JP5877416B2 - 光ビーム経路におけるビーム調整のための装置および方法 - Google Patents

光ビーム経路におけるビーム調整のための装置および方法 Download PDF

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Description

本発明は、少なくとも2つの相互に独立した光源を有する光ビーム経路における、特に、好ましくは高解像度または超高解像度顕微鏡のビーム経路におけるビーム調整のための装置であって、光源のビームを、共通照明ビーム経路において重畳する必要がある装置に関する。
さらに、本発明は、特に、本発明の装置を適用するための対応する方法に関する。
少なくとも2つの相互に独立した光源からの光を共通ビーム経路で結合するのを支援する、一般に決定力のある装置は、慣例から周知である。そこでは、例外的に小さな構造を備えたサンプルの像を写すために、重畳されるビームを用いることによって、ビーム位置を調整するのが通例である。この目的のために、とりわけ、20nm〜1μmの直径を有するいわゆるビーズが用いられる。これらの非常に小さな構造の像が、微視的に写されるが、この目的は、関連する画像を合同に重畳することである。ビームは、傾斜角および平行オフセットを手動で設定することによって調整される。
たとえばSTED(欧州特許第0 801 759 B1号明細書を比較されたい)、4Pi(欧州特許第0 491 289 B1号明細書を比較されたい)、RESOLFT(米国特許第7,064,824B2号明細書および国際公開第2004/090617 A2号パンフレットを比較されたい)、PALM(国際公開第2006/127692 A2号パンフレットを比較されたい)およびアップコンバージョン(米国特許第6,859,313B2号明細書を比較されたい)などの、高解像度または超高解像度顕微鏡法の場合には特に、周知の装置および対応して適用される方法は、適切でないかまたはせいぜい条件付きで適切である。なぜなら、そこでは精度に課される要件および機械的ドリフトが非常に厳しいので、(手動での)調整は、除外されるが、しかし少なくとも、一定間隔で、すなわち、早ければ数時間または数日の動作後に繰り返さなければならない。
上記の要件に対応するビーム調整は、特定の較正サンプルを必要とし、実際に検査されるサンプルを取り外すことが必要である。較正のために用いられるビーズサンプルは、塊を形成する傾向があるので、取り扱いが難しい。さらに、焦点を見つけるのが難しい。従来の調整は、時間がかかり、ユーザの側の優れた技能およびノウハウを必要とする。これは、実際には、しかるべき経験を備えた、選ばれた人だけが調整を行うことができるという事実につながることが多い。周知の調整技術のさらなる大きな欠点は、次の点に見いだされる。すなわち、サンプルの必要な変更ゆえに、特に、調整を目的としたサンプルの義務的な取り外しゆえに、合間における調整を必要とする長期的な測定が、初めから除外されるという点である。
上記の記載を鑑みて、本発明の目的は、少なくとも2つの相互に独立した光源を有する光ビーム経路において、特に、好ましくは高解像度または超高解像度顕微鏡のビーム経路において、たとえ顕微鏡の動作中であっても単純な手段を用いて信頼できる調整が可能なように、ビーム調整のための装置を構成および開発することである。対応する方法が、規定される。
本発明の装置は、特許請求項1の特徴によって上記の目的を達成する。したがって、この装置は、ビームの瞳位置および/または焦点位置をチェックできるように支援する較正サンプルを、照明ビーム経路に組み入れ、かつそこから取り出すことができることを特徴とする。本発明の方法は、独立特許請求項21の特徴によって上記の目的を達成する。
本発明に従って、実用的な利用とは無関係に、つまり高解像度顕微鏡の場合には検査サンプルおよび/または画像の記録とは無関係に、ビーム調整を行うことが可能であることが実現された。この目的のために、照明ビーム経路、すなわち重畳されるビームの共通ビーム経路に組み入れ、かつそこから取り出すことができる非常に独特な較正サンプルが提供される。較正サンプルは、重畳されたビームの瞳距離および/または焦点距離をチェックするために用いられる。重畳は、この場合、ビームの瞳距離および/または焦点距離が対応するように実行されなければならない。
較正サンプルが、照明ビーム経路にどのように組み入れられ、そこから取り出されるかは、基本的に重要ではない。しかるべきサンプルホルダの線形動作あるいは回転動作が考えられる。一種の回転装置または送り台(slide)を介して、多くの較正サンプルを利用できるようにすることも考えられる。
較正サンプルは、照明ビーム経路に都合よくピボットすることができる。この目的のために、特に単純な模造品を実装することができる。さらに、較正サンプルを、中間像の場所またはその近傍で照明ビーム経路に組み入れるのが有利である。この場合に、検査すべきサンプルを較正のために取り外す必要がなく、またこれによって、特に、長期的な検査が実行可能になることが、極めて重要である。
それは、基本的に、本明細書では、少なくとも2つの相互に独立した光ビームの重畳または結合の問題であることを、この時点で記載してもよい。換言すれば、少なくとも2つの相互に独立した光源およびそこから放射されるビームが、提供される。本発明の装置は、同様に、多数の光源からの光ビームを結合する際に使用でき、それに対応して設計可能である。
一意的に像を写すことが可能な表面構造を較正サンプルが有する場合、それは、較正サンプルにとって有利である。画定されているか、好ましくは規則的か、または対称的な表面構造を、この場合に含むことができる。同様に、任意か、不規則か、または非対称的な方法で、表面構造を設計することも考えられる。
特に、超高解像度顕微鏡での使用の場合に、較正サンプルの表面が微細構造化されているのが有利である。かかる極めて微細な構造は、たとえば、サンドブラストまたはガラスパールブラストによって生成することができる。
較正サンプルによる較正は、較正サンプルが、調整/重畳される2つ以上のビームの支援で照明され、しかるべく像が写されるように、実行される。波長選択性の(spectrally selective)検出器を用いて、重畳されるビームの検出光を検出し、特に、それぞれのビームの検出光から画像を得るようにすることができる。重畳されるビームの検出光を検出するために、光源のスイッチを入れ、そして個々にまたは順次スイッチを切ることも考えられる。光源のスイッチをオンオフする代わりに、それぞれのビーム経路を開けるか、またはブロックもしくは閉塞するシャッタを用いることもまた可能である。
上述したように、それぞれのビームから結果として得られる画像を整合させるべきである。この目的のため、すなわち調整のために、2つのビームの重畳の場合には、結合されるビームのうちの少なくとも1つのビームの瞳位置および/または焦点位置に作用するために、少なくとも1つの作動要素が設けられる。それに応じて、作動要素は、ビームのうちの1つのビームのビーム経路に配置される。多くの作動要素が準備されている場合には、作動要素は、共通照明ビーム経路の上流にあるそれぞれのビーム経路に配置される。
作動要素は、それぞれのビーム経路の瞳、または瞳の近傍に配置されるのが好ましい。これは、特に、画像オフセットを補正することだけを目標とする場合には有利である。関連構成の場合には、ビームオフセットは生成されず補正もされない。
対照的に、目標が、ビームオフセットの補正を行うことである場合には、作動要素は、中間像の近傍に配置されるのが有利である。起こり得る汚染事例の像を写さないために、作動要素の位置をちょうど中間像に置かないことが特に有利である。作動要素のための他の位置は、特に、角度および位置の両方を設定できるように考えることができる。
具体的な用語では、作動要素は、2つの軸の周りを、好ましくは回転または傾斜できるミラーとすることができる。特に、自動ビーム調整のためには、作動要素、好ましくはミラーを、電動式で回転または移動させることができるのがさらに有利である。
2D相互相関の最大位置を用いて、ビーム較正のために除去すべき、ビームに割り当てられる画像オフセットを決定するようにすることができる。それぞれのビームの検出された強度は、オフセットのための測定変数として働くことができる。それぞれのビーム位置を決定するために、部分的反射ミラーおよび/または位置敏感型検出器(PSD、CCD、ビームキャッチャ−独国特許出願公開第102 33 074 A1号明細書を比較されたい)を設けることもまた考えられる。
測定されたビーム位置のずれを援用して、作動要素の補正値に達するための調整規則は、周知の幾何学的条件から直接生じることができる。
実際には、作動要素の試験偏差によってシステムの応答を決定することが、通例、より簡単である。この目的のために、偏差は、たとえば2つの軸の周りを傾斜できる2つのミラーを用いる場合には、ベクトル的に説明できる。具体的には、
Figure 0005877416
および4「ユニット試験偏差」の形式である
Figure 0005877416
が適用される。
各試験偏差に対して、「応答ベクトル」
Figure 0005877416
が測定され、また応答ベクトルは、「応答マトリックス」
Figure 0005877416
として列に配置されるが、A・T=Xが、試験偏差に当てはまるようにする。
次に、このように決定された応答マトリックスを逆数にすることによって、あらゆる任意の所望の画像またはビームオフセットXに対して必要な偏差Tを決定することが可能である。すなわち、以下の通りである。
T=A−1・A・T=A−1・X
システム応答における非線形性ゆえに、一般に、何度も繰り返して調整を実行することが必要になる。また、場合によっては、多くの位置でシステム応答を決定することが必要になり得る。
さらに、本発明の場合には、機械的遊びを補償するために、作動要素の目標位置は、常に、同じ方向から近づく方法および同じ順序でアプローチされる。
STED設計における試験で得られる画像オフセットのための調整精度は、中間像(15.5mm/(ズーム64×512画素))の場所で、0.5μmより良好であり、これは、100倍対物レンズの場合には、サンプルに対する<5nmの精度に対応するものである。
本発明の教示を有利な方法で改良し発展させるための様々な選択肢がある。この目的のために、一方では、特許請求項1に従属する特許請求項を、他方では、図面を用いた、本発明の好ましい例示的な実施形態の以下の説明を参照してもよい。一般に好ましい改良形態および発展形態はまた、図面を用いて、本発明の好ましい例示的な実施形態に関連して説明される。
図1は、本発明の装置を組み込んだSTED顕微鏡のためのビーム経路の概略図を示す。
図1の選択された例示的な実施形態の場合には、2つの光源1、2が設けられ、これらの光が、照明光絞り3、4およびレンズ系5、6を介してビーム結合器7へ従来的な方法で伝わる。
それぞれのビーム8、9は、ビーム結合器7を介して照明ビーム経路10において結合される。
照明光12は、さらにビームスプリッタ/ビーム結合器11を介し、走査ミラー14を備えた走査装置13およびレンズ装置15を介して、対物レンズ16を通ってサンプル17に伝わる。
サンプル17から戻る検出光18は、走査ミラー14およびビームスプリッタ/ビーム結合器11を介し、レンズ系19および検出光絞り20を介して、検出器21に伝わるが、この場合に、検出器は、波長選択性の検出器21であるのが好ましい。
本発明によれば、照明ビーム経路10に較正サンプル22が設けられるが、この較正サンプル22は、前記照明ビーム経路に組み入れ、かつそこから取り出すことができ、また較正サンプル22を用いて、ビーム8、9の瞳位置および/または焦点位置をチェックすることができる。
図1は、較正サンプル22が、中間像の場所で照明ビーム経路10に組み入れられたことを明確に示す。
図2は、対称的な表面構造23を有する実現可能な較正サンプル22の例示的な実施形態を示す。プレート状構造の較正サンプル22の通路24が、しかるべき保持モードのための回転またはピボット軸を画定するが、この軸は図示されていない。回転軸または通路24の反対側における停止装置25が、回転運動の限界を定める働きをし、かくして、正確に配置される構成のための迫台として働く。
図2は、さらに、次のことを示す。すなわち、2つの相互に独立した光源1、2の使用を仮定すると、本明細書で選択した例示的な実施形態の場合では、特に、ビーム経路9におけるビーム調整を行うことができるようにするためには、作動要素26が1つのビーム経路9にのみ設けられれば十分である。作動要素26は、ビーム9の瞳および/または焦点位置に作用するように働き、作動要素26はまた、ビーム経路の瞳もしくは瞳の近傍に配置されるか、または中間像の近傍に配置することができる。作動要素26は、2つの軸の周りを傾斜できるミラーとして設計される。ミラーの傾斜動作は、自動調整が可能なように電動式で実行される。
図3は、作動要素26によってビーム9を調整するためのフローチャートを示す。このダイアグラムは、説明を要しない。
許容誤差外にある、それぞれの画像のずれが較正サンプルを用いることによって確定された場合には、較正は、図3に示すシーケンスに従って手動または自動で実行されるが、本記載の一般部分に記載した調整規則を用いることによって行われる。
一方では本発明の装置に関する、他方では本発明の方法に関するさらなる説明は、本記載の一般部分に関連するこの時点では不必要である。
最後に、上述した例示的な実施形態は、あくまで例として権利請求された教示を説明する役割を果たすが、前記教示を、例示的な実施形態−STED顕微鏡のためのビーム経路に限定しないことが指摘され得る。同じことは、本発明による方法にも当てはまる。
特に、本発明の方法を用いるための本発明の装置を備えたSTED顕微鏡におけるビーム経路の概略図を示す。 照明ビーム経路にピボットできる較正サンプルの例示的な実施形態を示す。 作動要素による調整のためのフローチャートを示す。
1 光源
2 光源
3 照明光絞り
4 照明光絞り
5 レンズ系
6 レンズ系
7 ビーム結合器
8 ビーム、ビーム経路
9 ビーム、ビーム経路
10 照明ビーム経路
11 ビームスプリッタ/ビーム結合器
12 照明光
13 走査装置
14 走査ミラー
15 レンズ装置
16 対物レンズ
17 サンプル
18 検出光
19 レンズ系
20 検出光絞り
21 検出器
22 較正サンプル
23 表面構造
24 通路、回転軸
25 (較正サンプルにおける)停止装置
26 作動要素

Claims (21)

  1. 少なくとも2つの相互に独立した光源(1、2)と、
    前記少なくとも2つの相互に独立した光源(1、2)から出射されるそれぞれのビーム(8、9)の各光ビーム経路(8、9)を結合するビーム結合器(7)と、
    前記ビーム結合器(7)で結合されたビーム(10)が共通照明ビーム経路(10)として照射されるサンプル(17)と
    を備え、前記各光ビーム経路(8、9)におけるビーム調整のための装置であって、前記光源(1、2)から出射された各ビーム(8、9)が、前記共通照明ビーム経路(10)において重畳される必要がある装置であって、
    前記ビーム(8、9)の瞳位置および/または焦点位置を、当該較正サンプル(22)の表面構造に基づいて、チェックできるように支援する較正サンプル(22)と、
    前記較正サンプル(22)を、中間像の場所またはその近傍で、前記共通照明ビーム経路(10)に組み入れ、かつそこから取り出すことができるように配置されたサンプルホルダと、
    前記各ビーム(8、9)のうちの1つのビームの瞳位置および/または焦点位置を、相対的に前記各ビーム(8、9)のうちの他の1つのビームの瞳位置および/または焦点位置に自動的に調整するように構成された少なくとも1つの作動要素(26)と
    を備えた光ビーム経路におけるビーム調整のための装置。
  2. 前記サンプルホルダは、前記較正サンプル(22)を前記共通照明ビーム経路(10)にピボットできるように構成されていることを特徴とする、請求項1に記載の光ビーム経路におけるビーム調整のための装置。
  3. 前記較正サンプル(22)の前記表面構造(23)が、規定された、規則的または対称的な表面構造(23)を含むことを特徴とする、請求項に記載の光ビーム経路におけるビーム調整のための装置。
  4. 前記較正サンプル(22)の前記表面構造(23)が、任意の、不規則的または非対称的な表面構造(23)を含むことを特徴とする、請求項に記載の光ビーム経路におけるビーム調整のための装置。
  5. 前記較正サンプル(22)の前記表面構造(23)が微細構造化されていることを特徴とする、請求項1〜4のいずれか一項に記載の光ビーム経路におけるビーム調整のための装置。
  6. 前記較正サンプル(22)の前記表面構造(23)が、サンドブラストまたはガラスパールブラストされていることを特徴とする、請求項に記載の光ビーム経路におけるビーム調整のための装置。
  7. 波長選択性の検出器(21)が、重畳される前記ビーム(8、9)の検出光(18)を検出するように設けられることを特徴とする、請求項1〜6のいずれか一項に記載の光ビーム経路におけるビーム調整のための装置。
  8. 検出器が、重畳される前記ビーム(8、9)の前記検出光(18)を検出するときに、前記光源(1、2)は、スイッチが入れられ、そして個々にまたは順次スイッチを切られるように構成されていることを特徴とする、請求項1〜7のいずれか一項に記載の光ビーム経路におけるビーム調整のための装置。
  9. 前記少なくとも1つの作動要素(26)が、結合される前記各ビーム(8、9)のうちの少なくとも1つのビームの瞳位置および/または焦点位置に作用することを特徴とする、請求項1〜8のいずれか一項に記載の光ビーム経路におけるビーム調整のための装置。
  10. 前記少なくとも1つの作動要素(26)が、結合される前記ビームの前記ビーム経路(8、9)にそれぞれ配置されることを特徴とする、請求項1に記載の光ビーム経路におけるビーム調整のための装置。
  11. 前記少なくとも1つの作動要素(26)が、前記ビーム経路(8、9)の瞳に配置されるかまたは瞳の近傍に配置されることを特徴とする、請求項1に記載の光ビーム経路におけるビーム調整のための装置。
  12. 前記少なくとも1つの作動要素(26)が、別の中間像の近傍に配置されることを特徴とする、請求項1に記載の装置。
  13. 前記少なくとも1つの作動要素(26)が、前記ビーム経路(8、9)の瞳もしくはその近傍に配置されるか、または別の中間像の近傍に配置されることを特徴とする、請求項1に記載の光ビーム経路におけるビーム調整のための装置。
  14. 前記少なくとも1つの作動要素(26)は、2つの軸の周りを傾斜できるミラーを含んで構成されていることを特徴とする、請求項1、9〜13のいずれか一項に記載の光ビーム経路におけるビーム調整のための装置。
  15. 前記ミラーを、電動式に移動させることができることを特徴とする、請求項14に記載の光ビーム経路におけるビーム調整のための装置。
  16. 部分的反射ミラーおよび/または位置敏感型センサが、それぞれのビーム位置を決定するために設けられることを特徴とする、請求項1〜15のいずれか一項に記載の光ビーム経路におけるビーム調整のための装置。
  17. 前記較正サンプル(22)は、重畳される前記少なくとも2つの前記各ビーム(8、9)により照射され、照射された画像が得られるように構成されている請求項1〜16のいずれか一項に記載の光ビーム経路におけるビーム調整のための装置。
  18. 前記少なくとも1つの作動要素(26)は、前記較正サンプル(22)から得られる前記少なくとも2つの前記各ビーム(8、9)に対応する画像のずれが許容誤差範囲内になるまで、前記各ビーム(8、9)のうちの1つのビームの瞳位置および/または焦点位置を、相対的に前記各ビーム(8、9)のうちの他の1つのビームの瞳位置および/または焦点位置に自動的に調整するように構成されている請求項1〜17のいずれか一項に記載の光ビーム経路におけるビーム調整のための装置。
  19. 少なくとも2つの相互に独立した光源(1、2)を有する光ビーム経路(8、9)におけるビーム調整のための方法であって、
    前記光源(1、2)のビームが、請求項1〜18のいずれか一項に記載の装置を適用するために、前記共通照明ビーム経路(10)において重畳される方法であって、
    前記各ビーム(8、9)の瞳位置および/または焦点位置がチェックされるのを支援する較正サンプル(22)を、前記共通照明ビーム経路(10)に組み入れ、かつそこから取り出すことを特徴とする方法。
  20. 2D相互相関の最大位置を用いて、前記ビーム(8、9)に割り当てられる画像オフセットを決定できることを特徴とする、請求項19に記載の光ビーム経路におけるビーム調整のための方法
  21. 前記ビーム(8、9)の検出された強度が、前記オフセットのための測定変数として働くことを特徴とする、請求項19に記載の光ビーム経路におけるビーム調整のための方法
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