JP6165713B2 - インスリン様増殖因子1に特異的に結合する抗体 - Google Patents
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Description
本発明の1つの態様において、配列番号3に含まれるエピトープ、またはアミノ酸のこのストレッチ内の部分配列(配列番号4)、例えばIGF−1前駆体(配列番号1)のアミノ酸77〜84の範囲の部分配列に結合するモノクローナル抗体を開示する。
1つの態様において、本発明は、インスリン様増殖因子1前駆体(配列番号1)のアミノ酸残基76〜84(配列番号3)内の単離抗体結合に関する。言い換えると、本発明記載の単離抗体は、配列番号3に含まれるエピトープに結合する。
本明細書において、用語「ヒトIGF−1に対する結合」、または「抗IGF−1抗体」は、交換可能である。本発明記載のヒトIGF−1抗原に対する抗体結合は、好ましくは、25℃で、1.0x10−8mol/lまたはそれ未満のKD値を有し、1つの態様において、25℃で、1.0x10−9mol/lまたはそれ未満のKD値を有する。標準結合アッセイ、例えば表面プラズモン共鳴技術(BIAcore(登録商標)、GE−Healthcare、スウェーデン・ウプサラ)で結合アフィニティを測定する。結合アフィニティのKD値を測定するための方法を、実施例セクションに記載する。したがって、本明細書において、「ヒトIGF−1に結合する抗体」は、25℃で、少なくともKD 1.0x10−8mol/lまたはそれ未満のKDで、好ましくはKD 1.0x10−9mol/l〜KD 1.0x10−12mol/lで、ヒトIGF−1抗原に結合する抗体を指す。
Biacore T200装置(GE Healthcare)を用いて、IGF−1ペプチドへの結合特異性に関して、ハイブリドーマ培養上清を動力学的に評価する。製造者の指示にしたがって、CM5シリーズSセンサーを系内に搭載し、そしてHBSN緩衝液(10mM HEPES pH 7.4、150mM NaCl)中で標準化した。系の緩衝液をHBS−ET(10mM HEPES pH 7.4、150mM NaCl、0.05% TWEEN 20)に交換する。試料緩衝液は、1mg/ml CMD(カルボキシメチルデキストラン、Sigma #86524)を補った系の緩衝液である。系を25℃で操作する。
好ましくは、IGF−1に特異的に結合する抗体は、重鎖可変ドメインが、配列番号15のCDR3領域および配列番号16のCDR2領域を含むことで特徴付けられる。
好ましくは、IGF−1に特異的に結合する抗体は、重鎖可変ドメインが配列番号23のCDR3領域および配列番号24のCDR2領域を含むことで特徴付けられる。
用語「抗体」は、限定されるわけではないが、全抗体および抗体断片を含む、多様な型の抗体構造を含む。本発明記載の抗体は、好ましくは、本発明記載の特徴的な特性が保持される限り、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、またはさらに遺伝子操作された抗体である。
用語「キメラ抗体」は、マウス由来の可変領域、すなわち結合領域、および異なる供給源または種由来の定常領域の少なくとも一部を含み、通常、組換えDNA技術によって調製されるモノクローナル抗体を指す。マウス可変領域およびヒト定常領域を含むキメラ抗体が特に好ましい。こうしたマウス/ヒトキメラ抗体は、マウス免疫グロブリン可変領域をコードするDNAセグメントおよびヒト免疫グロブリン定常領域をコードするDNAセグメントを含む、発現された免疫グロブリン遺伝子の産物である。本発明によって含まれる「キメラ抗体」の他の型は、クラスまたはサブクラスが元来の抗体のものから修飾されているかまたは変化しているものである。こうした「キメラ」抗体はまた、「クラススイッチ抗体」と称される。キメラ抗体を産生するための方法は、現在当該技術分野において周知である慣用的な組換えDNAおよび遺伝子トランスフェクション技術を伴う。例えば、Morrison, S.L.ら, Proc. Natl. Acad Sci. USA 81(1984) 6851−6855; US 5,202,238およびUS 5,204,244を参照されたい。
イムノアッセイは、当業者に周知である。こうしたアッセイを実施するための方法、ならびに実際上の適用および方法は、関連する教科書に要約される。関連する教科書の例は、Tijssen, P., Preparation of enzyme−antibody or other enzyme−macromolecule conjugates: Practice and Theory of Enzyme Immunoassays中, pp. 221−278, Burdon, R.H.およびv. Knippenberg, P.H.(監修), Elsevier, アムステルダム(1990)、ならびにMethods in Enzymology, Colowick, S.P.およびCaplan, N.O.(監修), Academic Press)の、免疫学的検出法を扱う多くの巻、特に第70巻、第73巻、第74巻、第84巻、第92巻および第121巻である。
特定の態様において、酵素連結免疫吸着アッセイ(ELISA)において、または電気化学発光に基づくイムノアッセイ(ECLIA)において、IGF−1を検出する。
配列番号1 ヒト・インスリン様増殖因子1前駆体の配列
配列番号2 成熟ヒト・インスリン様増殖因子1の配列
配列番号3 ヒト・インスリン様増殖因子1前駆体の部分配列(76〜84位)
配列番号4 ヒト・インスリン様増殖因子1前駆体の部分配列(77〜84位)
配列番号5 ヒト・インスリン様増殖因子1前駆体の部分配列(74〜90位)
配列番号6 人工配列:(gly−gly−gly−ser)
配列番号7 人工配列:(Hisタグ)
配列番号8 人工配列:FkBP−IGF−1(74〜90)融合タンパク質
配列番号9 人工配列:SlyD−FkBP−IGF−1(74〜90)融合タンパク質
配列番号10 人工配列:サーマス・サーモフィラス−SlyD−IGF−1(74〜90)融合タンパク質
配列番号11 人工配列:サーマス・サーモフィラス野生型SlyDタンパク質
配列番号12 人工配列:IFドメインを欠くサーマス・サーモフィラスSlyD
配列番号13 人工配列:サーモコッカス・ガンマトレランスSlyD−IGF−1(74〜90)融合タンパク質
配列番号14 人工配列:サーモコッカス・ガンマトレランスSlyD−IGF−2(53〜65)融合タンパク質
配列番号15 MAb 10.07.09の重鎖CDR3H
配列番号16 MAb 10.07.09の重鎖CDR2H
配列番号17 MAb 10.07.09の重鎖CDR1H
配列番号18 MAb 10.07.09の軽鎖CDR3H
配列番号19 MAb 10.07.09の軽鎖CDR2H
配列番号20 MAb 10.07.09の軽鎖CDR1H
配列番号21 MAb 10.07.09の重鎖可変ドメインVH
配列番号22 MAb 10.07.09の軽鎖可変ドメインVL
配列番号23 MAb 11.11.17の重鎖CDR3H
配列番号24 MAb 11.11.17の重鎖CDR2H
配列番号25 MAb 11.11.17の重鎖CDR1H
配列番号26 MAb 11.11.17の軽鎖CDR3H
配列番号27 MAb 11.11.17の軽鎖CDR2H
配列番号28 MAb 11.11.17の軽鎖CDR1H
配列番号29 MAb 11.11.17の重鎖可変ドメインVH
配列番号30 MAb 11.11.17の軽鎖可変ドメインVL
配列番号31 MAb 11.09.15の重鎖可変ドメインVH
配列番号32 MAb 11.09.15の軽鎖可変ドメインVL
配列番号33〜62 エピトープ分析で用いるような、ヒト・インスリン様増殖因子1前駆体の部分配列
モノクローナル抗体の生成のための一般的方法
あらかじめ配合した融合ポリペプチド免疫原を、実験動物、例えばマウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、またはハムスターに、異なる投薬量で腹腔内投与する。B細胞収集前に、ブースト免疫を行う。KoehlerおよびMilsteinの方法(Koehler, G.およびMilstein, C., Nature 256(1975) 495−497)にしたがって、B細胞ハイブリドーマを得ることも可能である。得たハイブリドーマを、マルチウェルプレートのウェル中に単一のクローンまたは細胞として入れる。分泌される抗体によって、抗体の結合に関して陽性の試験結果を生じた初代ハイブリドーマ培養を、動力学的スクリーニング法でさらにスクリーニングする。
SlyD/FKBP12−IGF−1(74〜90)融合ポリペプチドを用いた、インスリン様増殖因子1に対する抗体の生成
IGF−1に対するモノクローナル抗体の生成において、アミノ酸配列NKPTGYGSSSRRAPQTG(配列番号5)を含む融合ポリペプチドを、実験動物の免疫に用いてもよい。
免疫10週後、ELISAによって抗体力価を測定した。SlyD/FKBP12−IGF−1(74〜90)(配列番号9)融合ポリペプチドで免疫したマウスは、IGF−1に対して、配列番号5のペプチドに対して、SlyD/FKBP12−IGF−1(74〜90)融合ポリペプチドに対して、そしてSlyD/FKBP12対照ポリペプチド(配列番号5の配列を含まない配列番号9)に対して、低い力価を示した。1匹のマウスのみ(上記表のK1576M1)が十分に高い抗IGF−1力価を提供し、そしてこれをハイブリドーマの生成に用いた。これらの実験において、天然IGF−1を特異的に認識する抗体を産生するハイブリドーマはまったく同定不能であった。SlyD/FKBP12−IGF−1(74〜90)は、IGF−1特異的抗体の発生のための免疫試薬としては不適切であるようである。その後、ポリペプチドSlyD/FKBP12−IGF−1(74〜90)が熱力学的に安定でないことが実験的に確認された(データ未提示)。SlyDドメインのみが正しくフォールディングし、FKBP12−IGF−1(74〜90)ドメインは正しくフォールディングしない。したがって、FKBP12足場の熱力学的安定性が境界線上であるため、融合ポリペプチドは、IGF−1(74〜90)移植配列を効率的に提示しない。
サーマス・サーモフィラスSlyD−IGF−1(74〜90)融合ポリペプチドを用いた、インスリン様増殖因子1に対する抗体の生成
キメラであるサーマス・サーモフィラス−SlyD−抗原融合ポリペプチドを用いてマウスを免疫することによって、抗原特異的抗体を最終的に生成した。この足場表面上で、すなわちFKBPドメインおよびIFドメイン間の連結領域において、複数のエピトープをターゲティング可能である。陰性対照としての野生型サーマス・サーモフィラスSlyDに対する、または陽性対照としての天然組換え抗原(IGF−1)に対する、示差スクリーニングによって、移植されたターゲット抗原に結合する抗体を同定可能である。この例は、以前記載するように、準安定性ヒトFKBP12に比較して、熱安定性SlyD足場の好適な特性を立証する。サーマス・サーモフィラスSlyDは、エンタルピー的に強固でそして安定な構造の提示が可能であり、そしてしたがって、そうでなければ例えば実験動物の免疫系にアクセス可能でないであろう、代理天然タンパク質構造に対するモノクローナル抗体の発生のための、抗原提示足場として使用するのに適している。
NIGU(ドイツ・ヴァルトクライブルク)からグアニジニウム塩酸(GdmCl)(A等級)を購入した。Complete(登録商標)EDTA不含プロテアーゼ阻害剤錠剤、イミダゾールおよびEDTAを、Roche Diagnostics GmbH(ドイツ・マンハイム)より購入し、すべての他の化学薬品は、Merck(ドイツ・ダルムシュタット)の分析等級であった。限外ろ過膜(YM10、YM30)をAmicon(米国マサチューセッツ州ダンバース)より購入し、微小透析膜(VS/0.025μm)および限外ろ過装置(Biomaxウルトラフリーフィルターデバイス)をMillipore(米国マサチューセッツ州ベッドフォード)より購入した。未精製溶解物のろ過のための硝酸セルロースおよび酢酸セルロース膜(1.2μm、0.45μmおよび0.2μm孔サイズ)を、Sartorius(ドイツ・ゲッティンゲン)より購入した。
サーマス・サーモフィラス由来のSlyDポリペプチドの配列をSwissProtデータベース(寄託番号Q72H58)より回収した。サーモコッカス・ガンマトレランス由来のSlyDポリペプチドの配列をPrositeデータベース(寄託番号C5A738)より回収した。サーマス・サーモフィラスSlyDをコードする合成遺伝子、サーマス・サーモフィラスSlyD−IGF−1(74〜90)、およびサーマス・サーモフィラスSlyD−ΔIFを、Sloning Biotechnology GmbH(ドイツ)より購入し、そしてpQE80L発現ベクター内にクローニングした。大腸菌(E. coli)宿主細胞における発現のため、コドン使用を最適化した。したがって、サーモコッカス・ガンマトレランスSlyD、サーモコッカス・ガンマトレランスSlyD−IGF−2(53〜65)、サーマス・サーモフィラスSlyD−IGF−1(74〜90)抗原およびサーモコッカス・ガンマトレランスSly−D−IGF−1(74〜90)抗原をコードする類似の合成遺伝子をGeneart(ドイツ)より購入し、そしてpET24発現ベクター(Novagen、米国ウィスコンシン州マディソン)内にクローニングした。
ほぼ同一のプロトコルを用いることによって、すべてのSlyDポリペプチドを精製し、そして再フォールディングさせることも可能である。特定の発現プラスミドを宿する大腸菌BL21(DE3)細胞を、選択的増殖のためそれぞれの抗生物質(カナマイシン30μg/ml、またはアンピシリン(100μg/ml))を含有するLB培地中、37℃で、1.5のOD600まで増殖させ、そして1mMイソプロピル−β−D−チオガラクトシド(IPTG)を添加することによって、細胞質ゾル過剰発現を誘導した。誘導3時間後、遠心分離(5,000gで20分間)によって細胞を採取し、凍結し、そして−20℃で保存した。細胞溶解のため、7M GdmClおよび5mMイミダゾールを補った冷却50mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH8.0)中に、凍結ペレットを再懸濁した。その後、懸濁物を氷上で2〜10時間攪拌して、細胞溶解を完了させた。遠心分離(25,000g、1時間)およびろ過(硝酸セルロース膜、8.0μm、1.2μm、0.2μm)後、溶解物を、溶解緩衝液で平衡化したNi−NTAカラム上に適用した。続く洗浄工程において、イミダゾール濃度を10mMに上昇させ(7M GdmClを含む50mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH8.0)中)、そして5mM TCEPを添加して、チオール部分を還元型に維持し、そして未成熟なジスルフィド架橋を防止した。少なくとも15〜20体積の還元性洗浄緩衝液を適用した。その後、GdmCl溶液を、100mM NaCl、10mMイミダゾール、および5mM TCEPを含む50mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH8.0)に置換して、マトリックス結合したSlyD融合ポリペプチドのコンホメーション的な再フォールディングを誘導した。同時精製するプロテアーゼの再活性化を回避するため、プロテアーゼ阻害剤カクテル(Complete(登録商標)EDTA不含、Roche)を再フォールディング緩衝液に添加した。全部で15〜20カラム体積の再フォールディング緩衝液を一晩処置で適用した。その後、100mM NaClおよび10mMイミダゾールを含む50mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH8.0)10カラム体積で洗浄することによって、TCEPおよびComplete(登録商標)EDTA不含阻害剤カクテルを除去した。最後の洗浄工程において、イミダゾール濃度を30mM(10カラム体積)に上昇させて、頑強な混入物質を除去した。次いで、同じ緩衝液中の250mMイミダゾールを適用することによって、再フォールディングポリペプチドを溶出させた。Tricine−SDS−PAGEによって、純度に関してタンパク質含有分画を評価し(Schaegger, H.およびvon Jagow, G., Anal. Biochem. 166(1987) 368−379)、そしてプールした。続いて、緩衝系としてリン酸カリウム(50mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)、100mM KCl、0.5mM EDTA)を用いて、タンパク質をサイズ排除クロマトグラフィ(SuperdexTM HiLoad、Amersham Pharmacia)に供した。最後に、タンパク質含有分画をプールし、そしてAmiconセル(YM10)中で、〜5mg/mlの濃度まで濃縮した。
UVIKON XL二光線分光光度計で、タンパク質濃度測定を行った。SlyD変異体に関するモル吸光係数(ε280)を、Pace(Pace, C.N.ら, Protein Sci. 4(1995) 2411−2423)にしたがって、計算した。
本発明記載のキメラ融合タンパク質が、フォールディングされたコンホメーションを採用するかどうかを調べるため、近UV領域におけるCDスペクトルを測定した。製造者の推奨にしたがって、JASCO J−720装置およびJASCOソフトウェアを用いて、CDスペクトルを記録し、そして評価した。0.2cm経路長を持つ水晶キュベットを用いた。装置パラメータを1℃解像度、1nmバンド幅および5mdegの感度に設定した。試料緩衝液は50mMリン酸カリウムpH7.5、100mM NaCl、1mM EDTAであった。各分析のためのタンパク質濃度は、36μM(サーマス・サーモフィラス野生型SlyDの場合)、23μM(サーマス・サーモフィラスSlyD−ΔIFの場合)、16μM(サーマス・サーモフィラスSlyD抗原の場合)、19μM(サーモコッカス・ガンマデュランス野生型SlyDの場合)、および16μM(サーモコッカス・ガンマデュランスSlyD抗原の場合)であった。CDシグナルを20℃で250nm〜330nmの間、0.5nm解像度、そして1分あたり20nmのスキャン速度で記録した。シグナル対ノイズ比を改善するため、スペクトルを集積させた(9回)。続く実験態様において、CDシグナルを固定波長で温度の関数として記録した。融解および再フォールディング曲線(20℃〜100℃//100℃〜20℃)をサーモコッカス・ガンマトレランスSlyD誘導体に関して、ならびにサーマス・サーモフィラスSlyD誘導体に関して(20℃〜85℃//85℃〜20℃)、277nmで記録した。加熱および冷却速度は1分あたり1℃であった。
8〜12週齢のBalb/cおよびNMRIマウスをそれぞれ、100μgのサーマス・サーモフィラスSlyD−IGF−1(74〜90)での反復腹腔内免疫に供した。マウスを3回免疫し、すなわち最初の免疫の6週後および10週後の時点でもまた免疫した。完全フロイント・アジュバントを用いて第一の免疫を実行し、不完全フロイント・アジュバントを用いて第二および第三の免疫を行ってもよい。天然組換えIGF−1およびサーマス・サーモフィラスSlyD−IGF−1(74〜90)に対するマウス血清力価を、以下に記載するように、ELISA法によって12週後に試験した。Firmware:V3.15 19/03/01;XREAD PLUSバージョン:V4.20の元で実行するTecan Sunrise上で、ELISAを行った。1mlあたり0.5μgポリペプチドを含む溶液を適用することによって、Nunc Maxisorb Fマルチウェルプレートをサーマス・サーモフィラスSlyD−IGF−1(74〜90)でコーティングした。90ng/mlビオチン化IGF−1を含む溶液を適用することによって、単離およびビオチン化IGF−1をStreptaWell High Bind SAマルチウェルプレートのウェル中に固定した。その後、PBS中に1%RPLAを含む溶液を、室温で1時間適用することによって、未結合の結合部位をブロッキングした。0.9%(w/v)塩化ナトリウムおよび0.05%(w/v)Tweenを含む溶液でウェルを3回洗浄した。マウス血清をPBSで1:50に希釈し、そして試料として用いた。場合によって、1:819,200の最終希釈まで、さらなる希釈を1:4段階で行った。インキュベーション時間は、室温で1時間であった。0.9%(w/v)塩化ナトリウムおよび0.05%(w/v)Tweenを含む溶液でウェルを3回洗浄した。検出抗体として、ペルオキシダーゼにコンジュゲート化した、ターゲット抗体の定常ドメインに対するポリクローナル抗体を用いた(PAK<M−Fcγ>S−F(ab’)2−POD)。1%(w/v)RSAを含むPBS中、80ng/mlの濃度で検出抗体を適用した。インキュベーション時間は、室温で1時間であった。0.9%(w/v)塩化ナトリウムおよび0.05%(w/v)Tweenを含む溶液でウェルを3回洗浄した。その後、ウェルをABTS溶液と、室温で15分間インキュベーションした。発色強度を測光法で測定した。図3は、得られたマウス血清力価を示す。
免疫原、サーマス・サーモフィラスSlyD−IGF−1(74〜90)、ビオチン化天然IGF−1および野生型サーマス・サーモフィラスSlyDおよびブランクプレートそれぞれに対する反応性に関するELISAによって、一次培養上清を試験した。Tecan Sunrise、Firmware:V3.15 19/03/01;XREAD PLUSバージョン:V4.20で、ELISAを駆動した。Nunc Maxisorb Fマルチウェルプレートを5μg/ml SlyD融合ポリペプチドでコーティングした。125ng/ml組換えビオチン化IGF−1抗体でStreptaWell High Bind SAマルチウェルプレートをコーティングした。その後、PBS中の1%RPLAによって、室温で1時間、未結合の結合部位をブロッキングした。0.9%(w/v)塩化ナトリウムおよび0.05%(w/v)Tweenを含む溶液でウェルを3回洗浄した。RPMI 1640培地中の未希釈ハイブリドーマ上清を試料として用いた。インキュベーション時間は、室温で1時間であった。0.9%(w/v)塩化ナトリウムおよび0.05%(w/v)Tweenを含む溶液でウェルを3回洗浄した。検出抗体として、ペルオキシダーゼにコンジュゲート化した、ターゲット抗体の定常ドメインに対するポリクローナル抗体を用いた(PAK<M−Fcγ>S−F(ab’)2−POD)。1%(w/v)RSAを含むPBS中、80ng/mlの濃度で検出抗体を適用した。インキュベーション時間は、室温で1時間であった。0.9%(w/v)塩化ナトリウムおよび0.05%(w/v)Tweenを含む溶液でウェルを3回洗浄した。その後、ウェルをABTS溶液で、室温で15分間インキュベーションした。405nmで、発色強度を測光法で測定した。参照波長は492nmであった(図4を参照されたい)。組換えIGF−1、サーマス・サーモフィラスSlyD−IGF−1(74〜90)への結合に際して、ELISAにおいて迅速でそして強い色形成を示し、そしてサーマス・サーモフィラスSlyDに対してより少ない結合を示す、一次ハイブリドーマ上清を、以下に記載するような動力学スクリーニングプロセスに移した。
サーマス・サーモフィラスSlyD−IGF−1(74〜90)、天然組換えIGF−1、天然組換えIGF−2、野生型サーマス・サーモフィラスSlyD、およびサーマス・サーモフィラスSlyD−IGF−1(74〜90)を、SPRに基づく動力学スクリーニング分析に用いた。SPR分析のため、一般的に、溶液中で単量体および一価分析物を用いて、ラングミュア・モデルにしたがって抗体結合動力学を測定することが認められる。さらに、SPR測定のため、より高い分子量を持つ分析物を用いて、測定感度を増加させることがむしろ好適であり、これはSPRが質量感受性分析であるためである。
BIAcore CM5センサーを系内にマウントしたBIAcore T200装置(GE Healthcare)を用いた。0.1%SDS、50mM NaOH、10mM HClおよび100mM H3PO4を100μl/分で1分間注入することによって、センサーをプレコンディショニングした。
図8は、足場由来モノクローナル抗体M−11.11.17が、IGF−1に対してピコモル濃度アフィニティを有することを示す。足場由来モノクローナル抗体M−10.7.9は、IGF−1に対してナノモル濃度アフィニティを有する。IGF−2に対する交差反応性も、または野生型サーマス・サーモフィラスSlyDに対する交差反応性も、または野生型サーモコッカス・ガンマトレランスSlyDに対する交差反応性も、またはサーマス・サーモフィラスSlyD−ΔIF融合ポリペプチドに対する交差反応性も、またはサーモコッカス・ガンマトレランスSlyD−IGF−2(53〜65)融合ポリペプチドに対する交差反応性も、検出不能であった。
CelluSpotsTM合成およびエピトープマッピング
ヒトIGF1の配列に対応する重複固定ペプチド断片(長さ:15アミノ酸)のライブラリーによって、エピトープマッピングを行った。合成する各ペプチドを、1アミノ酸ずつシフトし、すなわち各ペプチドは、前のペプチドおよび後のペプチドと、それぞれ14アミノ酸の重複を有する。ペプチドアレイの調製のため、Intavis CelluSpotsTM技術を使用した。このアプローチでは、修飾セルロースディスク上、自動化合成装置(Intavis MultiPep RS)でペプチドを合成し、合成後にディスクを溶解させる。次いで、巨大分子セルロースに共有結合した個々のペプチドの溶液をコーティングした顕微鏡スライド上にスポットする。384ウェル合成プレート中、アミノ修飾セルロースディスク上で、9−フルオレニルメトキシカルボニル(Fmoc)化学反応を利用して、CelluSpotsTM合成を段階的に行った。各カップリング周期で、対応するアミノ酸をDMF中のDIC/HOBtの溶液で活性化した。カップリング工程間で、未反応アミノ基を、無水酢酸、ジイソプロピルエチルアミンおよび1−ヒドロキシベンゾトリアゾールの混合物でキャッピングした。合成完了時、セルロースディスクを96ウェルプレートに移し、そして側鎖脱保護のため、トリフルオロ酢酸(TFA)、ジクロロメタン、トリイソプロピルシラン(TIS)および水の混合物で処理した。切断溶液を除去した後、セルロース結合ペプチドを、TFA、TFMSA、TISおよび水の混合物で溶解し、ジイソプロピルエーテルで沈殿させ、そしてDMSO中に再懸濁した。続いて、Intavisスライドスポッティングロボットを用いて、ペプチド溶液をIntavis CelluSpotsTMスライド上にスポットした。
Claims (5)
- インスリン様増殖因子1前駆体(配列番号1)のアミノ酸76〜84(配列番号3)からなるエピトープに結合する、インスリン様増殖因子1(IGF−1)に特異的な単離されたモノクローナル抗体。
- 重鎖可変ドメインが、配列番号15のCDR3H領域、配列番号16のCDR2H領域、および配列番号17のCDR1H領域を含み、そして軽鎖可変ドメインが、配列番号18のCDR3L領域、配列番号19のCDR2L領域、および配列番号20のCDR1L領域を含むことにおいて、前記抗体が特徴付けられる、請求項1の抗体。
- 前記抗体が、インスリン様増殖因子1前駆体(配列番号1)のアミノ酸77〜84(配列番号4)からなるエピトープに結合する、請求項1の抗体。
- 重鎖可変ドメインが、配列番号23のCDR3H領域、配列番号24のCDR2H領域、および配列番号25のCDR1H領域を含み、そして軽鎖可変ドメインが、配列番号26のCDR3L領域、配列番号27のCDR2L領域、および配列番号28のCDR1L領域を含むことにおいて、前記抗体が特徴付けられる、請求項3の抗体。
- サンドイッチ・イムノアッセイを通じて、体液試料においてIGF−1を検出するための方法であって:
a)請求項1〜4のいずれか1項に記載の抗体と試料をインキュベーションし、それによって、前記試料中に含まれるIGF−1に対する前記抗体の結合が起こり、
b)IGF−1前駆体のアミノ酸76〜84を含まないエピトープに結合する、IGF−1に対する第二の抗体と、試料をインキュベーションし、それによって、第二の抗体の結合が起こり、そして
c)工程(a)および(b)において形成された免疫学的サンドイッチ複合体を測定し、それによって試料中のIGF−1を検出する
工程を含む、前記方法。
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JP2017048209A (ja) * | 2011-05-05 | 2017-03-09 | エフ.ホフマン−ラ ロシュ アーゲーF. Hoffmann−La Roche Aktiengesellschaft | インスリン様増殖因子1に特異的に結合する抗体 |
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