CN115201481A - 一种新型的可视化定位固相蛋白芯片 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种新型的可视化定位固相蛋白芯片的制备和应用，通过采用含有水溶性染料、表面活性剂、水溶性高分子聚合物等成分的蛋白固定液，在特定的固相载体上固定蛋白，制得无需封闭、清洗的可视化定位固相蛋白芯片；并且在采用该固相蛋白芯片进行测定过程中，水溶性染料会被彻底清除，丝毫不会影响被分析物检测过程的信号读取。本发明提供的新型的可视化定位固相蛋白芯片，由于可视化定位，便于固相蛋白芯片的质量控制和方便进行大量指标的同时分析，降低了固相蛋白芯片的制造难度并提高了质量，非常值得推广和应用。

Description

一种新型的可视化定位固相蛋白芯片

技术领域

本发明属于体外临床检验和生物芯片技术领域，具体而言，涉及新型的可视化定位固相蛋白芯片的制备和应用。

背景技术

蛋白芯片是一种高通量的蛋白功能分析技术。固相蛋白芯片的本质是二维平面上的蛋白点阵，使用适当的方法把含有蛋白分子的微小液滴分配到固相载体的不同位置，并通过适当方法原位固定。不同指标的点阵位置是区分不同指标的基础。在实际的固定过程中，保持以蛋白分子为主的生物大分子的活性和保证对微小液滴的精确操控往往是一对矛盾。为了保持生物大分子的生物学活性，需要避免使用高温，高压，电解等技术手段提高机械操控的精准程度。

目前固相芯片的制造已经有非常成熟的商业化机器了。大致分为两种，一种是接触式的，另一种是非接触式的。所谓接触式，是指使用头部有特殊结构的实心针蘸取点样试剂，然后控制实心针针头与硬质芯片基材，如玻璃，接触，将实心针头部的液体转移到固相平面上。这种方式可以将转移液体控制到pL水平，并且位置比较精确。所谓非接触式，是指利用压电原理制造可以喷射pL水平的喷头，在不接触基材的情况下，将微小液滴喷射到一定距离范围内，如4毫米的基材上。但这两种方式都存在效率低的问题。主要的原因有：1、不能将不同的点样针或喷头集成在一个芯片面积上，使得不能在一块芯片上同时完成不同点的点样。目前商用的点样设备大多采取先点一种试剂，然后清洗针头或管路再进行下一种试剂的点样。2、即使可以通过机械控制以及样点的体积来实现密度较高的生物芯片的制备，对于科研和药物筛选等样本数量有限的情况，或是日常检测中实际上并不需要数十种以上样点的领域，则该种方式的生产效率低下，难以形成大规模制备，限制在这些领域的应用。

商业化的机器并未充分考虑到点样液体的体积与形成液滴之间的关系以及芯片基材和点样液体之间的相互关系，仅仅强调移动液滴或喷点液滴的精度。而实际上，液滴的体积与液滴直径呈3次方关系，当液滴的体积达到5nL时，球形直径可以达到0.212mm，该尺寸已经大于普通机械移动可以控制达到的精度。本申请的发明人在前期实验中，发明了一种新的点样方式，经过注液在点样针头处形成液滴，当液滴与基材接触后，通过生物芯片基材和点样液体之间的相互作用，打破了针头顶部与液滴的吸附及液滴自身重力的平衡，当点样针头垂直向上移动后，液滴将留在芯片基材上。这种点样方式操作更方便，且容易实现大规模制造固相芯片。

如上的几种点样方式虽都可以实现大规模制造固相芯片，但由于芯片的面积有限，且考虑制造过程中的各点的微小位移不可避免，因此制造过程中势必会存在点样方面的误差，从而影响固相蛋白芯片的质量。由于现有的固相蛋白芯片中，固定蛋白位点都是无法通过肉眼辨别的(如CN202010108061.5和CN201810188202.1)，因此也就难以实现可视化的、方便的质量控制，难以保证固相蛋白芯片的质量，提高了制造难度；尤其是对于需要在一块蛋白芯片上实现大量指标的同时分析时，更是非常容易出错。

因此很有必要对固定蛋白位点进行可视化处理，从而方便质量控制，提升固相蛋白芯片的用户体验。但想要通过在固相蛋白芯片固定的蛋白位点添加染料从而实现可视化是很难达到的，有些染料可能会影响被分析物检测过程的信号读取，从而影响检测结果；而且目前固相蛋白芯片在进行样本检测前，一般需要经历封闭、清洗等步骤，染料很有可能会在封闭、清洗过程中就被除去，造成定位失败。可见，急需找到能实现固相蛋白芯片可视化定位的新方法。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供一种新型的可视化定位固相蛋白芯片的制备和应用。通过采用含有水溶性染料、表面活性剂、水溶性高分子聚合物等成分的蛋白固定液，在特定的固相载体上固定蛋白，制得无需封闭、清洗的可视化定位固相蛋白芯片；并且在采用该固相蛋白芯片进行测定过程中，水溶性染料会被彻底清除，丝毫不会影响被分析物检测过程的信号读取。本发明提供的新型的可视化定位固相蛋白芯片，由于可视化定位，便于固相蛋白芯片的质量控制和方便进行大量指标的同时分析，降低了固相蛋白芯片的制造难度并提高了质量，非常值得推广和应用。

传统的固相蛋白芯片，芯片上固定的蛋白是无法通过视觉直接观察到的，本发明提供了一种新颖的可视化定位蛋白芯片，无需另外的封闭等预操作，且不影响检测结果的信号读取，为固相蛋白芯片的制备和使用提供了更多的便利。

一方面，本发明提供了一种蛋白固定液，所述蛋白固定液包含水溶性染料，以及能与待测物结合的蛋白。

本发明在蛋白固定液的制备过程中，创造性地添加了水溶性染料。水溶性染料的加入，其主要功能是辅助固相蛋白芯片成品的蛋白阵列位置和单个固定区域形态的图像识别。在固相蛋白芯片的制造的过程中，尤其在蛋白分子的固定过程中，水溶性染料不影响蛋白质与固相载体表面的相互作用，当完成整个测定过程后，水溶性染料会被彻底清除，不会影响固定区域内和被分析物相关的信号的读取。

由于根据经典的酶联免疫法，制备芯片上的固定蛋白位点都需要经过包被—清洗—封闭等环节才能使用。封闭和清洗等的作用是有助于把固相表面的非特异性位点堵住，使用时酶结合物的分子不会非特异性地吸附在上面，可以提高信噪比。该方法一直沿用至今，因此目前市面上的固相蛋白芯片也都需要进过上述步骤。

但发明人经过大量实验发现，过去需要封闭、清洗的原因主要是由于酶结合物的特异性效价不高，使用浓度大，所以封闭才是有用的，而对于如今现有的酶结合物效价高，用量小的情况下，封闭并非是必要的。比如在测定甲胎蛋白AFP时，要加入血清样本，其实血清样本中含有60mg/mL的人血清白蛋白，10mg/mL左右的免疫球蛋白G，它们都可以起到封闭作用，不影响检测效果。相对比，测定的AFP的浓度只有10ng/mL左右，固定在芯片上的抗AFP抗体的量也只有几个ug/mL，固定后，表面的密度也只用100ng/cm²，因此封闭是不必要的。另一方面，在试剂应用过程中，与固相芯片接触的溶液中也已经含有大量的起封闭作用的杂蛋白等，因此采用本发明提供的蛋白固定液制备的可视化定位固相蛋白芯片不需额外的封闭、清洗等预处理步骤。

由于省略了封闭、清洗等步骤，本发明在蛋白固定液中添加的水溶性染料就不会在检测前，因封闭、清洗等步骤而被清除，从而难以起到可视化定位和提供分析区域信息的作用。

进一步地，所述水溶性染料为水溶性偶氮类染料、非偶氮类染料、具有激发荧光的特性的染料中的一种或多种。

进一步地，所述水溶性偶氮类染料为3-羧基-5-羟基-(对苯磺酸)-4-(对苯磺酸偶氮)吡唑三钠盐和/或1-(4'-磺酸基-1'-萘偶氮)-2-萘酚-3,6-二磺酸三钠盐；所述非偶氮类染料为靛蓝和/或其衍生物；所述具有激发荧光的特性的染料为罗丹明和/或荧光素。

进一步地，所述蛋白固定液还包括表面活性剂和平衡盐；所述表面活性剂为羟乙基化山梨糖醇脂肪酸酯(Tween)、聚氧乙烯与芳香烃聚合物(Triton)、或3-[3-(胆酰胺丙基)二甲基铵]-1-丙磺酸内盐(CHAPS)中的一种或多种；所述平衡盐为磷酸缓冲液、柠檬酸、甘氨酸、tris、碳酸缓冲液中的一种或多种。

蛋白固定液中含有一定量的表面活性剂，如非离子型表面活性剂或两性离子型表面活性剂等，所述表面活性剂可以调节蛋白位点和芯片的固相载体的表面接触角，使得蛋白位点在固相载体平面上能有一定的浸润，保持蛋白位点的均一性，不会在固相载体上发生位移。

本发明所述的平衡盐为能够成酸碱对的盐，可以保持一定的酸碱缓冲能力的，比如磷酸缓冲溶液，其磷酸根和磷酸氢根可以比较能稳定一定的溶液中的氢离子浓度，在pH6-8之间物质的量比较大，具有缓冲作用。具备这样能力的一对还包括其他的盐，如柠檬酸，甘氨酸，tris、碳酸缓冲液等。蛋白固定液为水溶液，根据蛋白类生物大分子的特性，其中含有一定量的平衡盐，来控制溶液中氢离子浓度，和盐离子浓度，使得蛋白质表面电荷具备一致性，这样可以一定程度上提高蛋白与芯片的固相载体表面的接触方向和结合效率。

进一步地，所述蛋白固定液还包括水溶性高分子聚合物，所述水溶性高分子聚合物为氧乙烯二醇、聚乙烯吡咯烷酮、右旋糖酐、普鲁兰中的一种或多种。

进一步地，所述蛋白固定液还包括其他蛋白，所述其他蛋白为动物血清白蛋白、酪蛋白、明胶蛋白中的一种或多种。

水溶性高分子聚合物和其他蛋白的作用比较复杂，针对不同的目标固定蛋白具有不同的作用，有封闭作用，有调节目标固定蛋白的固定作用，也有保护目标固定蛋白的作用。从微观上，大分子聚合物和其他蛋白表面都有构成与芯片表面和被固定的“捕获”蛋白表面的相互作用，这些相互作用会影响到固定在芯片点上的“捕获”蛋白本身表面性质，也会影响到标记有酶结合物的检测蛋白与芯片点上的作用。

因此针对不同的待测蛋白和被固定的“捕获”蛋白，都必须通过大量试验，找出最合适的蛋白固定液配方，从而实现最佳的检测效果。

另一方面，本发明提供了一种可视化定位的固相蛋白芯片，所述固相蛋白芯片上含有如上所述的蛋白固定液固定干燥后形成的固定蛋白，所述蛋白固定液中的水溶性染料能在固相蛋白芯片清洗过程中被完全清除。

进一步地，所述固相蛋白芯片还包括固相载体，所述固相载体采用具有热塑性和表面极性的有机高分子聚合物制备而成，或经所述有机高分子聚合物涂层制备而成。

由于蛋白质大分子表面带有电荷且并非均匀分布，暴露于的氨基酸残基具有一定程度的化学活性，以及蛋白氨基酸链折叠及柔性，可以赋予蛋白质与外界发生多种类型的相互作用。主要表现为数量众多的静电吸附作用，疏水相互作用，以及共价键结合。这些相互作用构成了蛋白质大分子可以吸附最终固定在某种材料表面的基础。具备这些表面的特征的材料很多，包括以硅氧化物为基础的硬质材料，金属氧化物薄膜片材，有机高分子聚合物等。

考虑到制造和使用方便，本发明采用热塑性及一定表面极性的有机高分子聚合物或涂层涂膜。

进一步地，所述有机高分子聚合物为聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚苯丙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚偏氟乙烯中的一种或多种；所述有机高分子聚合物中还需添加二氧化钛。

适合的有机高分子聚合物材料包括但不限于聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚苯丙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚偏氟乙烯等，或两种以上的聚合物混合物。

二氧化钛的加入，并与有机高分子聚合物材料混合后，能获得白底的固相载体，更方便于带水溶性染料的蛋白位点的识别，使可视化定位效果更佳。

再一方面，本发明提供了一种固相蛋白芯片的制备方法。

本发明采用点样单元在固相载体上进行蛋白平面阵列的点样，从而完成高效制备固相蛋白芯片，适用于大规模制造生物芯片。

所述点样单元由毛细管夹持片和点样毛细管组成。

进一步地，所述毛细管夹持片上设有毛细管夹持槽，所述毛细管夹持槽为半圆形，所述点样毛细管的外径和毛细管夹持槽的半圆的直径相等。

进一步地，毛细管夹持片可以逐层叠加，每一层毛细管夹持片上的毛细管夹持槽的半圆的直径和所夹持的点样毛细管直径一致。如图1和图2所示，以16个点阵的点样单元为例，首先将4根点样毛细管平行排列在毛细管夹持片1相应的毛细管夹持槽中，然后叠加毛细管夹持片2，毛细管夹持片2的夹持槽界面直径和位置与第一层点样毛细管相同和一致；按照如上的方法，依次完成5片毛细管夹持和相应点样毛细管的叠加。

进一步地，所述点样毛细管具有一定的刚性和均匀度，材质包括但不限于不同型号的不锈钢。

进一步地，所述点样毛细管夹持片由具备一定刚性的材质制造，包括但不限于不锈钢，铝，铜的机加工件；也可以是注塑或3D打印的高聚物塑料材料。

进一步地，点样单元在固相载体上进行蛋白平面阵列的点样方法为：将毛细管和毛细管夹持片固定，同时毛细管点样头保持平面水平进行点样。

进一步地，保持平面水平的方式有两种，一种方式是在适当松动和夹具配合下，例如使用高度测量仪，进行找平，当所有点样毛细管点样头处于一个平面3后，固定点样毛细管和点样毛细管加持片。另一种方式是先不考虑保持平面水平问题，固定好后，使用线切工艺将点样针头切平。

进一步地，点样单元的毛细管阵列底部为点样针头阵列，上部套入毛细导管；所述毛细导管可以是化学惰性的塑料材质制成，包括但不限于聚四氟乙烯，聚乙烯，聚丙烯，PEEK，硅胶等。

进一步地，毛细导管联通由步进电机或伺服电机控制的注射泵，通过控制电机来控制点样毛细管点样头部的注出微量液滴。以常见的100uL活塞直径为1.5mm的注射泵为例，当移动活塞1μm时，即可注出大约2nL液体。使用连体注射泵即可通过控制一个电机，来完成多个点样毛细管的微小液体传送。

进一步地，将点样单元在xy平面位置固定，固相载体置于点样单元下方，将点样单元沿z轴方向向下移动，在固相载体上方停止。

进一步地，点样毛细管点样阵列所形成的平面与固相载体之间的垂直距离小于点样毛细管注出的液滴的直径。

进一步地，点样方式有两种：一种方式是在向下移动的同时注出液滴，当移动停止时，液滴底部接触到固相载体，当点样单元向上移动后，液滴留在固相载体上；另一种方式是，当点样单元停止向下移动后，开始注出液滴，当注出足量液滴后，向上移动点样单元，液滴将留在固相载体上。

进一步地，当完成一次点样后，移走固相载体，在相同位置上放入另一个或一批固相载体，重复如上的动作。

再一方面，本发明提供了一种可视化定位的固相蛋白芯片的制备方法，主要采用如上所述的固相蛋白芯片的制备方法，其中点样毛细管装有如上所述的蛋白固定液，所述蛋白固定液中的水溶性染料能在固相蛋白芯片清洗过程中被完全清除。

进一步地，在洁净环境下，例如10万级洁净厂房，温度20-25℃，相对湿度40-60％的环境下，将蛋白由适当的固定液稀释成一定浓度的固定溶液，装载到工业注射泵中，同时驱动注射泵，将不同的固定溶液微量同时由毛细管挤出，在毛细管头部露出液滴。

由于大气压力和液滴的表面张力，在个毛细管上的液体成球冠形状，垂直方向将突出的液滴球冠蘸落在固相载体平面上。

进一步地，将蘸落阵列状蛋白溶液的固相载体在温度20-25℃，相对湿度40-60％的环境下自然干燥，在移至相对湿度低于30％环境下，温度控制在20-70℃环境下充分干燥。

再一方面，本发明提供了一种蛋白的测定方法，所述方法包括以下步骤：

1)取如上所述的固相蛋白芯片，置于特定位置，相机拍摄芯片的方式进行视觉定位芯片上的固定蛋白的阵列，软件储存各固定蛋白的位置信息和分析区域；

2)取待测样本稀释液与芯片混合均匀，静置，清洗芯片，加入含有标记酶的特异性试剂，静置，清洗芯片，加入底物液，静置，清洗芯片，吸干芯片上的残液；

3)将步骤2)获得的芯片置于步骤1)中的特定位置，相机拍摄芯片；

4)利用软件储存的信息在相应区域计算各固定蛋白的灰度值。

进一步地，步骤1)所述的视觉定位芯片上的固定蛋白的阵列，包括肉眼和机器视觉对芯片上的可视化阵列图像进行收集。

所述肉眼观察，主要适合于被分析物种类较少的情况，以及判断芯片上各个阵列点上固定的蛋白的分布情况等；所述对于机器视觉，则可以大大扩展被分析物种类数量，并将产生的数据储存起来。

对于一次可以获得多个指标测定结果的固相芯片，当被检测指标较少时，例如不超过4项，则可以用于通过肉眼直接观察的方式获取检测结果。当检测指标多至十项甚至数十项后，显然单凭肉眼判读，将会非常不易。因此有必要借助视觉传感器，例如利用智能手机拍照，扫描仪等方式辅助获取图像，并借助图像分析软件同步获得各种指标的检测结果。本发明采用相机拍摄芯片，非常适于检测指标数量较多的情况。

进一步地，步骤2)所述的测定步骤，主要基于免疫学原理。

蛋白芯片的使用依赖于抗原和抗体能够形成免疫复合物，参与免疫反应的液体试剂需要过一定修饰来提高免疫复合物的可观测性。到目前为止已经有多种修饰方法被开发出来，例如使用同位素标记，能受外光源激发产生荧光的物质，能够在一定化学条件下发光，能够通过堆积实现可观测的色团，以及通过酶辅助放大信号的酶标记等。

进一步地，本发明优选使用酶促方式引发在固定蛋白参与形成的免疫复合物的信号放大。

这里主要是因为这种方法具有足够的灵敏度，形成的信号可以在可见光范围内被观测到，不仅肉眼能够观察到，也可以通过普通的视觉传感器记录信号并进一步实现对被测样本中被分析物的做定性乃至定量分析。

进一步地，所述的酶包括但不限于辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、半乳糖苷酶等。

这些酶的通用使用方式是与利用化学方法标记参与免疫复合物反应的液体试剂成分，当该成分参与免疫复合物的形成时，酶也被加入到免疫复合物中。在适当的环境下，利用酶的高效和专一性特征，催化底物，在免疫复合物周围形成可视的斑点。通常斑点的有无或深浅反映样本中被分析物的有无和含量。

进一步地，所述免疫学原理主要包括间接法或夹心法、竞争法、阻断法等。

对于间接法或夹心法，将固定有蛋白大分子的固相载体，与液态的样本或样本稀释液(后统称为样本)接触。液态样本中的被分析物与固定在载体上的蛋白大分子发生免疫反应。经过一段时间后，将芯片与样本分开，经过充分清洗，将芯片与另一种试剂进行反应，如对于夹心法，该液体中含有标记酶的特异性抗原或特异性抗体；对于间接法，该液体中含有标记酶的二抗抗体。经过一段时间后，将会形成抗原芯片-抗体样本-抗原酶结合物液体试剂(双抗原夹心法)，抗体芯片-抗原样本-抗体酶结合物液体试剂(双抗体夹心法)，抗原芯片-抗体样本-二抗抗体酶结合物液体试剂(间接法)。特别地，对于夹心法，也可以将芯片与样本-液体试剂混合物同时反应。经过一段时间后，将会形成抗原芯片-抗体样本-抗原酶结合物液体试剂(双抗原夹心法)，抗体芯片-抗原样本-抗体酶结合物液体试剂(双抗体夹心法)。此时复合物的有无或深浅由样本中被分析物的有无或含量决定。之后，再利用复合物中酶的高效专一性催化活性，在适当的条件下产生可视化斑点。斑点的有无或深浅反映复合物中酶的有无或含量，由于复合物的结构中酶与样本中被分析物一一对应，从而斑点反映出样本中被分析物的有无和含量。

对于竞争法，芯片可以和样本与试剂混合物进行反应，当样本中含有被分析物，则形成抗原芯片-抗体样本(测定样本中的抗体)，或形成抗体芯片-抗原样本(测定样本中抗体)；当样本中不含有被分析物，则形成抗原芯片-抗体酶结合物液体试剂(测定样本中的抗体)，或形成抗体芯片-抗原酶结合物液体试剂(测定样本中抗体)。之后，再利用复合物中酶的高效专一性催化活性，在适当的条件下产生可视化斑点。斑点的有无或深浅反映复合物中酶的无有或含量，由于复合物的结构中酶与样本中被分析物一一对应，从而斑点反映出样本中被分析物的无有和含量。

对于阻断法，芯片先与样本进行反应，或经过清洗，或直接与液体试剂反应，当样本中含有被分析物，则形成抗原芯片-抗体样本(测定样本中的抗体)，或形成抗体芯片-抗原样本(测定样本中抗体)；当样本中不含有被分析物，则形成抗原芯片-抗体酶结合物液体试剂(测定样本中的抗体)，或形成抗体芯片-抗原酶结合物液体试剂(测定样本中抗体)。之后，再利用复合物中酶的高效专一性催化活性，在适当的条件下产生可视化斑点。斑点的有无或深浅反映复合物中酶的无有或含量，由于复合物的结构中酶与样本中被分析物一一对应，从而斑点反映出样本中被分析物的无有和含量。

进一步地，步骤4)所述的步骤为蛋白的测定过程中的数据处理及结果反馈。

所谓数据处理及结果反馈是指，通过测试前存储的信息，定位被分析物所处的位置，以及位于该位置的被分析区域，之后采集该区域的信号量。通过位置确定被分析物，通过信号量的有无或强度反馈引起该区域发生免疫反应的该被分析物的浓度。

本发明提供的可视化定位的固相蛋白芯片，具有如下的有益效果：

1、通过采用含有水溶性染料、表面活性剂、水溶性高分子聚合物等成分的蛋白固定液，在特定的固相载体上固定蛋白，制得可直接观察定位的可视化定位固相蛋白芯片；

2、利用可视化定位方法可以将芯片上的点样固定蛋白的位置和结果判读的位置一一对应，这样不仅可以为大量指标的同时分析带来更多的便利，而且也降低了固相芯片的制造难度，同时还可以将视觉检测引入固相芯片制造的质量控制环节，提高固相芯片的质量；

3、制得的可视化定位芯片无需封闭等预处理，可直接用于蛋白检测，为固相蛋白芯片的制备和使用提供了更多的便利。

附图说明

图1为实施例1中的16个点阵集成点样单元示意图

图2为实施例1中的16个点阵集成点样单元的装备示意图

图3为实施例1中的单个点样过程示意图

图4为实施例1中的16个点点阵点样效果示意图

图5为实施例2中的测定前各点的图像信息采集图

图6为实施例2中的解析获得的位置信息和被分析区域分布图

图7为实施例2中的检测结果图像采集图

图8为实施例3中的测定前各芯片的可视化图像信息采集图

图9为实施例3中的测定后各芯片的可视化结果信息采集图

图10为实施例3中的样本的甲胎蛋白AFP浓度与灰度平均值之间的四参数方程模拟曲线图

具体实施方式

下面结合附图对本发明的优选实施例作进一步详细描述，需要指出的是，以下所述实施例旨在便于对本发明的理解，而对其不起任何限定作用。本发明具体实施例中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。

实施例1本发明提供的可视化定位的固相蛋白芯片的制备

本实施例提供的可视化定位的固相蛋白芯片的制备如图1-4所示，其中图1为16个点阵集成点样单元示意图；图2为16个点阵集成点样单元的装备示意图，图3为单个点样过程示意图；图4为16个点点阵点样效果示意图。

本实施例制备的可视化定位的固相蛋白芯片是通过采用点样单元在固相载体上进行蛋白平面阵列的点样，从而完成高效制备固相蛋白芯片，适用于大规模制造生物芯片。如图1所示，本实施例提供的点样单元10为16个点阵的点样单元，由毛细管夹持片11和点样毛细管12组成。所述毛细管夹持片11上设有毛细管夹持槽13，所述毛细管夹持槽13为半圆形，所述点样毛细管12的外径和毛细管夹持槽13的半圆的直径相等。

优选地，毛细管夹持片11可以逐层叠加，每一层毛细管夹持片11上的毛细管夹持槽13的半圆的直径和所夹持的点样毛细管直径一致。

优选地，点样单元10的装备过程为：如图2所示，首先将4根点样毛细管12平行排列在毛细管夹持片1相应的毛细管夹持槽中，然后叠加毛细管夹持片2，毛细管夹持片2的夹持槽界面直径和位置与第一层点样毛细管12相同和一致；按照如上的方法，依次完成5片毛细管夹持和相应点样毛细管12的叠加。

优选地，所述点样毛细管12的材质为304不锈钢；所述点样毛细管夹持片11由聚氯乙烯材质制备。

如图3所示，点样单元10在固相载体上进行蛋白平面阵列的点样方法为：将点样毛细管12和毛细管夹持片11固定，同时毛细管点样头14保持平面水平进行点样。所述保持平面水平的方式有两种，一种方式是在适当松动和夹具配合下，例如使用高度测量仪，进行找平，当所有点样毛细管点样头14处于一个平面3后，固定点样毛细管和点样毛细管加持片。另一种方式是先不考虑保持平面水平问题，固定好后，使用线切工艺将点样针头切平。

本实施例中的点样单元10的毛细管阵列底部为点样针头阵列，上部套入毛细导管(图中未示出)；所述毛细导管可以是化学惰性的塑料材质制成，包括但不限于聚四氟乙烯，聚乙烯，聚丙烯，PEEK，硅胶等。毛细导管联通由步进电机或伺服电机控制的注射泵，通过控制电机来控制点样毛细管点样头14的注出微量液滴。以常见的100uL活塞直径为1.5mm的注射泵为例，当移动活塞1μm时，即可注出大约2nL液体。使用连体注射泵即可通过控制一个电机，来完成多个点样毛细管的微小液体传送。

优选地，点样过程中，将点样单元10在xy平面位置固定，固相载体15置于点样单元10下方，将点样单元沿z轴方向向下移动，在固相载体15上方停止。点样毛细管12点样阵列所形成的平面与固相载体15之间的垂直距离小于点样毛细管注出的液滴的直径。点样方式有两种：一种方式是在向下移动的同时注出液滴，当移动停止时，液滴底部接触到固相载体15，当点样单元10向上移动后，液滴留在固相载体15上；另一种方式是，当点样单元10停止向下移动后，开始注出液滴，当注出足量液滴后，向上移动点样单元，液滴将留在固相载体15上。当完成一次点样后，移走固相载体15，在相同位置上放入另一个或一批固相载体15，重复如上的动作。

所述微小液体即为蛋白固定液，所述蛋白固定液包含水溶性染料、表面活性剂、平衡盐，以及能与待测物结合的蛋白，所述水溶性染料能在固相蛋白芯片清洗过程中被完全清除。

优选地，本实施例提供的可视化定位的固相蛋白芯片是在10万级洁净厂房，温度20-25℃，相对湿度40-60％的环境下，将蛋白由适当的固定液稀释成的蛋白固定液，装载到工业注射泵中，同时驱动注射泵，将不同的固定溶液微量同时由毛细管挤出，在毛细管头部露出液滴。

由于大气压力和液滴的表面张力，在个毛细管上的液体成球冠形状，垂直方向将突出的液滴球冠16蘸落在固相载体15的平面上，如图4所示，再将蘸落阵列状蛋白溶液的固相载体15在温度20-25℃，相对湿度40-60％的环境下自然干燥，在移至相对湿度低于30％环境下，温度控制在20-70℃环境下充分干燥，即制得可视化定位的固相蛋白芯片。

实施例2本发明提供的可视化定位的固相蛋白芯片的定位识别和结果计算举例

本实施例采用实施例1提供的制备方法制备可视化定位的固相蛋白芯片，其中固相载体采用添加二氧化钛的聚氯乙烯热压制片材制成；根据蛋白固定液的配制方法，分为以下5种：分别将4μg/mL巨细胞病毒抗原溶解在含：

①40μg/mL Tween20、2μg/mL牛血清白蛋白、10μg/mL胭脂红、0.01M磷酸缓冲溶液(pH7.0)；

②40μg/mL Tween20、10μg/mL右旋糖酐(5000Da)、2μg/mL牛血清白蛋白、10μg/mL胭脂红、0.01M磷酸缓冲溶液(pH7.0)；

③10μg/mL Tween20、10μg/mL右旋糖酐(20000Da)、2μg/mL牛血清白蛋白、10μg/mL胭脂红、0.01M磷酸缓冲溶液(pH7.0)；

④40μg/mL Tween20、10μg/mL普鲁兰、2μg/mL牛血清白蛋白、10μg/mL胭脂红、0.01M磷酸缓冲溶液(pH7.0)；

⑤10μg/mL胭脂红、0.01M磷酸缓冲溶液(pH7.0)。

由单通道点样器以1.5μL/点非精确定位下点在固相载体上。在相对湿度40-50％，温度20-25℃，环境下静置3小时，再将芯片静置在相对湿度10-20％，温度20-25℃，12小时，之后防潮保存待用。制备得到分别含有①、②、③、④、⑤5种蛋白固定液的可视化定位的固相蛋白芯片。此时每个芯片上都会可以观察到固定蛋白的各区域。

在测定样本前，视觉定位解析芯片上的阵列：使用相机拍摄芯片上各固定蛋白的位置信息和分析区域，并在软件中存储至少此两项基本信息。

测定：分别将巨细胞病毒抗体阴性血清样本，低浓度阳性血清样本，和高浓度阳性血清样本分别与不同的待用芯片反应。具体为使用含10mg/mL牛血清白蛋白的磷酸缓冲溶液按1/40倍稀释样本，然后将样本稀释液加入到芯片上，混合均匀后静置5分钟，清洗芯片，再在芯片上加入辣根过氧化物酶-蛋白A结合物溶液，混合均匀后静置5分钟，清洗芯片，接着加入底物液，静置5分钟，清洗芯片，吸干芯片上残液。将芯片置于测定样本前相同的位置，由相机拍摄。

数据处理及结果反馈：利用软件储存的信息在相应的区域计算平均灰度值。其中测定前各点的图像信息收集如图5所示，解析(软件储存各固定蛋白的位置信息和分析区域)获得的位置信息和被分析区域分布如图6所示，检测结果图像采集如图7所示。利用软件储存的信息在相应区域计算各固定蛋白的灰度值，灰度使用黑色调表示物体，即用黑色为基准色，不同的饱和度的黑色来显示图像，每个灰度对象都具有从0％(白色)到100％(黑色)的亮度值。灰度值计算结果如表1所示。

表1、不同对应点的灰度计算结果

由图7和表1可以看出，采用①、②、③、④4种蛋白固定液时针对阴性、低浓度阳性和高浓度阳性的三种血清样本，都可以较准确地测得其中的巨细胞病毒含量，其中蛋白固定液③测得的灰度值偏高些，可以进一步拉开低浓度和高浓度血清样本的灰度值范围，检测灵敏度更高，这可能是由于其中的10μg/mL Tween20、10μg/mL右旋糖酐(20000Da)两种成分和含量，能起到更好的封闭作用，或是调节目标固定蛋白的固定作用，更好地促进其反应的作用。

采用蛋白固定液⑤虽然也能测出巨细胞病毒含量，但检测结果与其他四种相比明显偏低，其原因很可能是因为蛋白固定液⑤中仅含有水溶性染色剂和缓冲液，没有其他成分，使目标蛋白固定效果有欠缺，同时也可能因为不含有其他蛋白，未能起到封闭作用。

因此蛋白固定液③为针对巨细胞病毒的可视化定位固相蛋白芯片的最佳蛋白固定液配方。

实施例3本发明提供的可视化定位的固相蛋白芯片的定性和定量应用举例

本实施例采用实施例1提供的制备方法制备可视化定位的固相蛋白芯片，其中固相载体采用添加二氧化钛的聚苯乙烯热注塑成型制成；蛋白固定液的配制方法为：将6μg/mL抗甲胎蛋白单克隆抗体溶解在含20μg/mL Tween20、2μg/mL牛血清白蛋白、10μg/mL右旋糖酐(5000Da)、10μg/mL苋菜红、0.05M碳酸缓冲溶液(pH9.6)中，由18通道点样仪器同时点在固相载体上，以0.5μL/点。在相对湿度40-50％，温度20-25℃，环境下静置3小时，再将芯片静置在相对湿度10-20％，温度20-25℃，12小时，之后防潮保存待用。此时每个芯片上都会可以观察到固定蛋白的各区域。

在测定样本前，视觉定位解析芯片上的阵列：使用相机拍摄芯片上各固定蛋白的位置信息和分析区域，并在软件中存储至少此两项基本信息。测定前各芯片的可视化图像信息如图8所示。

测定：将含有不同浓度甲胎蛋白抗原的样本分别与不同的待用芯片反应。具体为将样本加入到芯片上，混合均匀后静置10分钟，清洗芯片，再在芯片上加入辣根过氧化物酶-抗甲胎蛋白抗体结合物溶液，混合均匀后静置10分钟，清洗芯片，接着加入底物液，静置10分钟，清洗芯片，吸干芯片上残液。将芯片置于测定样本前相同的位置，由相机拍摄。测定后，各芯片的可视化结果信息如图9所示。数据处理及结果反馈：利用软件储存的信息在相应的区域计算平均灰度值，灰度值计算结果如表2所示。

表2、不同对应点的灰度计算结果

甲胎蛋白AFP浓度ng/mL	灰度值
		0	0
5	3.647
		10	7.672
50	32.971
		100	47.651
200	57.992

灰度平均值与样本中甲胎蛋白AFP浓度之间呈现正相关关系，可以使用四参数方程模拟，其曲线和模拟方程如图10所示，四参数方程模拟量效关系为：AFP浓度(ng/ml)＝53.97((灰度值-0.095)/(69.44-灰度值))^(1/1.24)，根据该种关系即可求出未知样本的AFP浓度。

本实施例仅为一个指标的检测，目的仅仅位于阐述在运用本发明可以通过可视化的精确定位，来实现定性和定量的测定。当芯片中各点的指标之间是相互独立的，即免疫复合物的形成是不受其他指标的干扰的，则可以运用本发明在一次检测时，同时获得多种指标的定量检测结果。

实施例4本发明提供的可视化定位的固相蛋白芯片的应用对比验证

本实施例分别采用实施例1提供的制备方法制备可视化定位的固相蛋白芯片，以及市面已有的不可视的固相蛋白芯片(华盈生物)，同时对同一批样品进行巨细胞病毒抗体检测，考察对比检测结果。

其中实施例1提供的可视化定位的固相蛋白芯片，其固相载体采用添加二氧化钛的聚苯乙烯热注塑成型制成，蛋白固定液的配制方法为：将6μg/mL抗甲胎蛋白单克隆抗体溶解在含20μg/mL Tween20、2μg/mL牛血清白蛋白、10μg/mL右旋糖酐(5000Da)、10μg/mL苋菜红、0.05M碳酸缓冲溶液(pH9.6)中，由18通道点样仪器同时点在固相载体上，以0.5μL/点。在相对湿度40-50％，温度20-25℃，环境下静置3小时，再将芯片静置在相对湿度10-20％，温度20-25℃，12小时，之后防潮保存待用。此时每个芯片上都会可以观察到固定蛋白的各区域。视觉定位解析芯片上的阵列：使用相机拍摄芯片上各固定蛋白的位置信息和分析区域，并在软件中存储至少此两项基本信息。

不可视的固相蛋白芯片将待测甲胎蛋白血清样本用荧光素标记，结合到芯片的蛋白质就会发出特定的信号。

测定：将含有不同浓度甲胎蛋白抗原的样本分别与可视化定位的固相蛋白芯片、以及不可视固相蛋白芯片反应。

具体步骤为：

(1)不可视固相蛋白芯片进行清洗，添加牛血清蛋白配制的封闭液，封闭过夜，清洗；可视化定位固相蛋白芯片无需任何操作。

(2)将样本加入到可视化定位固相蛋白芯片上，混合均匀后静置10分钟，清洗芯片，再在芯片上加入辣根过氧化物酶-抗甲胎蛋白抗体结合物溶液，混合均匀后静置10分钟，清洗芯片，接着加入底物液，静置10分钟，清洗芯片，吸干芯片上残液；

同时将样本用荧光素标记，加入到不可视固相蛋白芯片，混合均匀后静置10分钟，清洗芯片，吸干芯片上残液。

(3)将可视化定位的固相蛋白芯片置于测定样本前相同的位置，由相机拍摄；将不可视固相蛋白芯片置于荧光仪读取荧光值。

数据处理及结果反馈：可视化固相蛋白芯片的检测结果，利用软件储存的信息在相应的区域计算平均灰度值，并利用实施例3提供的四参数方程模拟量效关系计算甲胎蛋白AFP浓度；不可视固相蛋白芯片根据读取的荧光值计算甲胎蛋白AFP浓度。结果分别如表3和表4所示。

表3、本发明提供的可视化定位固相蛋白芯片测定结果

表4、不可视的固相蛋白芯片测定结果

由表3和表4可见，本发明提供的可视化定位固相蛋白芯片与现有的不可视的固相蛋白芯片都可用于定量检测样本中的甲胎蛋白AFP浓度，而且本发明提供的可视化定位固相蛋白芯片的检测准确度更高，检测过程更方便，无需任何封闭、清洗等预操作，而且由于其可视化定位的特征，便于固相蛋白芯片的质量控制和方便进行大量指标的同时分析，降低了固相蛋白芯片的制造难度并提高了质量，市场潜力巨大。

虽然本发明披露如上，但本发明并非限定于此。如根据其在医学上的应用范围均可做扩展。任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，均可作各种更动与修改，因此本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。

Claims (10)

1.一种蛋白固定液，其特征在于，包含水溶性染料，以及能与待测物结合的蛋白。

2.如权利要求1所述的蛋白固定液，其特征在于，所述水溶性染料为水溶性偶氮类染料、非偶氮类染料、具有激发荧光的特性的染料中的一种或多种。

3.如权利要求2所述的蛋白固定液，其特征在于，所述水溶性偶氮类染料为3-羧基-5-羟基-(对苯磺酸)-4-(对苯磺酸偶氮)吡唑三钠盐和/或1-(4'-磺酸基-1'-萘偶氮)-2-萘酚-3,6-二磺酸三钠盐；所述非偶氮类染料为靛蓝和/或其衍生物；所述具有激发荧光的特性的染料为罗丹明和/或荧光素。

4.如权利要求1-3任一项所述的蛋白固定液，其特征在于，还包括表面活性剂和平衡盐；所述表面活性剂为羟乙基化山梨糖醇脂肪酸酯、聚氧乙烯与芳香烃聚合物、或3-[3-(胆酰胺丙基)二甲基铵]-1-丙磺酸内盐中的一种或多种；所述平衡盐为磷酸缓冲液、柠檬酸、甘氨酸、tris、碳酸缓冲液中的一种或多种。

5.如权利要求4所述的蛋白固定液，其特征在于，所述蛋白固定液还包括水溶性高分子聚合物，所述水溶性高分子聚合物为氧乙烯二醇、聚乙烯吡咯烷酮、右旋糖酐、普鲁兰中的一种或多种。

6.如权利要求4或5所述的蛋白固定液，其特征在于，所述蛋白固定液还包括其他蛋白，所述其他蛋白为动物血清白蛋白、酪蛋白、明胶蛋白中的一种或多种。

7.一种可视化定位的固相蛋白芯片，其特征在于，所述固相蛋白芯片上含有如权利要求1-6任一项所述的蛋白固定液固定干燥后形成的固定蛋白，所述蛋白固定液中的水溶性染料能在固相蛋白芯片清洗过程中被完全清除。

8.如权利要求7所述的固相蛋白芯片，其特征在于，所述固相蛋白芯片还包括固相载体，所述固相载体采用具有热塑性和表面极性的有机高分子聚合物制备而成，或经所述有机高分子聚合物涂层制备而成。

9.如权利要求8所述的固相蛋白芯片，其特征在于，所述有机高分子聚合物为聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚苯丙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚偏氟乙烯中的一种或多种；所述有机高分子聚合物中还需添加二氧化钛。

10.一种蛋白的测定方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)取权利要求7-9所述的固相蛋白芯片，置于特定位置，相机拍摄芯片的方式进行视觉定位芯片上的固定蛋白的阵列，软件储存各固定蛋白的位置信息和分析区域；

2)取待测样本稀释液与芯片混合均匀，静置，清洗芯片，加入含有标记酶的特异性试剂，静置，清洗芯片，加入底物液，静置，清洗芯片，吸干芯片上的残液；

3)将步骤2)获得的芯片置于步骤1)中的特定位置，相机拍摄芯片；

4)利用软件储存的信息在相应区域计算各固定蛋白的灰度值。

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