JP6117227B2 - 顕微鏡用のモード切り換え可能な照射システム - Google Patents

Description

本発明は顕微鏡システム用のモード切り換え可能な照射システムに関し、より詳細には例えば全反射蛍光（ＴＩＲＦ）及び光動力学（ＰＫ）照射モードの間でモード切換可能な照射システムに関する。

全反射蛍光（ＴＩＲＦ）照射及び光動力学（ＰＫ）照射は、顕微鏡法において一般に用いられる２つの、レーザをベースとする照射モードである。通常のＴＩＲＦシステムは、高開口数（ＮＡ）対物レンズの背面焦点面（ＢＦＰ）の最も端部近くの集束されたレーザビームを用いるものである。この構成は結果として、急な入射角でカバースリップ／試料界面に突き当たるコリメート光ビームを生じる。入射角が十分に急である場合は、光はカバースリップ（ガラス）から試料（水）への界面において全反射されることになる。このようにしてカバースリップ／試料界面に近接した（＜１００ｎｍ）蛍光粒子のみが照射され、したがって画像コントラストが大幅に改善される。走査ＴＩＲＦはＴＩＲＦ照射の進歩した形であり、ビームは対物レンズＢＦＰの端部を囲むように円形パターンにて走査される。この技法は従来型のＴＩＲＦの薄い照射区間を生じるが、シャドーイング、散乱及び干渉パターンを含むＴＩＲＦ顕微鏡法での難点となる多くのアーチファクトを大幅に低減する。更に背面焦点面を囲むように励起ビームを走査することで、従来型のレーザ落射蛍光（非ＴＩＲＦ）照射方式におけるこれらの同じアーチファクトが低減又は除去される。

これと異なりＰＫ照射は、ビームが試料面において強く集束されるように、対物レンズに入るコリメート光ビームを用いるものである。この集束ビームは、非限定的に光活性化、光退色、化学アンケージング及びレーザアブレーションを含む、試料内の正確な場所でのいくつかの反応を引き起こすために用いることができる。走査ＰＫは、試料自体を移動せずに試料面内の任意の場所に集束ビームを導く能力をもたらす。

単一のレーザ発射点から単一の機器上で、走査ＴＩＲＦ及びＰＫ照射モードの両方をもたらすことが望ましい。更に多くの実験は、これら２つのモードの間で急速に切り換える能力から恩恵を受けることができる。

本発明の目的は、第１及び第２の照射モードの間でモード切換可能な顕微鏡システム用の新しい照射システムを提供することであり、この照射システムは従来技術の１以上の欠点を克服する。これは特許請求の範囲の独立項において定められる照射システムによって達成される。

米国特許出願公開２００２／０１５４３１１

一態様では、第１及び第２の照射モードの間でモード切換可能な顕微鏡システム用の照射システムが提供されるが、本照射システムは、コリメート光ビームを与える１つの光源と、光ビームを２つの異なるビーム経路に方向付ける２以上の位置に配置させることができる１以上の選択ミラーとを備えており、第１のビーム経路が直接射出ビーム経路であって、選択ミラーが光ビームを射出ビーム経路に沿って方向付けて第１の照射モードをもたらし、第２のビーム経路が、光ビームを選択ミラーへと方向付けて選択ミラーによって光ビームが再度射出ビーム経路に沿って方向付けられるように構成された２以上のミラーを備えるミラーループ経路であって、ミラーループ経路が、光ビームを光学的に変化させて第２の照射モードをもたらすように構成された１以上の光学素子を備えている。

一態様では、ミラーループ経路は、光学素子に対して所定のビーム経路長を与える延長ミラーループを備える。

一態様では、走査ミラーは、出力光ビームの選択的走査をもたらすように射出ビーム経路に配設される。

一態様では、走査ミラーは、２次元の選択的走査をもたらすように構成される。

一態様では、選択ミラーは第１の次元で光ビームの選択的走査をもたらし、走査ミラーは第１の次元と実質的に交差する第２の次元での選択的走査をもたらすように構成され、走査ミラーと選択ミラーの相互走査が出力光ビームの２次元走査をもたらすように制御される。

一態様では、走査ミラーで選択的に指定される第２のミラーループ経路が設けられていて、光ビームを走査ミラーへと方向付けて、走査ミラーによって光ビームが再度射出ビーム経路に沿って方向付けられるように構成された２以上のミラーを備えており、もって射出ビームが平行移動によって走査される。

一態様では、１以上の射出光学素子であって、ミラーループ経路の１以上の光学素子に対して光学的に整合かつ位置していて、光ビームを光学的に変化させて第１及び第２の照射モードをもたらすように構成された１以上の射出光学素子が設けられる。

射出光学素子は、顕微鏡システムの対物レンズの背面開口に光ビームを集束するように構成された射出レンズとすることができ、ミラーループ経路内の光学素子は、光ビームが射出レンズに到達する前に、ビーム経路に沿った所定の点に光ビームを集束して、収束光ビームが再コリメートされるように構成されたレンズである。

一態様では、第１の照射モードは全反射（ＴＩＲＦ）であり、第２の照射モードは光動力学（ＰＫ）照射である。

更に、第１及び第２の照射モードの間でモード切換可能な照射システムを備える顕微鏡システムが提供される。

ここで述べられる全体的な解決策は、一実施形態によれば、別々の経路にビームを向けるため及びこれら２つの別々の経路からのビームを、対物レンズに向かう共通の射出経路に沿って向け直すための両方に、チルトミラー（好ましくは、非限定的にガルバノメータミラー）を用いることである。この手法は、２つのモードの１以上に対してビームが、チルトミラーから２回以上（１回はビームを代替経路に向けるように及び１回はビームを共通の射出経路に沿って向け直すために）反射しなければならないということが必要にする。第２のチルトミラーを追加する又はそれを２軸チップ／チルトミラーで置き換えることによってこの構成は、背面焦点面全体を囲むように（ＴＩＲＦモードで）又は試料面全体を囲むように（ＰＫモードで）、集束ビームの完全な走査能力をもたらすことができる。これはまた走査角度の大きさをわずかに減少することによって、従来型の落射蛍光（非ＴＩＲＦ）のやり方においてビームを走査する能力をもたらす。このようにして対物レンズ背面開口においてビームが刻む円の直径は、試料界面において全反射を発生するのに必要な閾値より小さい。更にシステムは、試料を通して非常に急な（ＴＩＲＦに近い）透過角度を生じる能力をもたらして試料焦点面の上又は下に存在する蛍光体の励起を低減することにより画像コントラストを大幅に改善する。

ここで述べられる手法は、同じ光学装置上で経路分岐と経路再結合の両方を行うことによって、以前の手法の多くの短所を克服する。これは効率を改善しながら、システムの複雑さ及びコストを共に低減することに役立つ。更にこのシステムは、複数のレーザ発射点又は高価で複雑なビーム再結合光学構成要素又は偏光器を必要としない。最後にこの手法は、ＴＩＲＦ、従来型の落射蛍光又はＰＫモードにおいてビームの完全な走査をもたらすように容易に適用することができ、モード間の切り換えは２ｍｓ程度の非常に高速に達成することができる。

本発明のより完全な理解、並びに本発明の他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明及び図面を参照することによって得られるであろう。

本発明の一実施形態に係る第１及び第２の照射モードの間でモード切換可能な顕微鏡システム用の照射システムの一例を示す概略図である。 本発明の一実施形態に係る第１及び第２の照射モードの間でモード切換可能な顕微鏡システム用の照射システムの一例を示す概略図である。 例示的なビームトランスレータの平面図及び等角図である。 図３に示すビームトランスレータの実例を示す図である。 図３に示すビームトランスレータを通って進む光ビームに関連する内部経路のスナップショット図である。 図１〜図２の照射システムの簡略図である。 図１〜図２の照射システムの簡略図である。 図１〜図２の照射システムの簡略図である。 図１〜図２のモード切り換え可能な照射システムの別の実施形態の簡略図である。 図１〜図２のモード切り換え可能な照射システムの別の実施形態の簡略図である。

図１及び図２は本発明の一実施形態に係る第１及び第２の照射モードの間でモード切換可能な顕微鏡システム用の照射システムの一例の概略図を示す。開示される実施形態において照射システムは、第１の照射モードは全反射（ＴＩＲＦ）であり、第２の照射モードは光動力学（ＰＫ）照射である。図１はＴＩＲＦモードにおける照射システムを示し、図２はＰＫモードにおける照射システムを示す。システムは、コリメート光ビーム２２を供給するように構成された照射源２０、例えばレーザ源を備える。第１の走査ミラー３０（いくつかの実施形態では選択ミラーとも呼ばれる）は、例えばガルバノメータ駆動装置、圧電駆動装置などの、駆動ユニット４０によって第１の軸の周りに走査回転するように駆動される。図１では第１の走査ミラーは、第１の全体的な方向に位置決めされて、駆動ユニット６０によって、好ましくは第１の軸を横切る第２の回転軸の周りに走査回転するように駆動される第２の走査ミラー５０に光ビームを反射する。図１では第２の走査ミラー５０は、第１の全体的な位置に配置されて光ビームを射出ビーム経路５２に沿って方向転換して光ビームは対物レンズ１７０の背面開口に光ビームを集束するように構成されたレンズ１６０を通過する。制御ユニット２００は、第１及び第２の走査ミラー３０及び５０の走査位置を制御するように接続及び構成される。図１の照射モードでは、第１及び第２の走査ミラー３０及び５０は、それらのそれぞれの第１の全体的な位置内で走査されそれによって、例えば走査ＴＩＲＦの場合は、図１の点線円によって示されるように対物レンズ１７０の背面焦点面の端部における所望の位置において射出光ビームを選択的に位置決めするように構成される。図１では走査ＴＩＲＦモードは、第１の走査ミラー３０から対物レンズ１７０の背面開口に延びる２つのビーム経路（実線及び破線）によって示される。しかし開示される実施形態は、１つの光ビームを走査するように構成され、開示されるビーム経路のそれぞれは、第１及び第２の走査ミラー３０及び５０の２つの異なる相互位置をそれぞれ表す。

図２には、光動力学照射モードにおけるシステムが示され、第１及び第２の走査ミラー３０及び５０は共に第２の全体的な位置においてそれぞれ構成される。第２の全体的な位置に構成されたときは走査ミラー３０は、再び第１の走査ミラー３０上に光ビームを方向付けるように構成されたミラー９０、１００、１１０、１２０及び１３０を備える第１のミラーループ７０内に光ビームを向け直す。その後に光ビームは第２の走査ミラー５０に向けられる。この第２の全体的な位置では第２の走査ミラー５０は、再び第２の走査ミラー５０上に光ビームを方向付けるように構成されたミラー１４０及び１５０から構成される第２のミラーループ内に、光ビームを方向付けるように構成される。

前述のように光動力学照射モードは、コリメート光ビームの角度を、対物レンズ１７０の背面開口において走査するものである。これは結果として試料面において、集束されたスポットの位置の走査を生じる。開示されるシステムではこれは、光ビームがレンズ１６０に到達する前にビーム経路に沿った所定の点に光ビームを集束して収束光ビームが再コリメートされるように構成された、第１のミラーループ７０にレンズ１９０を組み込むことによって達成される。対物レンズ１７０の背面焦点面における光ビームの角度は、第１及び第２の走査ミラー３０及び５０はそれらのそれぞれの第２の全体的な位置内で走査されるように構成されるので走査することができ、それによって射出光ビームを選択的に位置決めすることができる。

以下で図３〜図５を参照してより詳しく説明するように、第１及び第２のミラーループ構成は、光ビームの純粋な変換を達成するように設計することができる。レンズ１９０を備える第１のミラーループでは、これはループ内のミラーの非偶数回の反射によって達成され、ループ内に５つの静止ミラー９０、１００、１１０、１２０及び１３０を用いた開示される実施形態は、限定的なものではなく、単にどのようにこのようなループが設計されるかの例として役立つものである。以下で例えば図６及び図７で開示されるように、第１のミラーループは２つのミラーだけを用いて設計することができる。図１及び図２の実施形態では、個々のミラー及び他の構成要素の配置は１つの設計を表し、機能的な、空間的な効率の良い照射システムをもたらすように、異なる構成要素の間の光路長が考慮に入れられる。具体的にはミラー１００、１１０及び１２０は、図８において更に開示されるように、第１の走査ミラー３０及びレンズ１９０の間の引き伸ばされた経路長を確立するように設計に含められる。第２のミラーループでは２つのミラーによって純粋な変換が達成されるが、望むなら引き伸ばされた経路長をもたらすために、第２のループ内に追加のミラーを含めることもできる。

純粋なモード選択ユニットが十分である場合は、第２の走査ミラーは省くことができ、第１の走査ミラーを、上記の全体的な位置に対応する２つの固定の位置に位置決めするだけでよい。

これらの実施形態によって第１の走査ミラーは、ビームを別々の経路に導くため及びこれらの２つの別々の経路からのビームを、対物レンズに向かって共通の射出経路に沿って向け直すための両方に、用いることができる。

図に示されない一実施形態では、更には１つの走査ミラーに関連して２以上のミラーループが存在することができ、それによって光路内に代替の光学構成要素を導入することができる。一実施形態では光学素子、例えばレンズ１６０及び１９０は、フィルタ又は光ビームを光学的に変化させるように構成された他の光学素子などの、１以上の他の光学素子によって置き換えることができ又はそれらは、ミラーループ内に又はミラーループ外に切り換えることによって制御されるのに従って、そこで光路に含める又は光路から除外される、光路内の異なる位置に配置することができる。

図３Ａ〜図３Ｂは、前の実施形態において開示されたようなミラーループを備える例示的なビームトランスレータ６００の平面図及び等角図を示す。トランスレータ６００は、走査ミラー６０２、第１の平坦な固定ミラー６０４及び第２の平坦な固定ミラー６０６を含む。固定ミラー６０４の反射面は走査ミラー６０２と固定ミラー６０６の間の領域に向かって曲げられ、固定ミラー６０６の反射面は走査ミラー６０２と固定ミラー６０４の間の領域に向かって曲げられる。図３Ａ〜図３Ｂの例では走査ミラー６０２は、ガルバノメータモータ又はステッパモータとすることができるモータ６１０の回転可能なシャフトに取り付けられた平坦なピボットミラー６０８を含む、ガルバノメータミラーである。代替として走査ミラーは圧電制御型ミラーとすることができる。図３Ａ〜図３Ｂに示すようにミラー６０８は、ある範囲の角度にわたりモータ６１０によって連続的に往復して回転される。

図４は、動作時のビームトランスレータ６００の平面図を示す。上述のような光源１０２からの光ビーム出力などの、光ビーム７００はミラー６０８に向けられる。図４はミラー６０８が、ミラー６０８に対する一連の回転位置のうちの３つだけを表す、３つの位置１、２及び３に回転されることを示す。異なるパターンの線７０１〜７０３はそれぞれ、ピボットミラー６０８が３つの位置１、２及び３のうちの１つに回転されたときの、トランスレータ６００を通って進むビーム７００の３つの異なる経路を表す。図４の例に示すように、固定ミラー６０４及び６０６、並びにピボットミラー６０８は、ビームが４回の反射を通じて、３つの実質的に平行な経路の１つに沿って出力されるように配置される。言い換えればミラー６０８は、一連の実質的に平行な経路の１つに沿った４回の反射の後に、トランスレータ６００から結果としてビームが出力される、一連の位置のいずれかに１つに回転することができる。理想的には、出力ビームがそれに沿って進む出力経路は平行であり交差しないが、実際には経路は、相対的な配置及びミラーの方向におけるわずかなばらつきにより、トランスレータ６００から離れた非常に長い距離においては、近似的に平行なだけとなり又は交差し得ることが理解される。結果としてトランスレータ６００からビームをそれに沿って出力することができる経路は、近似的に平行であると呼ばれる。

結果としてビーム７００が平行な経路の１つに置かれる、ピボットミラー６０８の各回転位置に対して、ビーム７００は、ピボットミラー６０８から２回、固定ミラー６０４から１回及び固定ミラー６０６から１回反射され、合計４回の反射となる。図５Ａ〜図５Ｃはそれぞれ、ピボットミラー６０８が３つの位置１、２及び３に回転されたときに、ビーム７００がトランスレータ６００を通って進む内部経路のスナップショットを示す。図５Ａではピボットミラー６０８は位置１に回転される。ビーム７００は点８０２においてピボットミラー６０８に当たり、順に１、２、３及び４と番号が付けられた反射を有して、ミラー６０４、６０６及び６０８から４回の反射を受ける。点８０４でのピボットミラー６０８からの４番目の反射は、図８にも示される経路７０１上にビームを置く。図５Ｂではピボットミラー６０８は位置２に回転される。ビーム７００は点８０６においてピボットミラー６０８に当たり、順に１’、２’、３’及び４’と番号が付けられた反射を有して、ミラー６０４、６０６及び６０８から４回の反射を受ける。点８０６近くでのピボットミラー６０８からの４’番目の反射は、図８にも示される経路７０２上にビームを置く。図５Ｃではピボットミラー６０８位置３に回転される。ビーム７００は点８０８においてピボットミラー６０８に当たり、順に１”、２”、３”及び４”と番号が付けられた反射を有して、ミラー６０４、６０６及び６０８から４回の反射を受ける。点８１０でのピボットミラー６０８からの４”番目の反射は、図８にも示される経路７０３上にビームを置く。

ビームトランスレータ６００は、走査ミラー６０２のためにガルバノメータミラーを用いて実現されたときは、ミリ秒未満の出力ビームの変換を達成することができる。

図６及び図７は、図１及び図２の照射システムの全体的な図を示すが、システム及びビーム経路の３次元の図は、図３〜図５のビームトランスレータ６００に基づく簡略化された２次元の図に変形されている。図６及び図７では、第１及び第２の走査ミラー３０及び５０、並びにそれらの関連するミラーは、２つの概略的なビームトランスレータ区間Ａ及びＢのそれぞれに分離されている。照射システムの簡略図を示すために、区間Ａのビームトランスレータは、区間Ｂのビームトランスレータに対してほぼ９０°回転されて示される。２つの区間Ａ及びＢの互いに対する回転角は正確に９０°である必要はなく、システムからの出力光ビームの所望の走査能力を得るのに十分回転が大きければ十分である。図６及び図７では、区間Ａの第１の走査／選択ミラー３０は第１の次元、即ち第１の走査平面において光ビームを走査するように構成され、区間Ｂの第２の走査ミラー５０は第２の次元、即ち第２の走査平面において光ビームを走査するように構成され、第２の次元は第１の次元に本質的に直交する。したがって第１の走査／選択ミラー３０及び第２の走査ミラー５０の相互の走査を選択的に制御することによって、出力光ビームの２次元走査がもたらされる。更に図６及び図７はまた、照射システムからの出力光ビームをより良く示すために、区間Ｂのビームトランスレータに対して９０°回転されて対物レンズ１７０の背面端部が示される。上記で簡単に述べたように図６及び図７では、ビームトランスレータ区間Ａ及びＢを用いた第１及び第２の照射モードの間の切り換えの基本原理をより明確に示すために、図１及び図２のミラー１００、１１０及び１２０は省かれている。しかし図８は、引き伸ばされた、或いはその他の方法で再構成された光学経路を形成するためのミラーを備えた照射システムの、対応する簡略図を示す。

上述のように図１〜図２及び図６〜図７の実施形態では、両方のビームトランスレータ区間Ａ及びＢはそれぞれ、本質的に光ビームの平行移動を生じるように構成される。

図９及び図１０に概略的に開示される一実施形態によれば、ビームトランスレータ区間Ａは、照射システムの光学ビーム経路への及び経路外への１以上の光学素子の選択的な切り換えのための純粋なモードスイッチとして用いることができる。開示される実施形態では、前の実施形態の走査ミラー５０は、出力光ビームの所望の走査をもたらすように２次元の走査を行うことができる走査ミラー２１０によって置き換えられる。

本発明による第１及び第２の照射モードの間でモード切換可能な照射システムは、例えば適切な顕微鏡システム用のモジュール型増設ユニットとして提供することができ又は顕微鏡の一体部分として一体化することができ及び照射システムは２つの照射モードの間での切り換えに限定される必要はなく、広範な照射モード並びに適当な中間的な照射モードをもたらすことができる。

上記では説明の目的のために、本開示の十分な理解を得るために特定の用語が用いられた。しかし当業者には、本明細書で述べられたシステム及び方法を実施するためには特定の詳細は必要ないことが明らかであろう。特定の例についての上記の説明は、例示及び説明の目的のために示されたものである。これらは網羅的であることを意図するものではなく、述べられた正確な形に本開示を限定するものでもない。明らかに、上記の教示に鑑みて多くの変更形態及び変形形態が可能である。例は本開示の原理及び実際の用途を最も良く説明し、それにより当業者が本開示及び企図される特定の用途に適するように様々な変更を有する様々な例を最も良く利用することを可能にするように示され説明された。本開示の範囲は、添付の特許請求の範囲及びそれらと均等なものにより定められるものとする。

Claims (7)

1. 第１及び第２の照射モードの間でモード切換可能な顕微鏡システム用の照射システムであって、コリメート光ビームを与える１つの光源と、光ビームを２つの異なるビーム経路に方向付ける２以上の位置に配置させることができる１以上の選択ミラーとを備えた照射システムであって、
   第１のビーム経路が直接射出ビーム経路であって、選択ミラーが光ビームを射出ビーム経路に沿って方向付けて第１の照射モードをもたらし、
   第２のビーム経路が、光ビームを選択ミラーへと方向付けて選択ミラーによって光ビームが再度射出ビーム経路に沿って方向付けられるように構成された２以上のミラーを備えるミラーループ経路であって、ミラーループ経路が、光ビームを光学的に変化させて第２の照射モードをもたらすように構成された１以上の光学素子を備え、
   前記照射システムは、
   出力光ビームの選択的走査をもたらすように射出ビーム経路に配設された走査ミラーで選択的に指定される第２のミラーループ経路であって、光ビームを走査ミラーへと方向付けて、走査ミラーによって光ビームが再度射出ビーム経路に沿って方向付けられるように構成された２以上のミラーを備えた第２のミラーループ経路を有し、これにより射出ビームが平行移動によって走査される、照射システム。
2. ミラーループ経路が、光学素子に対して所定のビーム経路長を与えるように延長ミラーループを備える、請求項１記載の照射システム。
3. 走査ミラーが、２次元の選択的走査をもたらすように構成される、請求項１又は２に記載の照射システム。
4. 選択ミラーが第１の次元で光ビームの選択的走査をもたらすように構成され、走査ミラーが第１の次元と実質的に交差する第２の次元での選択的走査をもたらすように構成され、走査ミラーと選択ミラーの相互走査が出力光ビームの２次元走査をもたらすように制御される、請求項１乃至３のうちのいずれか１項記載の照射システム。
5. １以上の射出光学素子であって、ミラーループ経路の１以上の光学素子に対して光学的に整合かつ位置していて、光ビームを光学的に変化させて第１及び第２の照射モードをもたらすように構成された１以上の射出光学素子を備える、請求項１乃至請求項４のいずれか１項記載の照射システム。
6. 射出光学素子が、顕微鏡システムの対物レンズの背面開口に光ビームを集束するように構成された射出レンズであり、ミラーループ経路内の光学素子が、光ビームが射出レンズに到達する前に、ビーム経路に沿った所定の点に光ビームを集束して、収束光ビームが再コリメートされるように構成されたレンズである、請求項５記載の照射システム。
7. 請求項１乃至請求項６のいずれか１項記載の照射システムを含む、顕微鏡システム。