JP5861895B2 - 分光器及び顕微分光システム - Google Patents

Description

本発明は、分光器及び顕微分光システムに関する。

従来の走査型蛍光顕微鏡では、点光源から射出された励起光を走査ユニットにより標本上で走査し、この励起光により励起された標本から射出された蛍光を走査ユニットでディスキャンしフィルタにて分光し、さらに、分光された蛍光をそれぞれの受光器で検出するように構成されている。この場合、標本から射出された蛍光を効率良く検出するためには、ユーザが使う励起光や蛍光色素に応じてフィルタを多数用意しておく必要がある（例えば、特許文献１参照）。

米国発行特許発明第６９０９５４２号明細書

しかしながら、従来のフィルタを用いた分光方式では、蛍光波長の取得領域はフィルタごとに決まっているため、必要に応じて蛍光波長の取得領域を任意に選択することができず、また、蛍光色素が変わるたびに適切なフィルタを選びなおさなければならないため、装置に多くのフィルタを所持していなければならずコストがかかるとともに、装置が大型化するという課題があった。

本発明はこのような課題に鑑みてなされたものであり、角度依存素子である分光素子に対する蛍光の入射角度を変化させてこの分光素子の波長特性を変化させることにより、分光して検出する光の波長領域を変化させることができる分光器及び顕微分光システムを提供することを目的とする。

前記課題を解決するために、本発明に係る分光器は、光を略平行光とするコリメート光学系と、この光の入射角度により分光する波長帯域が変化する分光素子を少なくとも１枚含む分光光学系と、この分光光学系で分光された光を検出する少なくとも１つの受光器と、分光素子に対する光の入射角度を変化させる機構と、光を分光する波長帯域に応じて、分光素子に対する光の入射角度を決定し、当該入射角度になるように機構を制御する制御部と、を有することを特徴とする。

このような分光器において、分光光学系は、入射する光の一部を透過し、残りを反射する第１の光学素子と、第１の光学素子で反射された光の少なくとも一部を反射する第２の光学素子と、を有し、第１の光学素子及び第２の光学素子の少なくとも一方は、光の入射角度により分光する波長帯域が変化する分光素子であり、制御部は、機構を制御して第１の光学素子の入射面の向きを変化させ、第１の光学素子の入射面の向きの変化に伴って、機構を制御して第２の光学素子の入射面の向きを変化させる。

また、このような分光器において、制御部は、機構を制御して、第１の光学素子の入射面を延長した面と第２の光学素子の入射面を延長した面とのなす角度を所定の値に維持したまま、第１の光学素子及び第２の光学素子を移動させて入射角度を変化させる。

また、このような分光器は、機構を制御して、第１の光学素子の入射面を延長した面と第２の光学素子の入射面を延長した面との交線を軸として第１の光学素子及び第２の光学素子を一体に回転させることにより、入射角度を変化させてもよい。

また、このような分光器において、制御部は、機構を制御して、コリメート光学系の光軸上に位置する回転軸による第１の光学素子の回転に応じて、この第１の光学素子の回転軸を中心に第２の光学素子を回転させることにより、入射角度を変化させてもよい。

また、このような分光器は、第２の光学素子から射出する光を受光器上に集光する集光レンズを有してもよい。

また、このような分光器は、分光光学系と当該分光光学系で分光された光を受光する受光器との間に配置され、前記光とは異なる波長の光を遮断するバリアフィルタを有し、このバリアフィルタは、異なる波長の光のバリアフィルタに対する入射角度により遮断する光の波長帯域が変化してもよい。

また、本発明に係る顕微分光システムは、光源から放射された所定の波長を有する照明光を走査して対物レンズにより標本に照射するとともに、この標本から放射される、所定の波長とは異なる波長を有する光を対物レンズで集光する顕微鏡と、この顕微鏡からの光を分光して検出する上述の分光器のいずれかと、を有することを特徴とする。

このような顕微分光システムにおいて、制御部は、入力部で入力された蛍光色素の種類、照明光の波長及び前記光の波長の少なくも一つに対応して前記入射角度になるように機構を制御してもよい。

また、このような分光システムは、前記入射角度を蛍光色素の種類、照明光の波長及び前記光の波長の少なくとも一つに対応付けて記憶する記憶部を有し、制御部は、記憶部から読み出された入射角度になるように機構を制御してもよい。

また、このような分光システムにおいて、制御部は、照明光の波長の切り替えによって生じる入射角度の補正値に基づいて機構を制御してもよい。

本発明によれば、角度依存素子である分光素子に対する信号光（蛍光）の入射角度を変化させてこの分光素子の波長特性を変化させることにより、分光して検出する光の波長領域を変化させることができる分光器及び顕微分光システムを提供することができる。

顕微分光システムの構成を示す説明図である。 第１の実施形態に係る分光器の構成を示す説明図である。 分光素子の透過率の波長特性を説明するための説明図であって、（ａ）は１つの分光素子の波長特性を示し、（ｂ）は２つの分光素子を組み合わせた場合の波長特性を示す。 顕微分光システムにおいて標本の像を取得するときの処理を示すフローチャートである。 第２の実施形態に係る分光器の構成を示す説明図である。 第３の実施形態に係る分光器の構成を示す説明図である。 第１実施例に係る分光器の構成を示す説明図である。 第１実施例に係る分光器の波長特性を説明するための説明図である。 第２実施例に係る分光器の構成を示す説明図である。 第２実施例に係る分光器の波長特性を説明するための説明図である。 第３実施例に係る分光器の構成を示す説明図である。 第３実施例に係る分光器の波長特性を説明するための説明図である。 第４実施例に係る分光器の波長特性を説明するための説明図である。

以下、本発明の好ましい実施形態について図面を参照して説明する。まず、図１を用いて顕微分光システムの構成について説明する。図１に示すように、この顕微分光システム１は、光源系１０、共焦点ユニット２０及び顕微鏡３０を有する共焦点顕微鏡と、分光器４０と、制御部５０と、を有して構成されている。この顕微分光システム１において、共焦点ユニット２０と分光器４０とは、ファイバカプラ２９ａ，２９ｂを介して光ファイバ２８により光学的に接続されている。

光源系１０は、レーザ装置１１と、光ファイバ１３と、ファイバカプラ１２，１４と、を有する。レーザ装置１１は、例えば、レーザーダイオードを備え、目的の波長特性を有するレーザ光（照明光）を射出する。この照明光は、光ファイバ１３を介して共焦点ユニット２０に導かれる。なお、図１の例では、照明光として、標本３３を励起して蛍光を発光させるための励起光を射出する。

共焦点ユニット２０は、光源系１０からの照明光を略平行光束とするコリメートレンズ２１と、ダイクロイックミラー２２と、走査ユニット２３と、スキャナレンズ２４と、集光レンズ２５と、ピンホール２６ａを有するピンホール板２６と、リレーレンズ２７と、を有する。また、顕微鏡３０は、第２対物レンズ３１及び対物レンズ３２と、標本３３が載置されるステージ３４と、を有する。これらの共焦点ユニット２０と顕微鏡３０とを組み合わせて走査型共焦点顕微鏡が構成される。なお、ダイクロイックミラー２２は、光源系１０から射出されたレーザ光を顕微鏡３０側に反射し、このレーザ光により励起した標本３３から放射される蛍光を透過するように構成されている。また、集光レンズ２５の像側焦点は、ピンホール板２６のピンホール２６ａと略一致するように配置されている。

光源系１０のレーザ装置１１から射出されたレーザ光（照明光）はファイバカプラ１２を介して光ファイバ１３に導入される。さらにこの光ファイバ１３を通ったレーザ光はファイバカプラ１４から共焦点ユニット２０のコリメートレンズ２１に入射する。そして、このレーザ光はコリメートレンズ２１で略平行光に変換された後、ダイクロイックミラー２２で顕微鏡３０側の光路に反射され、直交配置された２つのガルバノミラーからなる走査ユニット２３及びスキャナレンズ２４に導入されて、二次元的に走査される。走査されたレーザ光は、第２対物レンズ３１で略平行光にされた後、対物レンズ３２で標本３３上の１点に集光される。なお、走査ユニット２３により二次元的に走査される標本３３上の位置は、制御部５０により走査ユニット２３におけるガルバノミラーの動作を制御することにより制御される。そして、このレーザ光（照明光）により励起された標本３３から放射された蛍光（信号光）は、対物レンズ３２で略平行光に変換され、レーザ光（照明光）と逆の経路を辿ってダイクロイックミラー２２に入射する。さらに、ダイクロイックミラー２２に入射した蛍光はこのダイクロイックミラー２２を透過し、集光レンズ２５によりピンホール板２６のピンホール２６ａ上に集光される。

ピンホール２６ａを通過した蛍光（信号光）は、リレーレンズ２７を経て、ファイバカプラ２９ａから光ファイバ２８に導かれる。リレーレンズ２７を介すると、図１に示すように、ピンホール２６ａを通過した光が、そのままであると発散光束となるところを、再び、集光され、光ファイバ２８の開口端において、見かけ上、小さな開口径でも、有効に（ロスが少なく）入射できるようになる。

ここで、ピンホール２６ａに形成される集光点は標本３３上での光スポットの像となっているため、標本３３上の他の点から発した光がたとえあったとしても、ピンホール２６ａでは像を結ばずピンホール板２６により遮られ、ファイバカプラ２９ａにほとんど到達できない。そのため、このピンホール２６ａを通過できた光のみが、リレーレンズ２７を介してファイバカプラ２９ａに到達できる。この結果、走査型共焦点顕微鏡では高い横分解能だけでなく、高い縦分解能を持って標本を観察できる顕微鏡となっている。

ファイバカプラ２９ａに入射した蛍光（信号光）は、光ファイバ２８を通り、ファイバカプラ２９ｂを介して分光器４０に導入される。以下、本実施形態に係る分光器４０の構成について説明する。

［第１の実施形態］
図２に示すように、分光器４０は、ファイバカプラ２９ｂを介して光ファイバ２８から入射する信号光（図１の例では蛍光）を略平行光束とするコリメート光学系４１と、このコリメート光学系４１の光軸上に配置され、入射する信号光の一部を透過し、残りを反射する第１及び第２の分光光学系４２，４３と、第１の分光光学系４２で反射されて分光された信号光の強度を検出する第１の受光器４４と、第１の分光光学系４２を透過し第２の分光光学系４３で反射されて分光された信号光の強度を検出する第２の受光器４５と、第２の分光光学系４３を透過して分光された信号光を検出する第３の受光器４６と、から構成される。

この分光器４０において、第１及び第２の分光光学系４２，４３の各々は、例えば、図３（ａ）に示すように、所定の波長λより短い波長の光を反射し、この波長λより長い波長の光を透過する、１枚のロングパスフィルタ（分光素子４２ａ，４３ａ）で構成されている（以下、この波長λを「境界波長」と呼ぶ）。また、これらの第１及び第２の分光光学系４２，４３を構成する分光素子４２ａ，４３ａは、角度依存素子であって、入射する光の入射角度に応じて、透過と反射の境界波長λが変化するものである（図３（ａ）の場合、λ−Δλからλ＋Δλまで変化可能な場合を示している）。

図２に示すように、２枚の分光素子４２ａ，４３ａを組み合わせた場合、図３（ｂ）に示すように、第１の分光光学系４２（分光素子４２ａ）の境界波長がλ１で、第２の分光光学系４３（分光素子４３ａ）の境界波長がλ２とすると、第１の分光光学系４２の分光素子４２ａにより、λ１より短い波長の光が反射されて第１の受光器４４で検出され、第２の分光光学系４３の分光素子４３ａにより、λ１より長くλ２より短い波長の光が反射されて第２の受光器４４で検出され、λ２より長い波長の光が第３の受光器４６で検出される。このとき、分光素子４２ａ，４３ａの各々を光軸に直交する方向の軸（図２の紙面に垂直な方向）を中心に回転させることにより、これらの分光素子４２ａ，４３ａに入射する信号光の入射角度が変化するため、それぞれの境界波長λ１，λ２を変化させて第１〜第３の受光器４４〜４６で検出される信号光の波長帯域を調整することができる。すなわち、この第１の実施形態に係る分光器４０では、検出する信号光の波長帯域毎に異なる境界波長の第１及び第２の分光光学系４２，４３を用意する必要はなく、これらの分光素子４２ａ，４３ａを回転させることにより、分光される信号光の波長帯域を調整することが可能となる。

なお、分光素子４２ａ，４３ａを回転させて入射する信号光の入射角度を変化させると、反射して射出する射出角度も変化する。そのため、図２に示すように分光素子４２ａ，４３ａの回転に応じて第１及び第２の受光器４４，４３も、分光素子４２ａ，４３ａの回転中心を中心に回転させる必要がある。

また、以上のような構成の分光器４０において、分光素子４２ａ，４３ａを移動させる機構（分光素子４２ａ，４３ａに対する光の入射角度を変化させる機構）として駆動ユニット５４ａ〜５４ｄを設け、駆動ユニット５４ａ〜５４ｄにより第１及び第２の分光光学系４２，４３の分光素子４２ａ，４３ａを回転させ、第１及び第２の受光器４４，４５を回転させるように構成し、これらの回転の制御を制御部５０からの制御信号により行うように構成することが可能である。

図２に示すように、制御部５０には、第１及び第２の分光光学系４２，４３や第１及び第２の受光器４４，４５の作動を制御するための情報を入力するための入力部５１、第１〜第３の受光器４４〜４６で検出された標本３３の画像を表示する出力部５２、これらの画像及び制御情報等を記憶する記憶部５３、並びに、第１の分光光学系４２の分光素子４２ａを移動（回転）させる駆動ユニット５４ａ、第２の分光光学系４３の分光素子４３ａを移動（回転）させる駆動ユニット５４ｂ、第１の受光器４４を移動させる駆動ユニット５４ｃ及び第２の受光器４５を移動させる駆動ユニット５４ｄからなる機構が接続されている。この制御部５０に対して、第１〜第３の受光器４４〜４６で検出する波長の範囲（実際には、分光素子４２ａ，４３ａの境界波長λ１，λ２）を入力部５１を介して制御部５０に設定し、制御部５０によりこの境界波長となるように分光素子４２ａ，４３ａの回転角度（これらの分光素子４２ａ，４３ａに対する信号光の入射角度）を決定し、またこの回転角度に応じて第１及び第２の受光器４４，４５の回転角度を決定して駆動ユニット５４ａ〜５４ｄによりこれらの分光素子４２ａ，４３ａ及び受光器４４，４５を作動させる。あるいは、蛍光色素毎に、この蛍光色素を励起するための照明光の波長（励起波長）及び励起された色素から発生する信号光の波長（蛍光波長）を対応付けて記憶部５３に記憶しておき、入力部５１から入力された蛍光色素の種類や励起波長又は蛍光波長に基づいて制御部５０が記憶部５３から必要な情報を読み出して第１及び第２の分光光学系４２，４３の境界波長を決定し、この決定された境界波長となるように駆動ユニット５４ａ〜５４ｄにより第１及び第２の分光光学系４２，４３及び第１及び第２の受光器４４，４５の作動を制御するように構成してもよい。もちろん、上記蛍光色素等に対応付けて分光素子４２ａ，４３ａに対する信号光の入射角度を予め記憶部５３に記憶しておき、この入射角度を読み出して駆動ユニット５４ａ〜５４ｄにより第１及び第２の分光光学系４２，４３等の作動を制御してもよいし、蛍光色素毎に基準の入射角度からの補正値を記憶部５３に記憶しおき、この補正値に対応させて駆動ユニット５４ａ〜５４ｄにより分光素子４２ａ，４３ａ等の回転角度を制御してもよい。さらに、光源系１０のレーザ装置１１から放射される照明光の波長を切り替えることができる場合は、この光源系１０から放射される照明光の波長と、上述の蛍光色素、吸収波長又は蛍光波長とを対応付けて記憶部５３に記憶しておいて駆動ユニット５４ａ〜５４ｄにより第１及び第２の分光光学系４２、４３等の作動を制御するように構成してもよい。

このような構成の顕微分光システム１における制御部５０の処理の一例を図４を用いて説明する。入力部５１により光路切り替えが選択されると（ステップＳ１００）、設定方法が判断され（ステップＳ１０１）、手動設定が選択されている場合には、励起波長を選択する（ステップＳ１０２）。励起波長の選択方法としては、上述のように入力部５１から直接入力させてもよいし、光源系１０から放射される照明光の波長から選択してもよい。そして、この励起波長に対応する蛍光波長を記憶部５３から選択して決定し（ステップＳ１０３）、取得する蛍光波長領域（分光素子４２ａ，４３ａの境界波長λ１，λ２）を決定する（ステップＳ１０４）。一方、ステップＳ１０１で自動設定が選択されていると判断した場合は、入力部５１により蛍光色素を選択させる（ステップＳ１０５）。

次に、上述のようにして決定した取得蛍光波長領域又は蛍光色素から第１及び第２の分光光学系４２，４３を構成する分光素子４２ａ，４３ａの回転角度や第１及び第２の受光器４４，４５の回転角度を決定する（ステップＳ１０６）。これらの回転角度の決定方法としては、後述する演算式を用いて演算により求めてもよいし、予め蛍光色素や取得波長領域毎に求めて記憶部５３に記憶しておき、この値を読み出してもよい。そして、求められた回転角度に基づいて駆動ユニット５４ａ〜５４ｄにより第１及び第２の分光光学系４２，４３及び第１及び第２の受光器４４，４５の作動を制御し（ステップＳ１０７）、所定の位置になったら第１〜第３の受光器４４〜４６から標本３３の画像を取得する（ステップＳ１０８）。取得された標本３３の画像は、出力部５２に表示してもよいし、記憶部５３に記憶してもよい。

なお、このような分光光学系の機構（駆動ユニット５４ａ〜５４ｄ）による制御方法は、以降の実施形態においても同様である。

また、図２に示すこの第１の実施形態に係る分光器４０は、２枚の分光素子４２ａ，４３ａと、これらで反射又は透過して分光された信号光を受光する第１〜第３の受光器４４〜４６から構成した場合について説明したが、分光素子の枚数は、この実施形態に限定されることはなく、１枚でも３枚以上でもよい。また、受光器もこれらの分光素子の枚数により増減可能である。なお、必ずしも分光された光のすべてを受光器で検出する必要はないため、受光器は少なくとも１つ以上あればよい。

また、上述した顕微分光システム１では、標本３３を励起した励起光が、この標本３３で反射して信号光（蛍光）とともに分光器４０に入射する場合がある。そのため、信号光から励起光を除去するために、励起光カットフィルタ（バリアフィルタ）を配置してもよい。この場合、励起光カットフィルタが角度依存素子である場合は、回転させて入射角度を変化させることにより、励起光の波長に応じて除去する波長を調整することができる。

さらに、この分光器４０は、光ファイバ２８のファイバカプラ２９ｂを入射端としているので、容易に共焦点顕微鏡に接続することが可能である。上述したように、共焦点顕微鏡では光検出をピンホールに接続した光検出器で行っているが、ピンホール透過後の光を光ファイバに入射させることで分光器への光導入を容易に光ファイバで行うことが可能である。このようにして、分光機能を持った共焦点顕微鏡に適した分光器を構成することができる。

［第２の実施形態］
第１の実施形態に係る分光器４０を図２に示すような構成にすると、上述したように、分光素子４２ａ，４３ａの回転に応じてこれらの分光素子４２ａ，４３ａで反射する信号光を検出する第１及び第２の受光器４４，４５も回転させる必要が生じる。そこで、図５に示すように、各々の分光光学系を２枚の光学素子で構成することで、固定配置された受光器に分光された信号光を導くように構成することが可能である。例えば、図２の構成の分光器４０の第１の分光光学系４２の場合、図５に示すように、コリメート光学系４１の光軸上に配置され、入射する信号光の一部を透過し、残りを反射する第１の光学素子４２ａと、この第１の光学素子４２ａに入射する信号光のうち、反射された信号光をさらに反射して第１の受光器４４に導く第２の光学素子４２ｂと、から構成する。ここで、第１の光学素子４２ａは、上述の分光素子（例えばロングパスフィルタであって角度依存素子）で構成される。また、第２の光学素子４２ｂはミラーで構成される。そして、これらの２枚の光学素子４２ａ，４２ｂの入射面（反射面）の延長線上で、互いに交差する軸（図５の紙面に垂直に延びる軸）Ｃを中心に第１及び第２の光学素子４２ａ，４２ｂの相対位置を固定してこれらの光学素子４２ａ，４２ｂを回転させることにより、第１及び第２の光学素子４２ａ，４２ｂに対する信号光の入射角度は変化するが、この入射角度の変化にかかわらず、固定配置された第１の受光器４４に分光された信号光を入射させることができる。

ここで、第１の光学素子４２ａと第２の光学素子４２ｂの位置関係を説明する。なお、コリメート光学系４１の光軸をＸ軸とし、このＸ軸に直交する方向（図５の紙面における上下方向）で、かつ第１の受光器４４の中心を通る軸をＹ軸として説明する。

第１の光学素子４２ａに対する信号光の入射角度をα、入射位置をＡとし、この第１の光学素子４２ａで反射した信号光の第２の光学素子４２ｂに対する入射角度をβ、入射位置をＢとする。また第１の光学素子４２ａの入射面と平行かつ点Ａを通る直線と第２の光学素子４２ｂの入射面と平行かつ点Ｂを通る直線との交点をＣとし、第２の光学素子４２ｂから射出される射出角度をγとする（ここでは、コリメート光学系４１の光軸に対して第２の光学素子４２ｂで反射された光線のなす角度を射出角度γとして定義する。以降の説明においても同様である）。上述したように、第１の光学素子４２ａと第２の光学素子４２ｂとは角度ＡＣＢを一定に保ちつつ回転する。このとき射出角度γは次式（１）のように表される。

γ ＝ 2α＋2β （１）

また、三角形ＡＢＣの内角の和が１８０度であることから、入射角度α，βの関係は次式（２）のように表され、射出角度γは次式（３）のように表される。

角度ＢＡＣ＋角度ＡＢＣ＋角度ＡＣＢ＝１８０
角度ＢＡＣ＝９０−α、 角度ＡＢＣ＝９０−β
α＋β ＝ 角度ＡＣＢ （２）
γ ＝ ２×角度ＡＣＢ （３）

よって入射角度αが変化しても射出角度γは常に一定の値を取る。なお角度ＡＣＢは式(３)のような関係があるため、角度ＡＣＢを４５度に設定すれば、どのような入射角度αでも射出角度γを常に９０度にすることができる。この第２の実施形態に係る分光器４０の小型化という観点で好ましい形態は射出角度γが９０度のときである。

また、第１の光学素子４２ａの入射面の所定の位置点Ａがコリメート光学系４１の光軸（Ｘ軸）と交わるように、第１の光学素子４２ａを移動させる。さらに、第１の光学素子４２ａと第２の光学素子４２ｂとによる角度ＡＣＢ一定の下、第１光学素子４２ａからの反射光を到達させるために、第２の光学素子４２ｂの入射面の所定の位置点Ｂが、コリメート光学系４１の光軸（Ｘ軸）とのなす角をγとなる直線（Ｙ軸）上にあるように第２の光学素子４２ｂを移動させることが好ましい。

このとき、Ｘ軸とＹ軸との交点を原点、第１の光学素子４２ａ側を正、第１の受光器４４側を正とすると、第１の光学素子４２ａの入射位置Ａの座標は（ｘ１，０）、第２の光学素子４２ｂの入射位置Ｂの座標は（０，ｙ１）（ｙ１＜０）であり、以下の条件式（４）を満たす。

ｙ１／ｘ１ ＝ −ｔａｎ２α （４）

さらに、第１の光学素子４２ａと第２の光学素子４２ｂを以下の式をみたすような交点Ｃの座標を中心に、第１の光学素子４２ａと第２の光学素子４２ｂとによる角度ＡＣＢ一定の下、回転させてもよい。ここで、交点Ｃの座標を（ｘ２,ｙ２)とすると、以下の条件式（５）を満たす。

ｙ２／ｘ２ ＝ １ （５）

［第３の実施形態］
分光光学系を２枚の光学素子（第１及び第２の光学素子４２ａ，４２ｂ）で構成し、これらの光学素子で分光した信号光を反射させて受光する構成において、第１の分光素子４２ａを回転させて境界波長を変化させても、その射出角度γを常に一定にする方法としては、図６に示すように、コリメート光学系４１の光軸上で回転する第１の光学素子４２ａに対して、この第１の光学素子４２ａの回転中心Ａを中心に第２の光学素子４２ｂを回転させる（信号光の入射する点Ｂが点Ａを中心とする円の円周上を移動する）ように構成してもよい。但し、このような構成の場合、第２の光学素子４２ｂで反射された光がコリメート光学系４１の光軸に沿ってシフトしてしまう。そのため、この反射光を固定配置された第１の受光器４４に入射させるためには、図６に示すように集光レンズ４２ｃが必要となる。ここで、第１の受光器４４は、集光レンズ４２ｃの焦点上に配置されている。

なお、この第２の光学素子４２ｂに入射する信号光の位置Ｂの移動距離をＬとすると、集光レンズ４２ｃに最低限必要なＮＡおよび焦点距離は以下の式（６），（７）のような関係になる。

ｆ ≧ Ｌ （６）
ＮＡ ≧ Ｌ／ｆ （７）

以上の関係を保つことによりこの第３の実施形態において第１の光学素子４２ａ及び第２の光学素子４２ｂに対する入射角度βが変わっても第１の受光器４４を移動させずに受光することできる。

このような構成にすると、第１の実施形態のように受光器を移動させる必要がなくなるので、分光器４０を小型化することができる。なお、分光素子に対する光の入射角度を変化させる方法として、分光素子（第１の光学素子４２ａ）を移動させる例を説明したが、これに限らず、光が移動するような構成にしてもよい。

それでは、上述した分光器を用いた標本の観察方法について説明する。なお、以降の実施例では、第２の実施形態に示すように、分光光学系を２枚の光学素子で構成し、かつ、少なくとも一方の光学素子が角度依存素子である場合を例に説明するが、第１又は第３の実施形態に示す構成とすることも可能である。

［第１実施例］
まず、図７を用いて第１実施例に係る分光器１４０の構成を示す。この分光器１４０は、ファイバカプラ２９ｂから射出した信号光を略平行光束に変換するコリメート光学系４１と、第１及び第２の分光光学系１４２，１４３と、第１〜第３の受光器１４４〜１４６と、から構成されている。また、第１の分光光学系１４２は、コリメート光学系４１の光軸上に配置され、コリメート光学系４１から射出する略平行の信号光が入射する第１の光学素子１４２ａと、第１の光学素子１４２ａで反射された信号光を反射する第２の光学素子１４２ｂと、第２の光学素子１４２ｂで反射された信号光に含まれる励起光を遮断する励起光カットフィルタ１４２ｃと、から構成され、この励起光カットフィルタ１４２ｃを透過した信号光が入射する位置に第１の受光器１４４が配置されている。また、第２の分光光学系１４３は、コリメート光学系４１の光軸上に配置され、第１の分光光学系１４２の第１の光学素子１４２ａを透過した信号光が入射する第１の光学素子１４３ａと、第１の光学素子１４３ａで反射された信号光を反射する第２の光学素子１４３ｂと、第２の光学素子１４３ｂで反射された信号光に含まれる励起光を遮断する励起光カットフィルタ１４３ｃと、から構成され、この励起光カットフィルタ１４３ｃを透過した信号光が入射する位置に第２の受光器１４５が配置され、第１の光学素子１４３ａを透過した信号光が入射する位置に励起光カットフィルタ１４３ｄ及び第３の受光器１４６が配置されている。なお、この第１実施例に係る分光器１４０において、第１及び第２の分光光学系１４２，１４３の第１の光学素子１４２ａ，１４３ａは、角度依存素子であるロングパスフィルタで構成されている。また、第２の光学素子１４２ｂ，１４３ｂは、ミラーで構成されている。

励起光カットフィルタ１４２ｃ、１４３ｃ、１４３ｄは、従来の角度に依存して特定が変化しないフィルタ（ロングパスフィルタ、又はバンドパスフィルタ）、角度依存素子のいずれであっても良い。角度依存素子は１枚のロングパスフィルタ、又は１枚のバンドパスフィルタで構成しても良いし、１枚のロングパスフィルタと１枚のショートパスフィルタとの組み合わせで構成しても良い。

なお、ショートパスフィルタは、所定の波長λより短い波長の光を透過し、この波長λより長い波長の光を反射する特性を有し、バンドパスフィルタは、所定の波長領域のみ光を透過する特性を有する。なお、後述する第２実施例、第３実施例も同様である。

この第１実施例に係る分光器１４０は、２つの分光光学系１４２，１４３を用いて、図８に示すように、測定する波長領域を３つの領域（第１の分光光学系１４２の第１の光学素子１４２ａの境界波長をλ１とし、第２の分光光学系１４３の第１の光学素子１４３ａの境界波長をλ２とした場合、λ１より短い波長の領域、λ１〜λ２の波長の領域、及び、λ２より長い波長の領域）に分割し、それぞれの領域の光強度を、第１〜第３の受光器１４４〜１４６で検出するように構成している。ここで、図８は、標本を、ＤＡＰＩ、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）及びｍＣｈｅｒｒｙの３つの蛍光色素で染色（３重染色）し、それぞれの蛍光色素に対して、λｅｘ１＝４０５ｎｍ、λｅｘ２＝５１４ｎｍ及びλｅｘ３＝５９４ｎｍの励起光で励起したときに発生する蛍光（それぞれの励起光に対応して、ＦＥ１，ＦＥ２，ＦＥ３とする）に対して設定された第１及び第２の分光光学系１４２，１４３の第１の分光素子１４２ａ，１４３ａの境界波長λ１，λ２の関係を示している。この図８から明らかなように、蛍光ＦＥ１〜ＦＥ３の強度が最大になる波長は、各々の蛍光を発生させるための励起光の波長λｅｘ１〜λｅｘ３よりも長くなっている。そのため、第１及び第２の分光光学系１４２，１４３の第１の光学素子１４２ａ，１４３ａの境界波長λ１，λ２を、λex２，λｅｘ３より短く設定すれば、上記３つの領域のそれぞれに、３つの蛍光色素に対する励起光及び蛍光が入ることになる。そして、それぞれの領域において、励起光カットフィルタ１４２ｃ、１４３ｃ、１４３ｄで励起光を遮断することにより、３つの蛍光のピークを中心とする強度を第１〜第３の受光器１４４〜１４６で検出することができる。

この図８には、従来の分光器で用いられており、信号光から所望の波長帯域の光を分光するフィルタの分離領域ＥＭ１〜ＥＭ３を示しており、従来の分光器ではこの範囲内でしか蛍光を検出することができない。しかし、この第１実施例に係る分光器１４０によれば、第１及び第２の分光光学系１４２，１４３の第１の光学素子（ロングパスフィルタ）１４２ａ，１４３ａの光軸に対する角度を変化させ信号光の入射角度αを変えることにより、境界波長λ１，λ２をシフトさせることができるため、蛍光取得領域を任意に広げることができる。また、励起光の波長が誤差によりずれる場合でも、角度依存素子である励起光カットフィルタ１４２ｃ、１４３ｃ及び１４３ｄを回転させて信号光の入射角度を変化させることにより、除去できる波長を変化させて調整することができる。なお、以上の第１実施例では、２つの分光光学系により３つの領域に分割した場合について説明したが、１つの分光光学系で構成してもよいし、４つ以上の分光光学系で構成してもよい。

［第２実施例］
図９は第２実施例に係る分光器２４０の構成を示しており、この分光器２４０は、４つの分光光学系２４２〜２４５により、信号光を５つの波長領域に分光し、それぞれの領域の光強度を５つの受光器２４６〜２５０で検出するように構成する場合を示している。各々の分光光学系２４２〜２４５は、上述の第１実施例と同じであり、角度依存素子であるロングパスフィルタで構成される第１の光学素子２４２ａ〜２４５ａと、ミラーで構成される第２の光学素子２４２ｂ〜２４５ｂと、で構成されている。このように複数の波長領域に分割し、各々の領域における光強度を検出することにより、信号光のピーク分離をすることができる。例えば、図１０に示すように、ピークが近い２つの蛍光ＦＥ１，ＦＥ２を観察する場合でも、それぞれのピークを含む波長領域を５つの領域に分割することにより、ピーク分離を行うことができる。このとき、第１の光学素子２４２ａ〜２４５ａの各々を回転させて信号光の入射角度を変化させることにより、境界波長λ１〜λ４を変化させることができるので、計測する蛍光のピークに合わせて、分割された領域の波長帯域を調整することができる。なお、励起光カットフィルタ２４２ｃ，２４４ｃは、励起光に応じて適宜配置することにより、信号光から励起光を除去することができる。この励起光カットフィルタ２４２ｃ，２４４ｃも角度依存素子である場合は、回転させることにより、除去することができる波長を、励起光の波長に合わせて調整することができる。

［第３実施例］
図１１は、第３実施例に係る分光器３４０の構成を示しており、この分光器３４０は、２つの分光光学系３４２，３４３により、信号光を３つの波長領域に分光し、それぞれの領域の光強度を３つの受光器３４４〜３４６で検出するように構成する場合を示している。この分光器３４０において、第１及び第２の分光光学系３４２，３４３は、第１及び第２実施例と同様に２枚の光学素子で構成されており、第１の光学素子３４２ａ，３４３ａは、ある波長以下の光を吸収し、それ以上の波長の光を透過するシャープカットフィルタで構成される。シャープカットフィルタは角度依存素子でないため、第１の光学素子３４２ａ，３４３ａを回転させても境界波長は変化しない。一方、第２の光学素子３４２ｂ，３４３ｂは、所定の狭い波長帯域の光を透過し、残りの波長の光を反射するノッチフィルタであって、角度依存素子として構成されている。そのため、この第２の光学素子３４２ｂ，３４３ｂを回転させて信号光の入射角度を変化させると、透過する光の波長帯域が変化する。また、この第１及び第２の分光光学系３４２，３４３は、第１の分光光学系３４２の第２の光学素子３４２ｂと第１の受光器３４４との間、第２の分光光学系３４３の第２の光学素子３４３ｂと第２の受光器３４５との間に励起光カットフィルタ３４２ｃ，３４３ｃが配置されている。

図１２は、脳細胞に含まれるタンパク質のうち、チャンネルロドプシン（ＣＨＲ２）とハロロドプシン（ＮＰＨＲ）の刺激光の波長に対して刺激を受ける感度を示しており、ＣＨＲ２の感度曲線Ｓ１及びＮＰＨＲに対する感度曲線Ｓ２として示されている。この図１２から分かるように、刺激波長はその波長によって感度が違うだけで様々である。つまり、ユーザが望む刺激波長は様々であり（例えば図１２に示すλｅｘ１〜λｅｘ６）、現状のフィルタにおいてそれら全て対応することは現実的でない。

この第３実施例に係る分光器３４０は、第１及び第２の分光光学系３４２，３４３の第１の光学素子３４２ａ，３４３ａにより、信号光を３つの波長領域に分光して検出しているが、これらの境界領域を変化させることができない。一方、第２の光学素子３４２ｂ，３４３ｂは、第１の光学素子３４２ａ，３４３ａで分光された信号光に含まれる刺激光を透過させて除去する機能を有しており、この第２の光学素子３４２ｂ，３４３ｂを回転させて入射角度を変化させることにより、透過させる（除去する）刺激光の波長帯域を調整することができる。なお、刺激光により刺激された試料に対し、励起光を照射することにより、蛍光を放射させるため、第２の光学素子（ノッチフィルタ）３４２ｂ，３４３ｂで反射された信号光に含まれる励起光が第１及び第２の受光器３４４，３４５に入射しないように、図１１に示すように、励起光カットフィルタ３４２ｃ，３４３ｃが配置されている。このように、この第３実施例に係る分光器３４０によれば、第２の光学素子（ノッチフィルタ）３４２ｂ，３４３ｂに対する信号光の入射角度を変えることにより波長シフトを起こさせユーザが望む刺激波長カットを任意に設定することができる。この第３実施例においては分光光学系を２組用いたが、複数の刺激波長が存在する場合３組以上で構成してもよい。

［第４実施例］
第４実施例として、図１３を用いて、異なる蛍光色素の組み合わせによる観察を行うときの分光光学系を構成する分光素子の回転角度について説明する。まず、ＤＡＰＩと強化緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）による２色蛍光観察を行う場合、ＥＧＦＰの励起波長λｅｘ１は４８８ｎｍであるので、レーザ装置１１の公差を±５ｎｍとすると、分光素子の境界波長λ１を４８５ｎｍに設定することにより、この励起光が入射しない範囲でＤＡＰＩの蛍光を取得することができる。一方、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）と強化黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ）による２色蛍光観察を行う場合、ＥＹＦＰの励起波長λｅｘ２は５１４ｎｍであるので、レーザ装置１１の公差を±５ｎｍとすると、分光素子の境界波長λ２を５１１ｎｍに設定することにより、この励起光が入射しない範囲でＣＦＰの蛍光を取得することができる。このように、２色蛍光観察において、一方の蛍光色素から出る蛍光を他方の蛍光色素から出る蛍光から分離する場合、従来のフィルタキューブを用いた場合はフィルタを交換しなければならないが、上述した実施形態のように分光光学系の分光素子を回転させ信号光の入射角度を変化させるように構成することにより、分光素子を回転するだけで境界波長を変化させることができる。この第４実施例の場合、分光素子を１８度回転させることで、境界波長λ１とλ２とを切り替えることができる。また、このように境界波長を調整できることにより、励起光の波長に近接するように境界波長を設定し、試料からの蛍光を可能な限り効率良く取得することができる。

なお、上述の各実施形態の要件は、適宜組み合わせることができる。また、一部の構成要素を用いない場合もある。また、法令で許容される限りにおいて、上述の各実施形態及び変形例で引用した装置などに関する全ての公開公報及び米国特許の開示を援用して本文の記載の一部とする。

１ 顕微分光システム ４０，１４０，２４０，３４０ 分光器
４１ コリメート光学系
４２，４３，１４２，１４３，２４２〜２４５，３４２，３３４ 分光光学系
４２ａ，４３ａ，１４２ａ，１４３ａ，２４２ａ〜２４５ａ，３４２ａ，３４３ａ 第１の光学素子
４２ｂ，４３ｂ，１４２ｂ，１４３ｂ，２４２ｂ〜２４５ｂ，３４２ｂ，３４３ｂ 第２の光学素子
１４２ｃ，１４３ｃ，１４３ｄ，２４２ｃ，２４４ｃ，３４２ｃ，３４３ｃ 励起光カットフィルタ（バリアフィルタ）
４４〜４６，１４４〜１４６，２４６〜２５０，３４４〜３４６ 受光器
５０ 制御部 ５１ 入力部 ５３ 記憶部
５４ａ〜５４ｄ 駆動ユニット（機構）

Claims (9)

1. 光を略平行光とするコリメート光学系と、
   前記光の入射角度により分光する波長帯域が変化する分光素子を少なくとも１枚含む分光光学系と、
   前記分光光学系で分光された前記光を検出する少なくとも１つの受光器と、
   前記分光素子に対する前記光の前記入射角度を変化させる機構と、
   前記光を分光する波長帯域に応じて、前記分光素子に対する前記光の前記入射角度を決定し、当該入射角度になるように前記機構を制御する制御部と、を有し、
   前記分光光学系は、
   入射する前記光の一部を透過し、残りを反射する第１の光学素子と、
   前記第１の光学素子で反射された前記光の少なくとも一部を反射する第２の光学素子と、を有し、
   前記第１の光学素子及び前記第２の光学素子の少なくとも一方は、前記光の入射角度により分光する波長帯域が変化する前記分光素子であり、
   前記制御部は、前記機構を制御して、前記第１の光学素子の入射面を延長した面と前記第２の光学素子の入射面を延長した面とのなす角度を所定の値に維持したまま、前記第１の光学素子及び前記第２の光学素子を移動させて前記入射角度を変化させることを特徴とする分光器。
2. 前記制御部は、前記機構を制御して、前記第１の光学素子の入射面を延長した面と前記第２の光学素子の入射面を延長した面との交線を軸として前記第１の光学素子及び前記第２の光学素子を一体に回転させることにより、前記入射角度を変化させることを特徴とする請求項１に記載の分光器。
3. 前記制御部は、前記機構を制御して、前記コリメート光学系の光軸上に位置する回転軸による前記第１の光学素子の回転に応じて、前記第１の光学素子の前記回転軸を中心に前記第２の光学素子を回転させることにより、前記入射角度を変化させることを特徴とする請求項１に記載の分光器。
4. 前記第２の光学素子から射出する前記光を前記受光器上に集光する集光レンズを有することを特徴とする請求項３に記載の分光器。
5. 前記分光光学系と当該分光光学系で分光された前記光を受光する受光器との間に配置され、前記光とは異なる波長の光を遮断するバリアフィルタを有し、前記バリアフィルタは、前記異なる波長の光の前記バリアフィルタに対する入射角度により遮断する光の波長帯域が変化することを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の分光器。
6. 光源から放射された所定の波長を有する照明光を走査して対物レンズにより標本に照射するとともに、前記標本から放射される、前記所定の波長とは異なる波長を有する前記光を前記対物レンズで集光する顕微鏡と、
   前記顕微鏡からの前記光を分光して検出する請求項１〜５のいずれか一項に記載の分光器と、を有することを特徴とする顕微分光システム。
7. 前記制御部は、入力部で入力された蛍光色素の種類、前記照明光の波長及び前記光の波長の少なくも一つに対応して前記入射角度になるように前記機構を制御することを特徴とする請求項６に記載の顕微分光システム。
8. 前記入射角度を前記蛍光色素の種類、前記照明光の波長及び前記光の波長の少なくとも一つに対応付けて記憶する記憶部を有し、
   前記制御部は、前記記憶部から読み出された前記入射角度になるように前記機構を制御することを特徴とする請求項７に記載の顕微分光システム。
9. 前記制御部は、前記照明光の波長の切り替えによって生じる前記入射角度の補正値に基づいて前記機構を制御することを特徴とする請求項８に記載の顕微分光システム。

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