JP5852051B2 - 創傷治癒のための方法及び薬剤組成物 - Google Patents
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Description
材料:
組織培養培地及び血清は生物学関連企業(Beit HaEmek、イスラエル)より購入した。増強化学発光(Enhanced Chemical Luminescence)(ECL)はBioRad(イスラエル)から購入したキットを用いて行った。モノクローナル抗p−tyr抗体は、Upstate Biotechnology Inc.(Lake Placid、ニューヨーク州、米国)から購入した。PKCアイソフォームに対するポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体は、Santa Cruz(カリフォルニア州、米国)及びTransduction Laboratories(Lexington、ケンタッキー州)から購入した。α6ラット抗マウスmAb(GoH3)は、Pharmingen(サンジエゴ、カリフォルニア州)から購入した。α6A細胞質ドメインに対する抗体6844は、V.Quaranta博士(Scripps Research Institute、La Jolla、カリフォルニア州)より恵与された。マウスβ4の細胞外ドメインに対して指向されるラットmAb(346−11A)は、S.J.Kennel博士(Oak Ridge National Laboratory、Oak Ridge、TN)から恵与された。ホスホチロシンに対するラットmAbはSigma(セントルイス、ミズーリ州)から購入し、ウサギ抗ホスホセリンはZymed(サンフランシスコ、カリフォルニア州)から購入した。西洋わさびペルオキシダーゼ−抗ウサギ及び抗マウスIgGはBio−Rad(イスラエル)から入手した。ロイペプチン、アプロチニン、PMSF、DTT、Na−オルトバナジウム酸、及びペプスタチンは、Sigma Chemicals(セントルイス、ミズーリ州)から購入した。インスリン(humulinR−組換えヒトインスリン)はEli Lilly フランス SA(Fergersheim、フランス)から購入した。IGF1はCytolab(イスラエル)から恵与された。ケラチン14抗体はBabco−Convance(Richmond、カリフォルニア州)から購入した。BDGF−BBはR&D systems(ミネアポリス)から購入した。PKCα偽基質(ミリストイル化)はCalbinochem(サンジエゴ、カリフォルニア州)から購入した。
初代ケラチン生成細胞を、以前に記載されたように(18)新生皮膚から単離した。ケラチン生成細胞は、ウシ胎仔血清で処理された、8%Chelex(Chelex−100、BioRad)を含むイーグル最小必須培地(EMEM)中で培養した。増殖性基底細胞表現型を維持するために、最終的なCa2+濃度は0.05mMに調整した。実験は、プレーティングの5〜7日後に実行した。
粗膜画分については、10μg/ml アプロチニン、10μg/ml ロイペプチン、2μg/ml ペプスタチン、1mM PMSF、10mM EDTA、200μM NaVO4、及び10mM NaFを含むPBS中に、細胞を擦り落とすことによって、全体の細胞溶解物を調製した。均質化及び4回の凍結/融解サイクルの後で、溶解物を4℃、20分間、最大速度で、微量遠心機で遠心分離した。可溶性細胞質ゾルタンパク質画分を含む上清を別のチューブに移した。ペレットを、プロテアーゼ及びホスファターゼの阻害剤とともに1% Triton X−100を含む250μlPBS中に再懸濁し、4℃で30分間インキュベートし、4℃で最大速度で微量遠心機で遠心分離した。上清は膜画分を含む。タンパク質濃度を、改変ローリーアッセイ(Bio−Rad DCタンパク質アッセイキット)を使用して測定した。細胞タンパク質画分のウェスタンブロット分析を記載されるように(6)実行した。
ケラチン生成細胞を含む細胞ディッシュを、Ca2+/Mg2+を含まないPBSで洗浄した。細胞を、プロテアーゼ及びホスファターゼの阻害剤のカクテル(20μg/ml ロイペプチン;10μg/ml アプロチニン;0.1mM PMSF;1mM DTT;200μM オルトバナジウム酸;2μg/ml ペプスタチン)を含むRIPA緩衝液(50mM Tris−HCl pH 7.4;150mM NaCl;1mM EDTA;10mM NaF;1% Triton x100;0.1% SDS、1% デオキシコール酸ナトリウム)中で機械的に脱着した。調製物を、4℃で、最大速度で20分間、微量遠心機で遠心分離した。上清を免疫沈殿のために使用した。
溶解物は、300μgの細胞溶解物を25μlのタンパク質A/Gセファロース(Santa Cruz、カリフォルニア州、米国)と混合することによってあらかじめ清澄化し、懸濁物を4℃で30分間連続して回転させた。次いで、調製物を最大速度で10分間、4℃で遠心分離し、30μlのA/Gセファロースを、個々の抗原に対する特異的ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体(希釈1:100)とともに上清に加えた。サンプルを4℃で一晩回転させた。次いで、この懸濁物を最大速度で10分間、4℃で遠心分離し、ペレットをRIPA緩衝液で洗浄した。再度、懸濁物を15,000×gで遠心分離し(4℃で10分間)、TBST中で4回洗浄した。サンプル緩衝液(0.5M Tris−HCl pH 6.8;10% SDS;10% グリセロール;4% 2β−メルカプトエタノール;0.05% ブロモフェノールブルー)を加え、サンプルを5分間煮沸し、次いでSDS−PAGEに供した。
24ウェルペトリプレート(Greiner)を、PBS中20μg/mlのマトリックスタンパク質で、1時間、37℃にてコートした(250μl/ウェル)。インキュベーション後、プレートを洗浄し、0.1% BSAで30分間、室温にてインキュベートして、非特異的結合をブロックした。ケラチン生成細胞培養物を、0.25%トリプシンで手短にトリプシン処理し、脱着後、細胞を再懸濁し、ケラチン生成細胞(1×106)をコートされたウェルに加え、37℃で1時間インキュベートした。非接着細胞を除去し、ウェルをPBSで2回すすぎ、残存した細胞を1M NaOH中で抽出した。細胞計数は、改変ローリーアッセイ(Bio−Rad DCタンパク質アッセイキット)を使用して、タンパク質濃度によって決定した。結果を、未処理対照に対するパーセンテージによって計算した。
初代ケラチン生成細胞を、ラミニン5コートしたガラススライド上にプレートした。2日齢ケラチン生成細胞を、1時間PKCアデノウイルスに感染させ、PBSで2回洗浄し、低Ca2+MEM中で培養物中に維持した。感染の24時間後、細胞を4%パラホルムアルデヒド中に30分間固定し、続いて0.2% Tritonで5分間透過化処理を行った。分析のために、対照及びPKC感染したケラチン生成細胞をPBSですすぎ、PBS中の1%BSAに希釈したPKC抗体(Santa Cruz)とともに4℃で一晩インキュベートした。インキュベート後、スライドをPBSで2回10分間洗浄し、ビオチン化抗ウサギ二次抗体と20分間インキュベートし、PBS中で2回洗浄し、ストレプトアビジン−FITCと20分間インキュベートした。α6β4染色の分析のために、ガラススライドを、氷上で5分間、0.2% Triton X−100で処理し、続いてメタノール中で5分間固定化を行った。このスライドを抗α6抗体又は抗β4抗体とともに一晩インキュベートし、続いて、それぞれビオチン化抗ラット二次抗体との20分間のインキュベーションを行い、PBS中で2回洗浄し、ストレプトアビジン−FITCと20分間インキュベートした。PBS中での2回の洗浄後、スライドを、1%のp−フェニレンジアミン(Sigma)を含むグリセロール緩衝液を用いてマウントし、蛍光をレーザー走査共焦点像顕微鏡(MRC1024、Bio−Rad、英国)によって調べた。
組換えアデノウイルスベクターを、以前に記載されたように構築した(19)。マウスPKCの顕性不活性変異体を、ATP結合部位におけるリジン残基のアラニンとの置換によって生成した。変異体cDNAを、SRD発現ベクターからEcoRIで切断し、pAxCA1wコスミドカセットに連結して、Axベクターを構築した。遺伝子の顕性不活性活性は、その自己リン酸化の抑止によって実証された。
培養培地を吸引除去し、ケラチン生成細胞培養物を、PKC組換えアデノウイルスを含むウイルス上清で1時間感染させた。次いで、培養物を、MEMで2回洗浄し、再度培地を与えた。感染の10時間後、細胞を、血清を含まない低Ca2+含有MEMに24時間移した。対照及びインスリン処理培養又はIGF1処理培養からのケラチン生成細胞を、増殖アッセイ、86Rb取り込みのために使用し、又は免疫沈殿、免疫蛍光、及びウェスタンブロッティングのために、記載されるように抽出し、並びに細胞質ゾル画分及び膜画分に分画した。
特異的PKC活性は、適切な処理後のケラチン生成細胞培養物からの新鮮に調製した免疫沈殿物中で測定した。これらの溶解物は、NaFを含まないRIPA緩衝液中で調製した。活性は、SigmaTECTタンパク質キナーゼCアッセイシステム(Promega、Madison、ウィスコンシン州、米国)の使用により、製造業者の指示書に従って測定した。PKCα偽基質をこれらの研究における基質として使用した。
細胞増殖は、24ウェルプレートにおいて、[3H]チミジンの取り込みによって測定した。細胞を、[3H]チミジン(1μCi/ml)で一晩パルスした。インキュベーション後、細胞をPBSで5回洗浄し、5% TCAを各ウェルに30分間加えた。溶液を除去し、細胞を1% Triton X−100中で可溶化した。細胞に取り込まれた標識されたチミジンを、Tricarb液体シンチレーションカウンターの3Hウィンドウで計数した。
Na+/K+ポンプ活性を、2mM RbCl及び2.5μCiの86Rbを含む、K+を含まない1mlのPBS中の全細胞による、86Rbのウアバイン感受性の取り込みの測定によって決定した。15分後、Rb取り込みを培地の吸引除去によって終結させ、その後、細胞をK+を含まない4℃の冷PBS中で迅速に4回すすぎ、1% Triton X−100中で可溶化した。ディッシュからの細胞を、シンチレーションバイアル中の3ml H2Oに加えた。サンプルを、Tricarb液体シンチレーションカウンターの3Hウィンドウで計数した。Na+/K+ポンプ活性に特異的に関連するRb取り込みを、10−4Mウアバインの存在下で蓄積したcpmの、阻害剤の非存在下で測定した取り込みからの減算によって決定した。
精製及び標準化されたPKCアイソザイムは、P.Blumberg博士(NCI、NIH、U.S.)及びMarcello G.Kazanietz博士(University of Pennsylvania、School of Medicine)から恵与された。初代ケラチン生成細胞を、500μlの1% Triton溶解緩衝液(1×PBS中の1% Triton−X 100、10μg/ml アプロチニン及びロイペプチン、2μg/ml ペプスタチン、1mM PMSF、1mM EDTA、200μM Na2VO4、10mM NaF)中で収集した。溶解物を4℃で30分間インキュベートし、16,000×gで30分間、4℃にて遠心分離した。上清を新鮮なチューブに移した。細胞溶解物の免疫沈殿を、5μg/サンプルの抗α6/GoH3(PharMingen)及び30μl/サンプルのタンパク質A/G−Plusアガローススラリー(Santa Cruz)を用いて4℃で一晩実行した。ビーズを、RIPA緩衝液で1回、及び50mM Tris−HCl pH 7.5で2回洗浄した。35μlの反応緩衝液(1mM CaCl2、20mM MgCl2、50mM Tris−HCl pH 7.5)を各アッセイに加えた。各アッセイについて、DMSO又は10mM TPAのいずれかを含む5.5μl/アッセイのリン脂質ベシクルの懸濁物を、標準化量の特異的PKCアイソザイムとともにスラリーに加えた。反応を、10μl/アッセイの125mM ATP(1.25μCi/アッセイ[γ−32P]ATP、Amersham)を加えることによって開始し、30℃で10分間継続させた。次いで、ビーズをRIPA緩衝液で2回洗浄した。30μl/サンプルのタンパク質負荷色素(3×Laemmli、5% SDS)を加え、サンプルをウォーターバス中で5分間煮沸した。タンパク質を、8.5%ゲル上のSDS−PAGEによって分離し、Protranメンブレン(Schleicher & Schuell)に転写し、オートラジオグラフィーによって可視化した。ヒストンのリン酸化及びPKC基質ペプチドのリン酸化を、PKC活性のための対照として使用した。
(実施例1)
組換えアデノウイルスベクターを利用するPKCアイソフォームの効果的な過剰発現
組換えβ−ガラクトシダーゼアデノウイルスを利用することによって、高い感染割合が達成され、培養されたケラチン生成細胞集団の90%より多くが組換えタンパク質を発現した。組換えβ−ガラクトシダーゼアデノウイルス感染は、細胞の生存度又は細胞増殖に影響を与えなかった。さらに、β−ガラクトシダーゼ発現は培養の2週間まで持続され、次の実験における対照感染として使用した。組換えPKCアデノウイルスが、タンパク質発現を誘導し、及びマウスケラチン生成細胞培養において正しく活性化される効率を調べた。図1におけるウェスタンブロッティングによって見られるように、組換えPKCアデノウイルス構築物を用いる1時間感染の24時間後、特異的PKCタンパク質発現の劇的な増加が、特異的アイソフォームの内因性の発現レベルよりも5倍から10倍上で観察された。組換えタンパク質は、感染後早くも6時間で、感染したケラチン生成細胞培養物において検出可能であり、ピーク発現は24時間までに得られた。タンパク質発現は、培養期間の全体を通して持続した(14日まで)。
過剰発現されたPKCアイソフォームはPKCアクチベーターによって活性化される
PKCアイソフォームの組換えタンパク質は、典型的にはPKCアクチベーターに応答した。図2において見られるように、ブリオスタチン1を用いる処理は、PKCαタンパク質及びPKCδタンパク質の膜画分へのトランスロケーションを誘導し、PKCη及びPKCζのアイソフォームに対してはより低い効果を有した。このことは、内因性アイソフォームを用いて得られた結果と同様であり、これらのコファクター要求性から予測される通りである。
過剰発現されたPKCアイソフォームはそれらのネイティブ型で活性である
感染後早くとも18時間で、PKCキナーゼアッセイは、独特なPKCアイソフォームの免疫沈殿物が、PKCアクチベーターによる刺激のさらなる必要性を伴うことなく、酵素的に活性であることを明らかにした(図3)。
特異的PKCアイソフォームの過剰発現は初代ケラチン生成細胞において独特な形態学的変化を誘導する
利用されたPKCアデノウイルス構築物の各々は、初代ケラチン生成細胞において特異的形態学的変化を誘導した(図4)。非感染初代マウスケラチン生成細胞培養物及びβ−ガラクトシダーゼ感染細胞は、培養中に、増殖性の基底細胞の特徴に典型的である立方体形態を提示した。アイソフォーム特異性に関わりなく、ケラチン生成細胞を過剰発現するすべてのPKCは、細胞の伸長及びニューロン様突出の出現を含む、PKC活性化に典型的な形態学的変化を示した。しかし、PKCアイソフォームの各々1つは、ケラチン生成細胞形態に対して特徴的な効果を有した。PKCα感染は、典型的な平板化された形態を有する、ケラチン生成細胞の層状化を誘導した。対照的に、PKCηは、迅速な速度で増殖する基底細胞の形態学的特徴を提示する、細胞の濃密なクローンとして見られた(図4)。2つのアイソフォームは、細胞マトリックス並びに細胞−細胞結合をもたらすように見られた。PKCδ感染の18〜48時間後、細胞は、ニューロン様突出を有して、細長く且つ伸長して見られた。これに続いて、徐々に培養ディッシュからの細胞の喪失が起こり、これは培養期間の過程で漸次的に起こった。過剰発現PKCζケラチン生成細胞は、円形のケラチン生成細胞クラスターとして見られ、これは、培養ディッシュにゆるく結合しており、感染の数日後に次第に失われた。
感染した初代ケラチン生成細胞中の過剰発現PKCアイソフォームの独特の局在化
独特の形態学的変化は、免疫蛍光分析によって特徴付けられるような独特な細胞局在化と関連した。増殖しているケラチン生成細胞において、PKCα、PKCδ、及びPKCζは、細胞質並びに原形質膜において発現された。内因性タンパク質発現と同様に、PKCηアイソフォームは、ケラチン生成細胞の核周辺領域に局在した(図5)。分布の劇的な変化がPKCδ及びPKCζに関連し、ここでは、細胞脱着に続いて、PKCアイソフォーム発現が、細胞膜に優先的に局在した(図5)。
PKCアイソフォームによるα6β4発現の調節
実験結果
増殖性基底層の基底表現型の特徴であるタンパク質を調節する、特異的PKCアイソフォームの能力を試験した。α6β4インテグリンの下方制御がケラチン生成細胞分化の間に起こる初期事象の1つであるので、種々のPKCアイソフォームがα6β4インテグリン(基底層の半接着斑に特異的に局在するインテグリン)の発現を調節する能力を評価した図6において提示されるイムノブロットにおいて見られることができるように、PKCδ及びPKCζアイソフォームのみが、対照ケラチン生成細胞のα6β4インテグリンサブユニットレベルとの比較において、α6β4発現を下方制御することが可能であった。同時に、α3又はβ1インテグリンサブユニットレベルは減少しなかった。対照的に、一貫して、PKCαアイソフォームの過剰発現は、対照発現よりも2〜3倍上に増加したα6β4レベルを生じた(図6)。PKCηの過剰発現は、α6β4タンパク質発現に影響を与えなかった。いくつかの特徴が分化に対する細胞の関与に付随しており、これはα6β4タンパク質の下方制御に続き、増殖速度の減少、新規なケラチンの合成、細胞脱着、及び基底膜成分への接着の喪失が含まれる。ケラチン発現の変化は、異なるPKCアイソフォームの過剰発現によっては観察されなかった。これには、基底の増殖しているケラチン生成細胞の特徴であるK5及びK14の発現、並びに棘層分化の初期段階の特徴であるK1及びK10の発現が含まれた。さらに、増殖速度が3H−チミジン取り込みによって分析された場合、α6β4発現と増殖能力の喪失の間の相関は存在しなかった。
過剰発現したPKCη及びPKCδはインビトロでケラチン生成細胞増殖を誘導する
PKCη及びPKCδの過剰発現は、ケラチン生成細胞増殖を、対照レベルよりもそれぞれ5倍及び2倍、有意に誘導する(図7)。PKCζ及びPKCαは細胞増殖に影響を与えなかった。
過剰発現したPKCδ及びζはインビトロでケラチン生成細胞脱着を誘導する
PKCδ及びζが過剰発現したケラチン生成細胞の接着特性を研究した。対照ケラチン生成細胞と比較して、特異的マトリックスタンパク質(ラミニン1、ラミニン5、フィブロネクチン、及びコラーゲンを含む)への接着能力の変化は観察されなかった(データは示していない)。しかし、PKCδアイソフォーム及びPKCζアイソフォームを過剰発現する細胞においては、培養ディッシュとの細胞接触の喪失が、培養ディッシュからの段階的なケラチン生成細胞脱着に付随した(図4)。
α6β4インテグリンの半接着斑局在に対するPKCアイソフォームの過剰発現効果
α6β4発現は半接着斑接着複合体の形成のために必須であるので、半接着斑へのα6β4局在化とのα6β4下方制御及び細胞脱着の関連を試験した。図8は、半接着斑複合体とのα6β4結合の免疫蛍光分析を提示する。図8において見られるように、対照の感染したケラチン生成細胞と比較して、過剰発現しているPKCαケラチン生成細胞におけるα6β4インテグリン発現の上方制御(図6)は、半接着斑複合体へのα6β4の組み込みの増加と関連する。PKCηを過剰発現する細胞はまた、半接着斑複合体とのα6β4インテグリンの結合を誘導するが、過剰発現しているPKCα細胞において観察されるものよりも少なかった。予測されるように、PKCδ及びPKCζを過剰発現するケラチン生成細胞におけるα6β4インテグリンの有意な下方制御が、細胞の半接着斑複合体とのα6β4の組み込みの減少に付随することを見い出した(図8)。これらの結果は、α6β4インテグリンが、細胞−マトリックス結合及びケラチン生成細胞が根底にある基底膜につながれることにおいて重要な役割を果たすことを示唆する。さらに、PKCδ及びζは、ケラチン生成細胞分化プロセスからの識別可能な経路において、α6β4下方制御を媒介し、ケラチン生成細胞の細胞脱着を開始する。最後に、PKC媒介α6β4下方制御を関連付け、半接着斑α6β4組み込み及びケラチン生成細胞脱着への特異的形態学的変化を減少するために、培養期間の間に異なるPKCアイソフォームを過剰発現する接着した細胞及び脱着した細胞の量の変化を追跡した。図9において、接着した細胞をPKCアデノウイルス感染の24時間後及び48時間後に培養中で計数した。明瞭に観察することができるように、PKCδ及びPKCζの両方はインビトロで細胞損失を誘導した。並行して、培養中での細胞の損失は、下層の培地に浮遊する培地の増加と相関した。これらの結果は、PKCδ及びPKCζが、細胞の分化及び移動の初期段階と関連する脱着工程の制御のために重要であることを示す。
PKCηは生理学的設定下でケラチン生成細胞の増殖及び分化を示差的に調節する
図7において明瞭に示されるように、PKCηアイソフォームを過剰発現する細胞は、対照の非感染細胞よりも5〜7倍上に加速した速度で増殖し、他のPKCアイソフォームを過剰発現するケラチン生成細胞培養よりも一貫して高かった。しかし、増殖の誘導は培地中のCa2+濃度を調節することによって決定されるような、ケラチン生成細胞の分化状態に依存した。低Ca2+濃度(0.05mM)よりも下に維持されたケラチン生成細胞を増殖する際に、内因性PKCηは、増殖している細胞の大部分の核周辺領域に局在化した(図10)。これらの条件下において、PKCηの過剰発現は、ケラチン生成細胞増殖に劇的な増加を誘導した(図11)。しかし、ケラチン生成細胞がCa2+濃度を0.12mMまで上昇させることによって分化された場合、PKCηの過剰発現は増殖を誘導しなかったが、ケラチン生成細胞分化をさらに刺激した。これらの結果は、過剰発現したPKCηは生理学的に増殖している細胞においてのみ増殖を誘導するが、細胞分化に干渉しないことを示唆する。PKCη発現の調節の相違はまた、インビボにおいても見られた。活発に増殖している皮膚並びに胚のニューロン細胞におけるPKCη発現が同定されたのに対して、成熟成体脳においては、PKCηは観察されず、表皮PKCηは皮膚の下流層に局在した。
PKCη及びDNPKCηの過剰発現は、PKC局在化及び細胞形態を特異的に調節する
ケラチン生成細胞における増殖又は分化の両方の状態におけるPKCηについてのポジティブな役割を支持する結果をさらに検証するために、キナーゼ不活性顕性不活性アデノウイルスPKCη構築物の効果を、増殖しているケラチン生成細胞及び分化しているケラチン生成細胞における感染の効果を研究することによって分析した。図12において見られるように、PKCη及びDNPKCηの両方のアデノウイルス感染は、増殖状態及び分化状態の両方において効率的であった。予測されるように、増殖しているケラチン生成細胞において、DNPKCηは、Ca2+誘導性分化と関連する形態学的変化に類似する細胞形態の劇的な変化(細胞の平板化、細胞−細胞境界の喪失を含む)を伴うケラチン生成細胞分化を誘導した(図12A〜B)。さらに、これらの変化は、ケラチン生成細胞増殖の停止(図11)及び分化マーカー(ケラチン1、ケラチン10、ロリクリン、及びフィラグリンを含む)の劇的な誘導に付随し、これらは、インビボでの正常皮膚において提示されるのと同様のレベルまで上昇した(図13A〜B)。同時に、分化プログラムの開始に際して、DNPKCηの過剰発現はCa2+誘導性分化を抑止しなかった。これらの結果は、PKCη及びDNPKCηが、生理学的設定下で、ケラチン生成細胞の増殖及び分化を示差的に調節するために使用可能であることを示唆する。
インビボ実験
PKCηがインビボで細胞の増殖及び分化を示差的に調節する能力を試験するために、ヌードマウスの背に作製した完全な切開性創傷の治癒をPKCηが誘導する能力を評価した。外因性組換えタンパク質を発現するケラチン生成細胞の能力を、対照β−galアデノウイルスを利用することによって確認した。図14において見られることができるように、感染の2週間後、β−gal発現は、インビトロケラチン生成細胞並びにインビボ皮膚で維持される。興味深いことに、創傷治癒プロセスが、対照、PKCα、及びPKCηのアデノウイルス構築物を用いる局所的感染後にマウスにおいて試験されたときに、PKCηのみが、局所的感染の早くも4日後で顆粒組織の形成を誘導した。これはまた、筋肉、脂肪、及び真皮層の組織化された形成もまた含んだ。同時に、対照及びPKCα感染皮膚において、濃密な顆粒組織は見い出されず、創傷の閉鎖は観察されなかった(図14)。それゆえに、PKCηは、創傷治癒プロセスの誘導において皮膚の増殖及び分化を調節する第1の候補物質であると見なされることが可能である。
インスリンは、増殖しているケラチン生成細胞におけるPKCδのトランスロケーションを特異的に誘導する
皮膚において発現される2種のPKCアイソフォームが、ケラチン生成細胞増殖に影響を与えることが見い出された:PKCη及びPKCδである。皮膚分化を調節する特異的PKCアイソフォームを活性化する内因性因子に取り組み且つこれを同定するために、ケラチン生成細胞増殖を促進することが知られているいくつかの増殖因子(EGF、KGF、インスリン、PDGF、及びIGF1を含む)が増殖依存性の様式で特異的PKCアイソフォームを活性化する能力を評価した。PKCアイソフォームα、δ、ε、η、及びζは皮膚において発現される。PKCアイソフォームの活性化は膜画分へのそれらのトランスロケーションと関連するので、種々のPKCアイソフォームの細胞質ゾルから膜へのトランスロケーションに対するこれらの増殖因子の効果を試験した。図15において見られるように、刺激の早くも5分後に、インスリンは細胞質画分から膜画分へのPKCδのトランスロケーションを特異的に誘導した。PKCδの膜発現は、インスリン刺激後数時間維持された。対照的に、IGF1は、膜におけるPKCδ発現を減少し、且つ細胞質画分におけるその発現の相対的レベルを増加した。他の増殖因子は、PKCδのトランスロケーション及び局在化に有意に影響を与えなかった。他のPKCアイソフォームの分布の変化は、IGF1及びインスリンを含むいずれの増殖因子による刺激後にも見られなかった。
インスリンは、増殖しているケラチン生成細胞においてPKCδの活性化を特異的に誘導する
PKCδのトランスロケーションが活性化のために十分であるか否かを決定するために、インスリン及びIGF1で処理したケラチン生成細胞の細胞質及び膜の画分からのPKC免疫沈殿物のキナーゼ活性を測定した。図16に示されるように、インスリンは膜画分中のPKCδの活性を増加したがIGF1は増加しなかった。PKCα活性の上昇は、細胞質画分においては観察されなかった。インスリン誘導性活性化はPKCδに特異的であり、PKCα、ε、η、又はζの活性化は、インスリン刺激の30分後まで観察されなかった。要するに、これらの結果は、インスリンによるがIGF1によらないPKCδ活性化の選択的刺激を示唆する。
インスリン及びIGF1はケラチン生成細胞増殖に対して相加的効果を有する
PKCδの特異的活性化が、ケラチン生成細胞における特異的インスリン誘導性の分裂促進的経路を意味するか否かを分析するために、インスリンとIGF1の両方の分裂促進的効果を、チミジン取り込みによって測定されるようなケラチン生成細胞増殖を誘導するそれらの能力を研究することによって試験した。図17Aにおいて示されるように、インスリンとIGF1の両方が、用量依存的な様式でチミジン取り込みを刺激し、それぞれ10−7M及び10−8Mで最大誘導が達成された。各濃度において、IGF1による最大刺激はインスリンによるそれよりも高かった。興味深いことに、すべての濃度において、両方のホルモンを一緒に与えた場合、分裂促進的効果は相加的であった(図17B)。これらの結果は、インスリンが、IGF1誘導性のケラチン生成細胞増殖に非依存的な独特な経路を通してケラチン生成細胞増殖を調節することを示唆する。
インスリン誘導性PKCδ活性化とインスリン誘導性ケラチン生成細胞増殖の間の関連性
インスリン誘導性PKCδ活性化とインスリン誘導性ケラチン生成細胞増殖の間の関連性を直接的に研究するために、組換えPKCアデノウイルス構築物を使用して、野生型PKCδ(WTPKCδ)並びにPKCのキナーゼ不活性顕性不活性変異体(これは内因性PKCδ活性を抑止する)(DNPKCδ)の両方を過剰発現させた。インスリン誘導性ケラチン生成細胞増殖に対する、WTPKCδ及びDNPKCδの過剰発現の効果を試験した。両方の構築物、並びにPKCα構築物は、ケラチン生成細胞において効率的に発現された(図18A)。さらに、PKCδ及びPKCαを用いる感染は、対照レベルよりも数倍上のアイソフォーム特異的PKC活性を誘導した(図18B)。予測されるように、DNPKCδの過剰発現はPKC活性を誘導しなかった。図19Aにおいて見られることができるように、トランスフェクトされていない細胞のインスリン処理又はインスリン処理を伴わないWTPKCδの過剰発現は、未処理細胞、又はPKCαで形質導入された細胞よりも2〜3倍とほぼ同じレベルまでチミジン取り込みを増加した。さらに、すでにWTPKCδを過剰発現している細胞へのインスリンの付加は、チミジン取り込みのさらなる増加を引き起こさなかった。IGF1は、非感染細胞並びにWTPKCδ及びPKCαを過剰発現する細胞の両方において同様にチミジン取り込みを増加した(図19A)。インスリン誘導された増殖におけるPKCδの直接的関与は、PKCδ活性を抑止することによって証明された。図19Bにおいて見られるように、顕性不活性PKCδを過剰発現する細胞におけるベースのチミジン取り込みはわずかであるが有意であり、非感染細胞におけるそれよりも低かった。DNPKCδの過剰発現は、インスリン誘導性の増殖を完全に除去したが、IGF1誘導性増殖に影響を与えなかった。さらに、インスリン及びIGF1の相加的効果は、IGF1単独のそれまで減少した。
PKCδ活性化のインスリン媒介経路への特異性
PKCδ活性化のインスリン媒介経路への特異性を、種々の増殖因子(IGF1、EGF、KGF、ECGF、及びPDGFを含む)に対する分裂促進的応答へのPKCδ及びDNPKCδの効果を研究することによって分析した。図20において見られるように、DNPKCδの過剰発現は、インスリンによって誘導される増殖性効果を選択的に除外したが、試験された他の増殖因子のいずれの効果もブロックしなかった。しかし、PKCδの過剰発現は、インスリン誘導性増殖を模倣し、IGF1誘導性増殖に影響を与えなかった。EGF及びKGFを用いる刺激によって誘導される増殖は増加した(図21)。これらのデータは、インスリンによるPKCδ活性化が、PKCδを含む経路を通してケラチン生成細胞の増殖を媒介すること、及びこの経路が、ケラチン生成細胞増殖を調節することが知られている2つの主要な増殖因子であるEGF及びKGFのシグナル伝達の上流にあることを示す。全体として、インスリンは、PKCδ活性の特異的レギュレーターであることが見い出され、この活性は、インスリン、EGF、及びKGFによって誘導されるケラチン生成細胞増殖を調節する際の特異的候補である可能性がある。
インスリン誘導性PKCδ活性及びケラチン生成細胞増殖は、STAT3転写活性化によって媒介される
インスリンシグナル伝達におけるPKCδの役割をさらに特徴付けし、これがSTAT3によって媒介される転写活性化の誘導を含むことを見い出した。図23において見られるように、初代ケラチン生成細胞において、PKCδは、STAT3と特異的に関連性があることが示された。インスリン刺激後、PKCδは活性化され、次には、STAT3をリン酸化及び活性化する(図24)。さらに、薬理学的阻害剤(ロットレリン)によるPKCδ活性の抑止は、STAT3の活性化並びに核トランスロケーションを阻害する。さらに、図25において見られるように、STAT3の過剰発現は、インスリンによって、及びPKCδの過剰発現によって誘導されるのと同様の増殖を誘導し、顕性不活性PKCδ変異体の過剰発現によるPKCδ活性の抑止は、STAT3がケラチン生成細胞増殖を誘導する能力を消滅させる。全体として、これらの結果は、インスリン及びPKCδが、ケラチン生成細胞増殖と関連した転写活性化において役割を果たすことを示唆する。
PKCδ及びPKCζはインビボでの創傷治癒プロセスに必須である
インビボでの創傷治癒プロセスにおけるPKCアイソフォームの重要性は、アイソフォーム特異的無PKCマウスを利用して確立された。図22A〜Bにおいて見られるように、全層創傷が、無PKCδマウス、無PKCζマウス、無PKCαマウス(ノックアウト、KO)及びそれらの野生型同腹仔の背において作製されたときに、創傷治癒の遅延が無PKCδマウス及び無PKCζマウスにおいて観察されたが、無PKCαマウスにおいては観察されなかった。このデータは、糖尿病バックグラウンドの非存在下においてさえ、特異的PKCアイソフォームが皮膚における創傷治癒プロセスのために必須であることを示す。
インビボでの創傷治癒のためのインスリンの単回対複数回塗布
創傷を切開により8〜10週齢のC57BLマウスの背に作製し、以下のように処置した:(i)インスリン0.1μM、7日間毎日塗布;(ii)インスリン1μM、7日間毎日塗布;(iii)インスリン10μM、7日間毎日塗布;(iv)インスリン1μM、創傷形成の4日後に1回塗布;及び(v)媒体(PBS)対照、7日間毎日塗布。すべてのマウスを創傷形成の7日後に屠殺し、それらの開いた創傷領域を測定した。図26に見られるように、1μM濃度におけるインスリンの毎日の処置は、より低濃度(0.1μM)又はより高濃度(10μM)でのインスリンの毎日の処置よりも有意に効果的であった。驚くべきことに、1μM濃度におけるインスリンの単回塗布の処置は、同じ濃度のインスリンの7回の日々の反復塗布の処置よりも実質的に有効であった。
インビボでの創傷治癒のためのインスリン及び血小板由来増殖因子(PDGF−BB)の組み合わせ
創傷を切開により8〜10週齢のC57BLマウスの背に作製し、創傷形成の4日後に以下のように処置した:(i)媒体(PBS)対照;(ii)インスリン 1μM;(iii)PDGF−BB 10μM(R&D Systems、ミネアポリス、米国);及び(iv)インスリン 1μM+PDGF−BB 10μM。処置の3日後にすべてのマウスを屠殺し、処置した創傷を、例えば、上記の実施例20に記載されるように、表皮閉鎖及び真皮閉鎖について組織学的に分析した。
インビボでの創傷治癒のためのインスリン及びPKCα阻害剤の組み合わせ
創傷を切開により8〜10週齢のC57BLマウスの背に作製し、媒体(PBS)対照、又はPKCα阻害剤(HO/02;PKCα偽基質、ミリストイル化;Calibiochem、サンジエゴ、カリフォルニア州、米国と組み合わせた、0.67μM インスリン(HO/01;Humulin、Eli Lilly、米国)のいずれかを用いて7日間毎日処置した。創傷形成の7日後、すべてのマウスを屠殺し、処置された創傷を、創傷閉鎖、表皮閉鎖、真皮閉鎖、及び表皮細胞の空間的分化について分析した。創傷閉鎖を、開いた創傷領域を測定することによって決定した。創傷の真皮閉鎖は、両方の創傷の側において真皮が×100倍率における光学顕微鏡下で観察される単一の視野において観察可能である場合にポジティブであると見なした。創傷の表皮閉鎖は、創傷ギャップにおける基底細胞の形成を強調するK14抗体を用いて創傷切片を染色することによって決定した。表皮細胞の空間的分化は、新規に形成された表皮細胞を強調するK1抗体を用いて創傷切片を染色することによって決定した。
インスリン及びPKCα阻害剤の組み合わせは、インスリンのみの処置によって引き起こされる有害な副作用を回避する
創傷を切開により8〜10週齢のC57BLマウスの背に作製し、媒体(PBS)対照、又は1μM インスリン(Humulin、Eli Lilly、米国)若しくは1μM PKCα偽基質(Calibiochem、サンジエゴ、カリフォルニア州、米国)と組み合わせた1μM インスリンの混合物のいずれかを用いて7日間毎日処置した。創傷形成の7日後、すべてのマウスを屠殺し、処置された創傷を、表皮の増殖能力(PCNA)、血管形成、炎症、表皮細胞、及び創傷ギャップにおける再構築プロセスについて組織学的に分析した。
PKCα阻害剤は創傷炎症を減少する
創傷における後期で且つ重篤な炎症性応答は治癒のプロセスを抑制する可能性があり、したがって、このような炎症を発生から防ぐことは、創傷治癒プロセスを促進するかもしれない。したがって、創傷炎症に対するPKCα阻害剤及びインスリンの効果を、以下の実験において試験した。
インビトロでの創傷閉鎖を加速することに対する、真皮細胞における特異的PKCアイソフォームの発現及び/又は活性を調節すること、並びに細胞に種々の薬剤を投与することの組み合わせ効果
材料及び方法
試薬:
D因子(アディプシン)ヒト、Calbiochem、カリフォルニア州、米国;組換えTNFαマウス、R&D Systems、ミネアポリス 米国;GW9662、Cayman chemical、米国;タンパク質キナーゼCα偽基質阻害剤、Calbiochem、カリフォルニア州、米国;タンパク質キナーゼCζ偽基質阻害剤、Calbiochem、カリフォルニア州、米国;タンパク質キナーゼCη偽基質阻害剤、Calbiochem、カリフォルニア州、米国;PDGF−BB、Cytolab、イスラエル;IL−6、Cytolab、イスラエル;KGF/FGF−7、Cytolab、イスラエル、IGF−1、Cytolab、イスラエル;TGFβ2、Cytolab、イスラエル;上皮増殖因子(EGF)、マウス、Chemicon international、カリフォルニア州、米国;PKCδRACK、AnaSpec、カリフォルニア州、米国;ロジグリタゾン(Rosiglitazon)、CalbioChem、カリフォルニア州、米国;アディポネクチン、MBL、マサチューセッツ州、米国及びコパキソン(Copaxone)(登録商標)、TEVA、イスラエル。
ケラチン生成細胞及び線維芽細胞(真皮細胞)をペトリ皿(内径5cm)で5日間培養し、次いで人工的な交差型の擦過傷を、200μlピペットチップを使用して各ペトリ皿において形成した。培養した細胞を、特異的PKCアイソフォームの発現及び/又は活性を調節可能なアデノウイルス構築物で感染させた。したがって、野生型(WT)PKCアデノウイルス構築物は特異的PKCを活性化するために使用したのに対して、顕性不活性(DN)PKCアデノウイルス構築物は、特異的PKCを阻害するために使用した。培養細胞は、以下の薬剤の1つをさらに供給された:インスリン(6.7×10−7M)、アディポネクチン(1μg/ディッシュ)、アディプシン(2μg/ml)、IL−6(1μg/ディッシュ)、GW9662(1μg/ディッシュ)、KGF(1μg/ディッシュ)、TNFα(12μg/ml)、TGFβ、ロジグリタゾン、SRC阻害剤、PKCδRACK(10−7M)、及びPKCα偽基質阻害ペプチド(107M)。得られる創傷治癒レベルは、0(閉鎖なし)〜10(完全な閉鎖)までの範囲の指標値を使用して、処置の24〜48時間後に決定した。
インビトロでの線維芽細胞創傷閉鎖に対する組み合わせ治療の効果は、以下の表3〜4及び表5〜6に要約されている。これらの結果は、線維芽細胞におけるPKCαの発現及び/又は活性の阻害が、細胞へのアディプシン又はインスリンの投与と組み合わせた場合に、創傷閉鎖を実質的に促進することを示す(それぞれ、10及び8の創傷閉鎖指標値)。創傷閉鎖はまた、線維芽細胞におけるPKCηの阻害、PKCεの阻害、PKCδの活性化、又はPKCζの活性化と組み合わせたPKCαの阻害によって加速された(それぞれ、9、9、9、及び7の創傷閉鎖指標値;図34A〜E)。さらに、創傷閉鎖は、細胞へのKFGの投与と組み合わせた、線維芽細胞中でのPKCζの阻害によって促進された(7の創傷閉鎖指標値;図36)。さらに加えて、創傷閉鎖は、インスリン、IL−6、KGF、又はGW9662の投与と組み合わせた、線維芽細胞におけるPKCβの阻害によって加速された(それぞれ、8、7、9、及び8の創傷閉鎖指標値;図38A〜E)。
インビトロ及びインビボでの創傷治癒のためのコポリマー1の投与
材料及び方法
コポリマー1:
コポリマー1(酢酸ガラティラメル)は、多発性硬化症を治療するために臨床的に使用されている薬物コパキソン(Copaxone)(登録商標)(Teva、イスラエル)の活性成分である。コポリマー1は、ミエリン鞘の天然成分であるミエリン塩基性タンパク質(MBP)の合成ポリペプチドアナログである。化学的には、コポリマー1は、L−アラニン、L−リジン、及びL−チロシンを有するL−グルタミン酸ポリマー、酢酸(塩)と呼ばれる。その構造式は:(Glu、Ala、Lys、Tyr)x.XCH3COOH(C5H9NO4・C3H7NO2・C6H14N2O2・C9H11NO3)x・xC2H4O2である。酢酸ガラティラメルの平均分子量は4,700〜11,000ダルトンである。これは、23,000ダルトンの平均分子量を有する生成物を形成する4種のアミノ酸を化学的に重合することによって合成される(米国特許第3,849,550号)。
アッセイを、本質的に本明細書中上記の実施例24に記載されるように実行した。コポリマー1は55μg/ディッシュの濃度で、単独で、又はPKCα偽基質(1μM)及び/若しくはインスリン(1μM)と組み合わせて、培養したケラチン生成細胞に供給した。得られる創傷閉鎖レベルを、処置の48時間後に、0(閉鎖なし)〜10(完全な閉鎖)までの範囲の指標値を使用して決定した。
創傷を切開(20mm)によりC57BLマウスの背に作製し、以下のように創傷形成の4日後に処置した:(i)媒体(PBS)対照;(ii)コポリマー1(55μg/ml);(iii)コポリマー1(55μg/ml)及びインスリン(1μM)の混合物;(iv)PKCα偽基質阻害ペプチド(1μM)及びインスリン(1μM)の混合物;並びに(v)コポリマー1(55μg/ml)、PKCα偽基質阻害ペプチド(1μM)、及びインスリン(1μM)の混合物。創傷を、(i)創傷閉鎖、(ii)痂皮形成、及び(iii)創傷の出血/滲出について形態学的に評価した。
インビトロアッセイ:
培養したケラチン生成細胞へのコポリマー1の投与は、0(閉鎖なし)〜10(完全な閉鎖)までのスケール上で8の指標値にインビトロ創傷の閉鎖を促進した。PKCα偽基質阻害ペプチド、又はPKCα偽基質及びインスリンの混合物とのコポリマー1の組み合わせは、同様の効果を生じた(それぞれ、8及び9の創傷閉鎖指標値;図40A〜F)。したがって、これらの結果は、コポリマー1それ自体が、インビトロでの創傷閉鎖を実質的に加速可能であることを示す。
コポリマー1を、単独で又はインスリン及び/若しくはPKCα偽基質と組み合わせて、切開創傷に投与することは、未処置対照と比較して、創傷ギャップを実質的に減少させ、創傷中の痂皮形成を加速した。さらに、コポリマー1を用いるすべての処置は、創傷領域における出血及び滲出を効果的に予防した。
創傷治癒プロセスに対する胸腺分泌物質の影響
材料及び方法:
創傷切開を、正常成体齧歯類又はSTZ糖尿病マウスの上背(首の近く)で実行した。これらの動物を処置の7日後又は9日後に屠殺し、創傷を、上記の実施例20において記載されるような染色手順を使用して、創傷領域に近接した胸腺の存在について、並びに創傷の表皮及び真皮の閉鎖について、組織学的に分析した。
図42A〜Hにおいて見られることができるように、創傷ギャップに密接に近接した胸腺の存在は、表皮形成の加速、組織の顆粒化、及び創傷中の真皮収縮と相関した。これらの観察は、胸腺分泌物質が創傷の治癒プロセスに効果的に寄与するかもしれないことを示す。したがって、サイモシン、β−サイモシン(例えば、サイモシンβ4、サイモシンβ10、サイモシンβ9、サイモシンβ12、サイモシンβ14)、αサイモシン(例えば、サイモシンα、1/ゼダキシン、プロサイモシンα、パラサイモシンα)、サイムリン、IGFI、IGFII、NGF、ソマトスタチン、サイログロブリン、副甲状腺ホルモン、及び/又は胸腺ホルモンペプチド(THP)などの胸腺由来物質は、創傷の治癒プロセスを加速するための処置において使用されてもよい。
Claims (10)
- インスリンとN−ミリストイル化PKCαインヒビター偽基質ペプチドの、
損傷した皮膚または皮膚創傷の治癒プロセスを誘導または促進するための局所適用用薬剤組成物を製造するための使用。 - 該皮膚創傷が、潰瘍、糖尿病関連の創傷、熱傷、日焼け、加齢による皮膚創傷、角膜潰瘍化による創傷、炎症性消化管疾患による創傷、腸炎症性疾患による創傷、クローン病による創傷、潰瘍性大腸炎、痔核、表皮水疱症による創傷、皮膚水疱形成性創傷、乾癬による創傷、動物の皮膚の創傷、動物の糖尿病による創傷、網膜症による創傷、口腔の創傷(粘膜炎)、膣粘膜炎による創傷、歯周病による創傷、裂傷、外科的切除による創傷、および外科的接着後の創傷からなる群から選択される、請求項1に記載の使用。
- 該潰瘍が、糖尿病性潰瘍、褥瘡性潰瘍、静脈性潰瘍、胃潰瘍、およびHIV関連潰瘍からなる群から選択される請求項2に記載の使用。
- 該薬剤組成物が、水溶液剤、ゲル剤、クリーム剤、ペースト剤、ローション剤、噴霧剤、懸濁液剤、粉末剤、分散液剤、膏薬、および軟膏剤からなる群から選択される、請求項1に記載の使用。
- 該薬剤組成物が、固体支持体を含む請求項4に記載の使用。
- 損傷した皮膚または皮膚創傷の治癒プロセスを誘導または促進するための局所適用用薬剤組成物であって、治療有効量のインスリンとN−ミリストイル化PKCαインヒビター偽基質ペプチドを含む局所適用用薬剤組成物。
- 0.1〜10μM濃度の低濃度インスリン、及びN−ミリストイル化PKCαインヒビター偽基質ペプチドの、損傷した皮膚または皮膚創傷の治癒プロセスを誘導または促進するための局所への単回投与用薬剤組成物を製造するための使用。
- 該低濃度のインスリンが、0.1〜1μM濃度である請求項7に記載の使用。
- 該皮膚が、真皮である請求項7又は8に記載の使用。
- 損傷した皮膚または皮膚創傷の治癒プロセスを誘導または促進するための局所への単回投与用薬剤組成物であって、0.1〜10μM濃度の低濃度のインスリン、N−ミリストイル化PKCαインヒビター偽基質ペプチドと製剤上許容される担体とを含む、損傷した皮膚または皮膚創傷の治癒プロセスを誘導または促進するための局所への単回投与用薬剤組成物。
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