CN109647552B - 集成式的微阵列生物芯片及识别方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种集成式的微阵列生物芯片及识别方法。微阵列生物芯片的反应区的阵列点呈m行*n列的矩阵分布，其中，第1～i行和第1～j列为识别区，1≤i＜m，1≤j＜n，微阵列生物芯片上的其余区域为检测区；识别区内的阵列点固定常染色点探针和非常显色点两类探针，相应形成常染色点和非常显色点，常染色点探针和非常显色点探针按照规则排列形成识别信息。本发明还公开了识别方法。本发明在检测过程中，识别标记集成在生物芯片的反应区域内，准确区分芯片的品种类别等身份信息，可以用识别区的阵列信息，对芯片的每个反应区域内的检测结果进行对比，从而使得质控体系更加健全完备。
Description
技术领域
本发明涉及生物芯片领域，特别涉及一种集成式的微阵列生物芯片及识别方法。
背景技术
生物芯片一般指高密度固定在互相支持介质上的生物信息分子(如基因片段、DNA片段或多肽、蛋白质、糖分子、组织等)的微阵列杂交型芯片(microarrays)，阵列中每个分子的序列及位置都是已知的，并且是预先设定好的序列点阵。生物芯片包括基因芯片、蛋白质芯片、组织芯片等。与传统的检测技术相比，生物芯片具有高通量、多靶标等优势。
由于有着上述优势，生物芯片的应用越来越广泛。例如，用来检测基因水平的表达、进行基因诊断、药物筛选、个体化医疗等等。随着芯片的应用日益广泛，在实验中区分芯片的种类和用途就变得尤为重要。目前，通常是采用在生物芯片的非反应区域进行附加标记的方法来进行区分。例如，在生物芯片的外包装盒、包装袋上粘贴文字或者条形码标签；在生物芯片上附带射频识别芯片(RFID)。这些方法都有着一些弊端，例如：在生物芯片的外包装盒、包装袋上贴文字或者条形码标签，当芯片被取出后，容易造成混淆；而使用RFID识别，则需要额外增加配套的射频识别设备，成本会大幅度上升。这些识别方法都会影响到芯片检测的可靠性。
发明内容
技术问题：为解决现有技术中的问题，本发明提供了一种集成式的微阵列生物芯片及识别方法，识别标记集成在生物芯片的反应区域内，准确区分芯片的品种类别等身份信息，还可以作为芯片图像分析时的定位参考，更可以用来对芯片的反应质量进行监控。
技术方案：
一种集成式的微阵列生物芯片，该微阵列生物芯片的反应区的阵列点呈m行*n列的矩阵分布，其中，第1～i行和第1～j列为识别区，1≤i＜m，1≤j＜n，微阵列生物芯片上的其余区域为检测区；识别区内的阵列点固定常染色点探针和非常显色点两类探针，相应形成常染色点和非常显色点，常染色点探针和非常显色点探针按照规则排列形成识别信息。
所述的常显色点在待检测样本中待测目标物的含量为任意值的情况下，均能显示出来，可被检测设备如生物芯片阅读仪采集到；所述的非常显色点在待检测样本中待测目标物的含量为任意值的情况下，均不能显示出来，不可被检测设备如生物芯片阅读仪采集到。
所述常染色点探针选自标记的蛋白、标记的核酸、标记的细胞中的一种或几种，非常染色点探针选自无标记蛋白、无标记核酸、无标记细胞中的一种或几种。
其中标记物选自辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、金属纳米颗粒、量子点颗粒、荧光材料中的一种或几种。
进一步的，常显色点探针为HRP酶标记的羊抗小鼠IgG，非常显色点探针为牛血清白蛋白。
所述检测区内的阵列点固定待检测项目的检测探针，所述检测探针包括糖、核酸、多肽、蛋白质、细胞中的一种或几种。
芯片载体为多孔板，如72孔板、96孔板、384孔板等，多孔板的每个孔均可形成一个上述的反应区。
本发明还提供了一种所述的集成式的微阵列生物芯片的识别方法，包括：
(1)制备所述的集成式的微阵列生物芯片；
(2)将待检测的样本溶液加入到微阵列生物芯片的反应区进行反应；
(3)对反应结果进行显色或显影；
(4)对芯片反应后的图像进行采集，获得微阵列生物芯片的识别区和检测区的信息，根据识别区的识别信息判定微阵列生物芯片的身份信息。
其中，所述的身份信息包括生物芯片的种类、检测项目或批号。
本发明所使用的术语“微阵列生物芯片”是指由生物分子会组织附着于玻璃、陶瓷、金属片、尼龙膜、硝酸纤维素膜等基片物质上构建而成的阵列。微阵列生物芯片的包括基因芯片、核酸芯片、蛋白芯片、多肽芯片、细胞芯片、组织芯片等。
有益效果：
本发明在微阵列芯片制作时，对识别区的常显色点、非常显色点进行一定的排列，这种排列信息形成特定的识别信息，可以用来识别芯片包含种类、用途及构成等基本信息。芯片反应后，可以通过检测设备如芯片阅读仪，将芯片反应区域内的识别区连同检测区同时读出，分析软件可根据识别区的阵列模式自动识别出芯片所包含的信息。识别区还可以作为芯片图像分析时的定位参考，更可以用来对芯片的反应质量进行监控。
本发明的常染色点和非常染色点的探针选择面更为广泛，并且使用的材料具有普适性，不需要考虑与检测区的生物样本的亲缘性关系，更为简便可靠。
本发明所涉及的两种阵列点(常显色点、非常显色点)均不参与生物芯片的反应，从而使得识别区的最终阵列点稳定可靠，不受实验干扰。如果参与杂交反应，由于杂交反应的结果具有不稳定性，容易受到温度、样本基质、溶液离子强度、酸碱性等诸多因素的干扰，将会对实验结果带来干扰，造成假阴性或假阳性，都会造成识别区的信息错误，对结果造成不良影响。
本发明提供的微阵列生物芯片识别方法，识别区是集成在生物芯片的反应区域内，意味着芯片的每个最小检测单元都有着标记。在检测过程中，我们还可以用识别区的阵列信息，对芯片的每个反应区域内的检测结果进行对比，从而使得质控体系更加健全完备。本发明的标记方法简单易操作，可以和生物芯片制备同时完成。并且，不需要增加检测设备、使用方便，成本低廉。因此，本发明具有重要的使用价值和良好的应用前景。
附图说明
图1是实施例1的微阵列生物芯片阵列点布局设计示意图；
图2为实施例1的微阵列生物芯片反应后显现的结果示意图；
图3是实施例2的微阵列生物芯片阵列点布局设计示意图；
图4为实施例2的微阵列生物芯片反应后显现的结果示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。
下述实施例中选择HRP酶标记的羊抗小鼠IgG作为“常显色点”探针，选择牛血清白蛋白(BSA)作为“非常显色点”探针。
实施例1一种集成式微阵列生物芯片(芯片种类：畜禽组织样本中的氯霉素、磺胺、呋喃唑酮的同时检测芯片)
图1显示了该实施例的生物芯片阵列点布局设计，该生物芯片的反应区布局为4*4阵列(即m＝4,n＝4)，其中识别区为第1行和第1列(即i＝1,j＝1)，其余区域为检测区，在识别区中，坐标位置第一行第二列、第一列第二行的阵列点为非常染色点，识别区的其余阵列点为常染色点；在检测区，坐标位置第二行第二列、第二行第三列、第二行第四列的阵列点为氯霉素抗原阵列，坐标位置第三行第二列、第三行第三列、第三行第四列的阵列点为磺胺抗原阵列，坐标位置第四行第二列、第四行第三列、第四行第四列的阵列点为呋喃唑酮抗原阵列。
1、参照图1，按照图1的设计进行生物芯片点样制备。具体步骤如下：
(1)按照图1，使用生物芯片制备系统将探针(HRP酶标记的羊抗小鼠IgG、牛血清白蛋白、氯霉素抗原、磺胺抗原、呋喃唑酮抗原)点样附着于96孔板的微孔表面，每个孔即一个反应区；
HRP酶标记的羊抗小鼠IgG购自于Sigma-Aldrich公司；
牛血清白蛋白购自于Sigma-Aldrich公司；
氯霉素抗原购自于R-Biopharm公司；
磺胺抗原购自于R-Biopharm公司；
呋喃唑酮抗原购自于Randox公司；
(2)将点样后的芯片置于4℃环境下静置12小时；
(3)取出芯片，回复至室温；每个孔内加入10mg/mL BSA溶液200μL；置于37℃下反应2小时；
(4)反应后，用pH为7.4的PBST缓冲液洗涤微孔，每次250μL，洗涤3次；晾干后备用。
2、芯片反应
(1)在96孔板的部分反应孔内加入50μL一系列含有不同浓度的氯霉素、呋喃唑酮、磺胺的标准品，然后在剩余孔内加入50μL待检测的禽畜样本溶液；
(2)向上述所有孔内加入50μL含有HRP酶标记的氯霉素单克隆抗体(浓度为0.25μg/mL)、HRP酶标记的呋喃唑酮单克隆抗体(浓度为0.40μg/mL)、HRP酶标记的磺胺单克隆抗体(浓度为0.50μg/mL)的混合溶液；
HRP酶标记的氯霉素单克隆抗体购自Randox公司；
HRP酶标记的呋喃唑酮单克隆抗体购自Randox公司；
HRP酶标记的磺胺单克隆抗体购自Randox公司；
(3)在25℃下反应30分钟；
(4)用250μL PBST(pH 7.4)缓冲液洗涤3次；
(5)每孔加入100μL的沉淀型TMB底物，25℃下反应15分钟；
(6)用250μL PBST(pH 7.4)缓冲液洗涤3次，晾干；
3、芯片阅读检测
反应后的芯片图像参见图2。识别区，常显色点显色可被仪器捕捉，非常染色点不显色，从而形成特定的阵列图像，检测设备的分析软件根据识别区的阵列图像模式，自动判断该芯片的种类为畜禽组织样本中的氯霉素、磺胺、呋喃唑酮的同时检测芯片，从而调取该芯片的标准曲线等参数，实现自动化分析。
实施例2一种集成式微阵列生物芯片(芯片种类：蜂蜜样本中的喹诺酮类抗生素、四环素族抗生素、林可霉素、链霉素和氟苯尼考的同时检测芯片)
图3显示了该实施例的生物芯片阵列点布局设计，该生物芯片的反应区布局为7*5阵列(即m＝7,n＝5)，其中识别区为第1～2行和第1～2列(即i＝2,j＝2)，其余区域为检测区，在识别区中，坐标位置第一行第三列、第一行第四列、第一列第四行、第二列第四行的阵列点为非常染色点，识别区的其余阵列点为常染色点；在检测区，坐标位置第三行第三列、第三行第四列、第三行第五列的阵列点为喹诺酮抗原阵列，坐标位置第四行第三列、第四行第四列、第四行第五列的阵列点为四环素抗原阵列，坐标位置第五行第三列、第五行第四列、第五行第五列的阵列点为林可霉素抗原阵列，坐标位置第六行第三列、第六行第四列、第六行第五列的阵列点为链霉素抗原阵列，坐标位置第七行第三列、第七行第四列、第七行第五列的阵列点为氟苯尼考抗原阵列。
1、参照图3，按照图3的设计进行生物芯片点样制备。具体步骤如下：
(1)按照图3，使用生物芯片制备系统将探针(HRP酶标记的羊抗小鼠IgG、牛血清白蛋白、喹诺酮类抗原、四环素族抗原、林可霉素抗原、链霉素抗原和氟苯尼考抗原)点样附着于96孔板的微孔表面，每个孔即一个反应区；
HRP酶标记的羊抗小鼠IgG购自于Sigma-Aldrich公司；
牛血清白蛋白购自于Sigma-Aldrich公司；
喹诺酮类抗原购自于R-Biopharm公司；
四环素族抗原购自于Randox公司；
林可霉素抗原购自于Randox公司；
链霉素抗原购自于R-Biopharm公司；
氟苯尼考抗原购自于R-Biopharm公司；
(2)将点样后的芯片置于4℃环境下静置12小时；
(3)取出芯片，回复至室温；每个孔内加入10mg/mL BSA溶液200μL；置于37℃下反应2小时；
(4)反应后，用PBST缓冲液洗涤微孔，每次250μL，洗涤3次；晾干后备用。
2、芯片反应
(1)在96孔板的部分反应孔内加入50μL一系列含有不同浓度的喹诺酮、四环素、林可霉素、链霉素和氟苯尼考的标准品，然后在剩余孔内加入50μL待检测的蜂蜜样本溶液；
(2)向上述所有孔内加入50μL含有HRP酶标记的喹诺酮类单克隆抗体(浓度为0.10μg/mL)、HRP酶标记的四环素单克隆抗体(浓度为0.50μg/mL)、HRP酶标记的林可霉素单克隆抗体(浓度为0.30μg/mL)、HRP酶标记的链霉素单克隆抗体(浓度为0.25μg/mL)和HRP酶标记的氟苯尼考单克隆抗体(浓度为0.63μg/mL)的混合溶液；
含有HRP酶标记的喹诺酮类单克隆抗体购自Abcam公司；
HRP酶标记的四环素单克隆抗体购自R-biopharm公司；
HRP酶标记的林可霉素单克隆抗体购自南京布克生物公司；
HRP酶标记的链霉素单克隆抗体购自Randox公司；
HRP酶标记的氟苯尼考单克隆抗体购自Randox公司；
(3)在25℃下反应30分钟；
(4)用250μL PBST(pH 7.4)缓冲液洗涤3次；
(5)每孔加入100μL的沉淀型TMB底物，25℃下反应15分钟；
(6)用250μL PBST(pH 7.4)缓冲液洗涤3次，晾干；
3、芯片阅读检测
反应后的芯片图像参见图4。识别区，常显色点显色可被仪器捕捉，非常染色点不显色，从而形成特定的阵列图像，检测设备的分析软件根据识别区的阵列图像模式，自动判断该芯片的种类为畜禽组织样本中的喹诺酮类抗生素、四环素族抗生素、林可霉素、链霉素和氟苯尼考的同时检测芯片，从而调取该芯片的标准曲线等参数，实现自动化分析。
Claims (6)
1.一种集成式的微阵列生物芯片的识别方法，其特征在于，微阵列生物芯片的反应区的阵列点呈m行*n列的矩阵分布，其中，第1~i行和第1~j列为识别区，1≤i＜m，1≤j＜n，微阵列生物芯片上的其余区域为检测区；识别区内的阵列点固定常显色点探针和非常显色点两类探针，相应形成常显色点和非常显色点，常显色点探针和非常显色点探针按照规则排列形成识别信息；
所述常显色点探针选自标记的蛋白、标记的核酸、标记的细胞中的一种或几种，非常显色点探针选自无标记蛋白、无标记核酸、无标记细胞中的一种或几种；
包括以下步骤：
（1）制备所述的集成式的微阵列生物芯片；
（2）将待检测的样本溶液加入到微阵列生物芯片的反应区进行反应；
（3）对反应结果进行显色或显影；
（4）对芯片反应后的图像进行采集，获得微阵列生物芯片的识别区和检测区的信息，根据识别区的识别信息判定微阵列生物芯片的身份信息；
所述的常显色点在待检测样本中待测目标物的含量为任意值的情况下，均能显示出来，可被检测设备采集到；所述的非常显色点在待检测样本中待测目标物的含量为任意值的情况下，均不能显示出来，不可被检测设备采集到。
2.根据权利要求1所述的集成式的微阵列生物芯片的识别方法，其特征在于，标记物选自辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、金属纳米颗粒、量子点颗粒、荧光材料中的一种或几种。
3.根据权利要求1所述的集成式的微阵列生物芯片的识别方法，其特征在于，常显色点探针为HRP酶标记的羊抗小鼠IgG，非常显色点探针为牛血清白蛋白。
4.根据权利要求1所述的集成式的微阵列生物芯片的识别方法，其特征在于，检测区内的阵列点固定待检测项目的检测探针，所述检测探针包括糖、核酸、多肽、蛋白质、细胞中的一种或几种。
5.根据权利要求1所述的集成式的微阵列生物芯片的识别方法，其特征在于，芯片载体为多孔板。
6.根据权利要求1所述的集成式的微阵列生物芯片的识别方法，其特征在于，所述的身份信息包括生物芯片的种类、检测项目或批号。
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