JP5828638B2

JP5828638B2 - 満腹活性を有する魚類タンパク質の加水分解産物、該加水分解産物を含む栄養補助食品及び医薬品の組成物、及び、その製造方法。

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Publication number: JP5828638B2
Application number: JP2010545508A
Authority: JP
Inventors: ラロシェル，ユベールドリュ; コロイス，エリーザ; キュドネック，ブノア; フーシェロー−ペロン，マルティーヌ; ラヴァレック−プレ，ロゼン
Original assignee: Museum National dHistoire Naturelle
Current assignee: Museum National dHistoire Naturelle
Priority date: 2008-02-12
Filing date: 2009-02-12
Publication date: 2015-12-09
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Description

本発明は、ガストリン／コレシストキニンファミリーに免疫学的に関連する分子を含み、ヒト又は動物で満腹活性を発揮し、食物摂取を調節することができる、魚類タンパク質の加水分解産物に関する。また本発明は、かかる魚類タンパク質の加水分解産物と、該魚類タンパク質の加水分解産物を含む、組成物、食品、補助栄養食品又は薬品との製造方法に関する。

肥満は集団中でますます観察されてきており、持続的な関心事になってきている。かかる現象は、平均エネルギー摂取量と、総エネルギー消費量との不均衡の結果である。なぜなら、生物は、該生物が消費するよりも多く摂取する際には、脂肪組織を構成する脂肪細胞において脂肪の形状でのエネルギー追加分の一部を貯蔵する。これらの細胞は肥大し、その後、目に見える体重増加を生じる。その後、それらは飽和に達し、増殖する場合がある。そこで、肥満と認められる。かかる場合には、前記体重増加は、循環器、関節又は代謝の障害のようなさまざまな健康上の問題の直接的な原因である。

体重増加をもたらす因子は２種類あり、第１は遺伝因子であり、第２は生活様式及び摂食行動である。食品及び栄養補助食品の産業は、現在、第２要因に注意を払っており、摂食行動、より具体的には、満腹の制御の原因である生理現象に関係する生物学的因子に興味を持っている。この制御の障害は体重増加の原因だけでなく、肥満、２型糖尿病、循環器障害、高血圧、アテローム性動脈硬化症及び高コレステロール血症のような消化管の障害に関係する重篤な疾患の原因の場合がある。

コレシストキニン（以下、「ＣＣＫｓ」という。）は神経内分泌ペプチドのファミリーである。これらは、腸内分泌細胞によって小腸管腔で分泌され、消化管と脳との情報伝達の役割をそれらに与える中枢神経系で分泌される（非特許文献１及び２）。小腸の十二指腸部分を食物が通過することでＣＣＫｓの分泌を生じる。この分泌は、腸運動性、胆嚢の収縮、胃のクリアランスの抑制、膵臓分泌の促進及び満腹現象の誘導のような多数の生理学的過程を生じる（非特許文献３）。ＣＣＫｓの放出は、重要な順番に、タンパク質、脂質及び糖質の化合物が作用するためである（非特許文献４）。

従来の研究は、ラット（非特許文献５及び６）、ブタ（非特許文献７）及びヒト（非特許文献８）において特定のタンパク質の加水分解産物によって満腹感が惹起されることを示した。

ＳｔｒａｄｅｒＡＤ及びＷｏｏｄｓＳＣ．２００５；１２８：１７５−１９１．ＭｏｒａｎＴＨ及びＫｉｎｚｉｇＫＰ．Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ．ＬｉｖｅｒＰｈｙｓｉｏｌ．２００４；２８６：Ｇ１８３−１８８．ＣｈａｕｄｈｒｉＯら、ＰｈｉｌｏｓＴｒａｎｓＲＳｏｃＬｏｎｄＢＢｉｏｌＳｃｉ２００６；３６１：１１８７−２０９．ＢａｉｌｅＣＡら、ＰｈｙｓｉｏｌＲｅｖ１９８６；６６：１７２−２３４．ＬｉｄｄｌｅＲＡら、ＡｍＪＰｈｙｓｉｏｌ１９８６；２５１：Ｇ２４３−８．ＤｏｕｇｌａｓＢＲら、Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔｉａ１９８８；４４：２１−３．ＣｕｂｅｒＪＣら、ＲｅｐｒｏｄＮｕｔｒＤｅｖ１９９０；３０：２６７−７５．ＭｉａｚｚａＢら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ１９８５；８８：１２１５−２２．

また出願人は、特定の魚類の筋肉を酵素的加水分解することで得られたタンパク質又はペプチドの加水分解産物は、腸内分泌細胞によるＣＣＫｓの分泌を促進する性質を有することを発見した。

グルカゴン様ペプチド１のＧＬＰ−１は、栄養摂取に応答して消化管の上皮細胞によって分泌される消化管ホルモンである。

ＧＬＰ−１は、血糖値（食後の血糖値）が非常に高い際に、インスリンの合成及び分泌を増大することによって栄養の代謝及びその排出を調節する。対照的に、ＧＬＰ−１は、膵島を介して高血糖症を生じるホルモンのグルカゴンの放出を制限する。

またＧＬＰ−１は、消化運動を低下し、満腹感を生じる。

図１は、本発明に応じるプタスダラのタンパク質の加水分解産物の加水分解の程度の変化を示す。

図２は、本発明に応じるプタスダラのタンパク質の加水分解産物のタンパク質断片の分子量分布を示す。

図３ないし５は、本発明に応じる別種の魚類タンパク質の加水分解産物のタンパク質断片の分子量分布を示す。

図６は、本発明に応じるプタスダラのタンパク質の加水分解産物の有無におけるＳＴＣ−１細胞によるＣＣＫ分子の分泌を示す。

図７は、本発明に応じるプタスダラのタンパク質の加水分解産物の有無におけるＳＴＣ−１細胞によるＧＬＰ１分子の分泌を示す。

図８は、ラットの食物摂取における本発明に応じるプタスダラのタンパク質の加水分解産物の効果を示す。

図９及び１０は、本発明に応じるプタスダラのタンパク質の加水分解産物の吸収後又は非吸収後のラットにおけるＣＣＫ及びＧＬＰ１の分子それぞれの血漿中の量（ｐｌａｓｍａｔｉｃｄｏｓａｇｅ）を示す。

プタスダラのタンパク質の加水分解産物の加水分解の程度の変化を示すチャート図。プタスダラのタンパク質の加水分解産物のタンパク質断片の分子量分布を示すチャート図。プタスダラ（Ｈ１）、サバ（Ｈ２）、アジ（Ｈ３）及びコソダラ（Ｈ４）のタンパク質の加水分解産物のタンパク質断片の分子量分布を示すチャート図。プタスダラ（Ｈ１）、ビブ（Ｈ５）、イワシ（Ｈ６）、ニシン（Ｈ７）及びパンガ（Ｈ８）のタンパク質の加水分解産物のタンパク質断片の分子量分布を示すチャート図。プタスダラ（Ｈ１）、タイセイヨウマダラ（Ｈ９）、シロイトダラ（Ｈ１０）及びモンツキダラ（Ｈ１１）のタンパク質の加水分解産物のタンパク質断片の分子量分布を示すチャート図。プタスダラのタンパク質の加水分解産物によるＳＴＣ−１細胞のＣＣＫ分子の分泌を示す棒グラフ。プタスダラのタンパク質の加水分解産物によるＳＴＣ−１細胞のＧＬＰ１分子の分泌を示す棒グラフ。ラットの食物摂取におけるプタスダラのタンパク質の加水分解産物の効果を示す棒グラフ。プタスダラのタンパク質の加水分解産物の吸収後のラットにおけるＣＣＫ分子の血漿中の量を示す棒グラフ。プタスダラのタンパク質の加水分解産物の吸収後のラットにおけるＧＬＰ１分子の血漿中の量を示す棒グラフ。

また本発明は、魚類タンパク質の加水分解産物が、ミクロメシスティウス・ポタソウ（Ｍｉｃｒｏｍｅｓｉｓｔｉｕｓｐｏｕｔａｓｓｏｕ）、クルペア・ハレングス（Ｃｌｕｐｅａｈａｒｅｎｇｕｓ）、スコムベル・スコムブルス（Ｓｃｏｍｂｅｒｓｃｏｍｂｒｕｓ）、サルディナ・ピルカルドゥス（Ｓａｒｄｉｎａｐｉｌｃｈａｒｄｕｓ）、トリソプテルス・エスマルキ（Ｔｒｉｓｏｐｔｅｒｕｓｅｓｍａｒｋｉ）及びトラクルス属の複数種（Ｔｒａｃｈｕｒｕｓｓｐｐ．）の浮魚類の種と、ガドゥス・モルア（Ｇａｄｕｓｍｏｒｈｕａ）、ポルラキウス・ヴィレンス（Ｐｏｌｌａｃｈｉｕｓｖｉｒｅｎｓ）、メラノグランムス・アレグレフィヌス（Ｍｅｌａｎｏｇｒａｍｍｕｓａｅｇｌｅｆｉｎｕｓ）及びコリファエノイデス・ルペストリス（Ｃｏｒｙｐｈａｅｎｏｉｄｅｓｒｕｐｅｓｔｒｉｓ）の底魚類の種と、シルリフォルメス（Ｓｉｌｕｒｉｆｏｒｍｅｓ）目に属する魚類の種とからなるグループから選択される少なくとも１種類のタンパク質の供給源を酵素的加水分解することによって得られ、該酵素的加水分解は、バチルス・アミロリクエファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）及びバチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）由来のエンドペプチダーゼを含む酵素混合物によって行われること、３００Ｄａ未満の分子量の分子が２３％から３１％まで、３００Ｄａから１０００Ｄａまでの分子量の分子が３１％から３４％まで、１０００Ｄａから３０００Ｄａまでの分子量の分子が２８％から３４％まで、３０００Ｄａから５０００Ｄａまでの分子量の分子が６％から８％まで、及び、５０００Ｄａから１００００Ｄａまでの分子量の分子が２％から４％までと、原材料の百分率として１％未満の脂質含有量と、原材料の百分率として０．１％未満の糖質含有量と、原材料の百分率として８０％よりも多いタンパク質含有量と、原材料の百分率として１０％から２０％までの無機質含有量との分子プロファイル分布を有すること、及び、コレシストキニン、すなわち、ＣＣＫｓに免疫学的に類似する分子を含むことを特徴とする、魚類タンパク質の加水分解産物に関する。

本発明に応じる前記タンパク質の加水分解産物は、外因性ＣＣＫ分子に寄与する。またそれは、消化管細胞による内因性ＧＬＰ１分子及びＣＣＫ分子の分泌を促進する。したがって、前記加水分解産物が以下の実施例で示されるように満腹を制御する。

本発明の１つの特徴によれば、前記魚類タンパク質の加水分解産物は、アミノ酸の総質量に関しての質量あたりの百分率として、グルタミン酸１７．４％、アスパラギン酸１１．４％、リジン１０．２％、ロイシン８．４％、アルギニン６．１％、アラニン６．８％、バリン４．７％、イソロイシン４．２％、グリシン５％、スレオニン４．５％、セリン４．４％、チロシン３．２％、フェニルアラニン３．９％、メチオニン２．５％、プロリン３．６％、ヒスチジン１．９％、システイン１％、トリプトファン０．８％のアミノ酸組成を有する。

本発明の好ましい実施態様によれば、前記魚類タンパク質の供給源は前記魚類の切り身のすり身（ｐｕｌｐ）の形状である。

本発明の別の実施態様によれば、前記酵素混合物はアスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅ）由来のエンドペプチダーゼも含む。

また、本発明は魚類タンパク質の供給源からタンパク質の加水分解産物を製造する方法に関し、前記加水分解産物は、前記消化管細胞のレベルでＣＣＫｓ及びＧＬＰ１の分泌を促進し、以前に明記したような満腹感を生じる効果を発揮できる性質を有する。本発明に応じる方法は、該方法が、魚類のすり身を回収するために、水の存在下で、ミクロメシスティウス・ポタソウ（Ｍｉｃｒｏｍｅｓｉｓｔｉｕｓｐｏｕｔａｓｓｏｕ）、クルペア・ハレングス（Ｃｌｕｐｅａｈａｒｅｎｇｕｓ）、スコムベル・スコムブルス（Ｓｃｏｍｂｅｒｓｃｏｍｂｒｕｓ）、サルディナ・ピルカルドゥス（Ｓａｒｄｉｎａｐｉｌｃｈａｒｄｕｓ）、トリソプテルス・エスマルキ（Ｔｒｉｓｏｐｔｅｒｕｓｅｓｍａｒｋｉ）及びトラクルス属の複数種（Ｔｒａｃｈｕｒｕｓｓｐｐ．）の魚類の種と、ガドゥス・モルア（Ｇａｄｕｓｍｏｒｈｕａ）、ポルラキウス・ヴィレンス（Ｐｏｌｌａｃｈｉｕｓｖｉｒｅｎｓ）、メラノグランムス・アレグレフィヌス（Ｍｅｌａｎｏｇｒａｍｍｕｓａｅｇｌｅｆｉｎｕｓ）及びコリファエノイデス・ルペストリス（Ｃｏｒｙｐｈａｅｎｏｉｄｅｓｒｕｐｅｓｔｒｉｓ）の前記底魚類の種と、前記シルリフォルメス（Ｓｉｌｕｒｉｆｏｒｍｅｓ）目に属する魚類の種とからなるグループから選択される少なくとも１種類のタンパク質の供給源をすりつぶすステップと、反応混合物を得るために、バチルス・アミロリクエファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）及びバチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）由来のエンドペプチダーゼを含む酵素混合物の添加後、１時間ないし５時間、４０°Ｃから６５°Ｃまでの温度、ｐＨ６からｐＨ９までの範囲のｐＨで前記タンパク質の供給源を酵素的加水分解するステップと、前記反応混合物の温度を７０°Ｃを下回らないレベルに８ないし２０分間上昇させた後、前記酵素を不活性化することによって前記酵素的加水分解を停止するステップと、前記反応混合物の残余から得られた前記タンパク質の加水分解産物を分離するステップとを含むことを特徴とする。

前記酵素的加水分解は、探し出された前記性質を有する、タンパク質の加水分解産物を得ることを可能にするために慎重に選択された酵素混合物によって実施される。前記酵素、前記加水分解の温度、及び、溶媒がないことを特徴とする前記方法は、得られた前記加水分解産物の感覚上及び栄養上の品質を大事にする。これらの加水分解産物は、食品、栄養補助食品組成物又は医薬品に取り込まれる場合がある。

本発明の１つの実施態様によれば、前記タンパク質の供給源をすりつぶすステップは、水に対するタンパク質の供給源の質量比が１となる水の存在下で実施される。

本発明の１つの実施態様によれば、前記酵素的加水分解は、タンパク質供給源に対する酵素の割合が０．０１％から２％までで実施される。タンパク質供給源及び酵素の前記割合は０．５％であることが好ましい。

本発明の１つの実施態様によれば、前記酵素的加水分解は６０°Ｃの温度で実施される。

本発明の１つの実施態様によれば、前記酵素的加水分解はｐＨ７．５で実施される。

前記反応混合物の残余から得られた前記タンパク質の加水分解産物を分離するステップは、４０００回転／分から７０００回転／分までの速度の遠心分離と、得られた残渣の除去とによって実施されることが一般的である。得られた前記タンパク質の加水分解産物を分離するステップは、前記遠心分離前に前記反応混合物を濾過することによって達成される場合があることが好ましい。反応物の濾過は固形物質を除去する。

本発明の１つの実施態様によれば、また前記方法は、得られた前記加水分解産物の濃縮及び微粒子化、すなわち、凍結乾燥を含む。

本発明の１つの実施態様によれば、前記酵素的加水分解は、加水分解の程度が９％の最大値、好ましくは８．７５％から８．９５％までに到達する際に、停止される。

本発明の１つの実施態様によれば、加水分解での前記反応混合物のｐＨは調節され、１ｍｏｌ．Ｌ^−１の水酸化ナトリウムを添加することによって一定に保たれる。

本発明の別の実施態様によれば、前記酵素混合物は、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅ）由来のエンドペプチダーゼも含む。

バチルス・アミロリクエファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）及びアスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅ）由来の３種類の酵素それぞれの混合物の存在下での加水分解反応後に得られた前記タンパク質の加水分解産物は、バチルス・アミロリクエファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）及びバチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）それぞれに由来の２種類の酵素混合物の存在下での加水分解反応後に得られたタンパク質の加水分解産物と同一の性質と、物理的及び化学的な特徴とを有する。

本発明に応じる方法の好都合な実施態様によれば、前記酵素混合物は、ＣＲ１０２０混合物又はプロタメックス（Ｐｒｏｔａｍｅｘ）混合物から選択される。前記ＣＲ１０２０混合物はミートザイム（Ｍｅａｔｚｙｍｅ）社（クリスチャンウィンザース通り３６Ａ、デンマークリュンビュー市２８００）によって販売される。前記プロタメックスはノボザイム（Ｎｏｖｏｚｙｍｅ）社（クロシェイ通り３６、デンマークバウスヴェア市２８８０）によって販売される。

本発明の１つの実施態様によれば、前記酵素的加水分解は、前記反応混合物の温度を９０°Ｃに上昇して、この温度を１０分間維持することよって停止される。

本発明の好ましい実施態様によれば、前記タンパク質の供給源をすりつぶすステップは、前記魚類の切り身を用いて実施される。

したがって、本発明に応じる前記方法は、以前に説明したような魚類タンパク質の加水分解産物を得ることを可能にする。

また本発明は、以前に説明されたような魚類タンパク質の加水分解産物を含む、組成物、食品及び補助栄養食品に関する。

また本発明は、以前に説明したような魚類タンパク質の加水分解産物を含む薬品と、肥満及び２型糖尿病の治療と、循環器障害、高血圧及びアテローム性動脈硬化症の予防とを意図する薬品を製造するための該魚類タンパク質の加水分解産物の使用とに関する。これは、以前に説明したように、本発明に応じる前記魚類タンパク質の加水分解産物は、かかる症状の治療又は予防で用いられる場合があるためである。より具体的には、本発明に応じる前記魚類タンパク質の加水分解産物は、ＣＣＫ分子の分泌の促進、及び／又は、ＧＬＰ１分子の分泌の促進で用いられる場合がある。

本発明に応じる魚類タンパク質の加水分解産物を取り込んでいる、栄養補助食品又は医薬品は、結合剤、風味剤、防腐剤又は着色剤のような製剤のタイプで通常使用される成分を含む場合があり、補助栄養食品又は薬品の場合には、錠剤、顆粒剤又はカプセル剤の形状の場合がある。本発明に応じる製剤は、飲料のような食品の形状か、懸濁剤又はシロップ剤の形状かの場合もある。

前述した本発明の特徴その他は、以下の実施例の実施態様の明細書を読むことでより明白に明らかになるであろうし、前記実施例は例示することを意図とし、限定することを意図しないであろう。

実施例１プタスダラ（ミクロメシスティウス・ポタソウ（Ｍｉｃｒｏｍｅｓｉｓｔｉｕｓｐｏｕｔａｓｓｏｕ）（Ｈ１））から得られたタンパク質の加水分解産物
プタスダラ（ミクロメシスティウス・ポタソウ（Ｍｉｃｒｏｍｅｓｉｓｔｉｕｓｐｏｕｔａｓｓｏｕ））は北大西洋ニューファンドランドで釣られる。魚類は切り身に切り取られ、その後、そのすり身を得るためにすりつぶされる。この魚類のすり身は、加水分解産物を製造するためのタンパク質の供給源の構成要素となる。前記すり身は使用されるまで−２０°Ｃで保管される。

予め解凍されたプタスダラのすり身３キログラムは、質量比１で水と混合される。混合物の温度は６０°Ｃに上昇され、ｐＨは攪拌しながら１Ｍ水酸化ナトリウム溶液によって７．５に調節される。

バチルス・アミロリクエファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）及びアスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅ）由来の３種類の酵素それぞれからなり、ミートザイム社（クリスチャンウィンザース通り３６Ａ、デンマークリュンビュー市２８００）によってＣＲ１０２０という名前で販売された混合物は、その後、タンパク質供給源に対する酵素の割合が０．５％で前記反応混合物に添加される。前記加水分解反応では、ｐＨは１Ｍ水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）を添加することによって７．５で一定に保たれる。

前記プタスダラのタンパク質の加水分解反応は、周知のいわゆるｐＨ−ＳＴＡＴ法による制御条件下で２時間実施される。前記ｐＨ−ＳＴＡＴ法は、前記加水分解反応でｐＨ定数を保つのに利用される。したがって、前記加水分解の程度は、ペプチド結合の総数分の切断されたペプチド結合の数によって決定される、加水分解の程度（ＤＨ）によって定量される。

前記ＤＨは、前記ｐＨ定数を保つために用いられた塩基の量及びモル濃度から算出される。前記ｐＨが一定のままである限り、加水分解された結合の数と、注がれた水酸化ナトリウムの量とに関係がある。一定の酵素系と、一定のｐＨとのために、機能性は、反応が同一のＤＨでいつも停止される場合には、１つの加水分解産物と別の加水分解産物とで同一であるであろう。

式１
％ＤＨ＝［（Ｂ．ＮＢ）／（α．ｈｔｏｔ．ＭＰ）］＊１００

上記式において、Ｂは前記塩基の消費量（ｍＬ又はＬ）であり、ＮＢは前記塩基の規定度であり、αは、ＨＮ基又はＣＯＯＨ基の平均解離度であり、ＭＰは（ｇ又はｋｇのケルダール法によって決定された）タンパク質量であり、ｈｔｏｔはペプチド結合の総数である。

加水分解反応の２時間後、前記タンパク質の加水分解産物の最終ＤＨは８．９％である（図１）。

加水分解の速度論の最後に前記酵素を不活性化することは、反応物の温度を９０°Ｃまで上昇させることによって達成される。この温度は１０分間維持される。

その後、得られたプタスダラのタンパク質の加水分解産物（以下、「Ｈ１」という。）が固形物質を除去するために篩（２ｍｍ／２ｍｍのメッシュ）上で濾過される。その後、容器に回収された分画は、４０００ｒｐｍから７０００ｒｐｍまでの速度で３０分間±５分間遠心分離される。残渣の除去後、上清は回収され、凍結乾燥され、乾燥した冷暗所で保存される。前記上清は微粒子化される場合もある。

本発明の１つの変形では、前述の酵素混合物を添加する前に温度を沸点に上昇することによって内因性酵素を不活性化することができる。

本発明の別の変形では、前記酵素的加水分解は、バチルス・アミロリクエファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）及びバチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）由来の２種類の酵素それぞれからなり、ノボザイム社（クロシェイ通り３６、デンマークバウスヴェア市２８８０）によってプロタメックスという名前で販売された混合物を用いて実施される。

プタスダラから得られたタンパク質の加水分解物の物理的及び化学的な解析
得られたタンパク質の加水分解産物を構成しているペプチドの分子量を決定することが、立体排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）によって実施される。

凍結乾燥後の粉末の形状の前記タンパク質の加水分解産物Ｈ１は２０ｍｇ／ｍＬで超純水に懸濁され、その後、０．４５μｍの膜上で濾過され、ファルマシア社によって販売されたスパーデックスペプチドＨＲ１０／３０カラムに付随するゲルを通して濾過することによって解析される。前記カラムの基質は、アガロースとデキストランとを架橋した多孔性ゲル（直径１３−１５μｍ）全量２４ｍＬから構成される。分画ドメインは１００Ｄａから７０００Ｄａまでである。前記カラムは、ポンプを装備した（ダイオネクス社によって販売された）ＨＰＬＣ製品（ダイオネクスＰ６８０モジュール）に取り付けられる。測定は、多波長紫外線検出器（ダイオネクスＵＶＤ１７０Ｕモジュール）によって実施される。タンパク質の加水分解産物は、アセトニトリル、水及びＴＦＡを含む移動相によって溶出される。前記溶出は、０．５ｍＬ／分の割合で約１時間続く。

分子量分布は、既知の分子量を有するマーカーのカラムの通過後、得られた検量線のパラメーターから算出される。これらのマーカーは、シトクロムＣ（１２４００Ｄａ）、アプロチニン（６５１１Ｄａ）、ガストリンＩ（２１２６Ｄａ）、Ｐ物質（１３４８Ｄａ）、Ｐ物質の断片１−７（９００Ｄａ）、グリシン（７５Ｄａ）及びロイペプチン（４６３Ｄａ）である。データはクロメレオンソフトフェア（ダイオネクス）によって採取される。前記分子量の百分率は、ソフトフェア（ポリマーラボラトリーズからのＧＰＣシーラス）によって算出される。取得波長は２１４ｎｍである。ｄＷ／ｌｏｇＭの分画としての前記分子量分布は図２に示され、サイズ分類による前記分子量分布は以下の表２で提供される。曲線下面積の百分率はペプチド分子の百分率に対応する。

プタスダラのタンパク質の加水分解産物Ｈ１のアミノ酸組成は、（欧州指令９８／６４／ＣＥと、ＮＦＥＮＩＳＯ１３９０４−２００５年１０月とに従って）表１で提供される。表２は、前記Ｈ１タンパク質の加水分解産物のアミノ酸分布を示す。

タンパク質含有量は、（ケルダール法によって採取された−ＮＦＶ１８−１２０−１９９７年３月に従う）原材料の百分率において８０％より高い。

脂質含有量は、（欧州指令９８／６４／ＣＥに従う）原材料の百分率として１％未満である。

タンパク質の加水分解産物Ｈ１の熱量は約３３０Ｋｃａｌ／１００ｇである。

糖質含有量は、（前記タンパク質及び糖質の含有量と、熱量とから推定された）０．１％未満である。

実施例２本発明に応じる別種の魚類から得られたタンパク質の加水分解産物
サバ（Ｈ２）（スコムベル・スコムブルス（Ｓｃｏｍｂｅｒｓｃｏｍｂｒｕｓ））、アジ（Ｈ３）（トラクルス属の複数種（Ｔｒａｃｈｕｒｕｓｓｐｐ．））、コソダラ（Ｈ４）（コリファエノイデス・ルペストリス（Ｃｏｒｙｐｈａｅｎｏｉｄｅｓｒｕｐｅｓｔｒｉｓ））（図３）と、ビブ（ｂｉｂ）（Ｈ５）（トリソプテルス・エスマルキ（Ｔｒｉｓｏｐｔｅｒｕｓｅｓｍａｒｋｉ））、イワシ（Ｈ６）（サルディナ・ピルカルドゥス（Ｓａｒｄｉｎａｐｉｌｃｈａｒｄｕｓ））、ニシン（Ｈ７）（クルペア・ハレングス（Ｃｌｕｐｅａｈａｒｅｎｇｕｓ））、パンガ（ｐａｎｇａ）（Ｈ８）、スリフォルメ（Ｓｕｌｉｆｏｒｍｅ）（図４）と、タイセイヨウマダラ（Ｈ９）（ガドゥス・モルア（Ｇａｄｕｓｍｏｒｈｕａ））、シロイトダラ（Ｈ１０）（ポルラキウス・ヴィレンス（Ｐｏｌｌａｃｈｉｕｓｖｉｒｅｎｓ））及びモンツキダラ（Ｈ１１）（メラノグランムス・アレグレフィヌス（Ｍｅｌａｎｏｇｒａｍｍｕｓａｅｇｌｅｆｉｎｕｓ））（図５）とのタンパク質の加水分解産物は実施例１の方法に従って調製された。加水分解産物それぞれを構成するペプチドの分子量分布は、実施例１で用いられたような同一方法に従って解析された。

ｄＷ／ｌｏｇＭの分画としての分子量分布は、図３ないし５に提供され、サイズ分類による前記分子量分布は以下の表２に提供される。曲線下面積の百分率はペプチド分子の百分率に対応する。

前記加水分解産物Ｈ１ないしＨ１１は、同一の分子量分布プロファイルを有する。

実施例３プタスダラのタンパク質の加水分解産物Ｈ１のコレシストキニン（ＣＣＫｓ）に免疫学的に類似する分子の解析
前記タンパク質の加水分解産物Ｈ１に存在するＣＣＫｓに類似する分子が、ＲＩＡキット（ＧＡＳＫ−ＰＲ、ＣＩＳバイオインターナショナル、フランスバニョール／セズ）を用いる放射線免疫学的解析によって解析された（試験は３回実施された。）。ＣＣＫｓに類似する分子は、ガストリン及びＣＣＫに共通な８個のアミノ酸に対して特異的な抗体に固定することができる分子のいずれかを意味し、前記抗体は前述の解析で用いられた抗体である。ガストリン及びＣＣＫｓは、ペプチド配列のＣ末端で同一の該ペプチド配列を有する。

前記タンパク質の加水分解産物は、加水分解産物の乾燥質量１ｍｇあたりガストリン／ＣＣＫｓに類似する分子５．６ｐｇを含む。

したがって、本発明に応じる前記加水分解産物は、ＣＣＫ分子に類似する分子を供給することを可能にする。

実施例４試験管内細胞培養試験ＣＣＫ分子の分泌の促進と、ＧＬＰ１分子の分泌の促進との効果
前記Ｈ１タンパク質の加水分解産物は、ＳＴＣ１腸内分泌細胞タイプでＣＣＫ分子と、ＧＬＰ１との分泌を促進する能力について試験された。これは、消化管内分泌細胞によるＣＣＫ及びＧＬＰ１の分泌が、満腹現象を構成する主要なシグナルの１つを示すためである。ＳＴＣ−１細胞は、マウスの小腸から生じる腫瘍内分泌細胞由来の多数のホルモン産生細胞（ｐｌｕｒｉｈｏｒｍｏｎａｌｃｅｌｌｓ）である。ＳＴＣ−１細胞は、ＣＣＫの特定の分泌を生じる現象の研究のための細胞モデル（ＭａｎｇｅｌＡＷら、ＡｍＪＰｈｙｓｉｏｌ、１９９５．２６８（１Ｐｔ１）：Ｇ９０−４頁）及びＧＬＰ１の特定の分泌を生じる現象を研究するための細胞モデル（ＢｒｕｂａｋｅｒＰＬら、ＣａｎＪＤｉａｂｅｔｅｓ．２００３；２７：１４１−１４８）として用いられる。

ＳＴＣ−１細胞は、２ｍＭのＬ−グルタミン、２ｍＭのペニシリン、５０μＭのストレプトマイシン及び１０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含むＤＭＥＭ培地で培養された。前記試験が実施される２日前から３日前まで、前記ＳＴＣ−１細胞は、２４ウェルプレート中で１ウェルあたり３００００個ないし４００００個の細胞の割合で培養された。前記細胞は約８５％コンフルエントレベルに達した際に、前記ウェルはインキュベーション緩衝液（４．５ｍＭＫＣｌ、１．２ｍＭＣａＣｌ_２、１．２ｍＭＭｇＣｌ_２、１０ｍＭグルコース、１４０ｍＭＮａＣｌ及び２０ｍＭヘペス−トリス、ｐＨ７．４）で２回洗浄された。

その後、前記細胞は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）か、異なる濃度のＨ１タンパク質の加水分解産物か、遊離アミノ酸（表３参照）か、商業用卵アルブミン加水分解産物（ＡＥＨ）か、培養参照（対照）として用いられたインキュベーション緩衝液かのいずれかからなるさまざまな溶液の存在下で２時間インキュベーションされた。培養上清は遠心分離された（２０００ｇで５分間）。遠心分離後、前記上清は回収され、前記ＲＩＡキット（ＧＡＳＫ−ＰＲ、ＣＩＳバイオインターナショナル、フランス、バニョール／セズ）を用いる放射線免疫学的解析によるＣＣＫ含有量を解析する前まで−２０°Ｃで保存された（ＳＴＣ−１細胞はガストリンを分泌しない。）。前記解析は販売業者によって提供されたプロトコルに従って実施される。前記ＳＴＣ−１細胞によって分泌された活性型のＧＬＰ−１濃度が放射線免疫学的解析キット（ＧＬＰ１Ａ−３５ＨＫ、リンコリサーチ、アメリカ合衆国ミズーリ州セントチャールズ）を用いて決定された。前記解析は販売業者によって提供されたプロトコルに従って実施された。

前記ＣＣＫ分子の分析に関する結果が図６に示され、前記細胞によって排出されたＣＣＫをピコモル／Ｌ（ｐＭ）で表記する。前記ＧＬＰ１分子の分析に関する結果が図７に示され、前記細胞によって排出されたＧＬＰ１をピコモル／Ｌ（ｐＭ）で表記する。

図６及び７において、記号＊は対照から得られた値と有意に異なる値を示す（ｔ−検定（ｐ＜０．０５））。文字（ａ、ｂ、ｃ、ｄ）は互いに有意に異なる値を示す（ｔ−検定、ｐ＜０．０５）。

前記結果は、前記ＳＴＣ−１細胞による細胞外の培地へのＣＣＫ分子及びＧＬＰ１分子の両方の分泌において、試験された別の溶液と比較して、異なる濃度の前記Ｈ１プタスダラのタンパク質の加水分解産物（体積あたりの質量の割合０．２、０．５及び１．０％）の顕著な効果を示す。

前記細胞によって放出されたＣＣＫ及びＧＬＰ１の分子の量は加水分解産物の濃度とともに顕著に増加する（図６及び７）。１．０％に濃縮された加水分解産物から得られたＣＣＫ分子の量は参照培養で得られた量よりも３０倍多かった（４．０２ｐＭのＣＣＫに対して１２２．０３ｐＭのＣＣＫそれぞれ）。１．０％のＢＳＡ又は遊離アミノ酸の存在下で得られたＣＣＫの量は、同一の濃度の加水分解産物の存在下で得られた量よりもかなり少なかった（３１．２及び８．６ｐＭそれぞれ）。同一の観察がＧＬＰ１分子の分泌に関して発見される。

これらの結果は、前記プタスダラのタンパク質の加水分解産物が前記ＳＴＣ−１細胞によるＣＣＫ及びＧＬＰ１の分子の分泌を非常に促進することができる分子を含むことを示す。ＢＳＡ溶液及び遊離アミノ酸溶液の低い促進潜在能力は、ＣＣＫ及びＧＬＰ１の分子の分泌を促進する効果がプタスダラの加水分解産物中に多く存在する「タンパク質の効果」又は遊離アミノ酸の作用のいずれかのためではないことを示す。したがって、この促進は、Ｈ１タンパク質の加水分解産物中に含まれるペプチド分子が主な原因であると考えられる。

実施例５生体内研究におけるラットでの本発明に応じるタンパク質の加水分解産物の満腹感を生じさせる効果の証明
実施例１に従って得られたＨ１加水分解産物の性質は、ラットの食物摂取と、さまざまな血液パラメーターとで評価された。食物摂取での前記加水分解産物の満腹感を生じさせる効果を証明する目的は、内分泌生理学的パラメーターによって実証した。

実験プロトコル
個体８頭の４つのグループに分けられた、体重２７５ないし２９０グラムのウィスターラットの雄３２頭（フランス、ハーラン）が、（それらから別のラットの光景を奪い、摂食を妨げないために）アルミニウムの格子によって閉じられた不透明な個別のケージに入れられる。それらは２１±１°Ｃの温度に空調され、１２時間（午後５時−午前７時）の昼夜周期の部屋に入れられる。それらは、食餌（完全食、フランスハーラン）及び水を順応期間（５日間）及び実験の最初の２週間自由に得た。

ラットの各グループは異なる強制給餌組成物で強制給餌され、グループ１は水であり、グループ２はＨ１（１日あたり５０ｍｇ）であり、グループ３はＨ１（１日あたり１００ｍｇ）であり、グループ４はＨ１（１日あたり２５０ｍｇ）である。

各ラットは、別のラットの光景が見えない個別の部屋において、水又は溶解されたＨ１加水分解産物（グループに応じて、５０、１００又は２５０ｍｇ．ｍＬ^−１）０．５ｍＬを用いてそれぞれ強制給餌される。強制給餌期間はラット１頭あたり３分間で評価され、（消費された食物の重さを量ることによって）食物摂取を測定することができるようにする場合があり、対照的に、前記完全食は強制給餌後の１０分間ラットに提供される。また同腹子は１週間あたり１回の強制給餌時間に変えられ、前記ラットは１週間に１回、月曜日に体重を量られる。

１食物摂取
等価平均質量でグループを形成するために体重を測定された後、前記ラットは実験開始前の７日間の順応期間維持される。前記実験期間は最初の週の月曜日（Ｄ１）に開始し、２週間継続する。

実験初日（Ｄ１）の朝に、前記ラットは２４時間絶食される。第２日目（Ｄ２）の朝に、前記ラットは体重を量られ、尾部末端で血液試料採取（５％ＥＤＴＡを含むチューブに採取）を受け、その後、完全食が再度それらに入手可能にされる。その後、前記血液試料採取は遠心分離され、血漿が−２０°Ｃで保管される。

４つのグループのラットは、第２日目（Ｄ２）の午後５時に胃内プローブによってそれらの強制給餌組成物それぞれを用いて最初に経口胃的に（ｏｒｏｇａｓｔｒｉｃａｌｌｙ）強制給餌される。体重を量ることによる食物摂取の最初の測定は２時間後に行う。第３日目（Ｄ３）の朝に、前記食物摂取は午前９時に実施された強制給餌前にもう一度評価され、その後、前記食物摂取の測定は３時間後にもう一度実施される。前記ラットは午後５時にもう一度強制給餌され、同時に前記食物摂取が測定され、その後、２時間後にもう一度測定される。強制給餌及び測定のこれらのステップは第５日目（Ｄ５）の晩まで実施され、月曜日（Ｄ８日目）の朝から金曜日（Ｄ１２日目）の晩まで２週間繰り返される。

２血漿ホルモン
第２週目の終わりに、前記ラットは、強制給餌３０分後、断頭によって屠殺され、血液はチューブ／５％ＥＤＴＡに試料採取される。その後、血漿の３つの分注液が以下の循環ホルモンを解析するために作成されるであろう。分注液１がＧＬＰ−１であり、分注液２がＣＣＫである。

結果
１食物摂取
図８に示された結果は、食物のグラムと、それらの最初の体重とで、実験の２週間全体にわたって前記ラットに与えられた食物の消費量を示す。値は実験期間の各グループについて得られた毎日の値の平均であり、±標準偏差で示される。＊はｐ値が０．０５未満であり、＊＊はｐ値が０．０１未満である。

したがって、前記結果は、午前９時から午後７時までＨ１を受け取ったグループ２、３及び４について得られた食物摂取に関する値が、Ｈ１を受け取らなかった参照グループ１について得られた値と比較して有意に少ないことを示す。Ｈ１加水分解産物の毎日の投与量に応じて食物摂取の減少が観察され、グループ２、３及び４で十分な違いは全くないが、前記参照グループと、別のグループ２、３、４との違いが存在する確率は、投与された加水分解産物の毎日の投与量とともに増加する。

２血漿ホルモン
ラットの血漿中のＣＣＫ濃度がペーシュ・サン・マロ・サンテ社（ＣｏｍｐａｇｎｉｅｄｅＰeｃｈｅｓＳａｉｎｔＭａｌｏ−Ｓａｎｔe）によって開発された放射線免疫学的解析によって測定された。この解析は硫酸化した活性型ＣＣＫｓに特異的抗体を用いる特殊性を有し、１９９８年に開発され（レーフェルド、１９９８）、該抗体は（ＣＣＫと比較してより多量に血漿中に存在する）ガストリンのさまざまな形状と交差しない。このプロトコルは、特に、同一の抗体を用いるＩＢＬ（ＩＢＬ、ドイツハンブルク）によって配給される解析キットから開発された。血漿中の活性型のＧＬＰ−１濃度は、前記放射線免疫学的解析キット（ＧＬＰ１Ａ−３５ＨＫ、リンコリサーチ、アメリカ合衆国ミズーリ州セントチャールズ）によって決定された。前記解析は販売業者によって提供された前記プロトコルに従って実施される。前記結果は、図９及び１０で示される。ＧＬＰ−１（図１０）及びＣＣＫ（図９）の血漿濃度が血漿のｐｍｏｌ．Ｌ−１で示される。値は各グループの平均であり、±標準偏差で示される。＊はＴ−検定でｐ値が０．０５未満であり、＊＊はＴ−検定でｐ値が０．０１未満である。図９では、同一の文字を割り当てられていない平均値は異なる。

血漿ＧＬＰ１濃度は、動物によって受け取られた加水分解産物の投与量がどんな量であっても、前記参照で得られた濃度と有意に異なることが特筆されるべきである。１日あたり１００又は２５０ｍｇのＨ１を受け取ったグループの血漿ＣＣＫ濃度は前記参照で得られた濃度と有意に異なる。この解析は食物摂取の解析と合致する。

文献目録
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Claims

魚類タンパク質の加水分解産物であって、該魚類タンパク質の加水分解産物が、ミクロメシスティウス・ポタソウ（Ｍｉｃｒｏｍｅｓｉｓｔｉｕｓｐｏｕｔａｓｓｏｕ）のタンパク質の供給源を酵素的加水分解することによって得られ、
該酵素的加水分解は、バチルス・アミロリクエファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）及びバチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）由来のエンドペプチダーゼを含む酵素混合物であるプロタメックス（登録商標）（ノボザイム社製）によって行われること、
３００Ｄａ未満の分子量の分子が２３％から３１％まで、３００Ｄａから１０００Ｄａまでの分子量の分子が３１％から３４％まで、１０００Ｄａから３０００Ｄａまでの分子量の分子が２８％から３４％まで、３０００Ｄａから５０００Ｄａまでの分子量の分子が６％から８％まで、及び、５０００Ｄａから１００００Ｄａまでの分子量の分子が２％から４％までと、
原産物の百分率として１％未満の脂質含有量と、
原産物の百分率として０．１％未満の糖質含有量と、
原産物の百分率として８０％よりも多いタンパク質含有量と、
原産物の百分率として１０％から２０％までの無機質含有量との分子プロファイル分布を有すること、及び、
コレシストキニン、すなわち、ＣＣＫｓに免疫学的に類似する分子を含むことを特徴とする、魚類タンパク質の加水分解産物。
前記魚類タンパク質の加水分解産物は、アミノ酸の総質量に関しての質量あたりの百分率として、グルタミン酸１７．４％、アスパラギン酸１１．４％、リジン１０．２％、ロイシン８．４％、アルギニン６．１％、アラニン６．８％、バリン４．７％、イソロイシン４．２％、グリシン５％、スレオニン４．５％、セリン４．４％、チロシン３．２％、フェニルアラニン３．９％、メチオニン２．５％、プロリン３．６％、ヒスチジン１．９％、システイン１％、トリプトファン０．８％のアミノ酸組成を有することを特徴とする、請求項１に記載の魚類タンパク質の加水分解産物。
魚類タンパク質の前記供給源は前記魚類の切り身から得られたすり身を含むことを特徴とする、請求項１又は２に記載の魚類タンパク質の加水分解産物。
前記魚類からすり身を回収するために、水の存在下で、ミクロメシスティウス・ポタソウ（Ｍｉｃｒｏｍｅｓｉｓｔｉｕｓｐｏｕｔａｓｓｏｕ）のタンパク質の供給源をすりつぶすステップと、
反応混合物を得るために、タンパク質の供給源に対して酵素の割合が０．０１％から２％までで、バチルス・アミロリクエファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）及びバチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）由来のエンドペプチダーゼを含む酵素混合物であるプロタメックス（登録商標）（ノボザイム社製）の添加後、１時間ないし５時間、４０°Ｃから６５°Ｃまでの温度、ｐＨ６からｐＨ９までの範囲のｐＨで前記タンパク質の供給源を酵素的加水分解するステップと、
前記反応混合物の温度を７０°Ｃを下回らないレベルに８ないし２０分間上昇させた後、前記酵素を不活性化することによって前記酵素的加水分解を停止するステップと、
前記反応混合物の残余から得られた前記タンパク質の加水分解産物を分離するステップとを含むことを特徴とする、請求項１ないし３の１つに記載の魚類タンパク質の加水分解産物の製造方法。
タンパク質供給源に対する酵素の割合が０．５％であり、前記加水分解温度は６０°Ｃであり、前記ｐＨは７．５であることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
請求項１ないし３の１つに記載の魚類タンパク質の加水分解産物を含むことを特徴とする、組成物。
請求項１ないし３の１つに記載の魚類タンパク質の加水分解産物を含むことを特徴とする、補助栄養食品。
請求項１ないし３の１つに記載の魚類タンパク質の加水分解産物を含むことを特徴とする、医薬品組成物。
肥満、２型糖尿病、高血圧、アテローム性動脈硬化症又は高コレステロール血症の治療か、循環器障害の予防かで使用するための請求項１ないし３の１つに記載の魚類タンパク質の加水分解産物。
ＣＣＫ分子及び／又はＧＬＰ１分子の分泌の促進で使用するための請求項１ないし３の１つに記載の魚類タンパク質の加水分解産物。
満腹の制御で使用するための請求項１ないし３の１つに記載の魚類タンパク質の加水分解産物。