CN105675496B - 一体化料筒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了用于样品处理和分析的一体化料筒。所述一体化料筒包括：样品制备室，所述样品制备室具有样品入口和样品出口；以及样品纯化室，所述样品纯化室适于接纳可更换的样品纯化单元，所述样品纯化单元包括壳体和在所述壳体内部的提取滤料。所述提取滤料特异地结合目标分子。所述样品纯化室具有与所述样品制备室的样品出口流体连通的样品入口。本发明还公开了基于微阵列的样品分析(MBSA)系统。

Description

一体化料筒
相关申请
本申请要求2009年9月21日提交的美国临时申请第61/272,397号的优先权，所述申请通过引用以其全文并入本文。
技术领域
技术领域为生物技术，更具体地，为用于分析生物分子的方法和装置。
发明背景
期望获得兼具样品制备和样品分析功能的分析仪器。还期望获得轻而小且能够以低成本生产的分析仪器。然而，微流体的挑战已阻碍了此类分析装置的开发。这些挑战部分是由于小规模下的流体动力学。例如，根据哈根-泊肃叶方程，随着微流体通道的直径的减小，穿过通道的压降增大4次幂。当利用复杂微流体几何学时，这些大的压降可能导致非常难以预测的流动特征，特别是在系统中具有气泡时。空气的热膨胀超过液体的5倍大，从而带来了其它挑战。
发明概述
公开了用于样品处理和分析的一体化料筒(cartridge)。所述一体化料筒包括：样品制备室，所述样品制备室具有样品入口和样品出口；和样品纯化室，所述样品纯化室适于接纳可更换的样品纯化单元，所述样品纯化单元包括壳体和在所述壳体内部的提取滤料。所述提取滤料特异地结合目标分子。所述样品纯化室具有与样品制备室的样品出口流体连通的样品入口。
还公开了基于微阵列的样品分析(MBSA)系统。所述MBSA系统包括：适于接纳可拆卸的料筒的料筒支架，所述可拆卸的料筒被构造为接纳可拆卸且可更换的样品分析单元，所述样品分析单元具有反应室和微阵列；流体控制子系统，所述流体控制子系统控制流体流动；和光学子系统，所述光学子系统被构造为捕获所述微阵列的图像。
附图简要说明
详细描述将参考下述附图，其中：
图1A和1B为示出一体化料筒的一个实施方案的示意图。
图2为示出具有细胞裂解装置的一体化料筒的示意图。
图3A-3C为示出双功能一体化料筒的蛋白质纯化部件的不同实施方案的示意图。
图4为基于微阵列的样品分析(MBSA)系统的框图。
图5为流体子系统的示意图，所述示意图示出连接至一体化料筒的泵和选择阀(SV)。
图6A为示出一体化料筒的示意图，所述一体化料筒位于不具有热循环仪气囊的流体歧管中。
图6B为示出一体化料筒的示意图，所述一体化料筒位于具有热循环仪气囊的流体歧管中。
图7为示出一体化料筒中安装的微流体料筒阀的位置的示意图。
图8为示出安装的微流体料筒阀的一个实施方案的示意图。
图9为示出流动池内的室布置的一个实施方案的示意图。
图10为示出对于位置RS1800407处的眼睛颜色SNP获得的PCR/APEX等位基因信号比率结果的图。在位于气囊热循环仪中的Akonni流动池中、在位于MJ热循环仪中的0.2mlPCR管中和在位于气囊热循环仪中的Cepheid管中进行PCR。离线进行APEX一个小时。结果表明所有三个PCR方法的APEX信号相当。
图11A为具有激光光源的光学子系统的一个实施方案的示意图。
图11B示出了间距300μm的Cy3阵列的典型图像，所述图像采用具有共轴照明的图11A所描述的光学子系统获得。
图12A为具有激光光源的光学子系统的另一个实施方案的示意图。
图12B示出了11x18Cy3阵列的典型图像，所述图像采用图12A的光学子系统获得。
图13A为示出具有高亮度LED的光学子系统的一个实施方案的示意图。
图13B为示出用于荧光和FII成像的光学组件的示意图。
图13C为示出用于荧光和FII成像的另一个光学组件的示意图。
图13D为示出图13B和13C所用的准直光源的示意图。
图14A为凝胶阵列(gel array)的FII图像。
图14B为示出图14A中的阵列元件的标准化像素强度情况的图。
图15为示出通过ImageJ软件中可得到的不同方法处理的凝胶阵列图像的复合图。图A，初始图像；图B，ImageJ处理：Process＝>Find Edges；图C，ImageJ处理：Process＝>Filters＝>Median，R＝5；图D，ImageJ处理：Process＝>Filters＝>Mean，R＝5；图E，ImageJ处理：Image＝>Adjust Threshold；图F，ImageJ处理：Process＝>Filters＝>Maximum….R＝2；图G，ImageJ处理：Process＝>Binary＝>Find Maxima；图H，分别示出找到的斑点中心和检测到的斑点边界的图像的重叠。
图16为示出斑点形态的评估结果的复合图。图A：以荧光成像模式获得的图像；图B：使用采取准直光束的斜射照明获得的相同阵列的FII图像；图C：在使用Process＝>FindEdges的ImageJ中的图像处理；图D：在使用Process＝>Filters＝>Median,R＝2；Image＝>Adjust Threshold的ImageJ中的图像处理。
图17A和17B为示出图15的图A中的凝胶斑点的形态评估结果的图。
图18A为示出采用原型MBSA系统和Aurora成像仪进行的酿脓链球菌(S.pyogenes)的检测结果的图。
图18B为示出采用原型MBSA系统和Akonni成像仪进行的酿脓链球菌的检测结果的图。
图19A为示出采用原型MBSA系统和示于图11A的成像方法进行的炭疽芽孢杆菌(B.anthracis)的检测结果的图。
图19B为用于图19A的微阵列的阵列图谱。
图20为示出酿脓链球菌DNA的PCR结果的图，所述酿脓链球菌DNA使用具有珠子混合器的一体化料筒提取。混合器1和混合器2：使用具有珠子混合器的一体化料筒，在两个分开的实验中提取的酿脓链球菌DNA。涡旋：使用标准的涡旋法提取的酿脓链球菌DNA。NTC：阴性对照。
图21A示出了6重PCR产物的微阵列结果。左上图为微阵列图像，其中箭头指向在多重PCR中产生的6种PCR产物。右上图为微阵列图谱。下图示出了在3个不同退火温度下产生的PCR产物的探针编号/引物标示符/荧光信号强度。
图21B为示出经料筒纯化的血液DNA的实时PCR分析的图。
图22示出了具有PID泵和加热器控制的热循环情况。线A示出了热区的温度，线B示出了冷区，线C示出了夹在气囊之间的热电偶的温度，线D示出了正要进入气囊之前的工作流体的温度。
图23为示出双功能一体化料筒的一个实施方案的图。
图24为示出完整的MBSA系统的一个实施方案的示意图。
发明的详细描述
本描述意在与附图共同阅读，所示附图被认为是本发明整个文字描述的一部分。所述附图不必定按照比例，并且为了清楚和简明的目的，本发明的某些特征可能按比例放大示出或在某种程度上以示意形式示出。在说明书中，相对性术语，例如“前”、“后”、“上”、“下”、“顶部”和“底部”及其衍生形式，应该理解为是指如随后描述的或者如在所讨论的附图中示出的取向。这些相对性术语为了方便描述，并且通常不意在需要特定取向。除非另外明确描述，关于连接、偶联等的术语，例如“连接的”和“附接的”，是指这样的关系：其中结构直接或通过中间结构间接地彼此固定或附接，以及二者为可移动的或刚性的附接或关系。
在描述本发明的优选实施方案时，为了清楚目的而采用具体术语。然而，本发明不意在限于所选择的具体术语。应该理解的是，每个具体元件都包括以类似方式操作以实现类似目的的所有技术等同物。
公开了用于样品处理和分析的一体化料筒。所述一体化料筒包括样品制备室、样品纯化室和可拆卸的样品分析单元。所述样品制备室具有样品入口和样品出口，并且与所述样品纯化室流体连通。所述样品纯化室包括提取滤料，所述提取滤料特异地结合目标分子。所述可拆卸的样品分析单元包括具有微阵列的至少一个样品分析室。
图1A示出了一体化料筒的一个实施方案。所述一体化料筒允许进行生物分子(例如多肽和多核苷酸)的提取以及随后在相同料筒内分析所述生物分子。在本实施方案中，一体化料筒100包括料筒本体1和样品分析单元2。料筒本体1包括样品制备室10、与样品制备室10流体连通的样品纯化室20、与样品纯化室20流体连通的样品洗脱室30、与样品纯化室20流体连通的废弃物室40、当样品分析单元2附接至料筒本体1时与样品分析单元2流体连通的产物废弃物室50、使所述室彼此连接的流体通道60以及允许一体化料筒100连接至料筒底座(未示出)的流体界面70。在一个实施方案中，样品分析单元2为料筒本体1的一体化部分。在另一个实施方案中，样品分析单元2为从料筒本体1可拆卸的。图1B为示出相同的料筒100的示意图，所述料筒100具有控制每个室中的流体流动的安装(on-board)的阀80。
样品制备室10在所述室的上部具有样品入口11，在所述室的下部具有样品出口12。在示于图1A和1B的实施方案中，样品入口11位于样品制备室10的顶部，样品出口12位于样品制备室10的底部。在一个实施方案中，样品入口11为圆顶阀。当连接至泵时，样品出口12还可以起空气入口的作用。可以通过从样品出口12向样品制备室10中泵送气体而实现在样品室内部的样品混合，所述气体例如空气或惰性气体(例如氮气)。所述气体形成从室10的底部向顶部迁移的气泡，并在此过程期间混合样品。
在另一个实施方案中，加热所述气体以提供一种在样品制备室10中均一地加热样品/试剂混合物的方式。
样品纯化室20包括提取滤料21，提取滤料21特异地结合分析物。分析物的实例包括、但不限于，多核苷酸、多肽、脂质和多糖。在一个实施方案中，所述提取滤料为特异地结合DNA的二氧化硅提取滤料。在另一个实施方案中，所述提取滤料为特异地结合蛋白质的多孔材料。在一个实施方案中，提取滤料21位于可移除的样品纯化单元22中，所述样品纯化单元22可以容易地从料筒本体1拆卸并替换为新的样品纯化单元22。样品纯化单元22包括具有入口和出口的壳体以及特异地结合分析物的提取滤料21。在一个实施方案中，样品纯化单元22为移液器吸头的形式。在优选实施方案中，所述移液器吸头的尺寸被定制为装配在样品纯化室20的空间内。在另一个优选实施方案中，提取滤料21为描述于美国专利申请系列第11/933,113号和第12/213,942号中的玻璃料，所述专利申请都通过引用以其全文并入本文。
洗脱室30当附接至所述料筒本体1时连接至样品纯化室20和样品分析单元2二者。在某些实施方案中，洗脱室30从所述一体化料筒去除，而样品纯化室20直接连接至样品分析单元2。
一体化料筒100设计为以直立位置操作，如图1A和1B所示。所述样品制备室和样品纯化室设计为直径足以允许气泡上升至顶部。
样品分析单元2可以包括用于样品分析的一个或多个室。在一个实施方案中，样品分析单元2包括微阵列室3，所述微阵列室3具有用于分析分析物的微阵列4。微阵列4可以为任何类型的微阵列。在一个实施方案中，微阵列4为DNA阵列。在另一个实施方案中，微阵列4为蛋白质或肽阵列。在另一个实施方案中，所述微阵列为描述于例如美国专利第5,741,700号、第5,770,721号、第5,981,734号和第6,656,725号以及美国专利申请第10/068,474号、第11/425,667号和第60/793,176号的凝胶元件阵列，所述专利和专利申请都通过引用以其全文并入本文。在另一个实施方案中，微阵列4为抗体阵列。
在一个实施方案中，微阵列室3还起到扩增反应的反应室的作用，所述扩增反应例如聚合酶链式反应(PCR)或引物延伸芯片法(APEX)。
在另一个实施方案中，样品分析单元2还包括扩增室5。在一个实施方案中，扩增室5为PCR室，其可被重复加热和冷却以扩增在扩增室5内部的DNA靶标。
样品分析单元2和/或料筒本体1由能够经受热循环并不受溶剂(例如乙醇)影响的材料制成。所述料筒本体可以通过机械加工或注塑成型。
在一个实施方案中，微阵列室3和/或扩增室5具有亲水内表面。在优选实施方案中，微阵列室3和/或扩增室5为描述于美国专利申请系列第12/149,865号中的亲水流动池，所述专利申请通过引用以其全文并入本文。
在操作过程中，将料筒100插入到流体对接站(fluidic docking station)中。在一个实施方案中，流体对接站通过鲁尔锥形套筒(luer tapered boss)与料筒100接合，所述套筒触发所述料筒上的鲁尔触发阀。样品，例如细胞悬液，通过样品入口11被装载到一体化料筒100的样品制备室10中。向样品制备室10中加入细胞裂解缓冲液，然后通过从样品制备室10的底部向顶部迁移的气泡使所述细胞裂解缓冲液与样品混合。通过空气泵调节空气流来控制所述气泡。可以加热此空气，用于需要在高温下孵育的操作程序。然后将经混合的样品引入样品纯化室20中，所述样品纯化室20包括特异地结合目标分析物的提取滤料21。所述样品穿过提取滤料21以允许目标分析物结合至提取滤料21。在某些实施方案中，所述样品在提取滤料21中来回循环多次，以提高分析物结合的效率。然后未结合的样品通过安装的料筒针阀80和流体通道60被导至废弃物室40。将废弃物留在料筒中，防止污染后续样品。
用洗涤缓冲液洗涤提取滤料21一次或多次。用过的洗涤缓冲液通过安装的料筒阀80和流体通道60被导至废弃物室40。在一个实施方案中，所述洗涤缓冲液为基于乙醇的洗涤缓冲液，并且通过提取滤料21循环5次。然后将洗脱缓冲液通过提取滤料21引入样品纯化室20中。洗脱的分析物被导入洗脱室30中，所述洗脱室30去除洗脱液中的气泡。洗脱的分析物然后用于在样品分析单元中进行后续样品分析。还可以移取洗脱的分析物的等分试样以进行其他类型的分析。在一个实施方案中，洗脱的DNA样品被导入扩增室5中以进行PCR扩增。可以通过振荡2种温度的流体通过柔性气囊(bladder)来实现扩增室5中的温度变化，所述柔性气囊与扩增室5紧密接触，如例如美国专利申请系列第11/843,843号和第12/232,669号中所描述的，所述专利申请通过引用以其全文并入本文。安装的料筒阀80在热控制的贮存器之间转换以提供快速的温度变化。扩增产物被导入微阵列室中，以杂交所述微阵列。
具有细胞裂解珠的一体化料筒
在某些实施方案中，样品制备室10还包括用于裂解细胞样品的样品裂解装置。在示于图2的实施方案中，样品制备室10包括多个细胞裂解珠13和具有磁体15的磁力搅拌元件14。向样品制备室10中加入完整细胞的悬液，然后向所述样品制备室10施加旋转磁场，从而使磁力搅拌元件14以足以裂解所述细胞的旋转速度旋转。
如本文使用，术语“细胞”是指真核细胞、原核细胞及其组分或片段。术语“细胞”包括寄生物、细菌、细菌孢子、真菌、病毒粒子以及细胞聚集体，例如多细胞生物体、组织及其片段。术语“细胞悬液”是指细胞和液体介质的混合物，其中所述细胞悬浮在液体介质中。优选地，所述细胞悬浮的浓度不过于稠或粘以至于干扰磁力搅拌元件的运动。
在某个实施方案中，将真核或原核细胞以1x102至1x105细胞/ml的浓度范围悬浮。在另一个实施方案中，真核或原核细胞以1x103至1x104细胞/ml的浓度范围悬浮。在其他实施方案中，病毒粒子以1x107至1x1013粒子/ml的浓度范围悬浮。在其他实施方案中，病毒粒子以1x109至1x1011粒子/ml的浓度范围悬浮。
所述液体介质可以为等渗的、低渗的或高渗的。在一些实施方案中，所述液体介质是水性的。在某些实施方案中，所述液体介质含有缓冲液和/或至少一种盐或盐的组合。在一些实施方案中，所述液体介质的pH范围为约5至约8、约6至8或约6.5至约8.5。多种pH缓冲液可以用于实现期望的pH。适合的缓冲液包括、但不限于，Tris、MES、Bis-Tris、ADA、ACES、PIPES、MOPSO、Bis-Tris丙烷、BES、MOPS、TES、HEPES、DIPSO、MOBS、TAPSO、HEPPSO、POPSO、TEA、HEPPS、Tricine、Gly-Gly、Bicine和磷酸盐缓冲液(例如磷酸钠或磷酸钠-钾等)。所述液体介质可以包含约10mM至约100mM缓冲液、约25mM至约75mM缓冲液或约40mM至约60mM缓冲液等。用于所述液体介质的缓冲液的类型和量可以在应用之间变化。在一些实施方案中，所述液体介质的pH为约7.4，这可以使用约50mM Tris缓冲液实现。在一些实施方案中，所述液体介质为水。
所述细胞裂解珠可以为任何粒子状或珠子状的材料，其硬度大于要裂解的细胞的硬度。所述细胞裂解珠可以由塑料、玻璃、陶瓷或任何其他非磁性材料制成，所述非磁体材料例如非磁性金属珠。在一个实施方案中，所述细胞裂解珠为对于一个轴旋转对称的(例如球形、圆形、卵形、椭圆形、蛋形和滴形粒子)。在其他实施方案中，所述细胞裂解珠为多面体形状。在其他实施方案中，所述细胞裂解珠为不规则形粒子。在其他实施方案中，所述细胞裂解珠为具有凸起的粒子。
在一个实施方案中，所述细胞裂解珠的直径在10-1,000μm的范围内。在其他实施方案中，所述细胞裂解珠的直径在20-400μm的范围内。在其他实施方案中，所述细胞裂解珠的直径在50-200μm的范围内。
所述磁力搅拌元件可以为任何形状并具有与容器匹配的尺寸。换而言之，所述磁力搅拌元件应该足够小，以至能够放入到容器中并且能够在所述容器内旋转或搅拌。为给定容器选择具有合适尺寸的磁力搅拌元件，是在本领域普通技术人员的知识范围内。所述磁力搅拌元件可以为条形、圆柱形、杆状、十字形、V形、三角形、矩形或盘状的搅拌元件。在一个实施方案中，所述磁力搅拌元件具有矩形的形状。在另一个实施方案中，所述磁力搅拌器具有双分叉音叉的形状。在另一个实施方案中，所述磁力搅拌器具有V-形形状。在某些实施方案中，所述磁力搅拌元件包被了化学惰性材料，例如塑料、玻璃或瓷。
在一个实施方案中，将细胞裂解珠13和/或磁力搅拌元件14预填充到样品制备室10中。在另一个实施方案中，将细胞裂解珠13和/或磁力搅拌元件14预填充到可移除的样品裂解单元中，所述样品裂解单元可以容易地置入样品制备室10中并在细胞裂解后抛弃。在另一个实施方案中，向具有细胞悬液的样品制备室10中加入细胞裂解珠13和/或磁力搅拌元件14。可以将细胞裂解珠13、磁力搅拌元件14和细胞悬液以任何顺序置入样品制备室10中。在一个实施方案中，将所述细胞悬液首先装载到样品制备室10中，然后装入细胞裂解珠或磁力搅拌元件。在另一个实施方案中，首先将硬珠子和/或磁力搅拌元件置入样品制备室10中，然后装入细胞悬液。
然后将料筒与磁力搅拌器靠近放置。磁力搅拌元件以足以裂解在容器内部的细胞的旋转速度搅拌细胞悬液。可以基于要裂解的细胞、病毒或组织，以经验确定最佳搅拌速度和持续时间。合适的旋转速度取决于应用，并且可以由本领域普通技术人员确定。一般来说，通过下述因素确定足以裂解细胞的旋转速度：例如细胞类型，细胞悬液的浓度，磁力搅拌元件的尺寸和形状，硬珠子的量、尺寸、形状和硬度，以及容器的尺寸、形状和内表面粗糙程度。在某些实施方案中，将形状为测试管或Eppendorf管的容器放置在标准实验室磁力搅拌器板上的支架中，然后以最高速度设置进行搅拌。
在某些实施方案中，可以在搅拌步骤之前，通过向细胞悬液中加入添加物来促进特殊细胞类型的裂解。添加物的实例包括酶、洗涤剂、表面活性剂和其他化学品，例如碱和酸。已发现碱性条件(例如10mM NaOH)可以提高某些细胞类型的裂解效率。然而应该注意的是，所述添加物应该不干扰样品分析过程的下游反应。还可以在搅拌期间加热细胞悬液以提高裂解效率。
所述珠子/磁力搅拌器裂解方法和系统的其他实施方案描述于美国临时申请第61/272,396号，所述专利申请通过引用以其全文并入本文。
除了珠子/磁力搅拌器方法之外，可以用其他方法裂解样品制备室10中的细胞，所述其他方法例如珠磨、涡旋、超声和化学裂解。
为了避免通常与微流体装置相关的问题，所述一体化料筒可以包括下述特征中的一个或多个：(1)所述一体化料筒中的微流体通道足够大(直径0.2-1mm，优选0.5mm)以降低背压并且使得能够具有可复制的注塑成型特征，所述特征在产生低于0.1mm的微流体几何学时可以为高度可变的。(2)所述微流体通道的内表面完全覆盖或部分覆盖或者包被亲水膜，以降低所述微流体通道内部的气泡捕获。(3)所述一体化料筒中的反应室(即，样品制备室、样品纯化室和样品洗脱室)被设计成竖直取向的塔状，以确保气泡由于空气与水相比的密度差而能够上升至所述室的顶部。所述塔的设计还允许通过从塔的底部向样品中流入空气而在塔中进行样品混合。液体通过从底部上升至顶部的气泡而剧烈地混合。(5)所述一体化料筒中的提取滤料具有大的空隙，以使背压最小化。(6)所述一体化料筒中安装的料筒阀关闭流体通路，并且防止液体流入不期望的通路。(7)所述料筒被设计成使得通过精度泵和选择阀控制液体离开一次性料筒。液体计量以大于10μL的体积进行，以防止小气泡造成试剂比例的大的变动。
可以用于亲水覆盖物或涂层的亲水材料的实例包括、但不限于，亲水聚合物，例如聚(N-乙烯内酰胺)、聚(乙烯吡咯烷酮)、聚(环氧乙烷)、聚(环氧丙烷)、聚丙烯酰胺、纤维素、甲基纤维素、聚酸酐、聚丙烯酸、聚乙烯醇、聚乙烯基醚、烷基酚乙氧基化物、复合多元醇单酯、油酸的聚氧乙烯酯、油酸的聚氧乙烯失水山梨醇酯和脂肪酸的失水山梨醇酯；无机亲水材料，例如无机氧化物、金、沸石和金刚石样碳；以及表面活性剂，例如Triton X-100、Tween、十二烷基硫酸钠(SDS)、十二烷基硫酸铵、烷基硫酸盐、十二烷基醚硫酸钠(SLES)、烷基苯磺酸盐、皂、脂肪酸盐、鲸蜡基三甲基溴化铵(CTAB)(又名十六烷基三甲基溴化铵)、烷基三甲基铵盐、十六烷基氯化吡啶鎓(CPC)、牛油胺聚氧乙烯醚(POEA)、苯扎氯铵(BAC)、苄索氯铵(BZT)、十二烷基甜菜碱、十二烷基二甲基氧化胺、椰油酰胺丙基甜菜碱、可可两性甘氨酸盐烷基聚(环氧乙烷)、聚(环氧乙烷)和聚(环氧丙烷)的共聚物(商业上称为帕洛沙姆或Poloxamine)、烷基多糖苷、脂肪醇、椰油酰胺MEA、椰油酰胺DEA、椰油酰胺TEA。可以将表面活性剂与反应聚合物(例如聚氨酯和环氧化物)混合以起亲水涂层的作用。
简化的一体化料筒
还公开了用于样品处理的简化的料筒。所述料筒包括具有入口和出口的样品制备室以及具有入口和出口的样品纯化室。所述样品制备室包括磁力搅拌元件和设置在其中的多个细胞裂解珠。所述样品纯化室包括提取滤料并且与所述样品制备室流体连通。
在一个实施方案中，所述磁力搅拌元件和所述多个细胞裂解珠预装载于容器中，所述容器可以容易地插入所述样品制备室或从所述样品制备室移除，并且所述提取滤料预装载于容器中，所述容器可以容易地插入所述样品纯化室或从所述样品纯化室移除。
双功能一体化料筒
还公开了兼具蛋白质和核酸纯化能力的双功能料筒。简而言之，所述双功能料筒包括核酸纯化模块和蛋白质纯化模块。每个模块包括样品纯化室和样品洗脱室。在一个实施方案中，所述模块共有单个样品室和/或单个废弃物室。在另一个实施方案中，所述模块共有单个样品制备室，但是每个模块包括其各自的废弃物室。在另一个实施方案中，每个模块具有其各自的样品制备室和废弃物室。合适的料筒基础设置可以被构造为允许同时纯化核酸和蛋白质或顺序纯化核酸和蛋白质。
在一个实施方案中，以顺序方式处理样品。如图3A所示，处理样品以首先进行核酸纯化。将核酸废弃物室中的去除核酸的样品抽吸到第二纯化室(例如TruTip)中以进行蛋白质纯化，然后分配到第二废弃物室中。通过双向泵(例如milliGAT泵)驱动所述试剂。可以从缓冲液贮存器(未示出)向第二纯化室中直接加入蛋白质洗涤缓冲液。
在另一个实施方案中，改良所述一体化料筒以使得第二纯化室上的料筒阀可以起注射器型泵的作用。如图3B所示，仅需要单个废弃物室。具体而言，将料筒改良为具有连接至第二纯化室上的料筒阀的贮存器袋(示为图3B中的“注射器泵”)，以使得核酸废弃物室中的液体可以在“注射器泵”的“抽取”状态期间填入贮存器袋(类似于填入注射器的筒)，并且在“注射器泵”的“分配”状态期间流到第二纯化室中。所述贮存器袋的尺寸可以根据一体化料筒的尺寸和功能变化。在某些实施方案中，所述贮存器具有0.01-10ml、0.2-5ml、0.5-3ml或1-5ml的容积。可以基于所述一体化料筒的整体设计调节贮存器的形状和确切位置。在核酸废弃物室和第二纯化室之间安装止回阀，以确保液体的单向流动。所述第二纯化室中的洗涤步骤可以通过下述方式实现：关闭所述料筒阀，打开核酸废弃物室中的通气孔(未示出)，然后通过所述“注射器泵”使蛋白质洗涤缓冲液从所述缓冲液贮存器连续流入所述第二纯化室中。
在另一个实施方案中，第二纯化室附接至齿轮泵，所述齿轮泵使溶液通过第二纯化室中的玻璃料连续再循环(图3C)。所述齿轮泵可以双向地操作，并且在核酸废弃物室和第二纯化室之间不需要止回阀。所述蛋白质洗涤步骤可以通过下述方式实现：关闭所述料筒阀，打开核酸废弃物室中的通气孔，然后使蛋白质洗涤缓冲液通过所述齿轮泵从缓冲液贮存器连续流入所述第二纯化室中。
基于微阵列的样品分析(MBSA)系统
还公开了基于微阵列的样品分析(MBSA)系统。如图4所示，MBSA系统200的一个实施方案包括料筒支架210、流体控制子系统220、光学子系统230、控制软件240和任选的热循环仪250。
料筒支架210被构造为通过流体歧管212连接至一体化料筒100。料筒支架210还保持一体化料筒100处于促进所述一体化料筒的各部件和所述MBSA系统的子系统之间的相互作用的位置。例如，适当附接的料筒将所述料筒的PCR室5定位在热循环仪250的加热元件之间，并且允许通过光学子系统进行微阵列4的光学拾取。
流体控制子系统220控制MBSA系统200内的流体运动。所述子系统包括多个流体容器、泵、阀和管。流体控制子系统220通过流体歧管212直接连接至一体化料筒100。
光学子系统230被设计为在和样品杂交后捕获样品分析单元2的微阵列4的图像。在某些实施方案中，所述光学子系统被特别设计为用于微阵列上低水平荧光的检测。在一个实施方案中，所述光学子系统使用共焦或准共焦激光扫描仪，所述扫描仪在采用紧密聚焦的激光束拾取目标平面的过程中逐个像素地获得微阵列图像。激光扫描仪提供下述优势：空间上均匀的敏感度、宽泛的动态范围和有效摒弃焦点外的杂散光。然而，激光扫描仪是非常易损和昂贵的装置。
在另一个实施方案中，所述光学子系统使用具有泛光照明的成像装置，其中同时照射全部的微阵列元件(特征)，并且多元件的光检测器，例如CCD照相机，同时获得全部微阵列的图像或者以几个部分帧的顺序获得微阵列的图像，所述帧随后被连接在一起。与激光扫描仪相比，基于CCD的成像装置设计更为简单，成本更低。在依赖于中等复杂程度(即具有数百或更少的阵列元件)的微阵列的成本敏感的应用中，基于CCD的成像系统对于独立式和内置式阅读器是有吸引力的选择。商业仪器通常使用冷却型CCD照相机，并利用昂贵的客户定制的物镜，所述物镜具有提高的光收集能力，这在一定程度上有助于平衡激发方案的低效率。
在另一个实施方案中，所述光学子系统包括使用非冷却型CCD照相机的成像装置。尽管与冷却型相比，非冷却型照相机通常具有明显更高的暗电流，但所述光学子系统能够通过下述方式在不使用超过数秒的曝光的情况下提供所需的敏感度：(1)提高激发强度，或(2)利用光收集效率高的物镜；或(3)联合使用上述两种方法。光源可以是常规光源，例如金属卤化物灯或汞灯、基于激光的系统或高强度LED。
在另一个实施方案中，所述光学子系统具有不依赖于荧光的成像(FII)模式，作为微阵列阅读器操作的补充成像模式。所述FII模式无论阵列元件的荧光水平如何都允许对所述阵列元件进行成像。
在使用泛光照明的微阵列扫描仪和成像仪中，FII的实际应用在技术上都是一个挑战。当要被成像的微阵列为主流的平面阵列时，该问题尤其困难，这是因为固定在微阵列基底上的生物分子探针层过于薄，以至于在用于探测载片表面的光强度下无法产生明显的变化。
在一个实施方案中，本发明使用反射光中的暗场照明，以对印刷在不透明(黑色)塑料基底上的凝胶阵列进行成像。在另一个实施方案中，本发明使用透射光中的斜射照明，以对印刷在透明(玻璃)载片上的凝胶阵列进行成像。在两种情况下，用于FII的光源都可以为在所述阅读器的发射滤光器的透射谱带内发射的任何光源。
控制软件240被设计为控制所述MBSA系统的全部部件，包括流体控制子系统220、光学子系统230、热循环仪250和任何其他子系统。控制软件240可以安装在连接至所述MBSA系统的任何计算机上，并且提供用于所述MBSA系统的用户界面。在一个实施方案中，所述MBSA系统包括具有处理器、存储器和用户界面的控制器。
热循环仪250被构造为给一体化料筒100的PCR室5提供加热和冷却。在一个实施方案中，热循环仪250为描述于美国专利申请系列第11/843,843号和第12/232,669号中的气囊热循环仪，所述专利申请都通过引用以其全文并入本文。
在另一个实施方案中，所述MBSA系统还包括用于微阵列室3的等温加热系统。在一个实施方案中，所述等温加热系统包括空气加热装置和鼓风机，所述鼓风机将经加热的空气通过喷嘴吹到所述微阵列室的后侧。采用喷嘴处或微阵列室附近的热电偶实现热控制。
在另一个实施方案中，通过单侧气囊加热所述微阵列室，以使得可以采用光学系统从另一侧对微阵列室进行成像。此实施方案将允许阵列中的凝胶-元件的实时PCR监测，如别处描述(Khodakov等人,BioTechniques,(2008)44:241-248)。
在另一个实施方案中，所述MBSA系统还包括细胞裂解子系统。在一个实施方案中，所述细胞裂解子系统包括产生旋转磁场的磁力搅拌器。在另一个实施方案中，所述细胞裂解子系统向所述一体化料筒产生超声或震动，以促进细胞裂解。
实施例
实施例1：基于微阵列的样品分析(MBSA)系统的部件
A.流体子系统
所述流体子系统由三种类型的功能部件组成：双向微流体泵、选择阀和料筒“针”阀。图5为示出连接至所述一体化料筒的泵和选择阀的流体子系统的示意图。流体布局使用可得自Global FIA的双向泵和选择阀的组合。如图5所示，所述流体子系统通过流体歧管90连接至所述一体化料筒，并将各种试剂保存在一体化料筒100外部的储存容器中。
图6A示出了流体歧管90的一个实施方案。在本实施方案中，歧管90允许每个料筒端口72连接两个流体配件(fluidic fitting)91。所述歧管具有带鲁尔锥头的八个套筒(boss)94。这些套筒具有提供从流体配件至料筒端口的流路的流体通道。在本实施方案中，流体歧管90包括支架96，支架96被构造为以这样的方式保持一对热循环仪气囊(例如描述于美国专利申请系列第11/843,843号和第12/232,669号中的那些)，使得当一体化料筒100位于流体歧管90上时，一体化料筒100的样品分析单元2的扩增室5被定位在两个热循环仪气囊92之间。图6B示出了具有一体化料筒100和热循环仪气囊92的流体歧管90。
还通过安装的料筒阀80控制一体化料筒100内的液体流。图7示出了一体化料筒100的一个实施方案中的安装的微流体料筒阀80的定位。图8示出了阀80的一个实施方案。在本实施方案中，阀80由机械加工的塑料本体82、弹簧84、内部O型环86和外部O型环88制成，并且用螺丝拧紧在适当位置。所述机械加工的部件还可以被注塑成型以降低成本。在另一个实施方案中，所述阀还包括阀对准夹具(未示出)，用于迅速和相符合地插在所述料筒上。所述阀还可以通过激光焊接、热熔、超声焊接或用卡扣配合代替用螺丝拧紧在适当位置而被固定在料筒上。
通过手动转动螺丝以将阀轴推进和推出，可以打开和关闭安装的阀80。或者，可以实施具有支持电子器件和软件的自动化线性致动器板，以基于所需操作程序，以电子方式控制安装的料筒阀。
在一个实施方案中，所述流体子系统包括两个双向泵：一个用于样品制备，一个用于聚合酶链式反应(PCR)和/或APEX。这些泵与载体溶液和选择阀的中心连接。所述泵具有与其相关的两种类型的保持线圈(holding coil)：环形线圈，以提供通过“轨道”效应进行的混合；和切回线圈(switchback coil)，其在经历轨道效应的流线之间交替。
在本实施方案中，所述流体子系统包括三个10-端口的选择阀，以提供灵活性和将样品制备与PCR/APEX流体学相分离。所述选择阀中的一个用于将样品制备试剂等分到具有嵌入的Akonni TruTip的料筒，另一个用于将PCR和APEX粒料再水合缓冲液等分到所述料筒，第三个起向所述料筒上的贮存器排出或施加正压的装置的作用。提高每个选择阀的端口数量为增加每个仪器的料筒数量而不增加硬件复杂性的一种方式。
料筒针阀起到两个作用：(1)它们允许单个试剂供应线起到所述料筒上的多个贮存器的作用；以及(2)它们控制液体运动，否则由于顺应空气，所述液体运动将被导向在不希望的通路中。微型线性致动器采用小于35N的力打开和关闭所述料筒针阀。
小型支架设计和安装为刚性地将所述致动器定位成与所述针阀的轴同心。所述支架设计允许致动器沿着所述针阀轴的轴线旋转，从而紧密地将多个致动器压紧到位。该设计是必需的，原因在于所述致动器的本体从轴线突出，从而赋予其准椭圆形的轮廓(即，所述致动器并非为轴对称的)。所述致动器被固定到I-梁，以将它们刚性地固定到所述仪器。所述致动器的臂穿透第二I-梁上的孔，这提供对所述料筒的支撑。此第二I-梁具有线性模式的螺纹孔，其允许将支脚(standoff)固定到所述第二I-梁。所述支脚也具有螺纹孔，所述螺纹孔接纳穿透所述料筒的螺栓。所述螺栓将料筒保持在相对于x、y和z维度的固定位置。在一个实施方案中，通过螺丝固定所述针阀。在另一个实施方案中，通过单个致动器致动多个针阀。
B.筒胆热循环仪子系统
气囊热循环仪子系统描述于美国专利申请系列第11/843,843号和第12/232,669号中，所述专利申请都通过引用以其全文并入本文。
在一个实施方案中，所述气囊热循环仪子系统由下述部件组成：2个泵、3个三通阀、三个加热器(两个用于变性流动回路，一个用于退火/延伸流动回路)、2个贮存器(起气泡捕获和重填通道的作用)、散热器和具有两个彼此相对的柔性气囊的气囊组件。在本实施方案中，所述泵为流量范围为0.15-2.00升/分钟的隔膜泵且在高达82℃下操作。为了使泵的温度不受加热器的影响，使用PVC配件以将加热器与所述泵隔绝。
采用此系统进行加热和冷却的斜升时间(ramp time)皆为大约10℃/秒。为了预先评估所述气囊热循环仪的重复性能，在插在气囊热循环仪的气囊组件的气囊之间的Cepheid Smart Cycler管(平的反应管)中和插在MJ Research热循环仪中的标准0.2mlPCR管中进行PCR反应。两个热循环仪都产生了等量的产物。图9示出了可拆卸的样品分析单元2的一个实施方案。在本实施方案中，可拆卸的样品分析单元2为具有阵列室22和PCR室26的流动池，所述阵列室22具有微阵列23、入口端口24和出口端口25，所述PCR室26具有入口端口27和出口端口28。如图6B所示，所述流动池附接至所述一体化料筒的一侧，以使得所述PCR室从所述一体化料筒一侧延伸到附接至流体歧管的热循环仪的气囊加热单元中。图10显示了使用气囊热循环仪的流动池中的PCR以及后续的APEX，示出了在基于管的形式和气囊热循环仪上的Cepheid Smart Cycler管中得到同等识别。
在一个实施方案中，所述MSTA系统被设计成进行室温杂交。在另一个实施方案中，所述MSTA系统包括用于加热所述阵列室的等温加热系统。可以通过在所述阵列室的后侧吹经加热的空气来实现所述等温控制，所述空气用空气流动管的喷嘴处的热电偶加热。在某些实施方案中，所述等温加热系统能够将阵列室的温度保持在20℃-65℃、20℃-75℃、20℃-85℃或20℃-95℃的范围。
C.光学子系统
图11A为光学子系统的一个实施方案的示意图。开发低成本的光学子系统用于阅读复杂程度相对较低的阵列(阵列元件的数量<50)。用于阅读器的此子系统的CCD照相机为微型非冷却型照相机，其具有1/3”光学格式，分辨率为659x493像素，像素尺寸为7.4x7.4μm(例如Prosilica EC650型)。
物镜和照相机镜头皆为相同的F/1.5单元件的非球面镜头，例如Edmund Optics部件#NT47-732。所述镜头具有37.5mm的有效焦距。由于该成像系统的放大倍数等于1，因此目标平面中的像素尺寸与CCD传感器的像素尺寸相同(7.4μm)。
可用视野(FOV)的直径为约2mm，这对于包括至多50个斑点且在采取300μm阵列间距的情况下的成像阵列来说是足够的。FOV限制因素为场曲，可预见的是对于此非常简单的光学设置而言，所述场曲是相对较高的。
该光学设计的另一个特别的特征(除物镜具有由1.5的低光圈值(f-number)确保的高光收集效率之外)是利用15mW绿色(532nm)DPSS激光和多模光纤的共轴照明设计，所述多模光纤不仅用于光束递送，还用于光束成形和散斑抑制。
由于所述光纤的多模性质，光纤输入面处的激光束的高斯强度分布被转换成光纤输出处的高帽样(top-hat-like)分布。准直透镜和光束聚焦透镜共同起作用，以将光纤端面的图像投射到物镜的目标平面上。因此，目标平面中的强度分布类似于光纤输出处的强度分布，而照射斑点的尺寸由纤芯直径和双透镜投射系统的放大倍数决定。
在附接至所述光纤的微型振动电机(参见图11A)的帮助下实现散斑抑制。振动所述光纤导致快速调节不同光纤模式之间的相移，这转换成散斑模式下的高频率强度的振荡。后者可以在获取图像的过程中得到有效地消除，即使是曝光短至100ms也是如此。
在一个实施方案中，低成本的光学子系统扫描微阵列并将图像连接在一起，以产生所述微阵列的完整图片。在另一个实施方案中，使用线性运动系统连续扫描多个料筒上的阵列。
图11B示出了间距300μm的Cy3阵列的典型图像，所述图像采用具有共轴照明的图11A所描述的光学子系统获得。
图12A为另一个光学子系统的图。开发此版光学子系统，用于对特征数量多达200个的阵列进行成像，所述光学子系统足够用于多种诊断阵列。扩展视野需要具有高度像差纠正的物镜。其还使得使用具有更高光圈值的镜头成为必需。满足上述要求的物镜的实例为Leica的无限校正Planapo 2x镜头，其工作距离为39mm，数值孔径为0.234。应该注意的是，为了简明起见，所述光学子系统的成像光路中的物镜和照相机镜头示为单元件镜头。事实上，这些镜头皆为高度校正的多元件光学器件，所述光学器件以无限共轭点运行并且具有彼此相等的焦距。所以，整个镜头系统的放大倍数为1。
在另一个实施方案中，增大光束聚焦透镜的焦距，以将目标平面中的照射斑点扩展到约8mm。经实验手段发现，在如此大的斑点直径情况下，由倾斜角度的光束入射造成的照明非均一程度不超过5％。图12B示出了11x18Cy3阵列的典型图像，所述图像采用利用斜射照明方案(图12A)的光学子系统获得。如上文所述，阵列间距为300μm，阵列斑点的典型直径为约120μm。
图13A示出了光学子系统的另一个实施方案。在本实施方案中，斜射照明设计中的激光被替换为高亮度的发光二极管(LED)。示出的LED照明器采用照明设计(A.V.Arecchi,T.Messadi,和R.J.Koshel,Field Guide to Illumination,SPIE PressBook,Vol.FG11,August 31,2007,ISBN:9780819467683，其通过引用并入本文)用于投射系统，并且包括放置在收集透镜(collector lens)和聚光透镜(condenser lens)之间的净化滤光器(clean-up filter)以及将激发光以倾斜角度导向目标平面的光束控向反射镜(beam-steering mirror)。所述滤光器预期用于摒弃与用于DNA标记的染料(例如Cy3)的发射谱重叠的LED光的光谱成分。尽管示于图13A的实施方案为优选实施方案，但是可以修改具有反射镜的光束递送系统而不脱离本发明的范围和实质，这对于本领域技术人员是显而易见的。特别是，可以将液体光导件或光纤束引入所述光学组件，以促进来自远处光源的光束递送。
在其他实施方案中，所述光学子系统包括用于FII的微型低功率LED。图13B示出了光学组件的一个实施方案，所述光学组件能够使用透射光中的斜射照明进行荧光成像和FII二者。图13C示出了光学组件的一个实施方案，所述光学组件能够使用反射光中的暗场照明进行荧光成像和FII二者。图13C中的光学组件在载片支架(即目标平面)后需要较小空间。图13D示出了准直光源的示例性技术实施方式。使用的发光器为峰值发射波长是591nm的低强度黄色LED。
图14A示出了使用采取LED光源的准直光束的斜射照明记录的Akonni MRSA阵列载片的示例性图像。图14B示出了图14A中的阵列元件的标准化像素强度情况。尽管通常使用采取准直光源的斜射照明获得具有最高对比度的图像，但是斜射照明的其它光学设置也是可以的。此类方案的通常要求是照明强度在不同方位角之间的不对称分布。出于网格化和斑点形态分析的目的，可以使用相对简单的图像处理工具处理FII阵列图像，例如ImageJ软件中的图像处理工具(http://rsbweb.nih.gov/ij/)。图15为示出通过ImageJ软件中可获得的不同方法处理的凝胶阵列图像的复合图像。图16为示出使用ImageJ软件评估斑点形态的复合结果。
图17A和17B为示出图15的图A中的凝胶斑点的形态评估结果的图。在此项研究中，使用采取准直光束的斜射照明的FII成像允许检测阵列斑点中心和鉴定具有相当大形态异常的受损斑点。数据提示了，对于形态分析的最佳灵敏度，斑点需要通过参数的组合进行表征。例如，通过斑点面积和最佳拟合椭圆的参数。
然而，应该注意的是阵列图像QC不能仅依赖于FII成像模式：所述图像特征中的一些看起来在FII图像中无作用，事实上其可以是斑点荧光强度测量的显著干扰来源(例如，图16的图A和D中箭头所标的粒子)。
实施例2：采用一体化料筒和基于微阵列的样品分析系统检测测试样品中的细菌。
用于MBSA系统的事件的顺序如下。使用者将样品引入所述一体化料筒中。所述系统然后进行下述自动化步骤：制备样品，使用Bladder ThermocyclerTM进行PCR，将PCR产物与杂交和/或APEX反应混合物混合，将混合物转移至微阵列室，进行与微阵列的杂交，然后检测微阵列图像。
在一个实施方案中，在料筒上制备样品的顺序为：将样品引入样品塔，将结合缓冲液引入样品塔，与空气混合，将样品混合物运送至TruTip塔，在塔之间切换，分配至废弃物，将洗涤缓冲液引入TruTip塔，在塔之间切换，分配至废弃物，引入洗脱缓冲液，然后分配至洗脱塔。
PCR步骤的顺序为：向洗脱塔中加入PCR混合物或者在样品处理后用洗脱缓冲液复原冻干的试剂粒料，分配至流动池上的PCR室，关闭全部料筒针阀，然后开始热循环。
APEX步骤的顺序为：用APEX缓冲液冲洗PCR室，然后加入APEX贮存器中，充分混合，向阵列室中加入APEX试剂，在65℃下孵育，洗涤，然后成像。
在一个实验中，将500μL 105cfu/mL酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes,已通过涡旋2分钟离线裂解)引入一体化料筒的样品室。料筒连接至原型MBSA系统，所述原型MBSA系统包括料筒适配器、用于样品制备和处理的流体控制子系统、用于PCR扩增的热控制子系统、光学子系统和用于图像采集的数据采集卡和PC。
通过分析系统控制下述步骤。向样品混合室中加入结合缓冲液，然后通过从室的底部向所述室的顶部迁移的气泡使结合缓冲液与样品混合。通过仪器泵调节空气流来控制气泡。然后将经混合的样品引入样品纯化室中，并在基质之间来回循环5次，以提高结合效率，所述样品纯化室含有特异地结合DNA的二氧化硅提取滤料。然后通过安装的料筒阀将未结合的材料导向至料筒中的废弃物室。将废弃物留在料筒中，以防止污染后续样品。随后洗涤缓冲液在TruTip塔和样品制备塔之间切换5次，然后被导向至废弃物室。然后将120微升的洗脱体积通过TruTip塔从分析系统引入到料筒上，然后被导入洗脱室中，所述洗脱室去除气泡。
移取10ul洗脱DNA的等分试样，然后在Roche 480实时PCR Light Cycler上处理。此外，还从洗脱室移取第二份洗脱DNA的等分试样，然后在代表性流动池中“离线”扩增。然后将PCR母混合物(master mix)引入洗脱室中。通过从洗脱室的底部鼓入空气将洗脱样品与母混合物进行混合。之后经由安装的阀将经混合的样品导入附接至一体化料筒的流动池的PCR室中，当料筒插入到流体对接站中时，所述PCR室定位在热循环仪的两个顺应性气囊之间。使用顺应性气囊的一个制造益处在于，由于它们张开并与料筒流动池紧密接触，因此它们能够在无需改变设计的情况下就可以适应大范围的流动池厚度和位置变化。使用Bladder ThermocyclerTM方法，通过振荡两个温度的流体通过气囊，进行40个循环的双温PCR。此方法基于使经加热的流体流入与PCR室紧密接触的柔性膜(“气囊”)内。阀在热控制的贮存器之间转换以提供快速的温度变化。此热循环方法导致PCR操作方案是常规的载片热循环仪(依赖于Peltiers进行加热和冷却)速度的大约4倍。
扩增之后，PCR产物通过安装的料筒阀自动地转移至流动池的微阵列室，然后在室温下与微阵列室中的微阵列杂交一个小时。然后用Aurora PortArray 5000成像仪阅读所述微阵列。图18A示出了从Aurora Port Array5000获得的杂交微阵列的图像。用框指出阳性信号。
在与附接至一体化料筒的流动池相同的流动池中“离线”扩增的第二份洗脱DNA的等分试样。简而言之，将DNA样品手动装载到流动池的PCR室中，然后如上所述进行扩增。之后将扩增产物手动装载到微阵列室中，然后在室温下与微阵列室中的微阵列杂交一个小时。之后用特别设计用于凝胶元件阵列和流动池组件的Akonni成像仪阅读所述微阵列。图18B示出了从Aurora成像仪获得的杂交微阵列的图像。用框指出阳性信号。
在另一个实验中，使用上文所述的程序处理和分析500μl炭疽芽孢杆菌(Bacillusanthracis)样品(水中104cfu/ml)。图19A示出了微阵列的图像，其指示了测试样品中炭疽芽孢杆菌的阳性检测结果。图19B为图19A中所用的微阵列的阵列图谱。
在另一个实验中，使用在样品制备室中具有磁珠混合器的一体化料筒处理500μl酿脓链球菌样品(水中104cfu/ml)。向所述室中加入玻璃珠，然后搅拌珠子混合器以裂解所述室中的生物体。图20示出了采用所述混合器提取的DNA的PCR结果。通过以50/50的比率混合珠子与样品体积，并在1.5mL微离心管中涡旋2分钟，实现涡旋法。
实施例3：采用一体化料筒和基于微阵列的样品分析系统进行单核苷酸多态性的基因分型(SNP分型)
此实施例显示了微流体控制的系统进行外貌特征标志物的SNP分型的可行性，所述外貌特征标志物可以用于法医应用。实验设置组合了用于样品制备、PCR扩增和等位基因特异的引物延伸芯片法(AS-APEX)的部件，以形成一体化系统，从而检测眼睛颜色的标志物。所述系统包括流体处理子系统(例如泵)、热循环子系统(例如Akonni BladderThermocycler)、光学仪器(例如Akonni Reader)、一次性一体化料筒(即，Akonni TruTip、Akonni PCR/TruArray流动池、微流体通路和微流体阀)以及料筒对接站。
将列于表1的6个SNP用作实验的测试模型。这些SNP已经在文献中报道为眼睛颜色的主要指征。
表1.鉴定为眼睛颜色的主要决定簇的6个SNP
收集了SNP的序列信息，并合成了PCR的正向和反向引物。测试并优化了每个扩增子的单重PCR反应。实现了多重形式中引物的系统集中，以产生眼睛颜色扩增子的标准6重PCR反应。将此标准6重PCR反应转化为低温(LowTemp)6重PCR反应。LowTemp PCR包括使用化学品以补充温度退火严紧性。通过向母混合物中加入甲酰胺(常用的PCR添加物)，变性温度降低至85℃，而非正常的95℃。这一策略允许我们的一体化料筒的塑料和粘合剂具有更多选择；由此降低了制造成本。此外，更低的温度允许气囊热循环仪部件和管道具有更多的材料选择。在一个实施方案中，PCR和APEX二者使用一种酶。
图21A示出了在LowTemp 6重PCR中产生的每个扩增子的凝胶斑点信号的微阵列图像和荧光强度。检测到全部6个扩增子，其中扩增子信号强度超过了阵列上阳性需要的可接受阈值。尽管相对信号强度在产物之间不同，但是通过调整多重PCR中的引物浓度和/或用于APEX的引物的长度，可以很好地调整信号强度。
在APEX方法中，设计引物，以使得单个引物固定在阵列上的每个凝胶元件内，从而使得3′末端碱基位于SNP位点处。给每个要检测的SNP设计单独的引物。例如，如果在特定SNP位点处具有A或C的可能性，则给每种可能性设计单独的引物，一个以3′A结尾，一个以3′C结尾。如果引物的3′核苷酸与靶标不匹配，则由聚合酶进行的延伸受到抑制。在存在正确靶标和匹配的3’碱基的情况下，聚合酶掺入荧光标记的核苷酸以产生最终信号。
在一个实验中，使用所述一体化料筒从50ul血液样品中纯化基因组DNA。在此过程中，全部样品和样品废弃物以及与样品接触的全部试剂/缓冲液都保持在料筒上。用过的试剂/缓冲液被去除并储存在料筒废弃物室中。在计算机控制下进行整个过程。从料筒中手动移出的经提取、纯化的DNA样品的实时PCR结果显示强阳性PCR信号(图21B)。更重要的是，此经纯化的DNA成功地用于手工PCR和APEX，从而得到正确的基因型(表2)。简而言之，将自动化、一体化料筒纯化的DNA用于手工PCR(20ng DNA)/APEX分型。对阵列上每个引物的荧光强度进行成像，并且将粗信号强度数据用于产生每个SNP的引物(等位基因)信号比值。得到的基因型与基因组DNA测序结果匹配。
表2：使用引物(等位基因)信号比值进行的血液样品的基因分型
实施例4：软件开发：DX3000自动化任务执行程序
创造称为DX3000自动化任务执行程序(Automated Task Execution Program)的软件程序，以控制所述一体化测定系统。在National Instuments工业级计算机(NI 3110)上以Labview撰写代码，以控制所述三个主要子系统(流体处理子系统、热循环仪子系统和光学子系统)。所述NI 3110具有双核处理器，其中一个核执行Windows任务，另一个核执行实时操作系统(OS)任务。这种结构允许执行高水平的Windows任务(例如管理用户界面、串行通信和图像处理)以及低水平的确定性任务(例如加热器、线性致动器、热循环仪泵和精确定时事件的控制)。所述实时OS与Ethercat I/O模块通信，所述Ethercat I/O模块扫描模拟输入、模拟输出和数字I/O模块。
所述三个主要子系统中的每一个利用来自Windows和实时OS的资源，并且需要在这两个操作系统之间通信。在Windows环境内，管理由用户产生的一系列任务，并且经由共享变量与实时OS或Windows OS上的合适的过程建立通信。与流体处理子系统相关的任务包括：改变选择阀的位置、关闭/打开料筒阀和用微流体泵进行分配/抽吸。与热循环仪子系统相关的任务包括：加热热循环仪和开始热循环。而与光学子系统相关的任务包括：开始APEX加热和获得图像。可以保存顺序，并输入到DX3000自动化任务执行程序中。
归为由流体处理子系统控制的部件包括：2个双向泵、3个选择阀和8个线性致动器(其打开和关闭料筒阀)。双向泵和选择阀由USB串行端口控制。串行指令经由Global FIA开发的Labview驱动器与双向泵和选择阀建立通信。泵的控制指令为方向、流量、体积和地址，选择阀的控制指令包括选择阀端口数和地址。尽管这些指令完全在Windows内执行，但是线性致动器主要由实时操作系统控制。线性致动器，可得自Firgelli Technologies Inc.(Victoria,Canada)，由每个阀的4个MOSFET的H桥控制。每个致动器的两个数字I/O线触发致动器向前运动，向后运动，或保持静止。当所述致动器静止时，不需要动力。所述致动器包括内部电位计，以提供致动器臂的位置的反馈。使用校正程序以测定所述致动器臂达到的程度，这对应于料筒阀的关闭或打开位置。使用比较算法以比较所述臂的期望位置和实际位置。执行合适的运动，以达到在预定容忍窗口(tolerance window)内的期望位置。所述校正程序之后，可以关闭或打开所述料筒阀中的每一个、全部或一些组合，作为定序器中的任务。
归为由热循环仪子系统控制的部件包括：2个隔膜泵、3个三通阀、3个盘管式加热器(两个用于热区，一个用于冷区)和通过微型散热器提供冷却的风扇。Darlington BJT晶体管与模拟输出信号成比例地向所述隔膜泵发送电流，所述模拟输出信号由DX3000自动化任务执行程序控制。线性比例继电器(relay)控制给加热器提供动力的AC信号的幅值和用于散热器的AC风扇。模拟电压输出信号控制这些继电器的输出。接触再循环流的三个在线电热调节器位于热区和冷区加热器之后，并在气囊之前。两个单独的虚拟过程控制热区流体回路和冷区流体回路的再循环温度。这些虚拟过程包括用于PID控制回路中的温度的算法。将加热器PID用于宽范围的温度控制，但是其响应性低。泵流量PID具有窄范围的温度控制，但是其响应性快。因此，两种PID回路都用于实现具有稳定平稳时期的热区和冷区之间的快速切换，如图22所示。所述散热器风扇的速度通常保持在40％功率下。
归为由光学子系统控制的部件包括：LED、照相机、加热器和空气泵。通过固态继电器打开和关闭所述LED、照相机和空气泵。脉冲宽度调制算法使用固态继电器控制到加热器的AC动力的占空比(duty cycle)。空气泵流量保持在恒定速率下。所述加热器内部的热电偶给PID虚拟界面提供反馈。
实施例5：在同一料筒上的蛋白质和核酸纯化。
可以改良一体化料筒以兼具蛋白质纯化和核酸纯化能力。图23示出了双功能一体化料筒300的一个实施方案。简而言之，料筒300包括蛋白质纯化模块和核酸纯化模块。所述蛋白质纯化模块包括蛋白质废弃物塔T1、蛋白质纯化塔T2、蛋白质洗脱塔T3、料筒针阀CV1、CV2、CV3和CV4以及鲁尔触发阀LV1、LV2、LV3和LV4。所述核酸纯化模块包括核酸废弃物塔T4、样品制备塔T5、核酸纯化塔T6、核酸洗脱塔T7、料筒针阀CV5、CV6、CV7、CV8和CV9以及鲁尔触发阀LV5、LV6、LV7、LV8和LV9。
在一个实施方案中，经由下述程序纯化核酸：
1)A.关闭全部的CV
B.通过样品入口向T5中加入500μL样品
C.打开CV6和CV7
D.通过LV5向T5中加入500μL细胞裂解溶液(LV7通向大气)
2)通过LV5向T5中加入空气进行混合(LV7通向大气)
3)在室温下孵育5分钟
4)A.关闭CV6，打开CV8(CV7保持打开，CV8将持续打开直到开始蛋白质纯化程序)
B.通过LV7流入空气(LV8通向大气)
C.通过LV8流入空气(LV7通向大气)
重复步骤B&C五次。混合物将从T5至T6来回流动，结束于T6
5)A.关闭CV7，打开CV2
B.通过LV8流入空气(LV2通向大气)以将1mL混合物推到T1中
6)A.打开CV6，关闭CV2
B.通过LV5向T6中加入洗涤液(LV8通向大气)
C.关闭CV6，打开CV7
D.通过LV8流入空气(LV7通向大气)
E.通过LV7流入空气(LV8通向大气)
重复步骤D&E五次。洗涤液将从T5至T6来回流动，结束于T6
E.关闭CV7，打开CV5
F.通过LV8流入空气(LV6通向大气)以将洗涤液推到T4中
7)A.打开CV6，关闭CV5
B.通过LV5向T6中加入空气(LV8通向大气)
8)A.通过LV5向T6中加入洗脱液(LV8通向大气)
B.关闭CV6，打开CV9
C.通过LV8流入空气(LV9通向大气)
D.通过LV9流入空气(LV8通向大气)
重复步骤C&D五次。洗脱液将从T6至T7来回流动，结束于T7
经由下述程序纯化储存于T1中的1ml样品混合物(参见步骤5B)中的蛋白质：
9)A.打开CV1和CV2，关闭全部其余CV
B.通过LV1向T1中加入蛋白质结合溶液(LV2通向大气)
10)通过LV1向T1中加入空气进行混合(LV2通向大气)
11)在室温下孵育2分钟
12)A.打开CV3，关闭CV1(CV2保持打开，CV3将持续打开直到程序结束)
B.向后拉动泵臂，以将250μL溶液经由连接通道从T1拉动通过T2(LV2&LV3不排气)
C.向前推动泵臂，以将250μL溶液经由连接通道从T1推动通过T2(LV2&LV3不排气)
重复步骤B&C十至十五次。由于料筒上的单向止回阀，溶液将在单向回路中流动，所述单向止回阀位于CV2正上方且位于T1正下方。
D.打开CV5，关闭CV2
E.通过LV3流入空气以将溶液推到T4中(LV6通向大气)
注意：现在蛋白质废弃物室的容积(T1)已满，所以正在使用核酸废弃物室(T4)
F.打开CV1，关闭CV5
13)A.通过LV1向T2中加入洗涤液(LV3通向大气)
B.打开CV5，关闭CV1
C.通过LV3流入空气以将洗涤液推入T4中(LV6通向大气)
D.打开CV1，关闭CV5
重复步骤A-D五次。将向T2中加入洗涤液，然后所述洗涤液流到T4中
14)通过LV1向T2中加入空气(LV3通向大气)
15)增大空气的流量以吹出残余液体
16)A.通过LV1向T2中加入洗脱液(LV3通向大气)
B.关闭CV1，打开CV4
C.通过LV3流入空气(LV4通向大气)
D.通过LV4流入空气(LV3通向大气)
重复步骤C&D五次。洗脱液将从T2至T3来回流动，结束于T3
在一个实施方案中，所述样品裂解溶液为6M异硫氰酸胍。在另一个实施方案中，所述蛋白质结合溶液为0.1％三氟乙酸。
图24示出了包括一体化料筒510的原型MBSA系统500，所述一体化料筒510具有样品分析单元2(即，具有阵列室和PCR室的流动池)、流体控制子系统520、光学子系统530、气囊热循环仪子系统550和流体歧管560。在本实施方案中，流体控制子系统520包括能够在双功能一体化料筒中平行处理蛋白质和核酸的设置。所述设置包括两个泵521和523以及三个选择阀525、527和529。一个泵和一个选择阀将用于核酸提取，另一个泵和另一个选择阀用于蛋白质。第三个选择阀将用于打开和关闭通气孔。这样的设置将允许同时平行处理蛋白质和核酸。光学子系统530包括CCD照相机531、透镜组件533和照明组件535。气囊热循环仪子系统550包括两个泵551和552，三个加热器553、554和555(两个用于变性流动回路，一个用于退火/延伸流动回路)，起气泡捕获和重填通道作用的两个贮存器556和557，以及具有两个彼此相对的柔性胆筒的气囊组件558。
结合并入细节的具体实施方案对本发明进行了描述，以促进对本发明的构造和操作的原理的理解。本文对具体实施方案及其细节的参考不意在限制所附权利要求书的范围。在不脱离本发明的精神和范围的情况下可以对选择用于说明的实施方案进行修改，这对于本领域技术人员来说是显而易见的。说明书中引用的全部参考文献都通过引用以其全文并入本文。

Claims (11)

1.一种基于微阵列的样品分析(MBSA)系统，其包括：
料筒支架，所述料筒支架被构造为通过流体歧管连接至一体化料筒，其中所述一体化料筒包括反应室和位于所述室内的微阵列，其中所述反应室用作聚合酶链式反应的扩增反应的反应室；
流体控制子系统，所述流体控制子系统控制流体流动；以及
光学子系统，所述光学子系统被构造为捕获所述微阵列的图像。
2.如权利要求1所述的MBSA系统，其还包括：
热循环系统，所述热循环系统被构造为在反应过程中控制所述反应室中的温度。
3.如权利要求2所述的MBSA系统，其中所述热循环系统包括具有2个彼此相对的柔性气囊的气囊热循环仪。
4.如权利要求1所述的MBSA系统，其中所述光学子系统包括激光光源。
5.如权利要求1所述的MBSA系统，其中所述光学子系统包括高亮度LED光源。
6.如权利要求1所述的MBSA系统，其中所述光学子系统能够荧光成像和不依赖荧光成像。
7.如权利要求6所述的MBSA系统，其中所述光学子系统包括用于荧光成像的第一光源和用于不依赖荧光成像的第二光源。
8.如权利要求7所述的MBSA系统，其中所述第二光源为发光二极管(LED)。
9.如权利要求8所述的MBSA系统，其中所述LED被构造为反射光中的暗场照明。
10.如权利要求9所述的MBSA系统，其中所述LED被构造为透射光中的斜射照明。
11.如权利要求1所述的MBSA系统，其还包括细胞裂解子系统，其中所述细胞裂解子系统包括产生旋转磁场的磁力搅拌器。
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