＩＶペプチドコドンに先行するSpe I部位［a｜ctagt］、Ｃ末端の可動性リンカー又はＨＩＶペプチドコドンを追加されたNhe I部位、その後に続くＴＧＡ終止コドン、その後に続くEco RI部位、その後に続くNot I部位を有する。そのような可動性リンカー又はＨＩＶペプチドSpe I−Not I断片は、Nhe I−Not I消化を用いて調製されたＨ鎖ベクターの中に挿入される。Nhe I及びSpe Iは適合する部位であるが、ライゲーションされた場合、［g｜ctagt］は、もはやNhe I部位でもSpe I部位でもない。したがって、さらなるSpe I−Not I可動性リンカー又はＨＩＶペプチド断片は、最初の可動性リンカー又はＨＩＶペプチドに対して遠位の、新しいNhe I−Not Iの間に挿入することができる。この方法で、ＨＩＶペプチド及び／又は可動性リンカーコード領域のストリングは、発現ベクターＨ鎖コード領域に追加することができる。
ＨＩＶペプチドワクチン−インビトロ抗原ターゲティングバイオロジー
インビトロにおけるＨＩＶ患者に対する抗ＣＤ４０．ＬＩＰＯ５ ＨＩＶペプチドワクチン試験。αＣＤ４０．ＬＩＰＯ５ ＨＩＶペプチド融合組換え抗体（αＣＤ４０．ＬＩＰＯ５ ｒＡｂ）が抗原提示を媒介する能力を研究するために、融合ｒＡｂは、ＨＩＶに感染した個人に由来する血液細胞に追加し、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からのサイトカイン産生を測定した。
図５は、αＣＤ４０．ＬＩＰＯ５ ＨＩＶペプチド融合組換え抗体（αＣＤ４０．ＬＩＰＯ５ ｒＡｂ）が、ＰＢＭＣ培養物との関連において抗原特異的Ｔ細胞の増大を誘導する効力をアッセイするためにインビトロにおいて使用するプロトコールを示す。手短に言えば、ＨＩＶ患者のアフェレーシスに由来するＰＢＭＣ（２×１０６細胞／ｍｌ）を、用量範囲のαＣＤ４０．ＬＩＰＯ５ ＨＩＶペプチドワクチンと共にインキュベートした。２日目に、１００Ｕ／ｍｌ ＩＬ−２を培養物に追加し、次いで、培地は、２日ごとに１００Ｕ／ｍｌ ＩＬ−２を用いてリフレッシュする。１０日目に、増大した細胞に、αＣＤ４０．ＬＩＰＯ５ ＨＩＶペプチド融合ｒＡｂ中に組み込まれる５つのＨＩＶペプチド配列に対応する個々の長いペプチドを４８時間曝露する。次いで、培養上清は、採取し、多重ビーズアッセイ（Luminex）を使用してサイトカイン産生（ペプチド配列に対するＴ細胞受容体［ＴＣＲ］特異性を有するＴ細胞による）について評価する。そのようなアッセイにおいて検出された抗原特異的サイトカイン産生は、それが抗ＣＤ４０．ＬＩＰＯ５ ＨＩＶペプチドワクチンの存在に依存する場合、培養物中の抗原提示細胞［ＡＰＣ］によるワクチン取り込み及びプロセシング［タンパク質分解性の分解］及びＭＨＣ上へのペプチドの提示を反映する。抗原−ＭＨＣ複合体は、特定のＨＩＶ抗原−ＭＨＣ複合体のみを認識するＴＣＲを有するＴ細胞によって認識される。ＨＩＶ患者では、そのような細胞は、ＨＩＶ感染症に応じて患者内に増大した記憶Ｔ細胞であろう。
ワクチンの５つのＨＩＶペプチド領域すべてに由来するエピトープは、ＡＰＣによって提示することができる。図５中のスキームは、抗ＣＤ４０．ＬＩＰＯ５ペプチドワクチンに応じてＨＩＶペプチド特異的Ｔ細胞のインビトロにおける増大をアッセイするために使用した。７人の個人に由来する結果を図６中に示し、またαＣＤ４０．ＬＩＰＯ５ ＨＩＶペプチド融合ｒＡｂが、研究した患者のすべてにおいてＨＩＶペプチド特異的ＩＦＮγ応答を誘導したことを示す。したがって、α−ＣＤ４０．ＬＩＰＯ５ ＨＩＶペプチド融合ｒＡｂにより、ＤＣが、それぞれの個人のＴ細胞に、ワクチン内の５つのペプチドのうちの少なくとも１つ又は２つの異なるペプチドをクロスプライミングすることを可能にする。しかしながら、ＩＦＮγ産生を刺激したＨＩＶペプチドのセットは、それぞれの患者で異なり、最も、ＨＩＶ特異性について記憶Ｔ細胞の異なるプールを反映するであろう。
図６Ａ〜Ｃは、様々な濃度の抗ＣＤ４０．ＬＩＰＯ５ペプチドストリングワクチンと共にインキュベートした、ＨＩＶ患者に由来するＰＢＭＣにおけるＨＩＶペプチド特異的ＩＦＮγ産生を示す。Ｃは、コントロールグループであり、ワクチンを受けず、それぞれのペプチドに対する培養物のベースラインの応答を確定する。
図７は、８人のＨＩＶ患者に由来する５つのペプチド領域に対するαＣＤ４０．ＬＩＰＯ５ペプチドワクチン応答の概要を示す。データは、ペプチド特異的ＩＦＮγ産生に基づく。図７は、抗原特異的応答が８人のＨＩＶ患者内で観察されたことを示す。データは、ワクチン上のすべてのＨＩＶペプチド領域が処理され、Ｔ細胞に提示される能力を有することを実証し、適切なＴＣＲを運ぶ細胞が存在する場合のみ、これらのペプチドに対する応答が観察されるであろうという有望な状況が想定される。したがって、それぞれの患者は、特徴的な範囲のそのような細胞を有する。
αＣＤ４０．ＬＩＰＯ５ペプチドワクチンは、広い範囲のサイトカインを分泌することができる抗原特異的Ｔ細胞の増殖を誘起することができる。
図８Ａ〜Ｃは、αＣＤ４０．ＬＩＰＯ５ ＨＩＶペプチドワクチンが多数のサイトカインを分泌することができるＨＩＶペプチド特異的Ｔ細胞の増大−ワクチンにおいて望ましい特徴を誘導することを示す。図８Ａ〜Ｃでは、αＣＤ４０．ＬＩＰＯ５ ＨＩＶペプチドワクチンは、多数のサイトカインの産生によって特徴づけられる、ｇａｇ２５３、ｎｅｆ６６、ｎｅｆ１１６、及びｐｏｌ３２５ペプチド特異的応答を誘導する。これは、患者Ａ５である。
エクスビボＤＣの抗ＣＤ４０．ＬＩＰＯ５ ＨＩＶペプチドワクチン接種。
図９は、ＤＣによる、ターゲティングによる取り込み及びそれらの表面ＭＨＣ複合体上へのペプチドエピトープの提示から結果として生じる抗原特異的Ｔ細胞の増大を指示するためのその能力についてαＣＤ４０．ＬＩＰＯ５ ＨＩＶペプチドワクチンを試験するためのプロトコールを示す図である。手短に言えば、ＨＩＶ患者単球は、ＩＦＮα及びＧＭ−ＣＳＦを用いる２日間の培養によってＤＣに分化する。次いで、異なる用量のαＣＤ４０．ＬＩＰＯ５ ＨＩＶペプチドワクチン又は５つのペプチドのミックスを１８時間追加する。自己由来Ｔ細胞を３日目に共培養物（１：２０の比で）に追加した。５日目に、１００Ｕ／ｍｌ ＩＬ−２を培養物に追加し、次いで、培地は、２日ごとに１００Ｕ／ｍｌ ＩＬ−２を用いてリフレッシュする。１０日目に、増大した細胞に、αＣＤ４０．ＬＩＰＯ５ ＨＩＶペプチド融合ｒＡｂ中に組み込まれる５つのＨＩＶペプチド配列に対応する個々の長いペプチドを４８時間再度曝露する。次いで、培養上清は、採取し、Luminexを使用してサイトカイン産生について評価する。
図１０Ａ〜Ｂは、様々な用量のαＣＤ４０．ＬＩＰＯ５ ＨＩＶペプチドワクチンを用いて治療したＤＣ−Ｔ細胞共培養物からの、ＨＩＶペプチドに応じたサイトカイン分泌を示す。これは、患者Ａ１０である。図１０Ａ〜Ｂ中に示す患者Ａ１０における結果は、ｇａｇ１７、ｇａｇ２５３、及びｐｏｌ３２５ ＨＩＶペプチド領域内のエピトープに対応する抗原特異的Ｔ細胞の増大を実証する。ほとんどの場合では、αＣＤ４０．ＬＩＰＯ５ ＨＩＶペプチドワクチン及び非ＬＩＰＯ５ワクチン［αＣＤ４０．ＬＩＰＯ５ ＨＩＶペプチドワクチン中の配列に相当する配列を有する５つの非脂質付加ＨＩＶペプチドの混合物］の間に応答の一致がある。したがって、αＣＤ４０．ＬＩＰＯ５ ＨＩＶペプチドワクチンは、このインビトロ環境において十分に機能し、培養されたＤＣは、ＨＩＶ抗原を有効に処理し、Ｔ細胞に提示する。これは、エクスビボにおけるワクチン接種のためのαＣＤ４０．ＬＩＰＯ５ ＨＩＶペプチドワクチンの使用を例証し、それに従って「ワクチン接種されるＤＣ」は、同じ患者への将来の再注射のために凍結保存されるであろう。
αＣＤ４０．ＬＩＰＯ５ ＨＩＶペプチドワクチン−可動性リンカー領域の可能性のある免疫効果。αＣＤ４０．ＬＩＰＯ５ ＨＩＶペプチドワクチン内にＨＩＶペプチド配列を分散させている可動性リンカー配列自体がＴ細胞エピトープを含有する可能性がある。図１１Ａ〜Ｂは、患者Ａ４が、αＣＤ４０．ＬＩＰＯ５ ＨＩＶペプチドワクチン内の５つの可動性リンカー配列に対して特異性を有する記憶Ｔ細胞の有意なプールを有するように思われないことを示す。図１１Ａ〜Ｂでは、αＣＤ４０．ＬＩＰＯ５ ＨＩＶペプチドワクチンを用いて治療した患者Ａ４に由来するＰＢＭＣが、抗原特異的Ｔ細胞の増大を誘導し、ｇａｇ２５３領域に対して特異性を有するが、可動性リンカー配列に対して特異性を有していない。太字のエリアに対する配列中の対応する可動性リンカーの長いペプチドと共に、図９中に記載されるプロトコールを使用し、ＨＩＶペプチドは、下記の配列中に示す太字イタリック体とする。
太字で可動性リンカー領域を、下線を引いて結合配列を、且つ太字イタリック体の影付きでＨＩＶペプチド領域を示すαＣＤ４０．ＬＩＰＯ５ ＨＩＶペプチドワクチン重鎖配列。

。
図１２Ａでは、αＣＤ４０．ＬＩＰＯ５ ＨＩＶペプチドワクチンを用いて治療した患者Ａ３に由来するＰＢＭＣは、抗原特異的Ｔ細胞の増大を誘導し、ｇａｇ２５３、ｎｅｆ６６、及びｎｅｆ１１６領域に対して特異性を有するが、可動性リンカー配列に対して特異性を有していない。図８中に示される太字のエリアに対する配列中の対応する可動性リンカーの長いペプチドと共に、図１中に記載されるプロトコールを使用した。
図１２Ｂ−１及びＢ−２は、３０ｎＭの３つの異なるＨＩＶ５ペプチドＤＣターゲティングワクチンと共にインキュベートしたＨＩＶ患者Ａ１７ ＰＢＭＣから誘起されたＨＩＶ抗原特異的Ｔ細胞応答を示す。細胞は、ＩＬ−２と共に１０日間培養し、次いで、ＤＣターゲティングワクチン内に包含される５つのＨＩＶペプチド配列に相当する個々の長さのペプチドを用いて刺激した。１時間後に、ブレフェルジンＡを追加し、ＦＡＣＳ分析のために染色する前にさらに５時間、インキュベーションを継続した。ＦＡＣＳプロットは、ＣＤ３＋Ｔ細胞上のＩＦＮγ及びＣＤ８の染色を示す。円は、ワクチンなしで培養したＰＢＭＣに由来する細胞と比較した、ＩＦＮγ＋細胞の有意な、ワクチンに誘起された増大を示す。ＣＤ８−細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞である。データは、抗ＣＤ４０．ＨＩＶ５ｐｅｐワクチンが、他のＤＣターゲティング媒体で見られない、ｎｅｆ６６（Ｎ６６）特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の強い増大を誘起することを示す。
これらは、ＬＩＰＯ５ ＨＩＶペプチドストリングに基づくデータである。例えば、抗ＣＤ４０ Ｈ鎖は、配列
EVKLVESGGGLVQPGGSLKLSCATSGFTFSDYYMYWVRQTPEKRLEWVAYINSGGGSTYYPDTVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSRLKSEDTAMYYCARRGLPFHAMDYWGQGTSVTVSSAKTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKASQTPTNTISVTPTNNSTPTNNSNPKPNPASEKIRLRPGGKKKYKLKHIVASSSVSPTTSVHPTPTSVPPTPTKSSPASNPPIPVGEIYKRWIILGLNKIVRMYSPTSILDASPTSTPADSSTITPTATPTATPTIKGASHTQGYFPDWQNYTPGPGVRYPLTFGWLYKLASTVTPTATATPSAIVTTITPTATTKPASVGFPVTPQVPLRPMTYKAAVDLSHFLKEKGGLASTNGSITVAATAPTVTPTVNATPSAAASAIFQSSMTKILEPFRKQNPDIVIYQYMDDLYAS (配列番号３７)
を有する抗ＣＤ４０＿１２Ｅ１２．３Ｆ３＿Ｈ−ＬＶ−ｈＩｇＧ４Ｈ−Ｃ−Ｆｌｅｘ−ｖ１−Ｐｅｐ−ｇａｇ１７−ｆ１−ｇａｇ２５３−ｆ２−ｎｅｆ１１６−ｆ３−ｎｅｆ６６−ｆ４−ｐｏｌ１５８］である。
図１２Ｃ−１及びＣ−２は、ＰＢＭＣが異なるＨＩＶ患者（Ａ２）に由来する以外は、図１２Ｂにおいて示す研究に類似する研究を示す。データは、抗原特異的ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞応答が、他のＤＣターゲティングワクチンではなく抗ＣＤ４０．ＨＩＶ５ｐｅｐによって又はペプチド自体の混合物によって誘起されたことを示す。
図１２Ｄは、１５の異なるＨＩＶペプチド応答［３人の患者においてサンプリングした５つのペプチド領域］の分析に基づいて、抗ＣＤ４０．ＨＩＶ５ｐｅｐワクチンが、広範囲のＨＩＶペプチド特異的ＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ応答の誘導について、抗ＤＣＩＲ．ＨＩＶ５ｐｅｐ、抗ＬＯＸ−１．ＨＩＶ５ｐｅｐ、及び非ＬＩＰＯ５ミックスより明らかに優れていることを示す。
可動性リンカー配列の免疫原性は、αＣＤ４０．ＬＩＰＯ５ ＨＩＶペプチドワクチンデザインについての関心事である。可動性リンカー配列内のエピトープに対する特異性を有するＴ細胞のリコールを試験する、上記に示す限られたデータセットは、これらの配列に対するヒトレパートリーが多様であることを示唆する。また、これらの配列が新たに応答を刺激する能力は試験していない。サルにおけるαＣＤ４０．ＬＩＰＯ５ ＨＩＶペプチドワクチンに対する応答は、本発明を使用して試験することができる。必要ならば、これらの領域内のある種の望ましくないエピトープは、予測的な計算手段及びペプチド刺激の精査の組合せによって同定することができ、次いで、ＴＣＲ相互作用を抑止する突然変異を導入することによって排除することができる。
抗ＣＤ４０結合分子は、以下のアミノ酸配列（配列番号３８）を有する軽鎖を含む。抗体軽鎖の可変領域に下線を引き、ＣＤＲは、太字とする（それぞれ、配列番号４１、４２、及び４３）。


抗ＣＤ４０結合分子は、以下の配列を有する重鎖を含む。抗体重鎖の可変領域に下線を引き、ＣＤＲは、太字とする（それぞれ配列番号４４、４５、及び４６）。

一態様では、軽鎖をコードする核酸は、配列番号４０を含む。抗体軽鎖核酸配列の可変領域に下線を引き、ＣＤＲは、太字とする。

。
一態様では、重鎖をコードする核酸は、配列番号１６２を含む。抗体重鎖核酸配列の可変領域に下線を引き、ＣＤＲは、太字とする。

。
ヒト化抗体は、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、重鎖及び軽鎖可変領域のフレームワーク領域は、ドナーヒト抗体に由来し、軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）は、アミノ酸配列SASQGISNYLN（配列番号４１）を有するＣＤＲ１Ｌ、アミノ酸配列YTSILHS（配列番号４２）を有するＣＤＲ２Ｌ、及びアミノ酸配列QQFNKLPPT（配列番号４３）を有するＣＤＲ３Ｌに対して少なくとも８０％、９０％、９５％、又はそれよりも高い同一性を有し、重鎖相補性決定領域は、ＣＤＲ１Ｈ、ＣＤＲ２Ｈ、及びＣＤＲ３Ｈに対して少なくとも８０％、９０％、９５％、又はそれよりも高い同一性を含み、ＣＤＲ１Ｈは、アミノ酸配列GFTFSDYYMY（配列番号４４）を有し、ＣＤＲ２Ｈは、アミノ酸配列YINSGGGSTYYPDTVKG（配列番号４５）を有し、ＣＤＲ３Ｈは、アミノ酸配列RGLPFHAMDY（配列番号４６）を有する。例えば、ヒト化抗体は、配列番号３８のフレームワークに対して少なくとも９５％の同一性を有するＶＬフレームワーク及び配列番号３９のフレームワークに対して少なくとも９５％の同一性を有するＶＨフレームワークを含んでいてもよい。他の態様では、ドナーＣＤＲ配列は、抗ＣＤ４０＿１２Ｅ１２．３Ｆ３に由来し、さらに、抗体又はその断片は、ＣＤ４０に特異的に結合する。
前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、サイクリンＤ１、ＭＡＲＴ−１、インフルエンザウイルス核タンパク質（ＮＰ）、及びインフルエンザウイルス赤血球凝集素（Ｈ１Ｎ１、ＰＲ８）のＨＡ１サブユニット並びにペプチドスクリーニング
抗ＣＤ４０ ｍＡｂの内部移行。１×１０６ ＩＬ−４ＤＣは、非特異的結合をブロックするために３％ＢＳＡを含有するＰＢＳ中で３ｍｇ／ｍｌヒトガンマグロブリンと共に氷中で１時間インキュベートした。細胞に、Ａｌｅｘａ ５６８標識抗ＣＤ４０ ｍＡｂを氷上で３０分間適用した（すべて、非特異的ブロック中２０ｎｇ／ｍｌ最終濃度で）。次いで、細胞は、洗浄し、３７℃で、０〜９０分間の異なる時間、表面結合抗体を内部移行させた。内部移行の後に、細胞は、１％ＢＳＡ及び０．０５％アジ化ナトリウムを含有する氷冷ＰＢＳ（ＰＢＡ）を用いて２度洗浄し、４℃で一晩、ＰＢＳ中、氷冷１％メタノール不含ホルムアルデヒド（ＭＦＦ）中で固定した。細胞は、４℃で２０分間、０．５％サポニンを含有するＰＢＳ ３％ＢＳＡ（ＰＢＡＳ）中で浸透性にし、９６ウェル丸底ポリプロピレンマイクロタイタープレートに移入した。氷冷ＰＢＡＳを用いて２度洗浄した後に、細胞は、ＰＢＡＳ中３ｍｇ／ｍｌヒトガンマグロブリンと共に氷上で１時間インキュベートした。ＢＯＤＩＰＹ−ファロイジンをＰＢＡＳ中で希釈し、氷中で１時間、細胞と共にインキュベートした。細胞は、さらに、核対比染色として、ＴＯＰＲＯ−IIを用いて染色した。スライドは、Ｌｅｉｃａ ＳＰ１共焦点顕微鏡上で画像処理した。
細胞。細胞表面染色のためのモノクローナル抗体を、BD Biosciences（CA）から購入した。健常ドナーに由来する単球（１×１０６／ｍｌ）は、ＧＭ−ＣＳＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−４（５０ｎｇ／ｍｌ）又はＧＭ−ＣＳＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）、及びＩＦＮα（５００ユニット／ｍｌ）（Ｒ＆Ｄ、ＣＡ）を含有するＣｅｌｌｇｅｎｉｃｓ培地（フランス）中で培養した。ＩＦＮＤＣについては、細胞にＩＦＮα及びＧＭ−ＣＳＦを１日目に与えた。ＩＬ−４ＤＣについては、同量のサイトカインを、１日目及び３日目に培地に補足した。ＰＢＭＣは、密度勾配遠心分離法によってPercoll（商標）勾配（GE Healthcare社製、Buckinghamshire、UK）を使用して、バフィーコートから単離した。全ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞は、StemCellキット（CA）を使用することによって精製した。
ペプチド。前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、サイクリンＤ１、ＭＡＲＴ−１、インフルエンザウイルス核タンパク質（ＮＰ）、及びインフルエンザウイルス赤血球凝集素（Ｈ１Ｎ１、ＰＲ８）のＨＡ１サブユニットについての１５アミノ酸長（１１アミノ酸オーバーラップ）を合成した（Mimotopes）。
ＤＣ及びＴ細胞の共培養並びにサイトカイン発現。組換え融合タンパク質（抗ＣＤ４０−ＨＡ１、コントロールＩｇ−ＨＡ１、抗ＣＤ４０−ＰＳＡ、抗ＣＤ４０サイクリンＤ１、抗ＣＤ４０−ＭＡＲＴ−１、抗ＭＡＲＣＯ−ＭＡＲＴ−１、及びコントロールＩｇ−ＭＡＲＴ−１）をロードした５×１０３ ＤＣを、８日間、２×１０５ ＣＦＳＥ標識ＣＤ４＋Ｔ細胞と共に共培養した。増殖は、ＡＰＣを用いて標識した抗ＣＤ４抗体を用いて細胞を染色した後に、ＣＦＳＥ希釈液を測定することによって試験した。
細胞内ＩＦＮγの発現を測定するために、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ブレフェルジンＡの存在下において５時間、１〜５ｕＭの示すペプチドを用いて再刺激した。異なる実験では、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、３６時間、示すペプチドを用いて再刺激し、次いで、ＣＤ４＋Ｔ細胞によって分泌されたサイトカインは、Luminexによって測定した。
ＣＤ８＋Ｔ細胞は、２０ユニット／ｍｌ ＩＬ−２及び２０ユニット／ｍｌ ＩＬ−７の存在下において１０日間、ＤＣと共に共培養した。培養の１０日目に、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、抗ＣＤ８及び示すテトラマーを用いて染色した。
ＣＴＬアッセイ。培養の１０日目に、５時間の５１Ｃｒ放出アッセイを行った。Ｔ２細胞に、５１Ｃｒを最初に適用し、次いで、ＭＡＲＴ−１の１０ｕＭ ＨＬＡ−Ａ２エピトープ又はインフルエンザウイルスＭ１の１ｎＭエピトープを用いて標識した。ペプチドを有していないＴ２細胞は、コントロールとして使用した。３回の試料の平均値を計算し、特異的な溶解のパーセンテージは、以下の式を使用して決定した。特異的な溶解のパーセンテージ＝１００×（実験５１Ｃｒ放出−コントロール５１Ｃｒ放出）／（最大５１Ｃｒ放出−コントロール５１Ｃｒ放出）。最大の放出は、２．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００中の標的からの数を指す。
ヒトＣＤ４０に特異的なｍＡｂの調製。受容体外部ドメイン．ｈＩｇＧ（ヒトＩｇＧ１Ｆｃ）及びＡＰ（ヒト胎盤アルカリホスファターゼ）の融合タンパク質は、それぞれ、マウスを免疫し、ｍＡｂをスクリーニングするために産生した。ヒトＩｇＦｃ融合タンパク質のための哺乳動物ベクターは、記載されるように設計した［J. Immunol. 163: 1973-1983 (1999)］。受容体外部ドメイン．ＡＰタンパク質についての哺乳動物発現ベクターは、近位のインフレームXho I部位並びに遠位の６Ｃ末端Ｈｉｓ残基、その後に続くＴＧＡ終止コドン及びNot I部位を追加しながら、ＡＰ残基１３３〜１５８１（ｇｂ｜ＢＣ００９６４７｜）についてのｃＤＮＡを増幅するために、ＰＣＲを使用して生成した。このXho I−Not I断片を、上記の外部ドメイン．ＩｇＧベクター中のヒトＩｇＧ Ｆｃコード配列と交換した。融合タンパク質は、メーカーのプロトコールに従ってＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３発現系（Invitrogen社製、ＣＡ）を使用して産生した（１．３ｍｌ 293Fectin試薬／Ｌを用いる合計１ｍｇのプラスミドＤＮＡのトランスフェクション）。受容体外部ドメイン．ｈＩｇＧは、０．１Ｍグリシン、ｐＨ２．７を用いて溶出した、１ｍｌ HiTrapプロテインＡアフィニティークロマトグラフィー（GE Healthcare社製、ＣＡ）によって精製した。画分は、２Ｍ Trisを用いて中和し、次いで、ＰＢＳに対して透析した。
マウスｍＡｂは、従来の技術によって生成した。手短に言えば、６週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスは、Ｒｉｂｉアジュバントと共に２０μｇの受容体外部ドメイン．ｈＩｇＧＦｃ融合タンパク質を用いて、ｉ．ｐ．免疫し、次いで、１０日及び１５日後に２０μｇ抗原を用いてブーストした。３カ月後に、マウスは、脾臓を採取する３日前に再度ブーストした。最終のブーストの３〜４日後に、流入領域リンパ節（ＬＮ，lymph node）を採取した。脾臓に由来するＢ細胞又はＬＮ細胞を、ＳＰ２／Ｏ−Ａｇ １４細胞（ＡＴＣＣ）と融合した。ハイブリドーマ上清は、融合パートナーのみと比較して受容体外部ドメイン融合タンパク質に特異的な又はアルカリホスファターゼに融合された受容体外部ドメインに特異的なｍＡｂを分析するためにスクリーニングした［J. Immunol. 163: 1973-1983 (1999)］。次いで、陽性ウェルは、完全長受容体ｃＤＮＡをコードする発現プラスミドを用いて一時的にトランスフェクトした２９３Ｆ細胞を使用してＦＡＣＳにおいてスクリーニングした。選択されたハイブリドーマは、単細胞クローニングし、CELLineフラスコ（Integra社製、CA）中で増大させた。ハイブリドーマ上清は、等量の１．５Ｍグリシン、３Ｍ ＮａＣｌ、１×ＰＢＳ、ｐＨ７．８（結合緩衝液）と混合し、MabSelect樹脂（GE Healthcare社製、CA）（８００μｌ／５ｍｌ上清）に流した。樹脂は、結合緩衝液を用いて洗浄し、０．１Ｍグリシン、ｐＨ２．７を用いて溶出した。２Ｍ Trisを用いる中和の後に、ｍＡｂはＰＢＳに対して透析した。
組換えｍＡｂの発現及び精製。全ＲＮＡは、RNeasyキット（Qiagen社製、CA）を使用して、ハイブリドーマ細胞から調製し、供給された５’プライマー及び遺伝子特異的３’プライマー（ｍＩｇＧκ、５’ggatggtgggaagatggatacagttggtgcagcatc３’（配列番号４８）；ｍＩｇＧ２ａ、５’ccaggcatcctagagtcaccgaggagccagt３’）（配列番号４９）を使用して、ｃＤＮＡ合成及びＰＣＲ（ＳＭＡＲＴ ＲＡＣＥキット、BD Biosciences社製）に使用した。次いで、ＰＣＲ産物は、クローニングし（ｐＣＲ２．１ ＴＡキット、Invitrogen社製）、ＤＮＡ塩基配列決定（MC Lab、CA）によって特徴づけた。マウス重（Ｈ）及び軽（Ｌ）鎖可変（Ｖ）領域ｃＤＮＡの誘導配列を使用して、特異的なプライマーは、下流のヒトＩｇＧκ又はＩｇＧ４Ｈ領域をコードする発現ベクターの中にクローニングするために、側面に位置する制限部位を組み込みながら、シグナルペプチド及びＶ領域をＰＣＲ増幅するために使用した。キメラｍＶκ−ｈＩｇκの発現のためのベクターは、Xho I及びNot Iの部位が側面に位置する残基４０１〜７３１（ｇｉ｜６３１０１９３７｜）を増幅し、ｐＩＲＥＳ２−ＤｓＲｅｄ２（BD Biosciences社製）のXho I−Not Iの間にこれを挿入することによって構築した。ＰＣＲは、開始コドンからｍＡｂ Ｖκ領域を増幅するために使用し、Nhe I又はSpe I部位を、次いでＣＡＣＣを（例えばｇｉ｜７６７７９２９４｜の残基１２６）をコードする領域に追加し、遠位のXho I部位を追加した。次いで、ＰＣＲ断片は、上記のベクターのNhe I−Not Iの間にクローニングした。コントロールヒトＩｇＧκ配列は、ｇｉ｜４９２５７８８７｜残基２６〜８５及びｇｉ｜２１６６９４０２｜残基６７〜７０９に相当する。コントロールヒトＩｇＧ４Ｈベクターは、ジスルフィド結合を安定化し、残存性のＦｃＲ相互作用を抑止するＳ２２９Ｐ及びＬ２３６Ｅの置換を有するｇｉ｜１９６８４０７２｜の残基１２〜１４７３に相当し［J. Immunol. 164: 1925-1933 (2000)］、終止コドンの代わりに配列５’gctagctgattaattaa３’を追加しながらｐＩＲＥＳ２−ＤｓＲｅｄ２のBgl II及びNot I部位の間に挿入した。ＰＣＲは、開始コドンからｍＡｂ ＶＨ領域を増幅するために使用し、ＣＡＣＣ、次いでBgl II部位を、ｇｉ｜１９６８４０７２｜の残基４７３をコードする領域に追加した。次いで、ＰＣＲ断片は、上記のベクターのBgl II−Apa Iの間にクローニングした。
インフルエンザＨＡ１融合タンパク質の発現及び精製。インフルエンザＨＡ１抗原コード配列は、ＣｉｐＡタンパク質［クロストリジウム・サーモセラム（Clostridium. thermocellum）］ｇｉ｜４７９１２６｜残基１４７〜１６０が先行する、Ｐ３２１Ｌ変異を有し、６つのＣ末端Ｈｉｓ残基を有する赤血球凝集素［インフルエンザＡ型ウイルス（Ａ／プエルトリコ／８／３４（Ｈ１Ｎ１））］ｇｉ｜１２６５９９２７１｜残基１８〜３３１であり、組換え抗体ＨＡ１融合タンパク質（ｒＡｂ．ＨＡ１）をコードするためにＨ鎖ベクターNhe I及びNot I部位の間に挿入した。同様に、組換え抗体−ＰＳＡ融合タンパク質（ｒＡｂ．ＰＳＡ）は、近位の配列GCTAGCGATACAACAGAACCTGCAACACCTACAACACCTGTAACAACACCGACAACAACACTTCTAGCGC（配列番号５０）（Nhe I部位及びＣｉｐＡスペーサー）並びに遠位のNot I部位と共にｇｉ｜３４７８４８１２｜前立腺特異的抗原残基１０１〜８３２を同じＨ鎖ベクターの中に挿入することによってコードした。組換え抗体タンパク質は、ｈＦｃ融合タンパク質について上記に記載されるように、発現し、精製した。ある場合には、ｒＡｂ．抗原コード領域及び対応する軽鎖コード領域は、異なるcetHS-puro UCOEベクター（Millipore社製、CA）に移入した。前もって適応された血清なしの浮遊細胞系と組み合わせたＵＣＯＥベクターの使用により、大量のタンパク質の迅速な産生を可能にした［Cytotechnology 38, 43-46 (2002)］。GlutaMAX及びＨＴ培地（Invitrogen社製）を補足したCD-CHO中で成長させたＣＨＯ−Ｓ細胞を、５００ｍｌ Corning Ehrlenmyerフラスコ中にトランスフェクションの２４時間前に５×１０５ｍｌで接種し、１２５ｒｐｍで８％ＣＯ２中でインキュベートした。トランスフェクションの日に、少なくとも９５％の生存率を有する１．２×１０７細胞を、GlutaMAXを有するCD-CHO中に、１２５ｍｌフラスコ中３０ｍｌの最終容量まで追加した。０．６ｍｌのOptiPRO SFM（Invitrogen社製）中４８μｌのFreeStyle Max試薬（Invitrogen社製）は、２４μｇのSce I直線化軽鎖ベクター及び２４μｇのSce I直線化Ｈ鎖ベクターに緩やかに混合しながら追加し、混合し、０．６ｍｌのOptiPRO SFM中に滅菌濾過した。２０分後に、ＤＮＡ脂質複合体を、回旋しながら、１２５ｍｌ CHO-S培養フラスコにゆっくり追加した。細胞は、５μｇ／ｍｌのピューロマイシン（A.G. Scientific社製、CA）、２×GlutaMAX、及び０．２５×Pen/Strep（Invitrogen社製）を含有する、CHO-M5（Sigma社製、CHOキット１のC0363成分）とCD-CHOの３０ｍｌの混合培地溶液を追加する２４時間前にインキュベートした。２日目に、さらに５μｇ／ｍｌのピューロマイシンを培養物に直接追加し、トランスフェクション後６日から細胞生存率を経過観察しながら、約１０〜１４日、選択を進行させた。生細胞数が減少し、生存密度が約２〜３×１０６／ｍｌとなったら、細胞は、１Ｅ６／ｍｌで、新鮮な選択培地（２×GlutaMAX、０．２５×Pen/Strep、１０μｇ／ｍｌピューロマイシンを有するCD CHO-S＋CHO M5）に移入した。生存率が９０％超に到達した場合、凍結細胞ストックを調製した。細胞密度が２×１０６／ｍｌを超過したら、細胞は、５００ｍｌフラスコ中４×２５０ｍｌに調整するまで選択培地中で分けた。細胞生存率が、８０％未満に落ちた場合、上清を採取し、最大の最終細胞密度は約７×１０６／ｍｌであった。内毒素レベルは、０．２ユニット／ｍｌ未満であった。
組換えインフルエンザＭ１及びＭＡＲＴ−１タンパク質の発現及び精製。ＰＣＲは、開始コドンの遠位にNhe I部位及び終止コドンの遠位にNot I部位を組み込みながらインフルエンザＡ型／プエルトリコ／８／３４／シナイ山（Ｈ１Ｎ１）Ｍ１遺伝子のＯＲＦを増幅するために使用した。消化断片は、pET-28b(+)（Novagen社製）の中にクローニングし、Ｈｉｓ６タグと共にインフレームでＭ１ ＯＲＦを置き、したがってＨｉｓ．Ｆｌｕ Ｍ１タンパク質をコードした。Nco I及びNhe I部位の間に挿入されたＣ．サーモセラム（未公開）に由来するＮ末端１６９残基コヒーシンドメインをコードするpET28b(+)誘導体は、Ｃｏｈ．Ｈｉｓを発現した。コヒーシン−Ｆｌｅｘ−ｈＭＡＲＴ−１−ペプチドＡ−Ｈｉｓの発現について、配列GACACCACCGAGGCCCGCCACCCCCACCCCCCCGTGACCACCCCCACCACCACCGACCGGAAGGGCACCACCGCCGAGGAGCTGGCCGGCATCGGCATCCTGACCGTGATCCTGGGCGGCAAGCGGACCAACAACAGCACCCCCACCAAGGGCGAATTCTGCAGATATCCATCACACTGGCGGCCG（配列番号５１）（DTTEARHPHPPVTTPTTDRKGTTAEELAGIGILTVILGGKRTNNSTPTKGEFCRYPSHWRP（配列番号５２）をコードするイタリック体の残基は、免疫優性ＨＬＡ−Ａ２拘束性ペプチドであり、ペプチドを囲む下線を引いた残基は、ＭＡＲＴ−１に由来する）は、上記のベクターのNhe I及びXho I部位の間に挿入した。タンパク質は、大腸菌（E. coli）株ＢＬ２１（ＤＥ３）（Novagen社製）又はT7 Express（NEB社製）中で発現させ、１２０ｍｇ／Ｌ IPTGを追加したら、カナマイシン抵抗性（４０μｇ／ｍｌ）について選択し、２００回／分で振盪しながら、対数増殖期中期まで３７℃でＬＢ中で成長させた。３時間後に、細胞は、遠心分離によって採取し、−８０℃で保存した。それぞれの１Ｌの発酵に由来する大腸菌細胞は、０．１ｍｌのプロテアーゼ阻害剤Cocktail II（Calbiochem社製、CA）と共に、３０ｍｌ 氷冷５０ｍＭ Tris、１ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０（緩衝液Ｂ）中で再懸濁した。細胞は、５分間の休み時間と共に、設定１８（Fisher Sonic Dismembrator 60）で２×５分間、氷上で超音波処理し、次いで、４℃で２０分間、１７，０００ｒ．ｐ．ｍ．（Sorvall SA-600）で回転させた。Ｈｉｓ．Ｆｌｕ Ｍ１精製については、５０ｍｌ細胞溶解物上清画分は、５ｍｌ Q Sepharoseビーズを通過させ、６．２５ｍｌ １６０ｍＭ Tris、４０ｍＭイミダゾール、４Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ７．９を、Q Sepharose通過画分に追加した。これは、Ｎｉ＋＋を用いて荷電した５ｍｌ HiTrapキレート化ＨＰカラム上に４ｍｌ／分でロードした。カラムに結合したタンパク質は、２０ｍＭ ＮａＰＯ４、３００ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．６（緩衝液Ｄ）を用いて洗浄し、１００ｍＭ Ｈ３ＣＯＯＮａ ｐＨ４．０を用いてさらに洗浄した。結合したタンパク質は、１００ｍＭ Ｈ３ＣＯＯＮａ ｐＨ４．０を用いて溶出した。ピーク画分は、プールし、１００ｍＭ Ｈ３ＣＯＯＮａ ｐＨ５．５を用いて平衡化した５ｍｌ HiTrap Ｓカラム上に４ｍｌ／分でロードし、平衡緩衝液を用いて洗浄し、その後、５０ｍＭ ＮａＰＯ４ ｐＨ５．５中０〜１Ｍ ＮａＣｌの勾配を用いて溶出した。約５００ｍＭ ＮａＣｌで溶出するピーク画分をプールした。Ｃｏｈ．Ｆｌｕ Ｍ１．Ｈｉｓ精製については、２Ｌの培養物に由来する細胞を上記のように溶解した。遠心分離後に、２．５ｍｌ Triton X114は、５分間氷上でインキュベーションしながら上清に追加した。５分間の２５℃でのさらなるインキュベーションの後に、上清は、２５℃での遠心分離後にTriton X114から分離した。抽出は、反復し、上清は、５ｍｌのQ Sepharoseビーズを通過させ、６．２５ｍｌ １６０ｍＭ Tris、４０ｍＭイミダゾール、４Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ７．９を、Q Sepharose通過画分に追加した。次いで、タンパク質は、上記に記載されるようにＮｉ＋＋キレート化クロマトグラフィーによって精製し、緩衝液Ｄ中０〜５００ｍＭイミダゾールを用いて溶出した。
図１３は、抗ＣＤ４０ ｍＡｂ：ＩＬ−４ＤＣの内部移行を示す。ＩＬ−４ＤＣは、５００ｎｇ／ｍｌの抗ＣＤ４０−Ａｌｅｘａ ５６８と共に処理した。
図１４は、抗ＣＤ４０−ＨＡ１を用いてターゲティングしたＤＣによるＣＤ４及びＣＤ８ Ｔ細胞増殖を示す。２ｕｇ／ｍｌの抗ＣＤ４０−ＨＡ又はコントロールＩｇ−ＨＡ１をロードした５×１０ｅ３ ＩＦＮＤＣは、７日間、ＣＦＳＥ標識自己由来ＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞（２×１０ｅ５）と共に共培養した。次いで、細胞は、抗ＣＤ４抗体又は抗ＣＤ８抗体を用いて染色した。細胞増殖は、ＣＦＳＥ希釈液を測定することによって試験した。
図１５は、ＣＤ４＋Ｔ増殖に対するＨＡ１融合タンパク質の力価測定を示す。融合タンパク質をロードしたＩＦＮＤＣ（５Ｋ）は、７日間、ＣＦＳＥ標識ＣＤ４＋Ｔ細胞（２００Ｋ）と共に共培養した。
図１６は、抗ＣＤ４０−ＨＡ１を用いてターゲティングしたＩＦＮＤＣがＨＡ１特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞を活性化することを示す。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、５ｕＭの示されるペプチドをロードしたＤＣを用いて再度刺激し、次いで、細胞内ＩＦＮγを染色した。
図１７は、抗ＣＤ４０−ＨＡ１を用いてターゲティングしたＩＦＮＤＣがＨＡ１特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞を活性化することを示す。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、３６時間、示されるペプチドをロードしたＤＣを用いて再度刺激し、次いで、培養上清は、ＩＦＮγの測定のために分析した。
図１８は、ＣＤ４０のターゲティングが、ＭＡＲＴ−１特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞へのクロスプライミングの増強をもたらすことを示す。融合タンパク質をロードしたＩＦＮＤＣ（５Ｋ／ウェル）は、１０日間、精製ＣＤ８＋Ｔ細胞と共に共培養した。細胞は、抗ＣＤ８及びテトラマーを用いて染色した。細胞は、健常ドナーに由来する（ＨＬＡ−Ａ＊０２０１＋）。
図１９は、ＣＤ４０のターゲティングが、ＭＡＲＴ−１特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞へのクロスプライミングの増強をもたらすことを示す（異なる健常ドナーに由来する細胞を使用する８回の反復実験の概要）。
図２０は、抗ＣＤ４０−ＭＡＲＴ−１を用いてターゲティングしたＩＦＮＤＣを用いて誘導されたＣＤ８＋ＣＴＬが機能的であることを示す。融合タンパク質を用いてターゲティングしたＩＦＮＤＣと共に共培養したＣＤ８＋Ｔ細胞は、１０ｕＭペプチドエピトープをロードしたＴ２細胞と混合した。
図２１は、抗ＣＤ４０−Ｆｌｕ Ｍ１を用いてターゲティングしたＩＦＮＤＣを用いて誘導されたＣＤ８＋ＣＴＬが機能的であることを示す。融合タンパク質を用いてターゲティングしたＩＦＮＤＣと共に共培養したＣＤ８＋Ｔ細胞は、１．０ｎＭペプチドエピトープをロードしたＴ２細胞と混合した。
図２２は、ＰＳＡ（前立腺特異的抗原）に連結された抗ＣＤ４０１２Ｅ１２から構成されるワクチンが、ナイーブＴ細胞集団からの増大を誘導する能力を試験するためのプロトコールの概略を示す。ＰＳＡ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＰＳＡエピトープの広範囲のアレイに相当する。手短に言えば、健常ドナーに由来する単球のＩＦＮα及びＧＭ−ＣＳＦを用いる培養に由来するＤＣをワクチンと共にインキュベートする。翌日、細胞を、新鮮な培地中に置き、同じドナーに由来する純粋なＣＤ４＋Ｔ細胞を追加する。数日後に、ＰＳＡペプチドを追加し、４時間後に、培養上清中に分泌されたγＩＦＮレベルを決定する。
図２３は、多くのＰＳＡペプチドが、強力なγＩＦＮ産生応答を誘導し、抗ＣＤ４０１２Ｅ１２及び類似する抗ＣＤ４０作用物質が、抗原をＤＣに効率的にデリバリーすることができることを示し、抗原の多数のエピトープに対する免疫応答のプライミングをもたらすことを示す。ＰＳＡの抗原のペプチドマッピング。２ｕｇ／ｍｌの抗ＣＤ４０−ＰＳＡをロードした５×１０ｅ３ ＩＦＮＤＣは、８日間、精製自己由来ＣＤ４＋Ｔ細胞（２×１０ｅ５）と共に共培養した。次いで、細胞は、３６時間、ＰＳＡに由来する、５ｕＭの個々のペプチドを用いて再刺激した。ＩＦＮγの量は、Luminexによって測定した。細胞
は、健常ドナーに由来する。
図２４は、抗ＣＤ４０−ＰＳＡを用いてターゲティングされたＤＣが、ＰＳＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘導することを示す。ＩＦＮＤＣは、ＰＳＡを有する１ｕｇ ｍＡｂ融合タンパク質を用いてターゲティングした。精製自己由来ＣＤ８＋Ｔ細胞を１０日間、共培養した。細胞は、抗ＣＤ８及びＰＳＡ（KLQCVDLHV）−テトラマーを用いて染色した。細胞は、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１陽性健常ドナーに由来する。結果により、抗ＣＤ４０がＰＳＡをＤＣに有効にデリバリーし、これは、次に、ＰＳＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の増大を誘導することが実証される。手短に言えば、２ｕｇ／ｍｌの抗ＣＤ４０−ＰＳＡをロードした５×１０ｅ３ ＩＦＮＤＣは、１０日間、精製自己由来ＣＤ８＋Ｔ細胞（２×１０ｅ５）と共に共培養した。次いで、細胞は、テトラマーを用いて染色した。細胞は、ＨＬＡ−０＊２０１陽性健常ドナーに由来する。
図２５は、スキーム（左）並びにドナー２についてのペプチドのプール及びコントロールのＴ細胞によるＩＦＮγ産生を示す。２ｕｇ／ｍｌの抗ＣＤ４０サイクリンＤ１をロードした５×１０ｅ３ ＩＦＮＤＣは、８日間、精製自己由来ＣＤ４＋Ｔ細胞（２×１０ｅ５）と共に共培養した。次いで、細胞は、ブレフェルジンＡの存在下において、５時間、サイクリンＤ１に由来する５ｕＭの個々のペプチドを用いて再度刺激した。細胞は、細胞内ＩＦＮγ発現を測定するために染色した。
図２６は、ペプチドの精査並びにドナー２についての図２５において示されるペプチドのプール及びコントロールから得られたＴ細胞によるＩＦＮγ産生を示す。２ｕｇ／ｍｌの抗ＣＤ４０サイクリンＤ１をロードした５×１０ｅ３ ＩＦＮＤＣは、８日間、精製自己由来ＣＤ４＋Ｔ細胞（２×１０ｅ５）と共に共培養した。次いで、細胞は、ブレフェルジンＡの存在下において、５時間、サイクリンＤ１に由来する５ｕＭの個々のペプチドを用いて再度刺激した。細胞は、細胞内ＩＦＮγ発現を測定するために染色した。
結論として、ＣＤ４０を介して、最も強力な抗原提示細胞であるＤＣに抗原をデリバリーすることは、抗原特異的ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞媒介性免疫の両方を誘導し、且つ活性化するための効率的な方法である。したがって、抗ＣＤ４０ ｍＡｂから作製されたワクチンは、癌及び感染症に対して強力な免疫を誘導するであろう。
ペプチド情報：
ＨＡ１配列：
MKANLLVLLCALAAADADTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLEDSHNGKLCR (配列番号５３)
LKGIAPLQLGKCNIAGWLLGNPECDPLLPVRSWSYIVETPNSENGICYPGDFIDYEELRE (配列番号５４)
QLSSVSSFERFEIFPKESSWPNHNTNGVTAACSHEGKSSFYRNLLWLTEKEGSYPKLKNS (配列番号５５)
YVNKKGKEVLVLWGIHHPPNSKEQQNLYQNENAYVSVVTSNYNRRFTPEIAERPKVRDQA (配列番号５６)
GRMNYYWTLLKPGDTIIFEANGNLIAPMYAFALSRGFGSGIITSNASMHECNTKCQTPLG (配列番号５７)
AINSSLPYQNIHPVTIGECPKYVRSAKLRMVTGLRNIPSI (配列番号５８)
図１７中のペプチドの配列
ペプチド２２: SSFERFEIFPKESSWPN (配列番号５９)
ペプチド４５: GNLIAPWYAFALSRGFG (配列番号６０)
ペプチド４６: WYAFALSRGFGSGIITS (配列番号６１)
ＮＰ配列：
MASQGTKRSYEQMETDGERQNATEIRASVGKMIGGIGRFYIQMCTELKLSDYEGRLIQNS (配列番号６２)
LTIERMVLSAFDERRNKYLEEHPSAGKDPKKTGGPIYRRVNGKWMRELILYDKEEIRRIW (配列番号６３)
RQANNGDDATAGLTHMMIWHSNLNDATYQRTRALVRTGMDPRMCSLMQGSTLPRRSGAAG (配列番号６４)
AAVKGVGTMVMELVRMIKRGINDRNFWRGENGRKTRIAYERMCNILKGKFQTAAQKAMMD (配列番号６５)
QVRESRNPGNAEFEDLTFLARSALILRGSVAHKSCLPACVYGPAVASGYDFEREGYSLVG (配列番号６６)
IDPFRLLQNSQVYSLIRPNENPAHKSQLVWMACHSAAFEDLRVLSFIKGTKVLPRGKLST (配列番号６７)
RGVQIASNENMETMESSTLELRSRYWAIRTRSGGNTNQQRASAGQISIQPTFSVQRNLPF (配列番号６８)
DRTTIMAAFNGNTEGRTSDMRTEIIRMMESARPEDVSFQGRGVFELSDEKAASPIVPSFD (配列番号６９)
MSNEGSYFFGDNAEEYDN (配列番号７０)
図２３中のペプチドの配列
ペプチド２２: GKWVRELVLYDKEEIRR (配列番号７１)
ペプチド３３: RTGMDPRMCSLMQGSTL (配列番号７２)
ペプチド４６: MCNILKGKFQTAAQKAM (配列番号７３)
前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）配列
MWVPVVFLTLSVTWIGAAPLILSRIVGGWECEKHSQPWQVLVASRGRAVCGGVLVHPQWV (配列番号７４)
LTAAHCIRNKSVILLGRHSLFHPEDTGQVFQVSHSFPHPLYDMSLLKNRFLRPGDDSSHD (配列番号７５)
LMLLRLSEPAELTDAVKVMDLPTQEPALGTTCYASGWGSIEPEEFLTPKKLQCVDLHVIS (配列番号７６)
NDVCAQVHPQKVTKFMLCAGRWTGGKSTCSGDSGGPLVCNGVLQGITSWGSEPCALPERP (配列番号７７)
SLYTKVVHYRKWIKDTIVANP (配列番号７８)
図２３中のペプチドの配列
ペプチド１: APLILSRIVGGWECE (配列番号７９)
ペプチド４:ECEKHSQPWQVLVAS (配列番号８０)
ペプチド２５:GDDSSHDLMLLRLSE (配列番号８１)
ペプチド２６: SHDLMLLRLSEPAEL (配列番号８２)
ペプチド４９: SGDSGGPLVCNGVLQ (配列番号８３)
ペプチド５４: GSEPCALPERPSLYT (配列番号８４)
ペプチド５６: ERPSLYTKVVHYRKW (配列番号８５)
ペプチド５８: VVHYRKWIKDTIVAN (配列番号８６)
サイクリンＤ１配列
MRSYRFSDYLHMSVSFSNDMDLFCGEDSGVFSGESTVDFSSSEVDSWPGDSIACFIEDER (配列番号８７)
HFVPGHDYLSRFQTRSLDASAREDSVAWILKVQAYYNFQPLTAYLAVNYMDRFLYARRLP (配列番号８８)
ETSGWPMQLLAVACLSLAAKMEEILVPSLFDFQVAGVKYLFEAKTIKRMELLVLSVLDWR (配列番号８９)
LRSVTPFDFISFFAYKIDPSGTFLGFFISHATEIILSNIKEASFLEYWPSSIAAAAILCV (配列番号９０)
ANELPSLSSVVNPHESPETWCDGLSKEKIVRCYRLMKAMAIENNRLNTPKVIAKLRVSVR (配列番号９１)
ASSTLTRPSDESSFSSSSPCKRRKLSGYSWVGDETSTSN (配列番号９２)
図２６中のペプチドの配列
ペプチド７: DRVLRAMLKAEETCA (配列番号９３)
ペプチド８: RAMLKAEETCAPSVS (配列番号９４)
ペプチド１０: TCAPSVSYFKCVQKE (配列番号９５)
ＭＡＲＴ−１抗原。ＭＡＲＴ−１は、腫瘍関連メラニン細胞分化抗原である。ＭＡＲＴ−１抗原を用いるワクチン接種は、メラニン細胞分化抗原を発現する腫瘍細胞に対して宿主細胞傷害性Ｔ細胞応答を刺激し、腫瘍細胞溶解をもたらし得る。
図２７は、抗ＣＤ４０−ＭＡＲＴ−１ペプチド抗体の発現及び構築物のデザインを示す。図２８は、ＭＡＲＴ−１についてのＣＤ４＋及びＣＤ８＋免疫優性エピトープの概要を示す。図２７及び２８は、ヒトＭＡＲＴ−１のかなりの（約２／３）部分に融合された組換え抗ＤＣ受容体ターゲティング抗体発現の成功を可能にするための可動性リンカー技術の使用を示す。全ＭＡＲＴ−１コード領域に対してＨ鎖Ｃ末端で融合された組換え抗体は、産生哺乳動物細胞から全く分泌されなかった［示さず］。Ｆｌｅｘ−ｖ１−ｈＭＡＲＴ−１−Ｐｅｐ−３−ｆ４−Ｐｅｐ−１付加物は、特に十分に発現し、最大負荷のＭＡＲＴ−１エピトープを運ぶＦｌｅｘ−ｖ１−ｈＭＡＲＴ−１−Ｐｅｐ−３−ｆ４−Ｐｅｐ−１−ｆ３−Ｐｅｐ−２付加物のように、ＭＡＲＴ−１−ターゲティングワクチンの好ましい一実施形態となる。スライド２及びＭＡＲＴ−１パワーポイントプレゼンテーションは、多数の抗ＤＣ受容体媒体にこれらの付加物を上手く追加することができることを示す。
下記の配列は、Ｈ鎖−ｐｅｐ３−ｐｅｐ１−ｐｅｐ２融合タンパク質のｈＭＡＲＴ−１ペプチドストリングであり、それぞれのｈＭＡＲＴ１ペプチド配列［太字イタリック体］は、ペプチド間スペーサーｆによって隔てられる［太字で示す］。この場合、セルロソームアンカースキャフォルディンＢ前駆物質［バクテロイデス・セルロソルベンス、ｇａｇ−ｎｅｆワクチンの本発明開示において記載される］に由来する２７アミノ酸長リンカーｆｌｅｘ−ｖ１（ｖ１）［イタリック体］は、Ｈ鎖Ｃ末端及びｈＭＡＲＴ１ペプチド可動性スペースストリングの間に挿入した。下線を引いたＡＳ残基は、結合配列である。
［ｍａｎｔｉ−ＣＤ４０＿１２Ｅ１２．３Ｆ３＿Ｈ−ＬＶ−ｈＩｇＧ４Ｈ−Ｃ−Ｆｌｅｘ−ｖ１−ｈＭＡＲＴ−１−Ｐｅｐ−３−ｆ４−Ｐｅｐ−１］Ｃ９８１：
［ｍａｎｔｉ−ＣＤ４０＿１２Ｅ１２．３Ｆ３＿Ｈ−ＬＶ−ｈＩｇＧ４Ｈ−Ｃ−Ｆｌｅｘ−ｖ１−ｈＭＡＲＴ−１−Ｐｅｐ−３−ｆ４−Ｐｅｐ−１−ｆ３−Ｐｅｐ−２］Ｃ９７８：
［ｍＡｎｔｉ−ＤＣＩＲ＿９Ｅ８＿Ｈ−ＬＶ−ｈＩｇＧ４Ｈ−Ｃ−Ｆｌｅｘ−ｖ１−ｈＭＡＲＴ−１−Ｐｅｐ−３−ｆ４−Ｐｅｐ−１］Ｃ１０１２：
［ｍＡｎｔｉ−ＤＣＩＲ＿９Ｅ８＿Ｈ−ＬＶ−ｈＩｇＧ４Ｈ−Ｃ−Ｆｌｅｘ−ｖ１−ｈＭＡＲＴ−１−Ｐｅｐ−３−ｆ４−Ｐｅｐ−１−ｆ３−Ｐｅｐ−２］Ｃ１０１３：
ＭＡＲＴ−１ ＤＮＡ配列：
３つのペプチド、開始／終止部位を有するＭＡＲＴ−１構築物に下線を引き、ペプチド１は太字とし、ペプチド２は太字イタリック体とし、ペプチド３は太字で下線を引く。

ペプチド３は太字とし、下線を引いたＦｌｅｘ−４アミノ酸配列が続く。

ペプチド１は太字とし、下線を引いたＦｌｅｘ−３アミノ酸配列が続く。

ペプチド３は太字とする。

ＭＡＲＴ１−ペプチド３、イタリック体の部分はＣＤ４＋免疫優性エピトープである。
Flex-4
ASTNGSITVAATAPTVTPTVNATPSAAAS (配列番号１０５)
ＭＡＲＴ１−ペプチド１、イタリック体の部分は、ＣＤ４＋免疫優性エピトープであり、下線を引いたイタリック体の部分は、ＣＤ８＋免疫優性エピトープである。

Flex-3: ASTVTPTATATPSAIVTTITPTATTKPAS (配列番号１０７)
ＭＡＲＴ１−ペプチド２、イタリック体の部分は、ＣＤ４＋免疫優性エピトープである。
２つのペプチドを有するＭＡＲＴ１構築物：
ペプチド３は、太字イタリック体で下線を引き、ｆｌｅｘ−４は太字とし、ペプチド１は、太字イタリック体で下線を引く。
タンパク質配列：Ｃ９７８。ｒＡＢ−ｃｅｔＨＳ−ｐｕｒｏ［ｍａｎｔｉ−ＣＤ４０＿１２Ｅ１２．３Ｆ３＿Ｈ−ＬＶ−ｈＩｇＧ４Ｈ−Ｃ−Ｆｌｅｘ−ｖ１−ｈＭＡＲＴ−１−Ｐｅｐ−３（太字イタリック体で下線を引く）−ｆ４（太字）−Ｐｅｐ−１（太字イタリック体）−ｆ３ （イタリック体）−Ｐｅｐ−２（太字で下線を引く）］
タンパク質配列：Ｃ９８１。ｒＡＢ−ｃｅｔＨＳ−ｐｕｒｏ［ｍａｎｔｉ−ＣＤ４０＿１２Ｅ１２．３Ｆ３＿Ｈ−ＬＶ−ｈＩｇＧ４Ｈ−Ｃ−Ｆｌｅｘ−ｖ１−ｈＭＡＲＴ−１−Ｐｅｐ−３（太字イタリック体で下線を引く）−ｆ４−（太字）−Ｐｅｐ−１］（太字で下線を引く）
ＧＰ１００抗原。ＧＰ１００抗原は黒色腫関連抗原である。ワクチン製剤で投与された場合、ｇｐ１００抗原は、この抗原を発現する腫瘍に対して細胞毒性Ｔ細胞ＨＬＡ−Ａ２．１拘束性免疫応答を刺激し、これにより、腫瘍サイズの低下がもたらされ得る。
組換え抗体Ｈ鎖コード領域に融合されたＧＰ１００外部ドメインコード領域は、産生哺乳動物細胞によって全く分泌されなかった［示さず］。全配列を下記に示す。イタリック体の残基は、リーダー配列及び膜貫通ドメインであり、ペプチドは、太字イタリック体とし、膜貫通ドメインは、イタリック体で下線を引く。
知られているＨＬＡ−Ａ０２０１拘束性ペプチド配列は、
GP100 M: 209-217 (2M): IMDQVPFSV (配列番号１１３); 209-217 WT: ITDQVPFSV (配列番号１１４) GP100 M: 280-288 (9V): YLEPGPVTV (配列番号１１５) 280-288 WT: YLEPGPVTA (配列番号１１６) GP100 WT: 154-162: KTWGQYWQV (配列番号１１７)
である。
図２９〜３３は、分泌抗ＤＣ受容体ターゲティングワクチンとして発現が成功したｇｐ１００付加物を示す。これらは、可動性リンカー配列及びｇｐ１００外部ドメインコード領域の断片化及びシャフリングを用いた。ｇｐ１００ワクチン付加物の好ましい実施形態を記載する。
図２９は、抗ＣＤ４０ｇｐ１００ペプチド抗体の発現及び構築物のデザインを示す。図３０は、さらなる抗ＣＤ４０ｇｐ１００ペプチド抗体のデザインを示す。図３１は、さらなる抗ＣＤ４０ｇｐ１００ペプチド抗体の発現及び構築物のデザインを示す。図３２は、ｇｐ１００についてのＣＤ４＋及びＣＤ８＋免疫優性エピトープの概要を示す。図３３は、さらなる抗ＣＤ４０ｇｐ１００ペプチド抗体の発現及び構築物のデザインを示す。
ｒＡＢ−ｃｅｔＨＳ−ｐｕｒｏ［ｍａｎｔｉ−ＣＤ４０＿１２Ｅ１２．３Ｆ３＿Ｈ−ＬＶ−ｈＩｇＧ４Ｈ−Ｃ−Ｆｌｅｘ−ｈｇｐ１００−Ｐｅｐ−１−ｆ４−Ｐｅｐ−３−ｆ３−Ｐｅｐ−４−ｆ４−Ｐｅｐ−５−ｆ３−Ｐｅｐ−２］Ｃ１２８５、ペプチドは、太字イタリック体とし、可動性リンカーは、太字とし、下線を引いたＡＳ残基は、結合配列である。
ｒＡＢ−ｃｅｔＨＳ−ｐｕｒｏ［ｈＩｇＧ４Ｈ−Ｃ−Ｆｌｅｘ−ｈｇｐ１００−Ｐｅｐ−１−ｆ４−Ｐｅｐ−３−ｆ３−Ｐｅｐ−４−ｆ４−Ｐｅｐ−５−ｆ３−Ｐｅｐ−２］Ｃ１２８６：
ｇｐ１００：−核酸配列。ペプチド１−下線を引く、ペプチド２−イタリック体、ペプチド３−太字、ペプチド４−太字で下線を引く、ペプチド５ 太字イタリック体。
ＧＰ１００ ペプチド１−核酸配列。
GATACAACAGAACCTGCAACACCTACAACACCTGTAACAACACCGACAACAACAAAAGTACCCAGAAACCAGGACTGGCTTGGTGTCTCAAGGCAACTCAGAACCAAAGCCTGGAACAGGCAGCTGTATCCAGAGTGGACAGAAGCCCAGAGACTTGACTGCTGGAGAGGTGGTCAAGTGTCCCTCAAGGTCAGTAATGATGGGCCTACACTGATTGGTGCAAATGCCTCCTTCTCTATTGCCTTGAACTTCCCTGGAAGCCAAAAGGTATTGCCAGATGGGCAGGTTATCTGGGTCAACAATACCATCATCAATGGGAGCCAGGTGTGGGGAGGACAGCCAGTGTATCCCCAGGAAACTGACGATGCCTGCATCTTCCCTGATGGTGGACCTTGCCCATCTGGCTCTTGGTCTCAGAAGAGAAGCTTTGTTTATGTCTGGAAGACCTGGGGCCAATACTGGCAAGTTCTAGGGGGCCCAGTGTCTGGGCTGAGCATTGGGACAGGCAGGGCAATGCTGGGCACACACACCATGGAAGTGACTGTCTACCATCGCCGGGGATCCCAGAGCTATGTGCCTCTTGCTCATTCCAGCTCAGCCTTCACCATTACTGACCAGGTGCCTTTCTCCGTGAGCGTGTCCCAGTTGCGGGCCTTGGATGGAGGGAACAAGCACTTCCTGAGAAATCAG (配列番号１２１)
タンパク質配列：
DTTEPATPTTPVTTPTTTKVPRNQDWLGVSRQLRTKAWNRQLYPEWTEAQRLDCWRGGQVSLKVSNDGPTLIGANASFSIALNFPGSQKVLPDGQVIWVNNTIINGSQVWGGQPVYPQETDDACIFPDGGPCPSGSWSQKRSFVYVWKTWGQYWQVLGGPVSGLSIGTGRAMLGTHTMEVTVYHRRGSQSYVPLAHSSSAFTITDQVPFSVSVSQLRALDGGNKHFLRNQ (配列番号１２２)
ＧＰ１００−ペプチド３
GGCACCACAGATGGGCACAGGCCAACTGCAGAGGCCCCTAACACCACAGCTGGCCAAGTGCCTACTACAGAAGTTGTGGGTACTACACCTGGTCAGGCGCCAACTGCAGAGCCCTCTGGAACCACATCTGTGCAGGTGCCAACCACTGAAGTCATAAGCACTGCACCTGTGCAGATGCCAACTGCAGAGAGCACAGGTATGACACCTGAGAAGGTGCCAGTTTCAGAGGTCATGGGTACCACACTGGCAGAGATGTCAACTCCAGAGGCTACAGGTATGACACCTGCAGAGGTATCAATTGTGGTGCTTTCTGGAACCACAGCTGCA (配列番号１２３)
タンパク質配列：
GTTDGHRPTAEAPNTTAGQVPTTEVVGTTPGQAPTAEPSGTTSVQVPTTEVISTAPVQMPTAESTGMTPEKVPVSEVMGTTLAEMSTPEATGMTPAEVSIVVLSGTTAA (配列番号１２４)
ＧＰ１００−ペプチド４：
CAGGTAACAACTACAGAGTGGGTGGAGACCACAGCTAGAGAGCTACCTATCCCTGAGCCTGAAGGTCCAGATGCCAGCTCAATCATGTCTACGGAAAGTATTACAGGTTCCCTGGGCCCCCTGCTGGATGGTACAGCCACCTTAAGGCTGGTGAAGAGACAAGTCCCCCTGGATTGTGTTCTGTATCGATATGGTTCCTTTTCCGTCACCCTGGACATTGTCCAG (配列番号１２５)
タンパク質配列：
QVTTTEWVETTARELPIPEPEGPDASSIMSTESITGSLGPLLDGTATLRLVKRQVPLDCVLYRYGSFSVTLDIVQ (配列番号１２６)
ＧＰ１００−ペプチド５
GGTATTGAAAGTGCCGAGATCCTGCAGGCTGTGCCGTCCGGTGAGGGGGATGCATTTGAGCTGACTGTGTCCTGCCAAGGCGGGCTGCCCAAGGAAGCCTGCATGGAGATCTCATCGCCAGGGTGCCAGCCCCCTGCCCAGCGGCTGTGCCAGCCTGTGCTACCCAGCCCAGCCTGCCAGCTGGTTCTGCACCAGATACTGAAGGGTGGCTCGGGGACATACTGCCTCAATGTGTCTCTGGCTGATACCAACAGCCTGGCAGTGGTCAGCACCCAGCTTATCGTGCCTGGGATTCTTCTCACAGGTCAAGAAGCAGGCCTTGGGCAG (配列番号１２７)
タンパク質配列：
GIESAEILQAVPSGEGDAFELTVSCQGGLPKEACMEISSPGCQPPAQRLCQPVLPSPACQLVLHQILKGGSGTYCLNVSLADTNSLAVVSTQLIVPGILLTGQEAGLGQ (配列番号１２８)
ＧＰ１００−ペプチド２
CCTCTGACCTTTGCCCTCCAGCTCCATGACCCTAGTGGCTATCTGGCTGAAGCTGACCTCTCCTACACCTGGGACTTTGGAGACAGTAGTGGAACCCTGATCTCTCGGGCACYTGTGGTCACTCATACTTACCTGGAGCCTGGCCCAGTCACTGCCCAGGTGGTCCTGCAGGCTGCCATTCCTCTCACCTCCTGTGGCTCCTCCCCAGTTCCAGCTAGC (配列番号１２９)
タンパク質配列：
PLTFALQLHDPSGYLAEADLSYTWDFGDSSGTLISRAXVVTHTYLEPGPVTAQVVLQAAIPLTSCGSSPVPAS（配列番号１３０）
サイクリンＢ１抗原。ＣＣＮＢ１としても知られているサイクリンＢ１は、有糸分裂に関与する調節タンパク質をコードするヒト遺伝子である。サイクリンＢ１は、ｐ３４（ｃｄｃ２）と複合体を形成して、成熟促進因子（ＭＰＦ）を形成する。別の転写開始部位の結果である、別の２つの転写物が知られている。第１の転写物は、恒常的に発現される転写物をコードする。第２の転写物は、Ｇ２／Ｍ期に主に発現される細胞周期調節性転写物である。
図３４Ａ及び３４Ｂは、抗体Ｈ鎖又はコヒージョンのＣ末端に融合された完全長サイクリンＢ１が哺乳動物２９３Ｆ細胞から分泌されないことを示す図である。データは、トランスフェクション上清の階段希釈についての抗ヒトＦｃ及び抗コヒーシンのＥＬＩＳＡである。ｒＡｂ．サイクリンＢ１及びＣｏｈ．サイクリンＢ１タンパク質は、哺乳動物細胞からの分泌産物として発現が不十分である。
以下のアミノ酸配列は、ヒトサイクリンＢ１である。Ｔ細胞エピトープを含有することが知られている２つのペプチド領域は、太字で下線を引き、またイタリック体で下線を引いて強調する。

ペプチド−１MEMKILRALNFGLGRPLPLHFLRRASKIGEVDVEQHTLAKYLMELTMLDY (配列番号１３２)
ペプチド−２
DWLVQVQMKFRLLQETMYMTVSIIDRFMQNNCVPKK (配列番号１３３)
図３５は、トランスフェクトされた哺乳動物２９３Ｆ細胞から分泌されたプロトタイプサイクリンＢ１ワクチンの相対的な発現レベルの概要を示す。可動性リンカー配列は、分泌を容易にする。
Ｃ１１８９ ｒＡＢ−ｃｅｔＨＳ−ｐｕｒｏ［ｍａｎｔｉ−ＣＤ４０＿１２Ｅ１２．３Ｆ３＿Ｈ−ＬＶ−ｈＩｇＧ４Ｈ−Ｃ−Ｆｌｅｘ−ｖ１（太字）−ｈサイクリンＢ１−ペプチド−２（イタリック体）−ペプチド−１（太字−イタリック体）−ｆ４（太字）］ ［ＡＳリンカー、下線を引く］
上記は、抗ＣＤ４０１２Ｅ１２サイクリンＢ１ワクチンの１つの形態についての成熟分泌Ｈ鎖の配列である。ＡＳ残基は、結合制限部位に由来する。ＤＮＡコード配列を下記に示す、また、これは、シグナルペプチドを含む。
ATGAACTTGGGGCTCAGCTTGATTTTCCTTGTCCTTGTTTTAAAAGGTGTCCAGTGTGAAGTGAAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGCAGCCCGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAACCTCTGGATTCACTTTCAGTGACTATTACATGTATTGGGTTCGCCAGACTCCAGAGAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCATACATTAATTCTGGTGGTGGTAGCACCTATTATCCAGACACTGTAAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACACCCTGTACCTGCAAATGAGCCGGCTGAAGTCTGAGGACACAGCCATGTATTACTGTGCAAGACGGGGGTTACCGTTCCATGCTATGGACTATTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAGCCAAAACGAAGGGCCCATCCGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACGAAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCACCCTGCCCAGCACCTGAGTTCGAAGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGTAAAGCTAGTCAGACCCCCACCAACACCATCAGCGTGACCCCCACCAACAACAGCACCCCCACCAACAACAGCAACCCCAAGCCCAACCCCGCTAGTGACTGGCTAGTACAGGTTCAAATGAAATTCAGGTTGTTGCAGGAGACCATGTACATGACTGTCTCCATTATTGATCGGTTCATGCAGAATAATTGTGTGCCCAAGAAGGCTAGTATGGAAATGAAGATTCTAAGAGCTTTAAACTTTGGTCTGGGTCGGCCTCTACCTTTGCACTTCCTTCGGAGAGCATCTAAGATTGGAGAGGTTGATGTCGAGCAACATACTTTGGCCAAATACCTGATGGAACTAACTATGTTGGACTATGCTAGTACCAACGACAGCATCACCGTGGCCGCCACCGCCCCCACCGTGACCCCCACCGTGAACGCCACCCCCAGCGCCGCCGCTAGCTGA (配列番号１３５)
Ｃ１１４３ ｒＡＢ−ｃｅｔＨＳ−ｐｕｒｏ［ｍａｎｔｉ−ＣＤ４０＿１２Ｅ１２．３Ｆ３＿Ｈ−ＬＶ−ｈＩｇＧ４Ｈ−Ｃ−Ｆｌｅｘ−ｖ１（太字）−ｈＣｙｃｌｉｎＢ１−ペプチド−２（イタリック体）−ｆ３（太字）］ ［ＡＳリンカー、下線を引く］。
上記は、抗ＣＤ４０１２Ｅ１２サイクリンＢ１ワクチンの１つの形態についての成熟分泌Ｈ鎖の配列である。ＡＳ残基は、結合制限部位に由来する。ＤＮＡコード配列を下記に示す、また、これは、シグナルペプチドを含む。
ATGAACTTGGGGCTCAGCTTGATTTTCCTTGTCCTTGTTTTAAAAGGTGTCCAGTGTGAAGTGAAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGCAGCCCGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAACCTCTGGATTCACTTTCAGTGACTATTACATGTATTGGGTTCGCCAGACTCCAGAGAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCATACATTAATTCTGGTGGTGGTAGCACCTATTATCCAGACACTGTAAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACACCCTGTACCTGCAAATGAGCCGGCTGAAGTCTGAGGACACAGCCATGTATTACTGTGCAAGACGGGGGTTACCGTTCCATGCTATGGACTATTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAGCCAAAACGAAGGGCCCATCCGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACGAAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCACCCTGCCCAGCACCTGAGTTCGAAGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGTAAAGCTAGTCAGACCCCCACCAACACCATCAGCGTGACCCCCACCAACAACAGCACCCCCACCAACAACAGCAACCCCAAGCCCAACCCCGCTAGTGACTGGCTAGTACAGGTTCAAATGAAATTCAGGTTGTTGCAGGAGACCATGTACATGACTGTCTCCATTATTGATCGGTTCATGCAGAATAATTGTGTGCCCAAGAAGGCTAGTACCGTGACCCCCACCGCCACCGCCACCCCCAGCGCCATCGTGACCACCATCACCCCCACCGCCACCACCAAGCCCGCTAGCTGA (配列番号１３７)
Ｃ９１１ ｒＡＢ−ｃｅｔＨＳ−ｐｕｒｏ［ｍａｎｔｉ−ＣＤ４０＿１２Ｅ１２．３Ｆ３＿Ｈ−ＬＶ−ｈＩｇＧ４Ｈ−Ｃ−Ｆｌｅｘ−ｖ１（太字）−ｈサイクリンＢ１−ペプチド−１（イタリック体）−ｆ４（太字）］
Ｃ９１１ ｒＡＢ−ｃｅｔＨＳ−ｐｕｒｏ［ｍａｎｔｉ−ＣＤ４０＿１２Ｅ１２．３Ｆ３＿Ｈ−ＬＶ−ｈＩｇＧ４Ｈ−Ｃ−Ｆｌｅｘ−ｖ１（太字）−ｈサイクリンＢ１−ペプチド−１（イタリック体）−ｆ４（太字）］核酸配列。
ATGAACTTGGGGCTCAGCTTGATTTTCCTTGTCCTTGTTTTAAAAGGTGTCCAGTGTGAAGTGAAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGCAGCCCGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAACCTCTGGATTCACTTTCAGTGACTATTACATGTATTGGGTTCGCCAGACTCCAGAGAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCATACATTAATTCTGGTGGTGGTAGCACCTATTATCCAGACACTGTAAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACACCCTGTACCTGCAAATGAGCCGGCTGAAGTCTGAGGACACAGCCATGTATTACTGTGCAAGACGGGGGTTACCGTTCCATGCTATGGACTATTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAGCCAAAACGAAGGGCCCATCCGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACGAAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCACCCTGCCCAGCACCTGAGTTCGAAGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGTAAAGCTAGTCAGACCCCCACCAACACCATCAGCGTGACCCCCACCAACAACAGCACCCCCACCAACAACAGCAACCCCAAGCCCAACCCCGCTAGTATGGAAATGAAGATTCTAAGAGCTTTAAACTTTGGTCTGGGTCGGCCTCTACCTTTGCACTTCCTTCGGAGAGCATCTAAGATTGGAGAGGTTGATGTCGAGCAACATACTTTGGCCAAATACCTGATGGAACTAACTATGTTGGACTATGCTAGTACCAACGGCAGCATCACCGTGGCCGCCACCGCCCCCACCGTGACCCCCACCGTGAACGCCACCCCCAGCGCCGCCGCTAGCTGA (配列番号１３９)
Ｄ型サイクリン抗原。Ｄ型サイクリンは、細胞周期のＧ１期中に主に発現する。サイクリンＤ１の発現パターンは、リンパ腫及び非小細胞肺癌を含むある種の癌型において広範囲に研究されてきた。乳癌の約３０パーセントは、サイクリンＤ１陽性である。サイクリンＤ１の過剰発現は、今や、特有の染色体転座ｔ（１１；１４）によって特徴づけられるマントル細胞リンパ腫、悪性非ホジキンリンパ腫の診断のための十分に確立された基準である。
サイクリンＤ１−ペプチド１は太字、ペプチド２は太字で下線を引き、ペプチド−３はイタリック体、ペプチド４は下線を引く。
Pep-1:
MEHQLLCCEVETIRRAYPDANLLNDRVLRAMLKAEETCAPSVSYFKCV (配列番号１４１)
Pep-2
QKEVLPSMRKIVATWMLEVCEEQKCEEEVFPLAMNYLDRFLSLEPVKKSRLQLLGATCMFVASKMKETIPLTAEKLCIYTDNSIRPEELLQMELL (配列番号１４２)
Pep-3
LVNKLKWNLAAMTPHDFIEHFLSKMPEAEENKQIIRKHAQTFVALCATDVKFISNPPSMV (配列番号１４３)
Pep-4
AAGSVVAAVQGLNLRSPNNFLSYYRLTRFLSRVIKCDPDCLRACQEQIEALLESSLRQAQQNMDPKAAEEEEEEEEEVDLACTPTDVRDVDI (配列番号１４４)
Flex-4配列
TNGSITVAATAPTVTPTVNATPSAA (配列番号１４)
Flex-3配列
TVTPTATATPSAIVTTITPTATTKP (配列番号１３)
Flex-var1
QTPTNTISVTPTNNSTPTNNSNPKPNP (配列番号１４５)
図３５は、知られている又は予測される構造ドメイン領域に基づくサイクリンＢ１セグメンテーション戦略を示す。
図３６は、サイクリンＤ１セグメントｐ２ではなくｐ１、ｐ３、及びｐ４が、Ｈ鎖Ｃ末端に対する直接的な融合物として十分に発現することを示す。これらは、２９３Ｆ細胞の中への、Ｌ鎖発現ベクターと共にコトランスフェクトしたＨ鎖ベクターの一過性のトランスフェクションであり、上清は、発現の４８〜７２時間後に採取した。Ｈ鎖Ｃ末端でともに連結されたサイクリンＤ１ ｐ３＋ｐ４セグメントもまた、十分に発現するが、分散したｆｌｅｘセグメントを有する及び有していない様々な他の組合せは、発現しない又は発現が非常に不十分である。
図３７は、可動性リンカー配列との様々な組合せにおける、Ｈ鎖Ｃ末端に対する直接的な融合物としての様々なサイクリンＤ１セグメントの相対的な発現レベルを示す。これらは、２９３Ｆ細胞の中への、Ｌ鎖発現ベクターと共にコトランスフェクトしたＨ鎖ベクターの一過性のトランスフェクションであり、上清は、発現の４８〜７２時間後に採取した。Ｈ鎖Ｃ末端でともに連結されたサイクリンＤ１ ｐ２＋ｐ３＋ｐ４＋ｆ４セグメントもまた、ワクチン産生に十分に発現する。
有用な抗ＤＣＩＲ ９Ｅ８−サイクリンＤ１Ｈ鎖融合タンパク質の配列は下記である。
１０８２は、ｒＡＢ−ｐＩＲＥＳ２［ｍＡｎｔｉ−ＤＣＩＲ＿９Ｅ８＿Ｈ−ＬＶ−ｈＩｇＧ４Ｈ−Ｃ−Ｆｌｅｘ−ｖ１（太字）−ｈサイクリンＤ１−Ｐｅｐ−１（イタリック体）−ｆ４（太字）−−］である。
Ｃ１０８６は、ｒＡＢ−ｐＩＲＥＳ２［ｍＡｎｔｉ−ＤＣＩＲ＿９Ｅ８＿Ｈ−ＬＶ−ｈＩｇＧ４Ｈ−Ｃ−Ｆｌｅｘ−ｖ１（太字）−ｈサイクリンＤ１−Ｐｅｐ−２−（太字）−Ｐｅｐ−３（太字で下線を引く）−Ｐｅｐ−４（イタリック体）−ｆ４）（太字）］である。
図３８は、ワクチンとしての様々なＨ鎖サイクリンＤ１セグメント構築物の概要及びそれらの相対的な発現力を示す。
図３９の上図は、ＤＣターゲティング抗体Ｈ鎖のＣ末端に融合された完全長サイクリンＤ１が、分泌組換え抗体としての発現が非常に不十分であることを示す。
抗ＣＤ４０＿１２Ｅ１２．３Ｆ３
抗ＣＤ４０＿１２Ｅ１２．３Ｆ３＿Ｈ−Ｖ−ｈＩｇＧ４Ｈ−Ｃの下線を引いた領域は、重鎖Ｖ領域アミノ酸配列を示す。
MNLGLSLIFLVLVLKGVQCEVKLVESGGGLVQPGGSLKLSCATSGFTFSDYYMYWVRQTPEKRLEWVAYINSGGGSTYYPDTVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSRLKSEDTAMYYCARRGLPFHAMDYWGQGTSVTFVSSAKTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKAS (配列番号１４８)
抗ＣＤ４０＿１２Ｅ１２．３Ｆ３＿Ｋ−Ｖ−ｈＩｇＧＫ−Ｃの下線を引いた領域は、軽鎖Ｖ領域アミノ酸配列を示す。
MMSSAQFLGLLLLCFQGTRCDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCSASQGISNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSILHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTIGNLEPEDIATYYCQQFNKLPPTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC- (配列番号１４９)
抗ＣＤ４０＿１２Ｂ４．２Ｃ１０
抗ＣＤ４０＿１２Ｂ４．２Ｃ１０重鎖：
MEWSWIFLFLLSGTAGVHSEVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTDYVLHWVKQKPGQGLEWIGYINPYNDGTKYNEKFKGKATLTSDKSSSTAYMELSSLTSEDSAVYYCARGYPAYSGYAMDYWGQGTSVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQKGEFV (配列番号１５０)
抗ＣＤ４０＿１２Ｂ４．２Ｃ１０軽鎖：
MMSSAQFLGLLLLCFQGTRCDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCHHGNTLPWTFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC (配列番号１５１)
抗ＣＤ４０＿１２Ｂ４．２Ｃ１０軽鎖−別のクローン（１７Ｋ６）
MDFQVQIFSFLLISASVIMSRGQIVLTQSPAILSASPGEKVTMTCSASSSVSYMYRYQQKPGSSPKPWIYGTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQYHSYPLTFGAGTKLELKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC (配列番号１５２)
抗ＣＤ４０＿１１Ｂ６．１Ｃ３
抗ＣＤ４０＿１１Ｂ６．１Ｃ３重鎖：
MGWSWIFLFLLSGTAGVLSEVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYSFTGYYMHWVKQSHVKSLEWIGRINPYNGATSYNQNFKDKASLTVDKSSSTAYMELHSLTSEDSAVYYCAREDYVYWGQGTTLTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQKGEFV (配列番号１５３)
抗ＣＤ４０＿１１Ｂ６．１Ｃ３軽鎖：
MKLPVRLLVLMFWIPASSSDVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFALKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPWTFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC (配列番号１５４)
［抗ＣＤ４０＿１２Ｅ１２．３Ｆ３＿Ｋ−Ｖ−ｈＩｇＧＫ−Ｃ］−下線を引いた領域は、軽鎖Ｖ領域配列を示す。
ATGATGTCCTCTGCTCAGTTCCTTGGTCTCCTGTTGCTCTGTTTTCAAGGTACCAGATGTGATATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTAGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGTGCAAGTCAGGGCATTAGCAATTATTTAAACTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTATTACACATCAATTTTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGATTATTCTCTCACCATCGGCAACCTGGAACCTGAAGATATTGCCACTTACTATTGTCAGCAGTTTAATAAGCTTCCTCCGACGTTCGGTGGAGGCACCAAACTCGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTATGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG (配列番号１５５)
［抗ＣＤ４０＿１２Ｅ１２．３Ｆ３＿Ｈ−Ｖ−ｈＩｇＧ４Ｈ−Ｃ］−下線を引いた領域は、重鎖Ｖ領域配列を示す。
ATGAACTTGGGGCTCAGCTTGATTTTCCTTGTCCTTGTTTTAAAAGGTGTCCAGTGTGAAGTGAAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGCAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAACCTCTGGATTCACTTTCAGTGACTATTACATGTATTGGGTTCGCCAGACTCCAGAGAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCATACATTAATTCTGGTGGTGGTAGCACCTATTATCCAGACACTGTAAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACACCCTGTACCTGCAAATGAGCCGGCTGAAGTCTGAGGACACAGCCATGTATTACTGTGCAAGACGGGGGTTACCGTTCCATGCTATGGACTATTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAGCCAAAACGAAGGGCCCATCCGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACGAAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCACCCTGCCCAGCACCTGAGTTCGAAGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGTAAAGCTAGCTGA (配列番号１５６)
抗ＣＤ４０＿１２Ｂ４．２Ｃ１０＿Ｈ−Ｖ−ｈＩｇＧ４Ｈ−Ｃ重鎖
ATGGAATGGAGTTGGATATTTCTCTTTCTTCTGTCAGGAACTGCAGGTGTCCACTCTGAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTAAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACATTCACTGACTATGTTTTGCACTGGGTGAAACAGAAGCCTGGGCAGGGCCTTGAGTGGATTGGATATATTAATCCTTACAATGATGGTACTAAGTACAATGAGAAGTTCAAAGGCAAGGCCACACTGACTTCAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGGAGCTCAGCAGCCTGACCTCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCAAGGGGCTATCCGGCCTACTCTGGGTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAGCCAAAACGAAGGGCCCATCCGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACGAAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCACCCTGCCCAGCACCTGAGTTCGAAGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGTAAAGCTAGCTGA (配列番号１５７)
抗ＣＤ４０＿１２Ｂ４．２Ｃ１０＿Ｋ−Ｖ−ｈＩｇＧＫ−Ｃ（バリアント１）軽鎖
ATGGATTTTCAAGTGCAGATTTTCAGCTTCCTGCTAATCAGTGCCTCAGTCATAATGTCCAGGGGACAAATTGTTCTCACCCAGTCTCCAGCAATCCTGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATGACCTGCAGTGCCAGCTCAAGTGTAAGTTACATGTACAGGTACCAGCAGAAGCCAGGATCCTCACCCAAACCCTGGATTTATGGCACATCCAACCTGGCTTCTGGAGTCCCTGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACCTCTTATTCTCTCACAATCAGCAGCATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAATATCATAGTTACCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTCGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTATGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG (配列番号１５８)
抗ＣＤ４０＿１２Ｂ４．２Ｃ１０＿Ｋ−Ｖ−ｈＩｇＧＫ−Ｃ（バリアント２）軽鎖
ATGATGTCCTCTGCTCAGTTCCTTGGTCTCCTGTTGCTCTGTTTTCAAGGTACCAGATGTGATATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGCAATTATTTAAACTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACTACACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCATCATGGTAATACGCTTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTCGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTATGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG (配列番号１５９)
抗ＣＤ４０＿１１Ｂ６．１Ｃ３＿Ｈ−Ｖ−ｈＩｇＧ４Ｈ−Ｃ重鎖
ATGGGATGGAGCTGGATCTTTCTCTTTCTCCTGTCAGGAACTGCAGGTGTCCTCTCTGAGGTCCAGCTGCAACAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATATCCTGCAAGGCTTCTGGTTACTCATTCACTGGCTACTACATGCACTGGGTGAAGCAAAGCCATGTAAAGAGCCTTGAGTGGATTGGACGTATTAATCCTTACAATGGTGCTACTAGCTACAACCAGAATTTCAAGGACAAGGCCAGCTTGACTGTAGATAAGTCCTCCAGCACAGCCTACATGGAGCTCCACAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGAGAGGACTACGTCTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCAGCCAAAACGAAGGGCCCATCCGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACGAAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCACCCTGCCCAGCACCTGAGTTCGAAGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGTAAAGCTAGCTGA (配列番号１６０)
抗ＣＤ４０＿１１Ｂ６．１Ｃ３＿Ｋ−Ｖ−ｈＩｇＧＫ−Ｃ軽鎖
ATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCTGATGTTCTGGATTCCTGCTTCCAGCAGTGATGTTGTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGCCTTGTACACAGTAATGGAAACACCTATTTACATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCGCACTCAAGATCAGTAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTTCTGCTCTCAAAGTACACATGTTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTCGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTATGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG (配列番号１６１)
本明細書において議論されるいかなる実施形態も、本発明のいかなる方法、キット、試薬、又は組成物に関しても実現することができ、逆もまた同様であることが企図される。さらに、本発明の組成物は、本発明の方法を達成するために使用することができる。
本明細書において記載される特定の実施形態は、本発明の限定としてではなく例証として示されることが理解されるであろう。本発明の主要な特徴は、本発明の範囲から逸脱することなく、様々な実施形態において用いることができる。当業者らは、日常的な実験作業だけを使用して、本明細書において記載される特定の手順に対する多数の等価物を認識する又は確認することができるであろう。そのような等価物は、本発明の範囲内であると考えられ、請求項によって包含される。
本明細書において言及されるすべての刊行物及び特許出願は、本発明が関する、当業者らの技術のレベルを示す。すべての刊行物及び特許出願は、あたかもそれぞれの個々の刊行物又は特許出願が参照によって組み込まれるように明確に個々に示されるのと同じ程度まで参照によって本明細書に組み込まれる。
請求項及び／又は明細書中の用語「含む（comprising）」に関連して使用される場合の単語「１つの（a）」又は「１つの（an）」の使用は、「１つ（one）」を意味してもよいが、それはまた、「１又は２以上の」、「少なくとも１つの」、及び「１又は１を超える」の意味と一致している。請求項中の用語「又は」の使用は、選択肢のみを指すように明示的に示されない限り、「及び／又は」を意味するために使用される又は選択肢は相互に排他的であるが、開示は、選択肢のみ及び「及び／又は」を指す定義を支持する。本出願の全体にわたって、用語「約」は、値が、値を決定するために用いられるデバイス、方法についての誤差の固有の偏差又は研究対象の間に存在する偏差を含むことを示すために使用される。
本明細書及び請求項（複数可）において使用される場合、単語「含む（comprising）」（並びに「含む（comprise）」及び「含む（comprises）」などの含む（comprising）の任意の形態）、「有する（having）」（並びに「有する（have）」及び「有する（has）」などの有する（having）の任意の形態）、「含む（including）」（並びに「含む（includes）」及び「含む（include）」などの含む（including）の任意の形態）、又は「含有する（containing）」（並びに「含有する（contains）」及び「含有する（contain）」などの含有する（containing）の任意の形態）は、包括的又は非限定的であり、さらなる、記載されていないエレメント又は方法のステップを除外しない。
本明細書において使用される用語「又はその組合せ」は、用語に先行する、列挙されたアイテムのすべての交換及び組合せを指す。例えば、「Ａ、Ｂ、Ｃ、又はその組合せ」は、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＡＢ、ＡＣ、ＢＣ、又はＡＢＣの少なくとも１つを含むように意図され、順序が特定の状況において重要な場合、ＢＡ、ＣＡ、ＣＢ、ＣＢＡ、ＢＣＡ、ＡＣＢ、ＢＡＣ、又はＣＡＢもまた含む。この例を続けると、ＢＢ、ＡＡＡ、ＭＢ、ＢＢＣ、ＡＡＡＢＣＣＣＣ、ＣＢＢＡＡＡ、ＣＡＢＡＢＢなどの、１又は２以上のアイテム又は用語の反復を含有する組合せが明らかに含まれる。当業者は、状況からその他に明白でない限り、典型的に、いかなる組合せにおいてもアイテム又は用語の数に制限はないことを理解するであろう。
本明細書において開示され、請求される組成物及び／又は方法はすべて、本開示に照らして不必要な実験作業なしで作製し、実施することができる。本発明の組成物及び方法は、好ましい実施形態によって記載されたが、変形が、本発明の概念、精神、及び範囲から逸脱することなく、組成物及び／又は方法に並びに本明細書において記載される方法のステップ又はステップの順序において適用されてもよいことが当業者らに明白であろう。当業者らに明白なすべてのそのような類似する代用及び修飾は、添付の請求項によって定義される本発明の精神、範囲、及び概念内にあると考えられる。

Claims (11)

  1. 式：
    Ａｂ−（ＰＬ−Ａｇ）ｘ；
    Ａｂ−（Ａｇ−ＰＬ）ｘ；
    Ａｂ−（ＰＬ−Ａｇ−ＰＬ）ｘ；
    Ａｂ−（Ａｇ−ＰＬ−Ａｇ）ｘ；
    Ａｂ−（ＰＬ−Ａｇ）ｘ−ＰＬ；又は
    Ａｂ−（Ａｇ−ＰＬ）ｘ−Ａｇを含む融合タンパク質であって、
    前記式において、Ａｂが、抗体又はその抗原結合断片であり、
    ＰＬが、
    SSVSPTTSVHPTPTSVPPTPTKSSP (配列番号１１);
    PTSTPADSSTITPTATPTATPTIKG (配列番号１２);
    TVTPTATATPSAIVTTITPTATTKP (配列番号１３);及び
    TNGSITVAATAPTVTPTVNATPSAA (配列番号１４)
    から選択される少なくとも１つのペプチドリンカーであり、
    Ａｇが、マイコバクテリウム・ツベルクローシス細菌抗原、ＨＩＶ抗原、及びＨＣＶ抗原から選択される少なくとも１つの抗原であり、且つ、
    ｘが、１〜２０の整数である、
    融合タンパク質。
  2. Ａｂが、
    GFTFSDYYMYのアミノ酸残基からなる重鎖超可変相補性決定領域（ＣＤＲ）１、YINSGGGSTYYPDTVKGのアミノ酸残基からなる重鎖ＣＤＲ２、及びRGLPFHAMDYのアミノ酸残基からなる重鎖ＣＤＲ３と、SASQGISNYLNのアミノ酸残基からなる軽鎖ＣＤＲ１、YTSILHSのアミノ酸残基からなる軽鎖ＣＤＲ２、及びQQFNKLPPTのアミノ酸残基からなる軽鎖ＣＤＲ３とを含むか、
    配列番号１５０に示されるアミノ酸配列からなる重鎖と、配列番号１５１に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖とを含むか、
    配列番号１５０に示されるアミノ酸配列からなる重鎖と、配列番号１５２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖とを含むか、或いは
    配列番号１５３に示されるアミノ酸配列からなる重鎖と、配列番号１５４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖とを含む
    抗ＣＤ４０抗体を含む、
    請求項１に記載の融合タンパク質。
  3. 式：
    ＮＨ２−Ａｂ−（ＰＬ−Ａｇ）ｘ−ＣＯＯＨ又はＮＨ２−Ａｂ−（Ａｇ−ＰＬ）ｘ−ＣＯＯＨを含む、安定した、分泌可能な融合タンパク質であって、
    前記式において、Ａｂが、抗体又はその抗原結合断片であり、
    ＰＬが、
    SSVSPTTSVHPTPTSVPPTPTKSSP (配列番号１１);
    PTSTPADSSTITPTATPTATPTIKG (配列番号１２);
    TVTPTATATPSAIVTTITPTATTKP (配列番号１３);及び
    TNGSITVAATAPTVTPTVNATPSAA (配列番号１４)
    から選択される少なくとも１つのペプチドリンカーであり、
    Ａｇが、マイコバクテリウム・ツベルクローシス細菌抗原、ＨＩＶ抗原、及びＨＣＶ抗原から選択される少なくとも１つの免疫原性抗原であり、且つ
    ｘが、１〜２０の整数である、
    融合タンパク質。
  4. 不安定な又は不溶性の１又は２以上の抗原ペプチドを融合タンパク質の中に組み込むステップを含む、抗原ペプチドを安定化するための方法であって、
    前記融合タンパク質が、以下の構造：
    Ａｂ−（ＰＬ−Ａｇ）ｘ又はＡｂ−（Ａｇ−ＰＬ）ｘを有し、
    前記式において、Ａｂが、抗体又はその抗原結合断片であり、
    ＰＬが、
    SSVSPTTSVHPTPTSVPPTPTKSSP (配列番号１１);
    PTSTPADSSTITPTATPTATPTIKG (配列番号１２);
    TVTPTATATPSAIVTTITPTATTKP (配列番号１３);及び
    TNGSITVAATAPTVTPTVNATPSAA (配列番号１４)
    から選択される少なくとも１つのペプチドリンカーであり、
    Ａｇが、マイコバクテリウム・ツベルクローシス細菌抗原、ＨＩＶ抗原、及びＨＣＶ抗原から選択される少なくとも１つの抗原であり、且つ、
    ｘが、１〜２０の整数である、
    方法。
  5. Ａｂが、
    GFTFSDYYMYのアミノ酸残基からなる重鎖超可変相補性決定領域（ＣＤＲ）１、YINSGGGSTYYPDTVKGのアミノ酸残基からなる重鎖ＣＤＲ２、及びRGLPFHAMDYのアミノ酸残基からなる重鎖ＣＤＲ３と、SASQGISNYLNのアミノ酸残基からなる軽鎖ＣＤＲ１、YTSILHSのアミノ酸残基からなる軽鎖ＣＤＲ２、及びQQFNKLPPTのアミノ酸残基からなる軽鎖ＣＤＲ３とを含むか、
    配列番号１５０に示されるアミノ酸配列からなる重鎖と、配列番号１５１に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖とを含むか、
    配列番号１５０に示されるアミノ酸配列からなる重鎖と、配列番号１５２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖とを含むか、或いは
    配列番号１５３に示されるアミノ酸配列からなる重鎖と、配列番号１５４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖とを含む
    抗ＣＤ４０抗体を含む、
    請求項４に記載の方法。
  6. 式：
    Ａｂ−（ＰＬ−Ａｇ）ｘ−（ＰＬｙ−Ａｇｚ）ｎ；又は
    Ａｂ−（Ａｇ−ＰＬ）ｘ−（ＰＬｙ−Ａｇｚ）ｎを含む融合タンパク質であって、
    前記式において、Ａｂが、抗体又はその抗原結合断片であり、
    ＰＬが、
    SSVSPTTSVHPTPTSVPPTPTKSSP (配列番号１１);
    PTSTPADSSTITPTATPTATPTIKG (配列番号１２);
    TVTPTATATPSAIVTTITPTATTKP (配列番号１３);及び
    TNGSITVAATAPTVTPTVNATPSAA (配列番号１４)
    から選択される少なくとも１つのペプチドリンカーであり、
    Ａｇが、マイコバクテリウム・ツベルクローシス細菌抗原、ＨＩＶ抗原、及びＨＣＶ抗原から選択される少なくとも１つの抗原であり、且つ、
    ｘが、１〜２０の整数であり、
    ｎが０〜１９であり、且つ
    ｙ又はｚが０〜１０である、
    融合タンパク質。
  7. 請求項１に記載の融合タンパク質を含む、単離精製ワクチンであって、
    Ａｂが、
    GFTFSDYYMYのアミノ酸残基からなる重鎖超可変相補性決定領域（ＣＤＲ）１、YINSGGGSTYYPDTVKGのアミノ酸残基からなる重鎖ＣＤＲ２、及びRGLPFHAMDYのアミノ酸残基からなる重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖と、SASQGISNYLNのアミノ酸残基からなる軽鎖ＣＤＲ１、YTSILHSのアミノ酸残基からなる軽鎖ＣＤＲ２、及びQQFNKLPPTのアミノ酸残基からなる軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖とを含む抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合断片を含む、
    前記単離精製ワクチン。
  8. 抗体軽鎖又はその断片をコードする第１のポリヌクレオチド及び
    抗体重鎖又はその断片をコードする第２のポリヌクレオチド
    を含む融合タンパク質をコードする核酸発現ベクターであって、
    前記融合タンパク質が、以下の式：
    Ａｂ−（ＰＬ−Ａｇ）ｘ又はＡｂ−（Ａｇ−ＰＬ）ｘを含み、
    前記式において、Ａｂが、抗体又はその抗原結合断片であり、
    ＰＬが、
    SSVSPTTSVHPTPTSVPPTPTKSSP (配列番号１１);
    PTSTPADSSTITPTATPTATPTIKG (配列番号１２);
    TVTPTATATPSAIVTTITPTATTKP (配列番号１３);及び
    TNGSITVAATAPTVTPTVNATPSAA (配列番号１４)
    から選択される少なくとも１つのペプチドリンカーであり、
    Ａｇが、マイコバクテリウム・ツベルクローシス細菌抗原、ＨＩＶ抗原、及びＨＣＶ抗原から選択される少なくとも１つの抗原であり、且つ
    ｘが、１〜２０の整数である、
    核酸発現ベクター。
  9. 第１及び第２のポリヌクレオチドが、恒常的プロモーターの下流にある、請求項８に記載のベクター。
  10. 抗体軽鎖をコードする第１のポリヌクレオチドと
    抗体重鎖をコードする第２のポリヌクレオチドとの融合タンパク質を含む核酸発現ベクターを含む宿主細胞であって、
    前記融合タンパク質が、以下の式：
    Ａｂ−（ＰＬ−Ａｇ）ｘ又はＡｂ−（Ａｇ−ＰＬ）ｘを含み、
    前記式において、Ａｂが、抗体又はその抗原結合断片であり、
    ＰＬが、
    SSVSPTTSVHPTPTSVPPTPTKSSP (配列番号１１);
    PTSTPADSSTITPTATPTATPTIKG (配列番号１２);
    TVTPTATATPSAIVTTITPTATTKP (配列番号１３);及び
    TNGSITVAATAPTVTPTVNATPSAA (配列番号１４)
    から選択される少なくとも１つのペプチドリンカーであり、
    Ａｇが、マイコバクテリウム・ツベルクローシス細菌抗原、ＨＩＶ抗原、及びＨＣＶ抗原から選択される少なくとも１つの抗原であり、且つ、
    ｘが、１〜２０の整数である、
    宿主細胞。
  11. 請求項１〜３のいずれかに記載の融合タンパク質を含む医薬組成物。
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