JP5993928B2 - 一体型カートリッジ - Google Patents
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Description
本明細書は、その全文を参照文献として本明細書に援用する2009年9月21日出願の米国仮特許出願第61/272,397号の優先権を主張する。
一定の実施形態においては、サンプル調製チャンバー10は細胞サンプルを溶解するためのサンプル溶解手段をさらに含む。図2に示す実施形態においては、サンプル調製チャンバー10は多数の細胞溶解ビーズ13および磁石15を有する磁気撹拌子14を収容する。無傷の細胞の懸濁液をサンプル調製チャンバー10に加え、さらにサンプル調製チャンバー10に回転磁場を適用し、細胞を溶解するのに十分な回転速度で磁気撹拌子14を回転させる。
サンプルの処理を目的とした簡易型カートリッジも開示される。カートリッジは、入口および出口を有するサンプル調製チャンバー、ならびに入口および出口を有するサンプル精製チャンバーを含む。サンプル調製チャンバーは、その中に排置された磁気撹拌子および多数の細胞溶解ビーズを含む。サンプル精製チャンバーは抽出フィルターを収容し、かつサンプル調製チャンバーと流動的に連絡する。
タンパク質精製能力および核酸精製能力を共に有するデュアルファンクションカートリッジも開示される。簡単に述べると、デュアルファンクションカートリッジは核酸精製モジュールおよびタンパク質精製モジュールを収容する。各モジュールはサンプル精製チャンバーおよびサンプル溶離チャンバーを収容する。1つの実施形態においては、モジュールは単一のサンプル調製チャンバーおよび/または単一の廃液チャンバーを共有する。他の実施形態においては、モジュールは単一のサンプル調製チャンバーを共有するが、各モジュールは専用の廃液チャンバーを収容する。さらに他の実施形態においては、各モジュールは専用のサンプル調製チャンバーおよび廃液チャンバーを有する。適切なカートリッジベース設定は、核酸およびタンパク質の同時精製または核酸およびタンパク質の連続精製を可能とするよう構築することができる。
マイクロアレイベースサンプル分析(MBSA)システムも開示される。図4に示すように、MBSAシステム200の実施形態はカートリッジホルダー210、流動制御サブシステム220、光学サブシステム230、制御ソフトウェア240および、任意選択で、サーモサイクラー250を含む。
(A.流動サブシステム)
流動サブシステムは3種類の機能的コンポーネント:二方向微量流動ポンプ、選択バルブ、およびカートリッジ「ピン」バルブよりなる。図5は、一体型カートリッジに接続されたポンプおよび選択バルブを示す流動サブシステムの模式図である。流動配置は、Global FIAより入手可能である二方向ポンプおよび選択バルブの組合せを用いる。図5に示すように、流動サブシステムは流動マニホールド90を介して一体型カートリッジと接続され、かつ一体型カートリッジ100の外部の貯蔵容器に様々な試薬を保持する。
嚢状サーモサイクラーサブシステムは、そのいずれもが本明細書に参照文献として援用される米国特許出願番号第11/843,843号および第12/232,669号に記載される。
図11Aは、光学サブシステムの1つの実施形態を示す模式図である。低コスト光学サブシステムは、比較的複雑度の低いアレイ(アレイエレメント数<50)を読み取ることを目的として開発される。リーダーのこのサブシステムにおいて用いられるCCDカメラは、解像度659×493ピクセルかつピクセルサイズ7.4×7.4μmの1/3”光学フォーマットの微小非冷却カメラ(例:ProsilicaモデルEC650)である。
MBSAシステムのための作業の順序は以下の通りである。ユーザーは一体型カートリッジにサンプルを導入する。次にシステムが以下の自動化ステップを実施する:サンプルを調製し、Bladder Thermocycler(商標)を用いてPCRを実施し、PCR産物をハイブリダイゼーションおよび/またはAPEX反応混合物と混合し、混合物をマイクロアレイチャンバーに移し、マイクロアレイとのハイブリダイゼーションを実施し、さらにマイクロアレイ画像を検出する。
この実施例は、法医学用途に利用することも可能な身体外観マーカーのSNP遺伝子型解析用微量流動制御システムの実施可能性を証明する。実験環境では、サンプル調製、PCR増幅およびアレル特異的配列プライマー伸長(AS−APEX)用コンポーネントを組み合わせ、眼色マーカーを検出するための一体型システムを形成する。システムは、液状物操作サブシステム(例:ポンプ)、サーマルサイクリングサブシステム(例:Akonni Bladder Thermocycler)、光学器具(例:Akonni Reader)、ディスポーザブル一体型カートリッジ(すなわちAkonni TruTip、Akonni PCR/TruArrayフローセル、微量流動回路、および微量流動バルブ)およびカートリッジドッキングステーションを含む。
一体型分析システムの制御を目的として、DX3000自動タスク実行プログラムと称するソフトウェアプログラムが作成された。3つの主要なサブシステム(流動操作サブシステム、サーモサイクラーサブシステム、および光学サブシステム)の制御を目的として、National Instruments産業用コンピュータ(NI 3110)上のLabviewにおいてコードを書いた。NI 3110は、一方のコアがWindows用のタスクを実行し、かつもう一方のコアがReal−Timeオペレーティングシステム(OS)用のタスクを実行するデュアルコアプロセッサを有する。このアーキテクチャにより、ユーザーインターフェースの管理、連続通信および画像処理といった高レベルのWindowsタスク、ならびにヒーター、リニアアクチュエーター、サーモサイクラーポンプ、および時間が厳密に決められたイベントの制御といった低レベルの決定論的タスクを実行することが可能となる。Real−Time OSは、アナログ入力、アナログ出力、およびデジタルI/OモジュールをスキャンするEthercat I/Oモジュールと通信する。
一体型カートリッジは、タンパク質精製能力および核酸精製能力を共に含むよう変更することができる。図23は、デュアルファンクション一体型カートリッジ300の1つの実施形態を示す。簡潔に述べると、カートリッジ300はタンパク質精製モジュールおよび核酸精製モジュールを含む。タンパク質精製モジュールはタンパク質廃液タワーT1、タンパク質精製タワーT2、タンパク質溶離タワーT3、カートリッジピンバルブCV1、CV2、CV3およびCV4ならびにルアー作動バルブLV1、LV2、LV3およびLV4を含む。核酸精製モジュールは、核酸廃液タワーT4、サンプル調製タワーT5、核酸精製タワーT6、核酸溶離タワーT7、カートリッジピンバルブCV5、CV6、CV7、CV8およびCV9、ならびにルアー作動バルブLV5、LV6、LV7、LV8およびLV9を含む。
1)A.全てのCVを閉じる。
B.サンプル500μLをサンプル入口よりT5に入れる。
C.CV6およびCV7を開く。
D.細胞溶解液500μLをLV5よりT5に入れる(LV7を大気にベントしながら)。
2)混合用空気をLV5よりT5に入れる(LV7を大気にベントしながら)。
3)室温で5分間インキュベートする。
4)A.CV6を閉じ、CV8を開く(CV7は開いたままとし、CV8はタンパク質精製プロトコルの開始まで開いたままとする)。
B.LV7より空気を流す(LV8を大気にベントしながら)。
C.LV8より空気を流す(LV7を大気にベントしながら)。
ステップBとCを5回繰り返す。混合物はT5とT6の間で往復して流れ、T6で止まる。
5)A.CV7を閉じ、CV2を開く。
B.LV8より空気を流し(LV2を大気にベントしながら)、混合物1mLをT1に押し出す。
6)A.CV6を開き、CV2を閉じる。
B.洗浄液をLV5よりT6に入れる(LV8を大気にベントしながら)。
C.CV6を閉じ、CV7を開く。
D.LV8より空気を流す(LV7を大気にベントしながら)。
E.LV7より空気を流す(LV8を大気にベントしながら)。
ステップDとEを5回繰り返す。洗浄液はT5とT6の間で往復して流れ、T6で止まる。
E.CV7を閉じ、CV5を開く。
F.LV8より空気を流し(LV6を大気にベントしながら)、洗浄液をT4に押し出す。
7)A.CV6を開き、CV5を閉じる。
B.空気をLV5よりT6に入れる(LV8を大気にベントしながら)。
8)A.溶離液をLV5よりT6に入れる(LV8を大気にベントしながら)。
B.CV6を閉じ、CV9を開く。
C.LV8より空気を流す(LV9を大気にベントしながら)。
D.LV9より空気を流す(LV8を大気にベントしながら)。
ステップCとDを5回繰り返す。混合物はT6とT7の間で往復して流れ、T7で止まる。
9) A.CV1およびCV2を開き、その他のCVは全て閉じる。
B.タンパク質結合液をLV1よりT1に入れる(LV2を大気にベントしながら)。
10)混合用空気をLV1よりT1に入れる(LV2を大気にベントしながら)。
11)室温で2分間インキュベートする。
12)A.CV3を開き、CV1を閉じる(CV2は開いたままとし、CV3はプロトコルの終了まで開いたままとする)。
B.ポンプアームを後方に引き、接続導管を経て溶液250μLをT1からT2に引き出す(LV2およびLV3はベントしない)。
C.ポンプアームを前方に押し、接続導管を経て溶液250μLをT1からT2に押し出す(LV2およびLV3はベントしない)。
ステップBおよびCを10〜15回繰り返す。CV2の直上かつT1の直下に位置するカートリッジ上の一方向チェックバルブによって、溶液は一方向ループにのみ流れる。
D.CV5を開き、CV2を閉じる。
E.LV3より空気を流し(LV6を大気にベントしながら)、溶液をT4に押し出す。
註:この段階でタンパク質廃液チャンバー(T1)が満たされているので、核酸廃液チャンバー(T4)が用いられている。
E.CV1を開き、CV5を閉じる。
13)A.洗浄液をLV1よりT2に入れる(LV3を大気にベントしながら)。
B.CV5を開き、CV1を閉じる。
C.LV3より空気を流し(LV6を大気にベントしながら)、洗浄液をT4に押し出す。
D.CV1を開き、CV5を閉じる。
ステップA〜Dを5回繰り返す。洗浄液をT2に加えた後T4に流し込む。
14)空気をLV1よりT2に加える(LV3を大気にベントしながら)。
15)空気の流量を上げて残余の液体を吹き飛ばす。
16)A.溶離液をLV1よりT2に加える(LV3を大気にベントしながら)。
B.CV1を閉じ、CV4を開く。
C.LV3より空気を流す(LV4を大気にベントしながら)。
D.LV4より空気を流す(LV3を大気にベントしながら)。
ステップCとDを5回繰り返す。溶離液はT2とT3の間で往復して流れ、T3で止まる。
Claims (14)
- 交換可能なカートリッジを受容するよう適合化されたカートリッジホルダー;
流動物の流動を制御する流動制御サブシステム;および
マイクロアレイの画像をキャプチャーするよう構成された光学サブシステム、
を含むマイクロアレイベースサンプル分析(MBSA)システムであって、
該交換可能なカートリッジは反応チャンバーおよび該反応チャンバー内のマイクロアレイを収容するサンプル分析ユニットを含み、
該反応チャンバーはポリメラーゼ連鎖反応の増幅反応のための反応チャンバーとしての役割を果たし、及び
該反応チャンバーは親水性内面を有する、前記MBSAシステム。 - 請求項1に記載のMBSAシステムであって、光学サブシステムがレーザー光源を含む、前記MBSAシステム。
- 請求項1に記載のMBSAシステムであって、光学サブシステムが、ピクセル毎にマイクロアレイ画像を取得する共焦点または準共焦点レーザースキャナーを含む、前記MBSAシステム。
- 請求項1に記載のMBSAシステムであって、光学サブシステムが、全てのマイクロアレイエレメントを同時に照明するフラッドイルミネーションによる撮像機器を含む、前記MBSAシステム。
- 請求項1に記載のMBSAシステムであって、前記光学サブシステムが高輝度LED光源を含む、前記MBSAシステム。
- 請求項1に記載のMBSAシステムであって、前記光学サブシステムがマルチエレメント光検出器を含む、前記MBSAシステム。
- 請求項6に記載のMBSAシステムであって、前記マルチエレメント光検出器がCCDベースの撮像機器である、前記MBSAシステム。
- 請求項7に記載のMBSAシステムであって、前記CCDベースの撮像機器が非冷却CCDカメラである、前記MBSAシステム。
- 請求項1に記載のMBSAシステムであって、前記光学サブシステムが蛍光撮像および蛍光非依存的撮像ができる、前記MBSAシステム。
- 請求項9に記載のMBSAシステムであって、前記光学サブシステムが蛍光撮像のための第1の光源および蛍光非依存的撮像のための第2の光源を含む、前記MBSAシステム。
- 請求項10に記載のMBSAシステムであって、前記第2の光源が発光ダイオード(LED)である、前記MBSAシステム。
- 請求項11に記載のMBSAシステムであって、前記LEDが反射光の暗視野照明を目的として構成される、前記MBSAシステム。
- 請求項11に記載のMBSAシステムであって、前記LEDが透過光の傾斜照明を目的として構成される、前記MBSAシステム。
- 請求項10に記載のMBSAシステムであって、前記第2の光源がハロゲン化金属または水銀球である、前記MBSAシステム。
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