-
Die Erfindung bezieht sich auf ein Laserscanningmikroskop mit einer Ablenkeinrichtung, die zur veränderlichen Ablenkung eines Laserstrahls um einen Ablenkwinkel ausgerichtet ist, und einer Steuereinrichtung, die die Ablenkeinrichtung mit einem Steuersignal ansteuert, sowie auf ein Laserscanningmikroskopieverfahren, bei dem ein Laserstrahl mittels Ansteuerung einer Ablenkeinrichtung veränderlich um einen Ablenkwinkel abgelenkt wird.
-
In der Laserscanningmikroskopie wird ein Flächenbereich eines Objektes punktweise mit einem Laserstrahl rasterartig beleuchtet und abgetastet. Dabei wird zur Beleuchtung ein paralleles Laserstrahlbündel mit typ. 10 mm Durchmesser im allgemeinen mittels einer Ablenkeinrichtung gemäß einem gewünschten Muster um einen Ablenkwinkel abgelenkt, z.B. ähnlich einem Elektronenstrahl in einer Brown’schen-Röhre. Der abgelenkte Laserstrahl wird dann durch ein optisches System in eine Zwischenbildebene des Laserscanningmikroskopes fokussiert und anschließend durch ein Objektiv auf bzw. in das Objekt abgebildet.
-
Die fokussierte Laserstrahlung tritt mit dem Objekt in Wechselwirkung, wobei reflektierte oder Fluoreszenzstrahlung entsteht, die auf demselben Weg, den die Laserstrahlung bei der Beleuchtung genommen hat, zurückläuft. Sie wird dann mittels eines Strahlenteilers, der im allgemeinen in Beleuchtungsrichtung der Ablenkeinrichtung vorgeordnet ist, in einen Detektorstrahlengang abgelenkt, in dem sich mindestens ein abbildendes System befindet, das die detektierte Strahlung in einer weiteren Bildebene fokussiert. Je nach Anwendungsfall können mehrere Detektorstrahlengänge vorliegen, die jeweils einen bestimmten Spektralbereich der vom Objekt abgegebenen Strahlung aufnehmen.
-
Durch die Ablenkeinrichtung wird eine rasterartige Bewegung des fokussierten Laserstrahls über die Objektfläche bewirkt, wobei die Information über den aktuellen Zustand der Ablenkung, d.h. über die aktuelle Lage des fokussierten Laserstrahls in der Objektfläche erforderlich ist, um die zu diesem Zeitpunkt im Detektorstrahlengang aufgenommene Strahlung einem Bildpunkt korrekt zuordnen zu können. Die Genauigkeit der Ablenkung wirkt sich also auf die geometrische Übereinstimmung des aufgenommenen Bildes mit dem Objekt aus, man spricht hier auch von Bildlinearität.
-
Es ergibt sich dabei die Problematik, dass die Ablenkeinrichtung, die beispielsweise in Form zweier Kippspiegel verwirklicht werden kann, einem vorgegebenen Ablenkverhalten, das üblicherweise durch ein Steuersignal bestimmt wird, aufgrund der Massenträgheit und verschiedener Störeinflüsse nur mehr oder weniger genau folgt. Da gleichzeitig eine hohe Betriebsgeschwindigkeit der Ablenkeinrichtung, d.h. eine hohe Abtastfrequenz, gewünscht wird, muss die Ablenkeinrichtung gewissen Mindesterforderungen entsprechen, um den fokussierten Laserstrahl mit konstanter, hoher Geschwindigkeit auf exakte Weise über die Objektfläche zu führen.
-
Naturgemäß strebt man dabei eine möglichst lineare Charakteristik für die Ablenkeinrichtung an. Hohe Abtastfrequenzen können dann besonders einfach erreicht werden, wenn man die Hin- und die Rückwärtsbewegung des Laserstrahls über das Objekt zur Abtastung ausnützt. Dies wird als bidirektionaler Scan bezeichnet. Dazu wird üblicherweise beispielsweise jeder Kippspiegel einer zwei Kippspiegel aufweisenden Ablenkeinrichtung mit einem Dreiecksignal angesteuert. Ein Kippspiegel bewirkt damit eine Ablenkung entlang einer Zeile der Objektfläche, wobei eine Zeile einer Halbperiode des Dreiecksignals, z.B. vom Minimalwert bis zum nächsten Maximalwert, entspricht, und der andere Kippspiegel lenkt senkrecht zur Zeilenrichtung ab, wobei hier die geschilderte Halbperiode des Dreiecksignals für diesen Kippspiegel einem Durchlauf des Laserstrahls über die gesamte Objektfläche, beispielsweise von oben nach unten, entspricht. Natürlich kann der zweite Kippspiegel, von dem eine wesentlich langsamere Bewegung gefordert ist, auch mit einem Sägezahn angesteuert werden.
-
Die Phasen und Amplituden des Steuersignals, das sich derart aus zwei Dreiecksignalen zusammensetzt, wirken sich somit direkt auf die Linearität der Bewegung des fokussierten Laserstrahls über die Objektfläche aus. Dabei ist es aber zwingend erforderlich, daß die Ablenkeinrichtung, z.B. die erwähnten Kippspiegel, dem Steuersignal getreu folgen, was jedoch in den seltensten Fällen der Fall ist. Verwendet man beispielsweise, wie bei Laserscanningmikroskopen üblich, Schwingspiegel in der Ablenkeinrichtung, so können diese nur begrenzt einem Dreiecksignal folgen. Darüber hinaus können Dreieckssignale als Fouriersynthese ungeradzahliger Harmonischer (Vielfacher) der Ablenkfrequenz aufgefasst werden. Wegen unvermeidlicher Phasenverzögerungen und einem niedereren Übertragungsfaktor höherer Harmonischer ergibt sich jedoch eine nichtlineare Bewegung der Kippspiegel.
-
Um die Genauigkeit, mit der die tatsächliche Ablenkung durch die Ablenkeinrichtung einer gewünschten Bewegung folgt, zu erhöhen, schlägt die
DE 197 02 752 A1 vor, an der Ablenkeinrichtung eine Rückmeldeeinrichtung vorzusehen, um zu messen, wie die Lage der in der Ablenkeinrichtung verwendeten Kippspiegel ist. Der Zustand der Ablenkeinrichtung wird dadurch erfasst und in Kombination mit einer Vorsteuerung zur Regelung auf ein Soll-Verhalten verwendet.
-
Um das dynamische Verhalten der Ablenkeinrichtung zu ermitteln, wird die Ablenkeinrichtung zuerst mit reinen Sinussignalen angesteuert, wobei eine breiter Frequenzbereich durchfahren und Amplitude und Phase der Bewegung der Kippspiegel erfasst wird. Mittels einer Fourier-Reihe kann dann ein Steuersignal synthetisiert werden, indem bei den einzelnen Fourier-Koeffizienten die Phasendrehung der Frequenz des jeweiligen Koeffizienten als Vorhalt und der Kehrwert des Übertragungsfaktors des jeweiligen Koeffizienten der Ablenkeinrichtung für die jeweilige Frequenz als Amplitudenanteil in die Synthese eingehen. Dadurch wird das Steuersignal so vorverzerrt, daß die Bewegung der Ablenkeinrichtung letztendlich der gewünschten Bewegungsform möglichst nahe kommt.
-
Da dabei jedoch die Ablenkeinrichtung mit der ansteuernden Steuereinrichtung nicht als lineares System angesehen werden kann, weshalb eine lineare Superposition der erwähnten Fourier-Koeffizienten nicht zu einem optimalen Ergebnis des Bewegungsablaufes führt, wird gemäß
DE 197 02 752 A1 in einem dritten Schritt unter Rückgriff auf die Rückmeldeeinrichtung ein etwaiger verbliebener Restfehler für die einzelnen Koeffizienten ermittelt und mittels einer weiteren Vorverzerrung des Steuersignals ausgeglichen.
-
Bei Ablenkfrequenzen unter 1 kHz erreicht dieses relativ rechenaufwendige Verfahren eine gute Genauigkeit. Um völlige Übereinstimmung der vorwärts- und rückwärtsabgetasteten Zeilen beim bidirektionalen Scan zu erreichen, müssen aber die Bewegungsabläufe zu den Umkehrpunkten symmetrisch sein. Es ergibt sich nun das Problem, dass wegen mangelnder Symmetrie ein Versatz zwischen den in einer Hinwärtsdrehbewegung der Kippspiegel aufgenommenen Bildzeilen und den Bildzeilen, die bei einer gegenläufigen Rückwärtsdrehbewegung aufgenommen werden, nicht vermieden werden kann. Dieser Versatz begrenzt die zulässige Ablenkfrequenz, weshalb der Zeitdauer für eine Bildaufnahme, die man naturgemäß möglichst gering halten möchte, eine untere Grenze gesetzt ist, wenn die Bildlinearität nicht leiden soll. Bei einem Bildformat von 512×512 Pixeln hat sich gezeigt, dass ein Versatz von 0,2 Pixel bei benachbarten Bildzeilen gerade noch toleriert werden kann.
-
US 4 861 982 A offenbart ein optisches Scanningmikroskop mit einer Positionserfassungsvorrichtung, das zwei sich bewegende Ablenkspiegeln aufweist. Im Strahlengang nach den Ablenkspiegeln ist ein Strahlteiler vorgesehen, welcher einen Teil des auf eine Probe gerichteten Lichts auf eine Positionserfassungsvorrichtung ablenkt. Diese weist ein Linsensystem, ein Gitter und ein Detektionssystem auf. Das Gitter ist als ein Strichgitter mit transmissiver oder reflektiver Eigenschaft ausgebildet.
-
DE 199 06 763 A1 befasst sich mit der Kalibrierung bei Laserscanningmikroskopen, um beim schnellen Scannen durch Trägheitskräfte und Reglerfehler verursachte Abweichungen des Scanstrahls von einer Sollbahn durch eine Kalibrierung auszugleichen. Dazu werden Kalibriermittel vorgeschlagen, die in einer Zwischenbildebene des Laserscanningmikroskops liegen. Die Kalibriermittel können dabei entweder fest eingebaut oder einschwenkbar ausgebildet sein. In einer Ausführungsform sind Referenzstrukturen, beispielsweise in Form eines Gitters vorgesehen. Zur Kalibrierung wird der Laserstrahl mittels der Scaneinrichtung auf das Gitter gelenkt.
-
JP H07-318 831 A zeigt ein Laserscanningmikroskop mit zwei zum Scannen beweglichen Spiegeln. Eine Erfassungsvorrichtung ist durch einen Strahlenteiler, eine Vergrößerungslinse und einen positionsempfindlichen Detektor realisiert. Auf die Probe fallendes Licht wird durch den Strahlteiler auf den empfindlichen Detektor abgelenkt. Das Steuerelement zerlegt die Positionsinformation in die X- und Y-Komponenten, wobei die Elemente die X- bzw. Y-Positionen des Strahlengangs bestimmen und ausgehend von diesem Signal die Steuerung der Spiegel mittels der Elemente korrigiert wird.
-
Der Erfindung liegt deshalb die Aufgabe zugrunde, ein Laserscanningmikroskop bzw. ein Laserscanningmikroskopieverfahren der eingangs genannten Art derart weiterzubilden, daß eine hohe Bildlinearität auch bei hohen Ablenkfrequenzen erreicht werden kann.
-
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß bei einem Laserscanningmikroskop der eingangs genannten Art dadurch gelöst, dass eine Erfassungsvorrichtung vorgesehen ist, die einen aktuellen Ablenkwinkelwert durch Detektion der Lage des Laserstrahls nach der Ablenkeinrichtung zumindest zeitweise erfasst. Dabei weist die Erfassungsvorrichtung eine Teststruktur mit mehreren, äquidistant zueinander liegenden, strichförmigen Strukturelementen auf, die entlang einer Ablenkrichtung der Ablenkeinrichtung angeordnet sind. Die Steuereinrichtung realisiert durch Variation der Amplitude der Ablenkung einen elektronisch-optischen Zoom und die Teststruktur weist dazu für jeden Zoomfaktor eine Gruppe strichförmiger Strukturelemente auf, die über den beim jeweiligen Zoomfaktor vorgesehenen Ablenkbereich äquidistant verteilt sind.
-
Die Erfindung geht von der Erkenntnis aus, dass die erwähnte Problematik des Versatzes ihre Ursache in unterschiedlichen Laufzeiten von der von der Rückmeldeeinrichtung gemessenen Position der Kippspiegel und dem im Detektorstrahlengang tatsächlich erfassten Punkt auf der Objektfläche haben. Deshalb erfolgt nun die Messung des Ablenkwinkelwertes nicht mehr durch die Erfassung des Zustands der Ablenkeinrichtung selbst, wie es beispielsweise mittels einer bekannten Lagemessung eines Kippspiegels bislang im Stand der Technik der Fall ist, da damit nicht die erforderliche Genauigkeit zur Synthese des Steuersignals erreicht werden kann.
-
Stattdessen wird in der Erfindung ein völlig anderer Weg beschritten, indem nämlich mittels einer Erfassungseinrichtung die Lage des abgelenkten Laserstrahles selbst detektiert wird, da diese letztendlich für die Funktion des Laserscanningmikroskops bzw. -verfahrens entscheidend ist.
-
Die Erfindung erfasst dabei den tatsächlichen Ablenkwinkelwert direkt und nicht mehr mittelbar über den Zustand der Ablenkeinrichtung. Damit treten die erwähnten Laufzeitunterschiede nicht mehr in störendem Maße auf. Auch andere systematische Meßfehler, die bei bekannten Lagerückmeldungssystemen auftreten, wie z. B. elastische Verformungen von Spiegeln oder Spiegelachsen einer Ablenkeinrichtung, spielen keine Rolle mehr und wirken sich nicht auf die Regelungsgüte aus. Durch die erfindungsgemäße Erfassung der Lage des Laserstrahls kann darüber hinaus eine Kalibrierung der Abtastung des Objektfeldes erreicht werden.
-
In einer zweckmäßigen Ausgestaltung ist es vorgesehen, dass die Erfassungsvorrichtung eine Teststruktur, die mindestens ein Strukturelement aufweist, dessen Lage einem bestimmten Ablenkwinkelwert zugeordnet ist, und die zum Zeitpunkt der Erfassung der Ablenkeinrichtung nachgeordnet ist, und eine Detektoreinrichtung aufweist, die ein Detektionssignal abgibt, wenn der Laserstrahl auf das Strukturelement gerichtet ist, wobei die Steuereinrichtung bei Empfang des Detektorsignals das aktuelle Steuersignal dem bestimmten Ablenkwinkelwert zuordnet.
-
Im Laserscanningmikroskopen ist üblicherweise ein Scanningobjektiv vorgesehen, das unter Erzeugung eines Zwischenbildes den Laserstrahl auf das abzutastende Objekt richtet. In diesem Zwischenbild hat der Laserstrahl minimalen Strahlquerschnitt. Der Ablenkwinkel lässt sich deshalb besonders exakt messen, wenn die Detektion in dieser Zwischenbildebene oder einer dazu konjugierten Ebene erfolgt. In einer vorteilhaften Weiterbildung der Erfindung ist deshalb ein der Ablenkeinrichtung nachgeordnetes Scanningobjektiv, mit dem ein von der Ablenkeinrichtung zugeführter Laserstrahl auf ein abzutastendes Objekt richtbar ist, vorgesehen, und die Teststruktur ist in eine Zwischenbildebene schaltbar oder liegt in einer dazu konjugierten Ebene.
-
Da herkömmliche Ablenkeinrichtungen üblicherweise eine gewisse Zeitstabilität aufweisen, muss die Messung der Ablenkwinkelwerte nicht während jeder Bildaufnahme erfolgen; es genügt, dass Testobjekt in gewissen Abständen in die Zwischenbildebene zu schalten.
-
Das Testobjekt kann dazu geeignet beweglich ausgebildet sein, beispielsweise kann es auf einem nach Art eines Diatransportmechanismus eingeschoben oder mittels eines Schwenkmechanismus in die Zwischenbildebene geschwenkt oder geklappt werden. Wesentlich ist dabei nur, dass das Testobjekt in die Zwischenbildebene verbringbar ist, und bei normaler Mikroskopie eines Objektes keine im verwendeten Spektralbereich liegende Störung des Strahlengangs erfolgt. Das Schalten der Teststruktur in die Zwischenbildebene stellt dann einen der eigentlichen Mikroskopie des Objektes vorgeschalteten Kalibrierschritt dar.
-
Weiter ist es möglich, einen Spiegel, der dem Scanningobjektiv nachgeordnet ist, vorzusehen, der derart eingeschwenkt werden kann, dass die Teststruktur im eingeschwenkten Zustand des Spiegels in der Zwischenbildebene des Scanningobjektivs liegt.
-
Für besonders hohe Anforderungen, kann jedoch auch das Testobjekt ständig in einer zur Zwischenbildebene des Scanningobjektives konjugierten Ebene liegen. Dazu ist vorteilhafterweise ein dem Scanningobjektiv nachgeordneter, dichroitischer erster Strahlteiler vorgesehen, der einen Laserstrahl bestimmter Wellenlänge zur Teststruktur abteilt, die in der zur Zwischenbildebene des Scanningobjektivs konjugierten Ebene liegt. Der Strahlteiler trennt dabei für die Laserscanningmikroskopie des Objektes nicht benötigte Spektralanteile ab und lenkt diese zur Teststruktur. Mit diesem Konzept kann auch bei geringer Stabilität der Ablenkeinrichtung bzw. bei hohen Genauigkeitsanforderungen die gewünschte Bildlinearität erreicht werden, da eine kontinuierliche Erfassung möglich ist.
-
Der Aufbau der Teststruktur ist prinzipiell vielfältig möglich. Wesentlich ist nur, dass eine Detektion möglich ist, ob der Laserstrahl auf das Strukturelement trifft. In einer besonders einfachen Realisierung der Teststruktur ist das Strukturelement ein Schlitz oder ein Steg und die Detektoreinrichtung detektiert durch die Teststruktur transmittierte oder reflektierte Strahlung. Bei Ausbildung des Strukturelementes als Schlitz wird an der Tatsache, dass durch die Teststruktur hindurch Strahlung transmittiert wird, erkannt, dass das Strukturelement von Laserstrahlung getroffen wird. Bei Ausbildung des Strukturelementes als Steg sind die Verhältnisse genau umgekehrt. In dieser Variante ist es besonders zweckmäßig, hinter der Teststruktur, eventuell unter Zwischenschaltung einer Sammellinse, einen Fotodetektor zu platzieren, der sämtliche Strahlung detektiert, die durch die Teststruktur fällt.
-
Einen besonders kompakten Aufbau erreicht man, wenn die Erfassungsvorrichtung einen ortsauflösenden Fotoempfänger aufweist. In diesem Fall kann die Detektoreinrichtung Teilfunktionen der Teststruktur dahingehend übernehmen, dass die Ortsauflösung zum Teil oder ganz durch die Ortsauflösung des Fotoempfängers verwirklicht wird. Eine besonders einfache Bauweise erreicht man mit einer CCD-Kamera. Dann entspricht jedes Pixel der CCD-Kamera einem Strukturelement der Teststruktur. Natürlich muss die CCD-Kamera dann synchronisiert zur Ansteuerung der Ablenkeinrichtung ausgelesen werden. Vorzugsweise erfolgt das Auslesen in Umkehrphasen des Laserstrahls zwischen Hin- und Rückwärtsbewegung.
-
Eine besonders einfach zu fertigende Teststruktur erhält man, wenn die Strukturelemente Laserstrahlen reflektieren und die Detektoreinrichtung an der Teststruktur reflektierte Strahlung erfasst. Dann kann die Teststruktur beispielsweise als Strichgitter ausgebildet werden, wobei die einzelnen Striche des Gitters reflektierende Elemente, beispielsweise metallisierte Oberflächen eines Glasträgers sind. Hier bietet es sich beispielsweise an, für die Teststruktur bekannte Maßstäbe, wie sie bei Linearmeßeinrichtungen im Auflichtprinzip verwendet werden, einzusetzen.
-
Um den Zeitversatz zwischen der Messung des Ablenkwinkelwertes und der tatsächlichen Erfassung der am zum mikroskopierenden Objekt reflektierten oder emittierten Strahlung möglichst gering zu halten, ist es zweckmäßig, das Erfassungsprinzip, mit dem die Lage des Laserstrahls detektiert wird, dem Detektorstrahlengang des Laserscanningmikroskops möglichst genau nachzubilden. Verzögerung- und Totzeiten sind dann identisch. In einer bevorzugten Weiterbildung der Erfindung ist es vorgesehen, dass die Detektoreinrichtung ein Pinhole-Objektiv aufweist, dass an der Teststruktur reflektierte Strahlung erfasst, die über das Scanningobjektiv und die Ablenkeinrichtung zum Pinhole-Objektiv gelangt. Bei dieser Ausbildung ist der Zeitversatz zwischen Messung des Ablenkwinkelwertes und Erfassung eines von einem Pixel des zu mikroskopierenden Objektes stammende Strahlung nur noch durch eventuelle optische Weglängendifferenzen bestimmt, die jedoch normalerweise vernachlässigbar sind.
-
Bei der Variante mit dichroitischem Strahlteiler ist dann zweckmäßigerweise in Beleuchtungsrichtung dem Scanningobjektiv ein gleicher dichroitischer Strahlteiler vorgeordnet, der von der Teststruktur reflektierte Strahlung zur Detektoreinrichtung leitet.
-
Die gewünschte Bildlinearität kann dann besonders einfach mittels der Erfassung des Ablenkwinkelwertes erreicht werden, wenn die Ablenkeinrichtung zwei, hinsichtlich des Ablenkwinkels angesteuerte Kippspiegel aufweist und die Steuereinrichtung das Steuersignal abhängig von der Erfassung des Ablenkwinkels so beeinflusst, dass optimale Bildlinearität erreicht ist.
-
Die Lage und Anzahl der Strukturelemente auf der Teststruktur ist prinzipiell frei wählbar. So genügt ein einzelnes strichförmiges Strukturelement, um die Nullpunktlage des Laserstrahls genau einrichten zu können und auch einen etwaigen Nullpunkt-Versatz bis zu einem gewissen Grade auszugleichen. Eine besonders genaue Messung ergibt sich natürlich, wenn mehrere Strukturelemente vorgesehen werden, da dann mehrere Ablenkwinkelwerte erfasst werden können. Dazu wird eine Teststruktur mit mehreren, vorzugsweise äquidistant zueinander liegenden, strichförmigen Strukturelementen verwendet, die entlang einer Ablenkrichtung der Ablenkeinheit angeordnet sind. Zweckmäßigerweise überdecken die strichförmigen Strukturelemente dabei den maximalen Ablenkbereich.
-
Die Anzahl der äquidistant zueinander liegenden, strichförmigen Strukturelemente ist dabei wesentlich für die Zahl der Stützstellen, die dann bei der Analyse der Bewegung des Laserstrahls über den Ablenkwinkelbereich verwendet werden können. Hohe Linearitätsansprüche erfordern mitunter eine Synthese des Steuersignals mit fünf bis zehn ungeradzahligen Fourier-Koeffizienten, d.h. es müssen Oberwellen bis zur 19-fachen Ablenkfrequenz berücksichtigt werden können. Dabei sind mindestens vier äquidistante Stützstellen pro Wellenlänge bei der höchsten Frequenz erforderlich, d.h. man benötigt 76 Stützstellen. Es ist deshalb zu bevorzugen, dass die Teststruktur über eine volle Schwingung mindestens 76 äquidistant liegende Stützstellen ermöglicht, d. h. über die Bildbreite sind mindestens 38 Strukturelemente äquidistant verteilt.
-
Da darüber hinaus oft Anfangsbedingungen vorhanden sind, die einen Versatz um mehr als einen Stützstellenabstand, d.h. mehr als einen Strukturelementabstand verursachen, ist zweckmäßigerweise in der Teststruktur eine vorteilhafterweise in der Mitte liegende Marke vorhanden, die sich von den anderen Stützstellen unterscheidet, beispielsweise durch die Dicke oder die Länge des strichförmigen Strukturelementes.
-
Die eingangs genannte Aufgabe wird erfindungsgemäß weiter bei einem gattungsgemäßen Laserscanningmikroskopieverfahren dadurch gelöst, dass der Ablenkwinkel erfasst wird, indem die Lage des Laserstrahls nach der Ablenkeinrichtung detektiert wird. Durch Variation der Amplitude der Ablenkung wird ein elektronisch-optischer Zoom realisiert und die Ablenkwinkelwerterfassung wird jeweils für mehrere verschiedene, um einen Faktor gegeneinander abgestufte Ablenkamplituden ausgeführt.
-
Auch hierzu ist der Einsatz der eingangs erwähnten Teststruktur zweckmäßig, wobei bei einer Teststruktur mit mehreren, äquidistant zueinander liegenden, strichförmigen Strukturelementen, die entlang einer Ablenkeinrichtung angeordnet sind, die Ablenkung so entlang der Ablenkrichtung verstellt wird, dass der Laserstrahl nacheinander auf alle diese Strukturelemente gerichtet wird. Bei äquidistant liegenden Strukturelementen und linearer Strahlablenkungsbewegung ist dann der zeitliche Abstand, in dem die Strukturelemente getroffen werden, konstant.
-
Durch die Zuordnung der Ablenkwinkelwerte zum Steuersignal, d.h. die Zuordnung der Einstellung der Ablenkung zu den jeweiligen Ablenkwinkelwerten, die auf die eingangs erwähnte Weise gewonnen werden kann, wird vorteilhafterweise eine Kalibrierung der Ablenkeinrichtung erreicht.
-
Dazu kann zuerst das in der
DE 197 02 572 A1 erwähnte Vorgehen verwendet werden, wobei nunmehr allerdings bei der dort eingangs vorgesehenen Ansteuerung der Ablenkeinrichtung mit Sinusfunktionen steigender Frequenz nicht mehr die an der Ablenkeinrichtung vorgesehene Rückmeldeeinrichtung verwendet wird, sondern die Ablenkwinkelwerte mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens erfasst werden. Dadurch wird ein Frequenzgang der Ablenkeinrichtung ermittelt, der frei von Fehlern durch Laufzeitunterschiede bei der Ablenkwinkelwertemessung gegenüber einem Bildsignal ist. Der Frequenzgang wird dann bei der Ansteuerung der Ablenkeinrichtung entsprechend berücksichtigt, um die gewünschte Bildlinearität zu erreichen.
-
Aus dem Frequenzgang können dann vorteilhafterweise mittels einer Fourier-Analyse Fourier-Koeffizienten bestimmt werden, die dann bei der Ansteuerung der Ablenkeinrichtung verwendet werden, um eine zeitlich gleichförmige Veränderung der hin- und hergehenden Ablenkung zu erreichen.
-
Bei der Fourier-Analyse können aus dem ermittelten Frequenzgang der Ablenkeinrichtung zuerst die ungeradzahligen Koeffizienten hinsichtlich Amplituden- und Phaseninformation erfasst werden. Anschließend erfolgt sukzessiv eine grobe Phasen- und Amplitudenkorrektur der einzelnen ungeradzahligen Fourier-Koeffizienten dadurch, dass Differenzen zwischen Messung des Ablenkwinkels bei Hinwärts- und bei Rückwärts-Bewegungen des Laserstrahls über ein in Bildmitte liegendes, strichförmiges Strukturelement einer Teststruktur erfasst werden.
-
Als nächstes kann dann ein Feinabgleich der ungeradzahligen Fourier-Koeffizienten vorgenommen werden, in dem eine entsprechende fourieranalytische Auswertung an weiteren, außerhalb der Bildmitte liegenden strichförmigen Strukturelementen vorgenommen wird, wobei wiederum die Differenzen zwischen in Vorwärts- und in Rückwärtsrichtung erfassten Ablenkwinkelwerten in die Auswertung eingehen.
-
Abschließend können dann geradzahlige Fourier-Koeffizienten berücksichtigt werden, die ebenfalls Linearitätsverzerrungen verursachen.
-
Zur weiteren Genauigkeitssteigerung kann man durch Variation der Fourier-Koeffizienten eine zusätzliche Linearisierung erreichen, wobei die nötige Information zur Größe und Richtung der Variation der Koeffizienten eine fourieranalytische Analyse der Linearitätsabweichungen erfolgt. Schließlich ist ein Feinabgleich aller Phasen- und Amplitudenanteile auf optimale Linearität und/oder minimalen Versatz zwischen vorwärts- und rückwärtsabgetasteten Ablenkwinkelwerten durch fourieranalytische Auswertung der Bildorte der strichförmigen Strukturelemente möglich, um optimale Bildlinearität zu erreichen.
-
Bei Laserscanningmikroskopen wird durch Variation der Amplitude der Ablenkung ein sogenannter elektronisch-optischer Zoom realisiert. Da sich dabei die Eigenschaften der Ansteuerung deutlich ändern, wird die erfindungsgemäße Ablenkwinkelwerterfassung jeweils für mehrere verschiedene, um einen Faktor gegeneinander abgestufte Ablenkamplituden ausgeführt. Es ist zweckmäßig, für jede Ablenkamplitude separat Fourier-Koeffizienten abzuspeichern. Beispielsweise können sechs verschiedene, um den Faktor 0,5·20,5 abgestufte Ablenkamplituden verwendet werden, die jeweils einem Zoomfaktor entsprechen. Zweckmäßigerweise sieht die Teststruktur dazu für jeden Zoomfaktor eine Gruppe strichförmiger Strukturelemente vor, die über den beim jeweiligen Zoomfaktor vorgesehenen Ablenkbereich äquidistant verteilt sind, wobei jeweils die gleiche Anzahl an strichförmigen Strukturelementen verwendet wird, um die oben erwähnte erforderliche Anzahl an Stützstellen zu gewährleisten.
-
Die Erfindung wird nachfolgend anhand der Zeichnung beispielhalber noch näher erläutert. In der Zeichnung zeigt:
-
1 eine schematische Darstellung eines Laserscanningmikroskops mit einer Vorrichtung zur Messung des Ablenkwinkels,
-
2 eine perspektivische Darstellung von Komponenten eines Laserscanningmikroskops,
-
3 eine vereinfachte Darstellung einer Teststruktur, die zur Messung von Ablenkwinkelwerten in der Vorrichtung der 1 bzw. 2 verwendet wird,
-
4 ein Blockschaltbild eines Verfahrens zur Kalibrierung eines Laserscanningmikroskops und
-
5 ein Blockschaltbild eines Abschnittes eines Verfahrens zur Kalibrierung eines Laserscanningmikroskops.
-
In 1 ist ein Laserscanningmikroskop gezeigt, das hinsichtlich der Ablenkung eines Laserstrahls kalibrierbar ist. Das Laserscanningmikroskop weist ein Faser 1 auf, aus der ein divergenter Laserstrahl 1a austritt. Dieser wird mittels eines Kollimators 2 zu einem parallelen Strahl gerichtet und trifft auf einen Hauptteiler 3, der den parallelen Laserstrahl 1a in Richtung einer zweiachsigen Ablenkeinrichtung reflektiert, die von zwei Scannerspiegeln 4 und 5 gebildet wird, deren Achsen zueinander gekreuzt sind (in 1 zur Vereinfachung in einer Ebene dargestellt). Von den Scannerspiegeln läuft der Laserstrahl 1a zu einem Scanningobjektiv 6, das den Laserstrahl in Richtung eines Objektes leitet. Dem Scanningobjektiv 6 ist eine Erfassungsvorrichtung 7 nachgeordnet, die später noch eingehender erläutert wird.
-
Ein Umlenkspiegel 8 nimmt einen vom Scanningobjektiv 6 zugeführten Laserstrahl auf und lenkt ihn zu einer Tubuslinse 9 die zusammen mit einem nachgeordneten Objektiv 10 den Laserstrahl auf ein Objekt 11 fokussiert.
-
Im Objekt 11 erfolgt eine Wechselwirkung des Laserstrahls 1a mit dem Objekt, wobei Reflexion oder Emission von Fluoreszenzstrahlung stattfindet. Diese im Objekt 11 generierte Strahlung läuft den Strahlungsweg entgegen der Beleuchtungsrichtung wieder zurück, d.h. wird vom Objektiv 10 aufgenommen und gelangt von der Tubuslinse 9 über den Umlenkspiegel 8 zum Scanningobjektiv 6 und wird von den Scannerspiegeln 5 und 4 zum Hauptteiler 3 gelenkt. Diesen passiert die vom Objekt 11 kommende Strahlung zumindest teilweise, so dass sie über ein Pinhole-Objektiv 12 und eine Pinhole-Blende 13 von einem Detektor 14 aufgenommen wird.
-
Die Scannerspiegel 4 und 5 werden zur Abrasterung einer Objektfläche am Objekt 11 geeignet angesteuert, was später noch näher erläutert wird. Für die Ansteuerung der Ablenkeinrichtung ist die Erfassungsvorrichtung 7 vorgesehen, mittels der der Wert des Ablenkwinkels, um den der Laserstrahl 1a von den Scannerspiegeln 4 und 5 abgelenkt wird, gemessen werden kann, um eine exakte Zuordnung zwischen Ansteuerung der Scannerspiegel 4 und 5 und Ablenkwinkel zu erhalten. Dabei wird insbesondere das dynamische Verhalten der Scannerspiegel 4 und 5 durch geeignete Ansteuerung berücksichtigt, so dass sich ein gewünschter Verlauf des Laserstrahls über das Objekt 11 ergibt.
-
Die Erfassungsvorrichtung 7 weist einen dichroitischen Strahlteiler 15 auf, der aus dem Laserstrahl 1a Strahlung eines bestimmten Wellenlängenbereiches auskoppelt. Dabei handelt es sich um einen Wellenlängenbereich, bei dem vom Laserstrahl 1a keine oder nur geringe bzw. zur Auswertung nicht interessierende Wechselwirkungen im Objekt 11 vom Laserstrahl 1a angeregt werden. Der vom dichroitischen Strahlteiler 15 ausgekoppelte Anteil des Laserstrahls 1a wird von einer Feldlinse 16 auf einem Testgitter 17 fokussiert. Dieses Testgitter 17 weist örtlich verteilte Strukturelemente auf, wobei jedes Strukturelement einem bestimmten Ablenkwinkelwert entspricht, d.h. nur bei einer ganz bestimmten Ansteuerung der Scannerspiegel 4 und 5 von dem Laserstrahl, den der dichriotische Strahlteiler 15 auskoppelt, beleuchtet wird.
-
Das Testgitter 17 kann verschiedenartig gestaltete Strukturelemente haben. In einer ersten Variante handelt es sich bei den Strukturelementen um reflektierende Striche, so dass nur dann, wenn die Scannerspiegel 4 und 5 den Laserstrahl auf ein Strukturelement richten, eine Rückreflexion zum dichroitischen Strahlteiler 15 erfolgt.
-
Die Anordnung von Testgitter 17, Feldlinse 16 und dichroitischem Strahlteiler 15 ist dabei zum Scanningobjektiv so ausgerichtet, dass das Testgitter 17 in einer zur Zwischenbildebene des Scanningobjektivs 6 konjugierten Ebene liegt. Wird an einem Strukturelement Strahlung reflektiert, gelangt diese über Feldlinse 16 und dichroitischen Strahlteiler 15 zum Scanningobjektiv 6 und von dort über die Scannerspiegel 4 und 5 zu einem Strahlteiler (nicht dargestellt), der die gleiche Funktion wie der Hauptteiler 3 erfüllt und vorzugsweise so ausgebildet ist, dass er den Wellenlängenanteil, den der dichroitische Strahlteiler aus dem Laserstrahl 1a abgeteilt hat, geeignet von der entgegen der Beleuchtungsrichtung laufenden Strahlung, die vom Objekt 11 stammt, abtrennt. Dieser Strahlteiler hat dann die gleichen Eigenschaften wie der dichroitische Strahlteiler 15 und sorgt dafür, dass die an einem Strukturelement des Testgitters 17 reflektierte Strahlung in einen separaten zur Erfassungsvorrichtung gehörenden Detektorstrahlengang gelangt, der analog dem zuvor beschriebenen Detektorstrahlengang ein Pinhole-Objektiv, eine Pinhole-Blende und einen Detektor aufweist.
-
Vom dichroitischen Strahlteiler 15 wieder in den Strahlengang entgegen der Beleuchtungsrichtung eingekoppelte, an einem Strukturelement des Testgitters 17 reflektierte Strahlung wird letztendlich von einem Detektor wahrgenommen. Detektiert die Erfassungsvorrichtung mittels dieses Detektors einen Reflex von einem Strukturelement des Testgitters 17, kann der Ablenkwinkelwert, der diesem Strukturelement entspricht, der momentanen Ansteuerung der Scannerspiegel 4 und 5 zugeordnet werden, wodurch eine exakte Lagerückmeldung erreicht ist.
-
Diese Lagerückmeldung ist gegenüber dem normalen Betrieb des Laserscanningmikroskops, in dem Wechselwirkungen am Objekt 11 für detektierte Strahlung sorgen, verzögerungsfrei, weshalb das Zeitverhalten der Scannerspiegel 4 und 5 mit Hilfe des Testgitters 17 ermittelt werden kann. Das derart bekannte Zeitverhalten wird dann auf noch zu beschreibende Weise bei der Ansteuerung der Scannerspiegel 4 und 5 während der Mikroskopierung eines Objektes 11 verwertet.
-
2 zeigt eine Abwandlung der Erfassungsvorrichtung 7. Hier ist anstelle des dichroitischen Strahlteilers 15 ein Schwenkspiegel 18 vorgesehen, der den vom Scanningobjektiv 6 kommenden Laserstrahl 1a so umlenkt, dass er auf das nun in der Zwischenbildebene 19 des Scanningobjektivs 6 liegende Testgitter 17 fällt. Wenn der Schwenkspiegel 18 eingeschwenkt ist, kann keine Strahlung mehr auf das Objekt 11 fallen. Stattdessen findet eine Kalibrierung der Scannerspiegel 4 und 5 statt. Zum eigentlichen Mikroskopieren wird der Schwenkspiegel 18 wieder ausgeschwenkt.
-
In einer weiteren Abwandlung kann anstelle des Schwenkspiegels 18 das Testgitter mit der ihm vorgeschalteten Feldlinse direkt in den Strahlengang nach dem Laserscanningmikroskop geschaltet werden (in 1 gestrichelt eingezeichnet). Dazu wird ein Testgitter 28 mit vorgeschalteter Feldlinse 27 in Richtung des Pfeiles 29 in den Strahlengang bewegt, beispielsweise durch einen Schwenk- oder Schiebemechanismus.
-
1 zeigt in punktierter Darstellung eine optionale Ausgestaltung der Erfassungsvorrichtung bezüglich der Detektion von auf ein Strukturelement des Testgitters 17 fallender Strahlung. Dazu ist das Testgitter 17 transmittiv ausgestaltet, wobei sich die Transmissionseigenschaften eines Strukturelementes von dem übrigen Transmissionsverhalten des Testgitters 17 unterscheidet. Dazu kann ein Strukturelement beispielsweise als transmittierender Schlitz oder als absorbierender Steg ausgebildet sein. Hinter das Testgitter 17 ist in dieser Variante ein flächiges photoempfindliches Element 30 geschaltet, der die durch das Testgitter 17 transmittierte Strahlung aufnimmt und somit eine Anzeige erlaubt, ob Laserstrahlung auf ein Strukturelement gerichtet ist oder nicht. Zweckmäßigerweise ist zwischen Testgitter 17 und Element 30 eine Optik geschaltet, die eine zwischen beiden Kippspiegeln liegende Ebene auf das Element 30 abbildet, damit Sensitivitätsunterschiede des Elementes über dessen Fläche keine Verfälschungen bewirken. Auf das Testgitter 17 kann verzichtet werden, wenn als Element 30 ein CCD-Detektor verwendet wird, der eine Ortauflösung erlaubt.
-
Der Aufbau des Testgitters 17 ist beispielhaft in 3 gezeigt. Das Testgitter 17 (in 3 auch mit 20 bezeichnet) hat eine Teststruktur 21, die aus einer Spiegelbeschichtung besteht, welche auf einem Träger, beispielsweise einem Glasträger aufgebracht ist. Diese Spiegelbeschichtung hat strichförmige Elemente. Eine Mittenmarke 22 legt die Mitte des Testgitters 17 fest und entspricht der Mittelachse eines abzutastenden Objektfeldes im Laserscanningmikroskop. Zusätzlich zu der Mittenmarke 22 ist eine Liniengitterstruktur 23 mit einzelnen Liniengittern 24 vorgesehen, die jeweils 40 bis 80 spiegelnde Gitterstriche 25 aufweisen. Die Gitterstriche 25 in den einzelnen Liniengittern 24 haben unterschiedlichen Abstand, so dass die einzelnen Liniengitter eine unterschiedliche Gitterkonstante aufweisen. Jedes Liniengitter 24 überdeckt einen anderen Ablenkwinkelbereich und ist, wie später noch erläutert wird, einem Zoomfaktor des Laserscanningmikroskops zugeordnet.
-
Eine Steuereinrichtung 26 ist mit den Scannerspiegeln 4 und 5 sowie mit dem Detektor 14 und dem Detektor der Erfassungsvorrichtung über nicht näher bezeichnete Leitungen verbunden und führt eine Kalibrierung der Bewegung der Scannerspiegel 4 und 5 nach dem nachfolgend geschilderten, in Fig. gezeigten, Verfahren aus:
Die Kalibration erfolgt für jeden Scannerspiegel 4, 5 separat, in der nachfolgenden Beschreibung wird von einer Kalibration des Scannerspiegels 4 ausgegangen. Welcher Scannerspiegel kalibriert wird, hängt von der Ausrichtung des Testgitters 17 ab, da die Striche möglichst senkrecht zur Richtung der Ablenkung liegen müssen, die durch den zu kalibrierenden Scannerspiegel bewirkt wird.
-
Bei im Strahlengang befindlichem Testgitter, d.h. bei eingeschwenktem Schwenkspiegel 18 oder bei eingefahrenem Testgitter 28, werden die Scannerspiegel 4 und 5 mit einem Steuersignal angesteuert. Die Ansteuerung erfolgt dabei mit einem Steuersignal, das mittels Fourier-Koeffizienten synthetisiert ist. Die Fourier-Koeffizienten können auf noch zu beschreibende Weise gewonnen werden. Dabei bewirken die Fourier-Koeffizienten eine Verzerrung des Steuersignals, die idealerweise so ist, dass die Bewegung des Scannerspiegels 4 zu einem gewünschten Ablenkungsverlauf des Laserstrahls führt.
-
Dann werden in einem Schritt S1 die Reflexe an der Mittenmarke 22 detektiert und die dieser Detektion zugeordneten Ansteuerwerte des Scannerspiegels 4 gespeichert. Mittels der Erfassung der Mittenmarke in Schritt S1 kann dann sukzessiv eine grobe Phasenkorrektur der einzelnen ungeradzahliger Fourier-Koeffizienten des Ansteuersignals des Scannerspiegels 4 durch Auswertung der Differenz zwischen Detektion der Mittenmarke bei einer Hinwärtsschwenkbewegung und einer Rückwärtsschwenkbewegung des Scannerspiegels 4 erfolgen.
-
Nach der ersten, groben Phasenkorrektur wird der Laserstrahl auf ein Liniengitter 24 gesteuert. Welches der mehrere Liniengitter der Teststruktur 17 dazu verwendet wird, hängt vom eingestellten Zoomfaktor ab. Ein Laserscanningmikroskop ermöglicht es, auf elektronisch-optische Weise einen bestimmten Bildausschnitt zu vergrößern, indem der Ablenkbereich des Laserstrahls eingeschränkt wird. Um eine optimale Anzahl an Stützstellen für die nachfolgend vorgenommene Fourier-Analyse zur Verfügung zu haben, wird dasjenige Liniengitter 24 ausgewählt, das gerade noch den beim gewählten Zoomfaktor überdeckten Ablenkwinkelbereich erfasst (Schritt S2).
-
Anschließend wird in einem Schritt S3 ein eindimensionaler Scan mit dem Scannerspiegel 4 vorgenommen, wobei ein Feinabgleich aller ungeradzahligen Fourier-Koeffizienten durch eine fourieranalytische Auswertung der Differenzen zwischen den detektierten Orten der einzelnen Gitterstriche 25 des Liniengitters 24 zwischen Vorwärts- und Rückwärtsbewegung des Scannerspiegels 4 erfolgt.
-
Dazu werden in einem Schritt S4 die Reflexe erfasst und die entsprechenden Amplituden- und Phaseninformationen in einem Schritt S5 ermittelt. In einer Fourier-Analyse werden dann in einem Schritt S6 weiter die geradzahligen Koeffizienten bestimmt, die Linearitätsverzerrungen verursachen. Dabei wird geprüft, ob die durch die Reflexe an den Gitterstrichen 25 detektierte Bewegung des Laserstrahls über den für diesen Zoomfaktor geltenden Ablenkwinkelbereich Fourier-Frequenzen enthält, die den gewünschten Bewegungsverlauf stören. Diese Anteile werden durch Hinzufügen geeigneter Koeffizienten kompensiert. Bei der Analyse werden Oberwellen bis zur 19-fachen Scanfrequenz berücksichtigt, so dass fünf bis zehn ungeradzahlige Fourier-Koeffizienten erfasst werden.
-
In einer anschließenden Optimierung zur weitergehenden Linearisierung (in 4 nicht dargestellt) erfolgt eine Variation der Amplitude der Fourier-Koeffizienten, wobei die Information zur Größe und Richtung der Variation aus einer fourieranalytischen Analyse der Linearitätsabweichungen von gemessenem Verlauf der Ablenkwinkelwerte zum Sollwert gewonnen wird.
-
Schließlich ermöglicht die Auswertung der detektierten Bildorte der Gitterstriche 25 in einer weiteren fourieranalytischen Auswertung einen Feinabgleich der Phasen- und Amplitudenanteile des Steuersignals, das aus den Fourier-Koeffizienten synthetisiert wird, hinsichtlich optimaler Linearität bzw. minimalen Versatz zwischen Vorwärts- und Rückwärtsbewegung des Scannerspiegels 4.
-
Dieses Vorgehen kann für jeden Zoomfaktor wiederholt werden (Schleife B in 4), so daß in der Steuereinrichtung 26 dann für mehrere Zoomfaktoren entsprechende Fourier-Koeffizienten abgespeichert sind, die eine kalibrierte Abtastung eines Objektes 11 ermöglichen. Die Zoomfaktoren, d.h. die Amplitudenunterschiede der Liniengitter 24, sind jeweils um 1:1,6 bis 1:2 abgestuft.
-
Weiter kann man durch eine lineare Interpolation zwischen Fourier-Koeffizienten benachbarter Zoomfaktoren optimale Ansteuerbedingungen für einen beliebigen, zwischen diesen Zoomfaktoren liegenden Zoomfaktor generieren.
-
Zum Kalibrieren des anderen Scannerspiegels 5 wird das Testgitter 17 um 90° gedreht. Optional kann auch ein Testgitter verwendet werden, das Strukturen für beide Ablenkeinrichtungen aufweist.
-
Die Gewinnung der grobkorrigierenden Fourier-Koeffizienten kann dem in 5 als Blockschaltbild dargestelltem Schema folgen. Dazu wird in einem Schritt S7 der Scannerspiegel 7 mit einem sinusförmigen Steuersignal angetrieben, wobei die Frequenz des Sinussignals über einen breiten Frequenzbereich verändert wird. Dann wird in Schritt S8 entweder über eine am Scannerspiegel vorgesehene Lagerückmeldung oder über geeignete Auswertung der Reflexe an den Gitterstrichen die Antwort des Scannerspiegels auf diese Sinusansteuerung erfasst.
-
Anschließend wird in einem Schritt S9 eine Fourier-Analyse vorgenommen, bei der die erwähnten ungeradzahligen Fourier-Koeffizienten in Amplituden- und Phaseninformation ermittelt werden, die eine Grobkorrektur des Frequenzganges des Scannerspiegels ermöglichen. Das Steuersignal wird dann mittels dieser Fourier-Koeffizienten so verzerrt, dass die Bewegung des Scannerspiegels in grober Näherung der Bewegung eines idealen Scannerspiegels unter Dreieckssignalansteuerung entspricht.
-
Durch diese Kalibrierung kann der Versatz zwischen Vorwärts- und Rückwärtslauf jedes Scannerspiegels 4, 5 unter 0,2 Pixel bei einem Bildformat von 512×512 Pixel gedrückt werden; die Position des Scannerspiegels kann durch die Erfassung der Lage des Laserstrahls mit einer Ortsauflösung ≥ 12 Bit ermittelt werden.
