WO2023120363A1 - 血糖値上昇抑制用組成物 - Google Patents
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Classifications
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- A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
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- C07K1/12—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by hydrolysis, i.e. solvolysis in general
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- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin or cold insoluble globulin [CIG]
Definitions
- the present invention relates to a composition for suppressing elevation of blood sugar level.
- the present invention also relates to a method for suppressing an increase in blood sugar level, and the like.
- Diabetes is a disease caused by abnormal glucose metabolism, and various complications (for example, diabetic retinopathy, diabetic nephropathy and diabetic neuropathy) are caused by pathologically elevated blood glucose levels (blood glucose concentration). It is a disease with a risk of causing disability). Appropriate control of blood sugar levels is important in preventing or improving diabetes. There is a demand for a substance that has an effect of suppressing an increase in blood sugar level and that can be used daily as a food or drink.
- Patent Document 1 describes a dipeptidyl peptidase IV inhibitor containing a collagen- or gelatin-derived peptide and a therapeutic/preventive agent for diabetes containing a dipeptidyl peptidase IV inhibitor as an active ingredient.
- Patent Document 1 does not describe the action of a chicken-derived collagen hydrolyzate and a chicken-derived peptide.
- An object of the present invention is to provide a composition for suppressing elevation of blood sugar level. Another object of the present invention is to provide a method for suppressing an increase in blood sugar level.
- the present inventors have made intensive studies in view of the above problems, and found that a collagen hydrolyzate derived from chicken and having a molecular weight of 3 to 100 kDa has a GLP-1 (glucagon-like peptide-1) secretion-promoting effect, It was found to be effective in suppressing elevation of blood sugar level.
- GLP-1 glycol-like peptide-1
- the present invention relates to, but is not limited to, the following composition for suppressing elevation of blood sugar level, method for suppressing elevation of blood sugar level, and the like.
- a composition for suppressing an increase in blood sugar level containing a collagen hydrolyzate derived from chicken and having a molecular weight of 3 to 100 kDa.
- the collagen hydrolyzate has a molecular weight of 3 to 30 kDa.
- the composition according to [1] above, wherein the collagen hydrolyzate has a molecular weight of 30 to 100 kDa.
- the trypsin-treated product obtained by treating the collagen hydrolyzate with trypsin has a peptide consisting of the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 10, and the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 10. , peptides consisting of amino acid sequences in which one or more amino acid residues are modified, the composition according to any one of [1] to [3] above.
- [7] The composition according to any one of [1] to [6] above, which is a packaged beverage.
- composition according to any one of [1] to [7] above which is for a diabetic patient or a subject at risk of developing diabetes.
- at least one selected from the group consisting of "suppressing elevation of blood glucose level” and “improving initial secretion of insulin through stimulation of GLP-1 secretion to moderate elevation of postprandial blood glucose level” The composition according to any one of [1] to [8] above, which is labeled with a function.
- a method for suppressing an increase in blood sugar level which comprises administering a chicken-derived collagen hydrolyzate having a molecular weight of 3 to 100 kDa.
- a method for promoting GLP-1 secretion which comprises administering a chicken-derived collagen hydrolyzate having a molecular weight of 3 to 100 kDa.
- a chicken-derived collagen hydrolyzate having a molecular weight of 3 to 100 kDa for suppressing an increase in blood sugar level.
- a composition for suppressing elevation of blood sugar level can be provided.
- the composition of the present invention can be used as foods, beverages, pharmaceuticals, etc. for suppressing elevation of blood sugar level. Further, according to the present invention, it is possible to provide a method for suppressing an increase in blood sugar level and the like.
- the composition for suppressing elevation of blood sugar level of the present invention contains a collagen hydrolyzate derived from chicken and having a molecular weight of 3 to 100 kDa.
- the composition for suppressing an increase in blood sugar level of the present invention usually contains a chicken-derived collagen hydrolyzate with a molecular weight of 3 to 100 kDa as an active ingredient.
- the composition for suppressing elevation of blood sugar level of the present invention is sometimes referred to as the composition of the present invention.
- the composition of the present invention is used to suppress elevation of blood sugar level.
- a chicken-derived collagen hydrolyzate with a molecular weight of 3 to 100 kDa is sometimes referred to simply as a collagen hydrolyzate of 3 to 100 kDa.
- suppression of increase in blood glucose level refers to suppression or alleviation of increase in blood glucose concentration.
- a collagen hydrolyzate derived from chicken and having a molecular weight of 3 to 100 kDa has a GLP-1 (glucagon-like peptide-1) secretagogue effect.
- GLP-1 is a gastrointestinal hormone secreted from the gastrointestinal mucosal epithelium. Actions of GLP-1 are known to include stimulation of insulin synthesis and secretion, inhibition of glucagon secretion, and reduction of hyperglycemia.
- GLP-1 is secreted when the blood glucose level rises after a meal, and promotes glucose-responsive insulin secretion via receptors expressed in pancreatic ⁇ cells. Therefore, by promoting the secretion of GLP-1, it is possible, for example, to suppress postprandial elevation of blood sugar level.
- the composition of the present invention can be used to suppress elevation of blood sugar level by promoting secretion of GLP-1.
- the composition of the present invention can be preferably used, for example, to suppress postprandial elevation of blood sugar level.
- the chicken-derived collagen hydrolyzate used in the present invention is a mixture of peptides (collagen peptides) obtained by hydrolyzing chicken collagen.
- the chicken-derived collagen hydrolyzate with a molecular weight of 3-100 kDa used in the present invention is a peptide mixture containing peptides with molecular weights in the range of 3-100 kDa and having various chain lengths.
- the chicken derived collagen hydrolyzate used in the present invention preferably has a molecular weight of 3 to 30 kDa.
- a collagen hydrolyzate with a molecular weight of 3-30 kDa has an excellent GLP-1 secretagogue effect. Therefore, when a collagen hydrolyzate with a molecular weight of 3 to 30 kDa is used, an excellent effect of suppressing elevation of blood sugar level can be obtained.
- the chicken-derived collagen hydrolyzate preferably has a molecular weight of 30 to 100 kDa, more preferably more than 30 kDa and less than or equal to 100 kDa.
- the molecular weight of the collagen hydrolyzate can be measured by ultrafiltration membrane separation. Conditions described in Examples can be adopted as conditions for ultrafiltration.
- the collagen hydrolyzate of 3 to 100 kDa one that permeates an ultrafiltration membrane with a nominal molecular weight cut off (NMWL) of 100 kDa and does not permeate an ultrafiltration membrane with an NMWL of 3 kDa can be preferably used.
- NMWL nominal molecular weight cut off
- As the collagen hydrolyzate with a molecular weight of 3 to 30 kDa it is preferable that NMWL permeate a 30 kDa ultrafiltration membrane and NMWL does not permeate a 3 kDa ultrafiltration membrane.
- the collagen hydrolyzate with a molecular weight of more than 30 kDa and less than or equal to 100 kDa it is preferable that NMWL permeate an ultrafiltration membrane of 100 kDa and that NMWL does not permeate an ultrafiltration membrane of 30 kDa.
- the collagen hydrolyzate in the present invention can preferably be obtained by heat-treating chicken collagen in a liquid.
- a hydrolyzate (heat-treated product) obtained by heat-treating collagen in a liquid is preferred.
- the heat treatment is preferably performed by heating a collagen solution obtained by mixing chicken-derived collagen with a solvent. Heating is preferably performed under high temperature and high pressure conditions (for example, 100° C. or higher and 1 atm or higher), and the heating temperature is preferably 100° C. or higher, more preferably 120° C. or higher.
- the solvent it is preferable to use water, ethanol, a mixture thereof, or the like, more preferably a solvent containing water, and even more preferably water or a mixture of water and ethanol.
- the pH of the collagen solution during heat treatment may not be adjusted, but may be adjusted. When adjusting the pH, it is preferably pH 5 to 10, more preferably pH 5 to 8.
- a solution containing collagen hydrolyzate of 3 to 100 kDa is obtained by mixing chicken-derived collagen with a solvent, heat-treating the mixture, and collecting the solvent.
- a preferable example of the method for producing a chicken-derived collagen hydrolyzate in the present invention is a method including the following steps. (1) a pretreatment step of heating chicken meat (chicken) in a liquid to remove water-soluble proteins contained therein; (2) a step of exchanging the liquid after the pretreatment and reheating the chicken (heating step); and (3) a step of filtering the obtained liquid sample containing the collagen hydrolyzate.
- the pretreatment step (1) may be a step of reducing water-soluble proteins contained in chicken meat, for example, at 100 to 160 ° C. for 30 minutes to several hours (preferably about 3 to 8 hours, more preferably). about 3 to 4 hours).
- a heating device a pressure cooker, an autoclave, or the like can be used according to the conditions.
- the heating step (2) is preferably performed at high temperature and high pressure (100° C. or higher, 1 atm or higher), for example, 100° C. or higher, more preferably 120° C. or higher.
- the heating time in the heating step (2) is preferably 30 minutes to several hours, more preferably about 3 to 7 hours.
- a heating device a pressure cooker, an autoclave, or the like can be used according to the conditions.
- the pretreatment step (1) and the heating step (2) may be continuous steps, and after the pretreatment step, the chicken may be taken out once, and the heating step may be further performed after liquid exchange. It is preferable to perform liquid exchange after the pretreatment step (1) and then perform the heating step (2), since substances that tend to precipitate can be removed.
- the heat treatment in steps (1) and (2) is preferably carried out in a liquid (solvent) in order to prevent the chicken from burning. It is preferable to use water, ethanol, a mixture thereof, or the like as the solvent.
- a solution containing a collagen hydrolyzate of 3 to 100 kDa is obtained by mixing a solvent with chicken meat, heat-treating the mixture, and collecting the solvent.
- Filtration step (3) can be carried out by a method well known to those skilled in the art, and the filtration strength may be appropriately determined according to the form of the composition. Specifically, the liquid composition (liquid sample) containing the collagen hydrolyzate of 3 to 100 kDa obtained in the above heating step is filtered, and the filtrate is recovered. A solution containing 3-100 kDa collagen hydrolyzate can be obtained as filtrate by filtration.
- the obtained solution containing the collagen hydrolyzate of 3 to 100 kDa may be used as it is as the composition of the present invention, or if necessary, it may be purified or concentrated to increase the concentration of the active ingredient. Concentration can be performed by an evaporator, freeze-drying, or the like. Furthermore, separation and purification may be performed as appropriate.
- the obtained collagen hydrolyzate is subjected to molecular weight fractionation to obtain a collagen hydrolyzate of 3 to 100 kDa, which is the active ingredient in the present invention. Ultrafiltration can be employed for molecular weight fractionation, and a desired ultrafiltration membrane may be used.
- the 3-100 kDa collagen hydrolyzate in the present invention is, for example, a trypsin-treated product obtained by treating the collagen hydrolyzate with trypsin, a peptide consisting of the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 1-10, and
- the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 10 preferably contains at least one peptide selected from the group consisting of peptides consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acid residues are modified.
- the temperature is preferably 30 to 40°C.
- the amount of trypsin solution to be added is preferably 5 to 50 ⁇ L at a trypsin concentration of 100 ng/ ⁇ L for 1 mg of collagen hydrolyzate of 3 to 100 kDa, for example.
- conditions described in Examples can be adopted as conditions for trypsin treatment.
- the trypsin-treated product obtained by treating a 3-100 kDa collagen hydrolyzate with trypsin contains at least one selected from the group consisting of peptides consisting of the amino acid sequences of any of SEQ ID NOS: 1-10. preferably included.
- the trypsinized product is at least one peptide selected from the group consisting of peptides having an amino acid sequence in which one or more amino acid residues are modified in any one of SEQ ID NOs: 1 to 10. is preferably included.
- the inclusion of the above peptide in the trypsin-treated product can be confirmed by analyzing the trypsin-treated product with LC-MS/MS.
- a trypsin-treated product obtained by treating a collagen hydrolyzate of 3 to 100 kDa with trypsin may contain peptides other than those described above.
- Modification of amino acid residues includes, for example, oxidation of amino acid residues such as proline residues, methionine residues, cysteine residues, lysine residues and arginine residues; removal of amino acid residues such as asparagine residues and glutamine residues; Amination is mentioned.
- One type of amino acid residue modification may occur in the same sequence, or two or more types may occur simultaneously.
- the above modified amino acid residue may be one or two or more in the same sequence.
- proline residues are oxidized to hydroxyproline (3-hydroxyproline or 4-hydroxyproline) residues.
- one of the multiple prolines when one or more proline residues are oxidized, one of the multiple prolines may be oxidized in the sequence, and two or more may be oxidized.
- amino acid sequences include one or more selected from the group consisting of proline residues, methionine residues, cysteine residues, lysine residues and arginine residues in any of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1 to 10 (preferably includes amino acid sequences in which one or more proline residues and/or methionine residues) are oxidized, and amino acid sequences in which one or more asparagine residues and/or glutamine residues are deaminated. Oxidation and deamination may occur simultaneously in the same sequence.
- Peptides (A1) to (A10) described in Examples below are examples of peptides consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acid residues are modified in any of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1 to 10. be done.
- the composition of the present invention can be used to prevent or ameliorate a condition or disease for which suppression of elevation of blood sugar level is effective for its prevention or amelioration.
- Such conditions or diseases include diabetes, myocardial infarction, cerebral infarction, retinopathy, renal failure, neuropathy, and the like.
- the composition of the present invention can be suitably used for prevention or improvement of diabetes.
- prevention of a condition or disease includes preventing onset, delaying onset, reducing the rate of onset, reducing risk of onset, and the like.
- Ameliorating a condition or disease includes ameliorating the subject from the condition or disease, alleviating symptoms of the condition or disease, ameliorating symptoms of the condition or disease, slowing progression of the condition or disease, preventing the condition or disease. etc.
- composition for suppressing elevation of blood sugar level of the present invention can be applied to both therapeutic use (medical use) and non-therapeutic use (non-medical use).
- Non-therapeutic is a concept that does not involve medical intervention, i.e. human surgery, treatment or diagnosis.
- the composition for suppressing elevation of blood sugar level of the present invention can be provided in the form of a drug, but is not limited to this form.
- the agent itself can be provided as a composition, or a composition containing the agent can be provided.
- the composition for suppressing elevation of blood sugar level of the present invention can also be referred to as an agent for suppressing elevation of blood sugar level.
- compositions of the invention may be either oral or parenteral.
- the compositions of the invention are preferably oral compositions.
- the composition of the present invention can be in the form of, for example, foods, beverages, pharmaceuticals, quasi-drugs, feeds, etc. Foods, beverages, or pharmaceuticals are preferred.
- the composition of the present invention can also be used by adding it to foods and beverages, pharmaceuticals, quasi-drugs, feeds, and the like.
- the form of the composition of the present invention is not particularly limited, and may be solid (for example, powder, granule, tablet, etc.), liquid, paste, or the like.
- composition of the present invention contains a collagen hydrolyzate of 3 to 100 kDa, and various diluents, acidulants, antioxidants, stabilizers, and preservatives that are acceptable as additives for foods, beverages, pharmaceuticals, etc. , fragrances, emulsifiers, pigments, seasonings, pH adjusters, nutritional enhancers, and the like may be added.
- composition of the present invention when used as a food or drink, 3 to 100 kDa collagen hydrolyzate is added with ingredients that can be used for food or drink (for example, food materials, food additives used as necessary).
- Various foods and drinks can be prepared by blending.
- Food and drink are not particularly limited, and examples thereof include general food and drink, health food, food with function claims, food for specified health use, health supplement, and food for the sick.
- Health foods, foods with function claims, foods for specified health uses, health supplements, etc. are various formulations such as liquids, fine granules, tablets, granules, powders, capsules, chewable formulations, dry syrups, and liquid diets. Can be used as a form.
- composition of the present invention When the composition of the present invention is used as a pharmaceutical or quasi-drug, a 3 to 100 kDa collagen hydrolyzate is blended with a pharmacologically acceptable carrier, an additive added as necessary, and the like. It can be used as pharmaceuticals or quasi-drugs in various dosage forms. Such carriers, additives, etc. may be those that can be used for pharmaceuticals or quasi-drugs and are pharmacologically acceptable. One or more of antioxidants, coloring agents and the like can be mentioned. Examples of administration (ingestion) forms of pharmaceuticals or quasi-drugs include oral or parenteral (transdermal, transmucosal, enteral, injection, etc.) forms of administration.
- composition of the present invention When used as a drug or quasi-drug, it is preferably an oral drug or oral quasi-drug.
- Dosage forms for oral administration include, for example, liquids, tablets, powders, fine granules, granules, dragees, capsules, suspensions, emulsions, chewables and the like.
- Dosage forms for parenteral administration include, for example, injections, drops, ointments, lotions, patches, suppositories, nasal preparations, pulmonary preparations (inhalants) and the like.
- the pharmaceutical may be a non-human veterinary pharmaceutical.
- a collagen hydrolyzate of 3 to 100 kDa may be added to the feed.
- Feed also includes feed additives. Examples of feeds include livestock feeds for cows, pigs, chickens, sheep, horses, etc.; small animal feeds for rabbits, rats, mice, etc.; pet foods for dogs, cats, small birds, etc.;
- composition of the present invention when used as a food or drink, a drug, a quasi-drug, a feed, or the like, the production method is not particularly limited. can be manufactured by
- the composition of the present invention is preferably a liquid composition, more preferably a beverage.
- the beverage may be, for example, a functional beverage.
- the form of the beverage is not particularly limited, it is preferably a packaged beverage.
- Containers for packaged beverages are not particularly limited, and containers of any shape and material may be used. For example, metal containers such as aluminum cans and steel cans; resin containers such as PET bottles; Containers; glass containers such as glass bottles; and wooden containers such as barrels. Any of commonly used containers can be used.
- a packaged beverage is obtained by filling and sealing such a container with a beverage.
- the content of the 3-100 kDa collagen hydrolyzate contained in the composition of the present invention is not particularly limited, and can be set according to its form and the like.
- the content of 3-100 kDa collagen hydrolyzate in the composition of the invention may be, for example, 0.01-90% by weight.
- the content of collagen hydrolyzate of 3 to 100 kDa in the beverage is preferably 0.01% by weight or more, and 0.04% by weight or more. is more preferable, and may be 1% by weight or less, or may be 0.1% by weight or less.
- the content of the 3-100 kDa collagen hydrolyzate may be, for example, 0.01-1% by weight, preferably 0.04-0.1% by weight. .
- the 3-100 kDa collagen hydrolyzate in the composition is quantified, for example, by separating a fraction with a molecular weight of 3-100 kDa by ultrafiltration and quantifying the fraction (for example, weighing with a balance). Is possible.
- the collagen hydrolyzate may be separated and quantified by a known method, if necessary.
- the composition of the present invention is preferably taken orally (orally administered). There is no particular limitation on the dose (which can also be referred to as intake) of the composition of the present invention.
- the dosage of the composition of the present invention may be an amount that provides an effect of suppressing elevation of blood sugar level, and may be appropriately set according to the dosage form, administration method, body weight of the subject, and the like.
- the dosage of the composition of the present invention is preferably such that the GLP-1 secretagogue effect is obtained.
- the dosage when the composition of the present invention is ingested or administered to a human (adult) subject, the dosage is preferably 10 mg or more per day as a dosage of collagen hydrolyzate of 3 to 100 kDa. , more preferably 20 mg or more, still more preferably 30 mg or more, more preferably 200 mg or less, more preferably 100 mg or less, still more preferably 70 mg or less.
- the dosage when the composition of the present invention is ingested or administered to humans (adults), the dosage is preferably 10 to 200 mg per day, preferably more than 10 to 200 mg, as a dosage of 3 to 100 kDa collagen hydrolyzate It is preferably 20 to 100 mg, more preferably 30 to 70 mg.
- the composition of the present invention may be an oral composition for ingesting or administering the above amount of collagen hydrolyzate of 3 to 100 kDa per 60 kg body weight per day to humans.
- composition of the present invention is preferably taken or administered continuously. It is expected that continuous ingestion or administration of 3-100 kDa collagen hydrolyzate will lead to higher effects.
- the composition of the present invention is preferably taken or administered continuously for one week or longer, more preferably for four weeks or longer, and even more preferably for eight weeks or longer.
- a collagen hydrolyzate derived from chicken and having a molecular weight of 3 to 100 kDa can be ingested as a food or drink, and from the viewpoint of safety, long-term ingestion is considered to have few problems.
- Subjects to whom the composition of the present invention is ingested or administered are not particularly limited. Humans or non-human mammals are preferred, and humans are more preferred.
- subjects to which the composition of the present invention is administered include subjects who need or desire suppression of elevation of blood sugar levels.
- the subject to which the composition of the present invention is administered is preferably a patient with diabetes or a subject at risk of developing diabetes.
- the composition of the present invention is preferably a composition for suppressing elevation of blood sugar levels for diabetic patients or subjects at risk of developing diabetes.
- the subject of administration of the composition of the present invention may be a healthy subject. For example, it can also be used for healthy people for the purpose of suppressing elevation of blood sugar level, preventing diabetes, and the like.
- the composition of the present invention may be labeled with a function exerted by suppressing elevation of blood sugar level or promoting GLP-1 secretion. Such indication is also called functionality indication.
- the display is not particularly limited. Such indications include, for example, “suppressing the rise in blood sugar level”, “improving the initial secretion of insulin through promotion of GLP-1 secretion and slowing the rise in postprandial blood sugar level”, and these Includes identifiable indications or functional indications.
- the composition of the present invention is preferably a food or drink labeled with one or more of the above labels.
- the above indication may be an indication that the above composition is used to obtain the above functions.
- the label may be attached to the composition itself, or may be attached to the container or packaging of the composition.
- Collagen hydrolysates with molecular weights of 3-100 kDa from chicken can be used to promote secretion of GLP-1.
- the present invention also includes a composition for promoting secretion of GLP-1, which contains as an active ingredient a chicken-derived collagen hydrolyzate with a molecular weight of 3 to 100 kDa.
- Preferred aspects of the composition for promoting secretion of GLP-1 are the same as the composition for suppressing elevation of blood sugar level of the present invention described above.
- a composition for promoting GLP-1 secretion can also be referred to as a GLP-1 secretion promoting agent.
- the invention also includes the following methods and uses.
- a method for suppressing an increase in blood sugar level comprising administering a chicken-derived collagen hydrolyzate having a molecular weight of 3 to 100 kDa.
- a method for promoting GLP-1 secretion comprising administering a chicken-derived collagen hydrolyzate having a molecular weight of 3 to 100 kDa.
- the method may be a therapeutic method or a non-therapeutic method.
- the use may be therapeutic use or non-therapeutic use.
- the 3-100 kDa collagen hydrolyzate described above can be used to suppress blood glucose elevation by promoting GLP-1 secretion.
- the subject ingest or administer a collagen hydrolyzate of 3 to 100 kDa once or more a day, for example, once to several times (for example, 2 to 3 times) a day.
- the above uses are preferably in humans or non-human mammals, more preferably in humans.
- the present invention also encompasses a method for preventing or improving diabetes, which comprises administering a chicken-derived collagen hydrolyzate with a molecular weight of 3 to 100 kDa.
- the amount of collagen hydrolyzate of 3 to 100 kDa that can obtain the effect of suppressing the elevation of blood sugar level (which can also be called an effective amount) may be used.
- the above-mentioned effective amount is preferably an amount such that a GLP-1 secretory effect can be obtained.
- the preferred dose, administration method, administration target, etc. of the 3-100 kDa collagen hydrolyzate are the same as those of the composition of the present invention described above.
- the 3-100 kDa collagen hydrolyzate may be ingested or administered as it is, or may be ingested or administered as a composition containing it.
- a composition of the invention may be ingested or administered.
- a chicken-derived collagen hydrolyzate with a molecular weight of 3 to 100 kDa is used for the production of foods and drinks, pharmaceuticals, quasi-drugs, feeds, etc. that are used to suppress blood sugar level elevation or promote GLP-1 secretion. can do.
- the present invention also includes use of a chicken-derived collagen hydrolyzate having a molecular weight of 3 to 100 kDa in the production of a composition for suppressing elevation of blood sugar level.
- the present invention also encompasses the use of chicken-derived collagen hydrolyzate with a molecular weight of 3-100 kDa in the manufacture of a composition for promoting the secretion of GLP-1.
- a chicken-derived collagen hydrolyzate of 3 to 100 kDa can be used, for example, for producing a composition for preventing or improving diabetes.
- a range represented by “1-2” means from 1 to 2 and includes 1 and 2.
- the upper limit and the lower limit may be any combination of ranges.
- ⁇ Preparation Example 1> (Preparation of BEC fraction) Chicken extract (trade name: BRAND'S Essence of Chicken (BEC), manufactured by BRAND'S Suntory) was fractionated by the following method. BEC is whole chicken hot water extract. BEC was lyophilized. 100 mg of the resulting freeze-dried product (freeze-dried BEC) was dissolved in 10 mL of water to obtain an aqueous solution.
- BEC is whole chicken hot water extract.
- BEC was lyophilized. 100 mg of the resulting freeze-dried product (freeze-dried BEC) was dissolved in 10 mL of water to obtain an aqueous solution.
- aqueous solution of lyophilized BEC was placed in an Amicon Ultra-100 kDa (nominal molecular weight cut-off: 100 kDa, Merck, Darmstadt, Germany) and centrifuged at 3500 rpm for 1 hour. After centrifugation, the supernatant was freeze-dried to obtain a dried product (Sample 1) with a molecular weight exceeding 100 kDa. The bottom layer after centrifugation was placed in Amicon Ultra-3 kDa (nominal molecular weight cut off: 3 kDa, Merck, Darmstadt, Germany) and centrifuged at 3500 rpm for 5 hours.
- the supernatant after centrifugation and the lower layer are each lyophilized, and the lyophilized supernatant is dried with a molecular weight of 3 to 100 kDa (Sample 2), and the lyophilized lower layer is dried with a molecular weight of less than 3 kDa (Sample 3). ).
- Collagenase treatment was performed as follows. 5 mg of freeze-dried BEC and 1200 units brightase-C (manufactured by Nippi Co., Ltd.) were dissolved in 0.5 mL buffer (20 mM HEPES-NaOH (pH 8.0), 30 mM NaCl, 2 mM CaCl 2 ), and placed in a reaction tube. It was kept at 37°C for 18 hours. Thereafter, the enzyme reaction was stopped by treating at 95° C. for 20 minutes and ice-cooling to obtain a collagenase-treated product (sample 4). Collagenase treatment was performed in the same manner as in the preparation of sample 4 above, but without the addition of lyophilized BEC, to obtain a collagenase control sample.
- Example 1 (GLP-1 secretagogue activity)
- the freeze-dried BEC prepared in Preparation Example 1 and Samples 1 to 4 were used as samples.
- the GLP-1 secretagogue activity of the samples was examined by the following method.
- the collagenase control sample prepared in Preparation Example 1 was also tested for GLP-1 secretion-promoting activity by the following method.
- Human enteroendocrine NCI-H716 cells were obtained from the American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). Cells were cultured (1.0 ⁇ 10 ⁇ 5 cells/20 mL) in a 75 cm 2 flask (AGC Techno Glass Co., Ltd.) at 37° C. in an air atmosphere containing 5% CO 2 .
- the medium was RPMI-1640 with L-, supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) SA (manufactured by Merck, Darmstadt, Germany) and 1% penicillin-streptomycin mixed solution (10000 units/mL penicillin, 10 mg/mL streptomycin). Glutamine (manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was used.
- FBS fetal bovine serum
- Glutamine manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
- the final concentrations of the samples are shown in Tables 1-3. Taking the GLP-1 secretion amount when no sample was added (blank) as 100%, the GLP-1 secretion promotion rate when the sample was added was calculated. The GLP-1 secretion level was measured using a GLP-1 active (high sensitivity) assay kit (manufactured by Immuno-Biological Laboratory Co., Ltd.).
- the GLP-1 secretagogue activity tests described in Tables 1 to 4 were conducted on separate days. For example, the tests shown in Table 1 were conducted on different days than the tests in Tables 2-4.
- the weight of the fractions (Samples 1-3) collected from 1 mg of lyophilized BEC was described as "corresponding to 1 mg BEC/mL".
- the GLP-1 secretory activity when exposed to 1 mg/mL BEC was 137.59% compared to Blank.
- the activity in the fractions is concentrated in the fraction with a molecular weight of 3 to 100 kDa (Sample 2), and in the fraction with a molecular weight of less than 3 kDa (Sample 3) and the fraction with a molecular weight of more than 100 kDa (Sample 1), No activity was observed.
- BEC in Table 3 is the GLP-1 secretagogue activity of the sample (lyophilized BEC) prepared in Preparation Example 1 without the addition of collagenase.
- Collagenase in Table 3 is the GLP-1 secretion-promoting activity of the sample prepared by treating with collagenase without adding BEC in Preparation Example 1 (collagenase control sample). In sample 4 in which BEC was treated with collagenase, the GLP-1 secretion-promoting activity of BEC disappeared. It was shown to be a peptide (collagen hydrolyzate).
- Example 2 (Sample processing) An aqueous solution of lyophilized BEC was placed in an Amicon Ultra-30 kDa (nominal molecular weight cut-off: 30 kDa, Merck, Darmstadt, Germany) and centrifuged at 3500 rpm for 2 hours. The supernatant after centrifugation was freeze-dried, and the freeze-dried product was used as a dried product (sample 5) with a molecular weight exceeding 30 kDa. The bottom layer after centrifugation was placed in Amicon Ultra-3 kDa (Merck, Darmstadt, Germany) and centrifuged at 3500 rpm for 5 hours. After centrifugation, the supernatant was freeze-dried to obtain a dry product (sample 6) with a molecular weight of 3 to 30 kDa.
- Amicon Ultra-30 kDa nominal molecular weight cut-off: 30 kDa, Merck, Darmstadt, Germany
- Example 3 Peptide analysis (pretreatment operation) 0.59 mg of sample 2 obtained in Preparation Example 1 (freeze-dried product of the fraction with a molecular weight of 3 to 100 kDa) was weighed and dissolved in 100 ⁇ L of water. The total amount of the dissolved solution was added to an ultrafiltration cartridge (Amicon Ultra 0.5 mL 30k), centrifuged (14,000 G, room temperature), and concentrated to about 30 ⁇ L. 100 ⁇ L of 50 mM ammonium bicarbonate was added to the concentrated sample and centrifuged (14,000 G, room temperature) to concentrate to about 30 ⁇ L. This operation was repeated three times and the concentrated solution was recovered.
- an ultrafiltration cartridge Amicon Ultra 0.5 mL 30k
- the entire amount of the filtrate was added to Amicon Ultra 0.5 mL 3k, centrifuged (14,000 G, room temperature), concentrated to about 30 ⁇ L, and the concentrated solution was recovered.
- 1 ⁇ L of 100 mM dithiothreitol solution was added to each solution after ultrafiltration and allowed to stand at 56° C. for 1 hour. After allowing to stand, 15 ⁇ L of a 550 mM iodoacetamide solution was added, and the mixture was shaken for 45 minutes while shielded from light. After adding 50 mM ammonium hydrogencarbonate to a total volume of 95 ⁇ L, 5 ⁇ L of 100 ng/ ⁇ L trypsin solution was added and allowed to stand at 37° C.
- collagen-derived peptides shown in Table 6 were contained in the trypsin-treated product obtained by treating the fraction with a molecular weight of 3 to 100 kDa with trypsin.
- the identified amino acid sequences of peptides A1-A10 are the sequences shown in Table 6, "Sequence" (SEQ ID NOs: 1-10).
- SEQ ID NOs: 1-10 The identified amino acid sequences of peptides A1-A10 are the sequences shown in Table 6, "Sequence" (SEQ ID NOs: 1-10).
- three of the prolines (P) in the sequence shown in "Sequence” were oxidized to hydroxyprolines (3-hydroxyproline or 4-hydroxyproline). That is, No.
- three of the 8th to 9th, 11th to 12th, 15th, 20th, 26th and 29th prolines (proline residues) in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 were oxidized. It is a peptide consisting of an amino acid sequence (which is hydroxyproline).
- Amino acid (amino acid residue) numbers are amino acid numbers from the N-terminus.
- Peptide A4 is a peptide consisting of an amino acid sequence in which prolines at positions 6, 12, 21 and 24 are oxidized and asparagine at position 2 is deaminated in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4.
- No. A5 peptide is a peptide consisting of an amino acid sequence in which the 12th proline is oxidized and two of the 3rd, 8th, 15th and 17th prolines are oxidized in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5. is.
- the peptide of A6 is a peptide consisting of an amino acid sequence obtained by oxidizing the 18th proline in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:6.
- the peptide of A7 is a peptide consisting of an amino acid sequence in which the third proline in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7 is oxidized and two of the 12th, 14th, and 21st to 21st prolines are oxidized. be.
- the peptide of A8 is a peptide consisting of an amino acid sequence in which four of the 3rd to 4th, 6th, 12th to 13th, 15th to 16th, and 18th prolines in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8 are oxidized. be.
- the peptide of A9 is a peptide consisting of an amino acid sequence in which three of the 3rd, 5th, 8th, 14th to 15th, and 21st prolines in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9 are oxidized. No. In the peptide of A10, in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10, the 15th, 24th and 30th prolines were oxidized, and one of the 2nd, 11th to 12th and 17th prolines was oxidized. It is a peptide consisting of an amino acid sequence.
- Peptides A1 to A5 were peptides derived from Collagen alpha-1(I) (Accession No. A0A1D5PYU1). The amino acid sequence of Collagen alpha-1(I) (Accession No. A0A1D5PYU1) is shown in SEQ ID NO:11.
- Peptides A6-A10 were derived from Collagen alpha-2(I) (Accession No. A0A5H1ZRJ7).
- the amino acid sequence of Collagen alpha-2(I) (Accession No. A0A5H1ZRJ7) is shown in SEQ ID NO:12.
- GFSGLQGPPGPPGAPGEQGPSGASGPAGPR SEQ ID NO: 1
- GPPGPMGPPGLAGPPGEAGR SEQ ID NO: 2
- GPPGSAGAAGKDGLNGLPGPIGPPGPR SEQ ID NO: 3
- GNDGAPGAAGPPGPTGPAGPPGFPGAAGAK SEQ ID NO: 4
- GSPGADGPIGAPGTPGPQGIAGQR SEQ ID NO: 5
- GETGPTGAIGPIGASGPPGPVGAAGPAGPR SEQ ID NO: 6
- GLPG IAGATGEPGPLGVSGPPGAR SEQ ID NO: 7
- VGPPGPAGITGPPGPPGPAGK SEQ ID NO: 8
- GEPGPVGPSGFAGPPGAAGQPGAK SEQ ID NO: 9
- GPSGEAGAAGPPGTPGPQGILGAPGILGLPGSRGER SEQ ID NO: 10.
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Abstract
本発明は、血糖値上昇抑制用組成物及び血糖値上昇抑制方法を提供することを目的とする。 本発明は、ニワトリ由来の、分子量が３～１００ｋＤａのコラーゲン加水分解物を含有する、血糖値上昇抑制用組成物に関する。
Description
本発明は、血糖値上昇抑制用組成物に関する。また、本発明は、血糖値上昇抑制方法等に関する。
現代社会では生活様式の変化等により、糖尿病患者又はその予備軍が増加している。糖尿病は、糖代謝の異常によって起こる疾患であり、血糖値（血液中のグルコース濃度）が病的に高まることによって、様々な合併症（例えば、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症及び糖尿病性神経障害）を引き起こす危険性のある疾患である。糖尿病の予防又は改善においては、血糖値を適切にコントロールすることが重要である。血糖値上昇抑制効果を有し、飲食品等として日常的にすることができる物質が求められている。
例えば、特許文献１には、コラーゲン又はゼラチン由来のペプチドを含有するジペプチジルペプチダーゼＩＶ阻害剤及びジペプチジルペプチダーゼＩＶ阻害剤を有効成分として含有する糖尿病治療・予防剤が記載されている。
特許文献１には、ニワトリ由来のコラーゲンの加水分解物及びニワトリ由来のペプチドの作用は記載されていない。
本発明は、血糖値上昇抑制用組成物を提供することを目的とする。また、本発明は、血糖値上昇抑制方法等を提供することを目的とする。
本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意研究した結果、ニワトリに由来する、分子量が３～１００ｋＤａであるコラーゲン加水分解物が、ＧＬＰ－１（グルカゴン様ペプチド－１）分泌促進作用を有し、血糖値の上昇抑制に有効であることを見出した。
すなわち、本発明は、これに限定されるものではないが、以下の血糖値上昇抑制用組成物、血糖値上昇抑制方法等に関する。
〔１〕ニワトリ由来の、分子量が３～１００ｋＤａのコラーゲン加水分解物を含有する、血糖値上昇抑制用組成物。
〔２〕上記コラーゲン加水分解物の分子量が、３～３０ｋＤａである、上記〔１〕に記載の組成物。
〔３〕上記コラーゲン加水分解物の分子量が、３０～１００ｋＤａである、上記〔１〕に記載の組成物。
〔４〕上記コラーゲン加水分解物をトリプシンで処理して得られるトリプシン処理物が、配列番号１～１０のいずれかのアミノ酸配列からなるペプチド、及び、配列番号１～１０のいずれかのアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸残基が修飾されたアミノ酸配列からなるペプチドからなる群より選択される少なくとも１種のペプチドを含む、上記〔１〕～〔３〕のいずれかに記載の組成物。
〔５〕ＧＬＰ－１の分泌を促進する、上記〔１〕～〔４〕のいずれかに記載の組成物。
〔６〕経口組成物である、上記〔１〕～〔５〕のいずれかに記載の組成物。
〔７〕容器詰飲料である、上記〔１〕～〔６〕のいずれかに記載の組成物。
〔８〕糖尿病の患者又は糖尿病の発症のリスクがある対象のための、上記〔１〕～〔７〕のいずれかに記載の組成物。
〔９〕「血糖値の上昇を抑制」及び「ＧＬＰ－１の分泌促進を介してインスリンの初期分泌を向上し、食後血糖値の上昇をゆるやかにする」からなる群より選択される少なくとも１の機能の表示を付した、上記〔１〕～〔８〕のいずれかに記載の組成物。
〔１０〕ニワトリ由来の、分子量が３～１００ｋＤａのコラーゲン加水分解物を投与することを含む、血糖値上昇抑制方法。
〔１１〕ニワトリ由来の、分子量が３～１００ｋＤａのコラーゲン加水分解物を投与することを含む、ＧＬＰ－１分泌促進方法。
〔１２〕ニワトリ由来の、分子量が３～１００ｋＤａのコラーゲン加水分解物の、血糖値上昇を抑制するための使用。
〔１３〕ニワトリ由来の、分子量が３～１００ｋＤａのコラーゲン加水分解物の、ＧＬＰ－１分泌を促進するための使用。
〔１〕ニワトリ由来の、分子量が３～１００ｋＤａのコラーゲン加水分解物を含有する、血糖値上昇抑制用組成物。
〔２〕上記コラーゲン加水分解物の分子量が、３～３０ｋＤａである、上記〔１〕に記載の組成物。
〔３〕上記コラーゲン加水分解物の分子量が、３０～１００ｋＤａである、上記〔１〕に記載の組成物。
〔４〕上記コラーゲン加水分解物をトリプシンで処理して得られるトリプシン処理物が、配列番号１～１０のいずれかのアミノ酸配列からなるペプチド、及び、配列番号１～１０のいずれかのアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸残基が修飾されたアミノ酸配列からなるペプチドからなる群より選択される少なくとも１種のペプチドを含む、上記〔１〕～〔３〕のいずれかに記載の組成物。
〔５〕ＧＬＰ－１の分泌を促進する、上記〔１〕～〔４〕のいずれかに記載の組成物。
〔６〕経口組成物である、上記〔１〕～〔５〕のいずれかに記載の組成物。
〔７〕容器詰飲料である、上記〔１〕～〔６〕のいずれかに記載の組成物。
〔８〕糖尿病の患者又は糖尿病の発症のリスクがある対象のための、上記〔１〕～〔７〕のいずれかに記載の組成物。
〔９〕「血糖値の上昇を抑制」及び「ＧＬＰ－１の分泌促進を介してインスリンの初期分泌を向上し、食後血糖値の上昇をゆるやかにする」からなる群より選択される少なくとも１の機能の表示を付した、上記〔１〕～〔８〕のいずれかに記載の組成物。
〔１０〕ニワトリ由来の、分子量が３～１００ｋＤａのコラーゲン加水分解物を投与することを含む、血糖値上昇抑制方法。
〔１１〕ニワトリ由来の、分子量が３～１００ｋＤａのコラーゲン加水分解物を投与することを含む、ＧＬＰ－１分泌促進方法。
〔１２〕ニワトリ由来の、分子量が３～１００ｋＤａのコラーゲン加水分解物の、血糖値上昇を抑制するための使用。
〔１３〕ニワトリ由来の、分子量が３～１００ｋＤａのコラーゲン加水分解物の、ＧＬＰ－１分泌を促進するための使用。
本発明によれば、血糖値上昇抑制用組成物を提供することができる。本発明の組成物は、血糖値上昇抑制のための飲食品、医薬品等として使用することができる。また、本発明によれば、血糖値上昇抑制方法等を提供することができる。
本発明の血糖値上昇抑制用組成物は、ニワトリ由来の、分子量が３～１００ｋＤａのコラーゲン加水分解物を含有する。
本発明の血糖値上昇抑制用組成物は、通常、ニワトリ由来の分子量が３～１００ｋＤａのコラーゲン加水分解物を有効成分として含有する。本明細書中、本発明の血糖値上昇抑制用組成物を、本発明の組成物ということもある。本発明の組成物は、血糖値上昇を抑制するために使用されるものである。本明細書中、ニワトリ由来の分子量が３～１００ｋＤａのコラーゲン加水分解物を、単に、３～１００ｋＤａのコラーゲン加水分解物ということもある。
本発明の血糖値上昇抑制用組成物は、通常、ニワトリ由来の分子量が３～１００ｋＤａのコラーゲン加水分解物を有効成分として含有する。本明細書中、本発明の血糖値上昇抑制用組成物を、本発明の組成物ということもある。本発明の組成物は、血糖値上昇を抑制するために使用されるものである。本明細書中、ニワトリ由来の分子量が３～１００ｋＤａのコラーゲン加水分解物を、単に、３～１００ｋＤａのコラーゲン加水分解物ということもある。
本発明において、血糖値上昇抑制とは、血液中のグルコース濃度の上昇を抑制又は緩和することをいう。ニワトリ由来の分子量が３～１００ｋＤａのコラーゲン加水分解物は、ＧＬＰ－１（グルカゴン様ペプチド－１）分泌促進作用を有する。ＧＬＰ－１は、消化管粘膜上皮から分泌される消化管ホルモンである。ＧＬＰ－１の作用として、インスリン合成や分泌の刺激、グルカゴン分泌の阻害、高血糖症の低減等が知られている。ＧＬＰ－１は、食後に血糖値が上がると分泌され、膵臓β細胞に発現する受容体を介したグルコース応答性インスリン分泌を促進する。このため、ＧＬＰ－１の分泌促進によって、例えば、食後における血糖値の上昇抑制を抑制することができる。
一態様において、本発明の組成物は、ＧＬＰ－１の分泌を促進することによって、血糖値上昇を抑制するために使用することができる。本発明の組成物は、例えば、食後における血糖値の上昇を抑制するために好ましく使用することができる。
本発明で使用するニワトリ由来のコラーゲン加水分解物は、ニワトリのコラーゲンを加水分解することによって得られるペプチド（コラーゲンペプチド）の混合物である。本発明で使用するニワトリ由来の分子量が３～１００ｋＤａのコラーゲン加水分解物は、分子量が３～１００ｋＤａの範囲にある、様々な鎖長を有するペプチドを含むペプチド混合物である。
一態様において、本発明で使用されるニワトリ由来のコラーゲン加水分解物の分子量は、好ましくは３～３０ｋＤａである。分子量が３～３０ｋＤａのコラーゲン加水分解物は、優れたＧＬＰ－１分泌促進作用を有する。このため、分子量が３～３０ｋＤａのコラーゲン加水分解物を使用すると、優れた血糖値上昇抑制作用を得ることができる。また、一態様において、ニワトリ由来のコラーゲン加水分解物の分子量は、３０～１００ｋＤａであることも好ましく、３０ｋＤａを超えて、１００ｋＤａ以下であることも好ましい。
コラーゲン加水分解物の分子量は、限外ろ過膜による分離で測定することができる。限外ろ過の条件は、実施例に記載の条件を採用することができる。
コラーゲン加水分解物の分子量は、限外ろ過膜による分離で測定することができる。限外ろ過の条件は、実施例に記載の条件を採用することができる。
本発明において、３～１００ｋＤａのコラーゲン加水分解物として、公称分画分子量（ＮＭＷＬ）が１００ｋＤａの限外ろ過膜を透過し、ＮＭＷＬが３ｋＤａの限外ろ過膜を透過しないものを好ましく用いることができる。分子量が３～３０ｋＤａのコラーゲン加水分解物として、ＮＭＷＬが３０ｋＤａの限外ろ過膜を透過し、ＮＭＷＬが３ｋＤａの限外ろ過膜を透過しないものが好ましい。分子量が３０～１００ｋＤａのコラーゲン加水分解物として、ＮＭＷＬが１００ｋＤａの限外ろ過膜を透過し、ＮＭＷＬが３０ｋＤａの限外ろ過膜を透過しないものが好ましい。分子量が３０ｋＤａを超えて、１００ｋＤａ以下のコラーゲン加水分解物として、ＮＭＷＬが１００ｋＤａの限外ろ過膜を透過し、ＮＭＷＬが３０ｋＤａの限外ろ過膜を透過しないものが好ましい。
本発明におけるコラーゲン加水分解物は、好ましくは、ニワトリのコラーゲンを液体中で熱処理することによって得ることができる。本発明におけるコラーゲン加水分解物として、コラーゲンを液体中で熱処理して得られる加水分解物（熱処理物）が好ましい。
ニワトリ由来のコラーゲン加水分解物を熱処理で製造する場合は、ニワトリ由来のコラーゲンに溶媒を混合したコラーゲン溶液を加熱することで、熱処理を行うことが好ましい。加熱は、高温高圧の条件（例えば、１００℃以上、１気圧以上）で行うことが好ましく、加熱温度は、１００℃以上が好ましく、１２０℃以上がより好ましい。溶媒としては、水、エタノール、又は、これらの混合物等を用いるのが好ましく、水を含む溶媒がより好ましく、水又は水とエタノールの混合物が更に好ましい。熱処理の際のコラーゲン溶液のｐＨは、調整しなくてもよいが、調整してもよい。ｐＨ調整する場合は、ｐＨ５～１０とすることが好ましく、ｐＨ５～８とすることがより好ましい。ニワトリ由来のコラーゲンに溶媒を混合して加熱処理を施し、この溶媒を採取することで、３～１００ｋＤａのコラーゲン加水分解物を含有する溶液が得られる。
本発明におけるニワトリ由来のコラーゲン加水分解物の製造方法の好ましい一例として、以下の工程を含む方法を挙げることができる。
（１）ニワトリの肉（鶏肉）を、液体中にて加熱することにより、それに含有される水溶性タンパク質を除去する前処理工程；
（２）前記前処理後に液体を交換し、鶏肉を再度加熱する工程（加熱工程）；及び
（３）得られたコラーゲン加水分解物を含有する液サンプルをろ過する工程。
（１）ニワトリの肉（鶏肉）を、液体中にて加熱することにより、それに含有される水溶性タンパク質を除去する前処理工程；
（２）前記前処理後に液体を交換し、鶏肉を再度加熱する工程（加熱工程）；及び
（３）得られたコラーゲン加水分解物を含有する液サンプルをろ過する工程。
前処理工程（１）としては、鶏肉中に含有される水溶性タンパク質を低減させる工程であればよく、例えば、１００～１６０℃で３０分～数時間（好ましくは３～８時間程度、より好ましくは３～４時間程度）ボイルすればよい。加熱装置としては、圧力鍋、オートクレーブなどを条件に合わせて用いることができる。
加熱工程（２）は、高温高圧（１００℃以上、１気圧以上）で行うことが好ましく、例えば、１００℃以上が好ましく、１２０℃以上がより好ましい。加熱工程（２）の加熱時間は３０分～数時間が好ましく、３～７時間程度がより好ましい。同様に、加熱装置としては、圧力鍋、オートクレーブなどを条件に合わせて用いることができる。
前処理工程（１）及び加熱工程（２）は、連続する工程であってもよく、前処理工程の後、一旦鶏肉を取り出し、液交換を行った後にさらに加熱工程を行ってもよい。前処理工程（１）の後に液交換を行い、その後に加熱工程（２）を行った方が、沈殿しやすい物質を除去できることから、分離して行った方が好ましい。
工程（１）及び工程（２）における加熱処理は、鶏肉の焦げを防止するため、液体（溶媒）中で行うのが好ましい。溶媒としては、水、エタノール、又は、これらの混合物等を用いるのが好ましい。鶏肉に溶媒を混合して加熱処理を施し、この溶媒を採取することで、３～１００ｋＤａのコラーゲン加水分解物を含有する溶液が得られる。
ろ過工程（３）は、組成物の形態に応じて、適宜、ろ過強度を決めればよく、当業者によく知られた方法にて行うことができる。具体的には、上記の加熱工程で得られた、３～１００ｋＤａのコラーゲン加水分解物を含有する液状組成物（液サンプル）をろ過し、ろ液を回収する。ろ過によって、３～１００ｋＤａのコラーゲン加水分解物を含有する溶液を、ろ液として得ることができる。
得られた３～１００ｋＤａのコラーゲン加水分解物を含む溶液をそのまま本発明の組成物として用いてもよいし、必要に応じて、精製又は濃縮して、有効成分濃度を高めて用いてもよい。濃縮は、エバポレーターや凍結乾燥などにより実施することができる。さらに、適宜分離精製を行ってもよい。例えば、得られたコラーゲン加水分解物を用いて分子量分画を行い、本発明における有効成分である３～１００ｋＤａのコラーゲン加水分解物を得ることができる。分子量分画として、限外ろ過を採用することができ、所望の限外ろ過膜を使用すればよい。
本発明における３～１００ｋＤａのコラーゲン加水分解物は、例えば、当該コラーゲン加水分解物をトリプシンで処理して得られるトリプシン処理物が、配列番号１～１０のいずれかのアミノ酸配列からなるペプチド、及び、配列番号１～１０のいずれかのアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸残基が修飾されたアミノ酸配列からなるペプチドからなる群より選択される少なくとも１種のペプチドを含むことが好ましい。トリプシン処理の条件は、温度が、３０～４０℃が好ましい。トリプシン溶液の添加量は、例えば、３～１００ｋＤａのコラーゲン加水分解物１ｍｇに対して、１００ｎｇ／μＬのトリプシン濃度で、５～５０μＬであることが好ましい。一態様において、トリプシン処理の条件は、実施例に記載の条件を採用することができる。一態様において、３～１００ｋＤａのコラーゲン加水分解物をトリプシンで処理して得られるトリプシン処理物は、配列番号１～１０のいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドからなる群より選択される少なくとも１種を含むことが好ましい。一態様において、上記トリプシン処理物は、配列番号１～１０のいずれかのアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸残基が修飾されたアミノ酸配列からなるペプチドからなる群より選択される少なくとも１種のペプチドを含むことが好ましい。
トリプシン処理物に上記のペプチドが含まれることは、トリプシン処理物をＬＣ－ＭＳ／ＭＳで分析することで確認することができる。３～１００ｋＤａのコラーゲン加水分解物をトリプシンで処理して得られるトリプシン処理物は、上記以外のペプチドを含んでいてもよい。
トリプシン処理物に上記のペプチドが含まれることは、トリプシン処理物をＬＣ－ＭＳ／ＭＳで分析することで確認することができる。３～１００ｋＤａのコラーゲン加水分解物をトリプシンで処理して得られるトリプシン処理物は、上記以外のペプチドを含んでいてもよい。
アミノ酸残基の修飾として、例えば、プロリン残基、メチオニン残基、システイン残基、リシン残基、アルギニン残基等のアミノ酸残基の酸化；アスパラギン残基、グルタミン残基等のアミノ酸残基の脱アミノ化が挙げられる。アミノ酸残基の修飾は、同一配列中に１種であってもよく、２種以上が同時に生じていてもよい。また、上記の修飾されたアミノ酸残基は、同一配列中に１つであってもよく、２つ以上であってもよい。例えば、プロリン残基が酸化されると、ヒドロキシプロリン（３－ヒドロキシプロリン又は４－ヒドロキシプロリン）残基になる。例えば、プロリン残基を複数含むアミノ酸配列において、１つ以上のプロリン残基が酸化されている場合、当該配列において、複数のプロリンのうちの１つが酸化されていてもよく、２つ以上が酸化されていてもよい。
配列番号１～１０のいずれかのアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸残基が修飾されたアミノ酸配列として、当該アミノ酸配列において、１以上のアミノ酸残基が酸化された、及び／又は、１以上のアミノ酸残基が脱アミノ化されたアミノ酸配列が挙げられる。このようなアミノ酸配列として、配列番号１～１０のいずれかのアミノ酸配列において、プロリン残基、メチオニン残基、システイン残基、リシン残基及びアルギニン残基からなる群より選択される１以上（好ましくは、プロリン残基及び／又はメチオニン残基の１以上）が酸化されたアミノ酸配列、アスパラギン残基及び／又はグルタミン残基の１以上が脱アミノ化されたアミノ酸配列が挙げられる。酸化、脱アミノ化は、同一配列中に同時に生じていてもよい。配列番号１～１０のいずれかのアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸残基が修飾されたアミノ酸配列からなるペプチドの一例として、後記の実施例に記載の（Ａ１）～（Ａ１０）のペプチドが挙げられる。
配列番号１～１０のいずれかのアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸残基が修飾されたアミノ酸配列として、当該アミノ酸配列において、１以上のアミノ酸残基が酸化された、及び／又は、１以上のアミノ酸残基が脱アミノ化されたアミノ酸配列が挙げられる。このようなアミノ酸配列として、配列番号１～１０のいずれかのアミノ酸配列において、プロリン残基、メチオニン残基、システイン残基、リシン残基及びアルギニン残基からなる群より選択される１以上（好ましくは、プロリン残基及び／又はメチオニン残基の１以上）が酸化されたアミノ酸配列、アスパラギン残基及び／又はグルタミン残基の１以上が脱アミノ化されたアミノ酸配列が挙げられる。酸化、脱アミノ化は、同一配列中に同時に生じていてもよい。配列番号１～１０のいずれかのアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸残基が修飾されたアミノ酸配列からなるペプチドの一例として、後記の実施例に記載の（Ａ１）～（Ａ１０）のペプチドが挙げられる。
一態様において、本発明の組成物は、血糖値の上昇抑制が、その予防又は改善に有効な状態又は疾患を予防又は改善するために使用することができる。このような状態又は疾患として、糖尿病、心筋梗塞、脳梗塞、網膜症、腎不全、神経障害等が挙げられる。一態様において、本発明の組成物は、糖尿病の予防又は改善のために好適に使用することができる。
本明細書において、状態又は疾患の予防は、発症を防止すること、発症を遅延させること、発症率を低下させること、発症のリスクを軽減すること等を包含する。状態又は疾患の改善は、対象を状態又は疾患から回復させること、状態又は疾患の症状を軽減すること、状態又は疾患の症状を好転させること、状態又は疾患の進行を遅延させること、防止すること等を包含する。
本明細書において、状態又は疾患の予防は、発症を防止すること、発症を遅延させること、発症率を低下させること、発症のリスクを軽減すること等を包含する。状態又は疾患の改善は、対象を状態又は疾患から回復させること、状態又は疾患の症状を軽減すること、状態又は疾患の症状を好転させること、状態又は疾患の進行を遅延させること、防止すること等を包含する。
本発明の血糖値上昇抑制用組成物は、治療的用途（医療用途）又は非治療的用途（非医療用途）のいずれにも適用することができる。非治療的とは、医療行為、すなわち人間の手術、治療又は診断を含まない概念である。
本発明の血糖値上昇抑制用組成物は、一例として、剤の形態で提供することができるが、本形態に限定されるものではない。当該剤をそのまま組成物として、又は、当該剤を含む組成物として提供することもできる。一態様において、本発明の血糖値上昇抑制用組成物は、血糖値上昇抑制剤ということもできる。
本発明の血糖値上昇抑制用組成物は、一例として、剤の形態で提供することができるが、本形態に限定されるものではない。当該剤をそのまま組成物として、又は、当該剤を含む組成物として提供することもできる。一態様において、本発明の血糖値上昇抑制用組成物は、血糖値上昇抑制剤ということもできる。
本発明の組成物は、経口用又は非経口用のいずれであってもよい。本発明の組成物は、好ましくは経口組成物である。本発明の組成物は、例えば、飲食品、医薬品、医薬部外品、飼料等の形態とすることができ、飲食品又は医薬品が好ましい。本発明の組成物は、飲食品、医薬品、医薬部外品、飼料等に添加して使用することもできる。本発明の組成物の形態は特に限定されず、固体状（例えば、粉末状、顆粒状、タブレット状等）、液状、ペースト状等のいずれであってもよい。
本発明の組成物は、３～１００ｋＤａのコラーゲン加水分解物を含み、更に飲食品又は医薬品等への添加物として許容されている各種の希釈剤、酸味料、抗酸化剤、安定剤、保存料、香料、乳化剤、色素類、調味料、ｐＨ調整剤、栄養強化剤等が添加されていてもよい。
例えば、本発明の組成物を飲食品とする場合、３～１００ｋＤａのコラーゲン加水分解物に、飲食品に使用可能な成分（例えば、食品素材、必要に応じて使用される食品添加物等）を配合して、種々の飲食品とすることができる。飲食品は特に限定されず、例えば、一般的な飲食品、健康食品、機能性表示食品、特定保健用食品、健康補助食品、病者用食品等が挙げられる。上記健康食品、機能性表示食品、特定保健用食品、健康補助食品等は、例えば、液剤、細粒剤、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤、チュアブル剤、ドライシロップ剤、流動食等の各種製剤形態として使用することができる。
本発明の組成物を医薬品又は医薬部外品とする場合、３～１００ｋＤａのコラーゲン加水分解物に、薬理学的に許容される担体、必要に応じて添加される添加剤等を配合して、各種剤形の医薬品又は医薬部外品とすることができる。そのような担体、添加剤等は、医薬品又は医薬部外品に使用可能な、薬理学的に許容されるものであればよく、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、抗酸化剤、着色剤等の１又は２以上が挙げられる。医薬品又は医薬部外品の投与（摂取）形態としては、経口又は非経口（経皮、経粘膜、経腸、注射等）投与の形態が挙げられる。本発明の組成物を医薬品又は医薬部外品とする場合、経口用医薬品又は経口用医薬部外品とすることが好ましい。経口投与のための剤形としては、例えば、液剤、錠剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、糖衣錠、カプセル剤、懸濁液、乳剤、チュアブル剤等が挙げられる。非経口投与のための剤形としては、例えば、注射剤、点滴剤、軟膏剤、ローション剤、貼付剤、坐剤、経鼻剤、経肺剤（吸入剤）等が挙げられる。医薬品は、非ヒト動物用医薬であってもよい。
本発明の組成物を飼料とする場合には、３～１００ｋＤａのコラーゲン加水分解物を飼料に配合すればよい。飼料には飼料添加剤も含まれる。飼料としては、例えば、牛、豚、鶏、羊、馬等に用いる家畜用飼料；ウサギ、ラット、マウス等に用いる小動物用飼料；犬、猫、小鳥等に用いるペットフードなどが挙げられる。
本発明の組成物を、例えば、飲食品、医薬品、医薬部外品、飼料等とする場合、その製造方法は特に限定されず、３～１００ｋＤａのコラーゲン加水分解物を用いて、一般的な方法により製造することができる。
一態様において、本発明の組成物は、液状組成物であることが好ましく、飲料であることがより好ましい。飲料は、例えば、機能性飲料であってよい。飲料の形態は特に限定されないが、容器詰飲料であることが好ましい。容器詰飲料の容器は特に限定されず、いずれの形態及び材質の容器を用いてもよく、例えば、アルミ缶、スチール缶等の金属製容器；ペットボトル等の樹脂製容器；紙パック等の紙容器；ガラス瓶等のガラス製容器；樽等の木製容器等の通常用いられる容器のいずれも用いることができる。このような容器に飲料を充填及び密閉することにより、容器詰飲料が得られる。
本発明の組成物に含まれる３～１００ｋＤａのコラーゲン加水分解物の含有量は特に限定されず、その形態等に応じて設定することができる。
一態様において、本発明の組成物における３～１００ｋＤａのコラーゲン加水分解物の含有量は、例えば、０．０１～９０重量％であってよい。一態様において、本発明の組成物が液状の飲料の場合、３～１００ｋＤａのコラーゲン加水分解物の含有量は、例えば、当該飲料中に０．０１重量％以上が好ましく、０．０４重量％以上がより好ましく、また、１重量％以下であってよく、０．１重量％以下であってよい。本発明の組成物が液状の飲料の場合、３～１００ｋＤａのコラーゲン加水分解物の含有量は、例えば、０．０１～１重量％であってよく、０．０４～０．１重量％が好ましい。
組成物中の３～１００ｋＤａのコラーゲン加水分解物は、例えば、限外ろ過により分子量が３～１００ｋＤａの画分を分離し、当該画分を定量（例えば、はかりによる秤量）することで、定量することが可能である。上記画分がコラーゲン加水分解物以外の成分を含む場合は、必要に応じて、公知の方法でコラーゲン加水分解物を分離し、定量すればよい。
一態様において、本発明の組成物における３～１００ｋＤａのコラーゲン加水分解物の含有量は、例えば、０．０１～９０重量％であってよい。一態様において、本発明の組成物が液状の飲料の場合、３～１００ｋＤａのコラーゲン加水分解物の含有量は、例えば、当該飲料中に０．０１重量％以上が好ましく、０．０４重量％以上がより好ましく、また、１重量％以下であってよく、０．１重量％以下であってよい。本発明の組成物が液状の飲料の場合、３～１００ｋＤａのコラーゲン加水分解物の含有量は、例えば、０．０１～１重量％であってよく、０．０４～０．１重量％が好ましい。
組成物中の３～１００ｋＤａのコラーゲン加水分解物は、例えば、限外ろ過により分子量が３～１００ｋＤａの画分を分離し、当該画分を定量（例えば、はかりによる秤量）することで、定量することが可能である。上記画分がコラーゲン加水分解物以外の成分を含む場合は、必要に応じて、公知の方法でコラーゲン加水分解物を分離し、定量すればよい。
本発明の組成物は、経口で摂取（経口投与）されることが好ましい。本発明の組成物の投与量（摂取量ということもできる）は特に限定されない。本発明の組成物の投与量は、血糖値上昇抑制効果が得られるような量であればよく、投与形態、投与方法、対象の体重等に応じて適宜設定すればよい。本発明の組成物の投与量は、ＧＬＰ－１分泌促進効果が得られるような量であることが好ましい。
一態様において、本発明の組成物をヒト（成人）を対象に摂取させる又は投与する場合、その投与量は、３～１００ｋＤａのコラーゲン加水分解物の投与量として、１日あたり、好ましくは１０ｍｇ以上、より好ましくは２０ｍｇ以上、更に好ましくは３０ｍｇ以上、また、好ましくは２００ｍｇ以下、より好ましくは１００ｍｇ以下、更に好ましくは７０ｍｇ以下である。一態様において、本発明の組成物をヒト（成人）に摂取させる又は投与する場合、投与量は、３～１００ｋＤａのコラーゲン加水分解物の投与量として、１日あたり、好ましくは１０～２００ｍｇ、より好ましくは２０～１００ｍｇ、更に好ましくは３０～７０ｍｇである。
上記量を、例えば、１日１回で、又は、数回（例えば２～３回）に分けて、摂取又は投与することが好ましい。一態様においては、上記量の３～１００ｋＤａのコラーゲン加水分解物を、経口で摂取させる又は投与することが好ましい。上記の投与量は、ヒト（成人）の場合、１日あたり体重６０ｋｇあたりの投与量であってよい。一態様において、本発明の組成物は、ヒトに、体重６０ｋｇあたり、１日あたり上記量の３～１００ｋＤａのコラーゲン加水分解物を摂取させる又は投与するための経口組成物であってよい。
上記量を、例えば、１日１回で、又は、数回（例えば２～３回）に分けて、摂取又は投与することが好ましい。一態様においては、上記量の３～１００ｋＤａのコラーゲン加水分解物を、経口で摂取させる又は投与することが好ましい。上記の投与量は、ヒト（成人）の場合、１日あたり体重６０ｋｇあたりの投与量であってよい。一態様において、本発明の組成物は、ヒトに、体重６０ｋｇあたり、１日あたり上記量の３～１００ｋＤａのコラーゲン加水分解物を摂取させる又は投与するための経口組成物であってよい。
本発明の組成物は、継続して摂取又は投与されるものであることが好ましい。３～１００ｋＤａのコラーゲン加水分解物を継続的に摂取させる又は投与することによって、より高い効果が得られることが期待される。一態様において、本発明の組成物は、好ましくは１週間以上、より好ましくは４週間以上、さらに好ましくは８週間以上継続して摂取又は投与されることが好ましい。ニワトリ由来の分子量が３～１００ｋＤａのコラーゲン加水分解物は、飲食品などとして摂取可能であり、安全性の観点から、例えば長期摂取することにも問題が少ないと考えられる。
本発明の組成物を摂取させる又は投与する対象（投与対象ということもできる）は、特に限定されない。好ましくはヒト又は非ヒト哺乳動物であり、より好ましくはヒトである。
一態様において、本発明の組成物の投与対象として、血糖値上昇抑制を必要とする又は希望する対象が挙げられる。一態様においては、本発明の組成物の投与対象として、糖尿病の患者又は糖尿病の発症のリスクがある対象が好ましい。本発明の組成物は、好ましくは、糖尿病の患者又は糖尿病の発症のリスクがある対象のための血糖値上昇抑制用組成物である。一態様において、本発明の組成物の投与対象は、健常者であってよい。例えば、血糖値上昇抑制、糖尿病の予防等を目的として、健常者に対して使用することもできる。
一態様において、本発明の組成物の投与対象として、血糖値上昇抑制を必要とする又は希望する対象が挙げられる。一態様においては、本発明の組成物の投与対象として、糖尿病の患者又は糖尿病の発症のリスクがある対象が好ましい。本発明の組成物は、好ましくは、糖尿病の患者又は糖尿病の発症のリスクがある対象のための血糖値上昇抑制用組成物である。一態様において、本発明の組成物の投与対象は、健常者であってよい。例えば、血糖値上昇抑制、糖尿病の予防等を目的として、健常者に対して使用することもできる。
本発明の組成物には、血糖値上昇抑制又はＧＬＰ－１分泌促進により発揮される機能の表示が付されていてもよい。このような表示は機能性表示ともいう。上記表示は、特に限定されない。このような表示として、例えば、「血糖値の上昇を抑制」、「ＧＬＰ－１の分泌促進を介してインスリンの初期分泌を向上し、食後血糖値の上昇をゆるやかにする」、及び、これらと同視できる表示又は機能性表示が挙げられる。
本発明の一態様において、本発明の組成物は、上記の表示が１又は２以上付された飲食品であることが好ましい。また上記の表示は、上記の機能を得るために上記組成物を用いる旨の表示であってもよい。当該表示は、組成物自体に付されてもよいし、組成物の容器又は包装に付されていてもよい。
本発明の一態様において、本発明の組成物は、上記の表示が１又は２以上付された飲食品であることが好ましい。また上記の表示は、上記の機能を得るために上記組成物を用いる旨の表示であってもよい。当該表示は、組成物自体に付されてもよいし、組成物の容器又は包装に付されていてもよい。
ニワトリ由来の分子量が３～１００ｋＤａのコラーゲン加水分解物は、ＧＬＰ－１の分泌を促進するために使用することができる。ニワトリ由来の分子量が３～１００ｋＤａのコラーゲン加水分解物を有効成分として含む、ＧＬＰ－１の分泌促進用組成物も、本発明に包含される。ＧＬＰ－１の分泌促進用組成物の好ましい態様は、上述した本発明の血糖値上昇抑制用組成物と同じである。ＧＬＰ－１分泌促進用組成物は、ＧＬＰ－１分泌促進剤ということもできる。
本発明は、以下の方法及び使用も包含する。
ニワトリ由来の、分子量が３～１００ｋＤａのコラーゲン加水分解物を投与することを含む、血糖値上昇抑制方法。
ニワトリ由来の、分子量が３～１００ｋＤａのコラーゲン加水分解物を投与することを含む、ＧＬＰ－１分泌促進方法。
ニワトリ由来の、分子量が３～１００ｋＤａのコラーゲン加水分解物の、血糖値上昇を抑制するための使用。
ニワトリ由来の、分子量が３～１００ｋＤａのコラーゲン加水分解物の、ＧＬＰ－１分泌を促進するための使用。
上記方法は、治療的な方法であってもよく、非治療的な方法であってもよい。上記使用は、治療的な使用であってもよく、非治療的な使用であってもよい。
ニワトリ由来の、分子量が３～１００ｋＤａのコラーゲン加水分解物を投与することを含む、血糖値上昇抑制方法。
ニワトリ由来の、分子量が３～１００ｋＤａのコラーゲン加水分解物を投与することを含む、ＧＬＰ－１分泌促進方法。
ニワトリ由来の、分子量が３～１００ｋＤａのコラーゲン加水分解物の、血糖値上昇を抑制するための使用。
ニワトリ由来の、分子量が３～１００ｋＤａのコラーゲン加水分解物の、ＧＬＰ－１分泌を促進するための使用。
上記方法は、治療的な方法であってもよく、非治療的な方法であってもよい。上記使用は、治療的な使用であってもよく、非治療的な使用であってもよい。
一態様において、上記の３～１００ｋＤａのコラーゲン加水分解物は、ＧＬＰ－１分泌を促進することによって、血糖値上昇を抑制するために使用することができる。
上記方法及び使用においては、１日に１回以上、例えば、１日１回～数回（例えば２～３回）、３～１００ｋＤａのコラーゲン加水分解物を対象に摂取させる又は投与することが好ましい。上記の使用は、好ましくはヒト又は非ヒト哺乳動物、より好ましくはヒトにおける使用である。ニワトリ由来の分子量が３～１００ｋＤａのコラーゲン加水分解物を投与することを含む、糖尿病の予防又は改善方法も本発明に包含される。
上記方法及び使用においては、血糖値上昇抑制効果が得られる量（有効量ということもできる）の３～１００ｋＤａのコラーゲン加水分解物を使用すればよい。上記有効量は、ＧＬＰ－１分泌効果が得られるような量であることが好ましい。３～１００ｋＤａのコラーゲン加水分解物の好ましい投与量、投与方法、投与対象等は上述した本発明の組成物と同じである。３～１００ｋＤａのコラーゲン加水分解物は、そのまま摂取又は投与してもよく、これを含む組成物として摂取又は投与してもよい。例えば、本発明の組成物を摂取又は投与してもよい。
ニワトリ由来の分子量が３～１００ｋＤａのコラーゲン加水分解物は、血糖値上昇抑制又はＧＬＰ－１の分泌促進のために使用される飲食品、医薬品、医薬部外品、飼料等の製造のために使用することができる。一態様において、本発明は、血糖値上昇抑制用組成物の製造における、ニワトリ由来の分子量が３～１００ｋＤａのコラーゲン加水分解物の使用、も包含する。本発明は、ＧＬＰ－１の分泌促進用組成物の製造における、ニワトリ由来の分子量が３～１００ｋＤａのコラーゲン加水分解物の使用、も包含する。また、ニワトリ由来の３～１００ｋＤａのコラーゲン加水分解物は、例えば、糖尿病の予防又は改善用組成物の製造のために使用することができる。
本明細書において下限値と上限値によって表されている数値範囲、即ち「下限値～上限値」は、それら下限値及び上限値を含む。例えば、「１～２」により表される範囲は、１以上２以下を意味し、１及び２を含む。本明細書において、上限及び下限は、いずれの組み合わせによる範囲としてもよい。
以下、本発明を実施例によりさらに詳しく説明するが、これにより本発明の範囲を限定するものではない。
＜調製例１＞
（ＢＥＣ分画物の準備）
チキンエキス（商品名：ＢＲＡＮＤ’Ｓ Ｅｓｓｅｎｃｅ ｏｆ Ｃｈｉｃｋｅｎ（ＢＥＣ）、ＢＲＡＮＤ’Ｓ Ｓｕｎｔｏｒｙ社製）を、下記の方法で分画した。ＢＥＣは、ニワトリ丸鶏熱水抽出液である。
ＢＥＣを凍結乾燥した。得られた凍結乾燥品（凍結乾燥ＢＥＣ）１００ｍｇを水１０ｍＬに溶解させて、水溶液を得た。
（ＢＥＣ分画物の準備）
チキンエキス（商品名：ＢＲＡＮＤ’Ｓ Ｅｓｓｅｎｃｅ ｏｆ Ｃｈｉｃｋｅｎ（ＢＥＣ）、ＢＲＡＮＤ’Ｓ Ｓｕｎｔｏｒｙ社製）を、下記の方法で分画した。ＢＥＣは、ニワトリ丸鶏熱水抽出液である。
ＢＥＣを凍結乾燥した。得られた凍結乾燥品（凍結乾燥ＢＥＣ）１００ｍｇを水１０ｍＬに溶解させて、水溶液を得た。
凍結乾燥ＢＥＣの水溶液を、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１００ ｋＤａ（公称分画分子量：１００ｋＤａ、メルク社製、ダルムシュタット、ドイツ）に入れ、３５００ｒｐｍで１時間遠心分離した。遠心分離後の上清は凍結乾燥し、分子量が１００ｋＤａを超えるものの乾固物（サンプル１）とした。
遠心分離後の下層は、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－３ ｋＤａ（公称分画分子量：３ｋＤａ、メルク社製、ダルムシュタット、ドイツ）に入れ、３５００ｒｐｍで５時間遠心分離した。遠心分離後の上清、下層をそれぞれ凍結乾燥し、上清の凍結乾燥物を分子量３～１００ｋＤａの乾固物（サンプル２）、下層の凍結乾燥物を分子量３ｋＤａ未満の乾固物（サンプル３）とした。
遠心分離後の下層は、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－３ ｋＤａ（公称分画分子量：３ｋＤａ、メルク社製、ダルムシュタット、ドイツ）に入れ、３５００ｒｐｍで５時間遠心分離した。遠心分離後の上清、下層をそれぞれ凍結乾燥し、上清の凍結乾燥物を分子量３～１００ｋＤａの乾固物（サンプル２）、下層の凍結乾燥物を分子量３ｋＤａ未満の乾固物（サンプル３）とした。
（コラゲナーゼ処理物の作製）
コラゲナーゼ処理は、以下のように行った。５ｍｇ－凍結乾燥ＢＥＣと１２００ ｕｎｉｔｓ ｂｒｉｇｈｔａｓｅ－Ｃ（（株）ニッピ製）を、０．５ｍＬバッファー（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ（ｐＨ８．０），３０ｍＭ ＮａＣｌ，２ｍＭ ＣａＣｌ２）に溶解し、反応チューブ内で３７℃、１８時間保温した。その後、９５℃、２０分間処理し氷冷することで酵素反応を停止させ、コラゲナーゼ処理物（サンプル４）を得た。
上記のサンプル４の調製において、凍結乾燥ＢＥＣを添加しない以外は同じ方法でコラゲナーゼ処理を行い、コラゲナーゼの対照サンプルを得た。
コラゲナーゼ処理は、以下のように行った。５ｍｇ－凍結乾燥ＢＥＣと１２００ ｕｎｉｔｓ ｂｒｉｇｈｔａｓｅ－Ｃ（（株）ニッピ製）を、０．５ｍＬバッファー（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ（ｐＨ８．０），３０ｍＭ ＮａＣｌ，２ｍＭ ＣａＣｌ２）に溶解し、反応チューブ内で３７℃、１８時間保温した。その後、９５℃、２０分間処理し氷冷することで酵素反応を停止させ、コラゲナーゼ処理物（サンプル４）を得た。
上記のサンプル４の調製において、凍結乾燥ＢＥＣを添加しない以外は同じ方法でコラゲナーゼ処理を行い、コラゲナーゼの対照サンプルを得た。
＜実施例１＞
（ＧＬＰ－１分泌促進活性）
調製例１で作製した凍結乾燥ＢＥＣ及びサンプル１～４をサンプルとして用いた。サンプルのＧＬＰ－１分泌促進活性を、下記の方法で調べた。調製例１で作製したコラゲナーゼの対照サンプルについても、下記の方法でＧＬＰ－１分泌促進活性を調べた。
ヒト腸内分泌ＮＣＩ－Ｈ７１６細胞はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，ＵＳＡ）より入手した。細胞を７５ｃｍ２フラスコ（ＡＧＣテクノグラス（株））、３７℃、５％ＣＯ２を含む空気雰囲気で培養した（１．０×１０＾５ｃｅｌｌｓ／２０ｍＬ）。培地は、１０％牛胎児血清（ＦＢＳ）ＳＡ（メルク社製、ダルムシュタット、ドイツ）、及び１％ペニシリン－ストレプトマイシン混合溶液（１００００ｕｎｉｔｓ／ｍＬ ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ，１０ｍｇ／ｍＬ ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）を添加したＲＰＭＩ－１６４０ ｗｉｔｈ Ｌ－Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（富士フイルム和光純薬（株）製）を使用した。
（ＧＬＰ－１分泌促進活性）
調製例１で作製した凍結乾燥ＢＥＣ及びサンプル１～４をサンプルとして用いた。サンプルのＧＬＰ－１分泌促進活性を、下記の方法で調べた。調製例１で作製したコラゲナーゼの対照サンプルについても、下記の方法でＧＬＰ－１分泌促進活性を調べた。
ヒト腸内分泌ＮＣＩ－Ｈ７１６細胞はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，ＵＳＡ）より入手した。細胞を７５ｃｍ２フラスコ（ＡＧＣテクノグラス（株））、３７℃、５％ＣＯ２を含む空気雰囲気で培養した（１．０×１０＾５ｃｅｌｌｓ／２０ｍＬ）。培地は、１０％牛胎児血清（ＦＢＳ）ＳＡ（メルク社製、ダルムシュタット、ドイツ）、及び１％ペニシリン－ストレプトマイシン混合溶液（１００００ｕｎｉｔｓ／ｍＬ ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ，１０ｍｇ／ｍＬ ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）を添加したＲＰＭＩ－１６４０ ｗｉｔｈ Ｌ－Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（富士フイルム和光純薬（株）製）を使用した。
試験３日前に、高グルコースＤＭＥＭ（Ｗｉｔｈ ４５００ｍｇ／Ｌ ｇｌｕｃｏｓｅ，Ｌ－ｇｌｕｔａｍｉｎｅ，ｓｏｄｉｕｍ ｐｙｒｕｖａｔｅ， ａｎｄ ｓｏｄｉｕｍ ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ， ｌｉｑｕｉｄ， ｓｔｅｒｉｌｅ－ｆｉｌｔｅｒｅｄ， ｓｕｉｔａｂｌｅ ｆｏｒ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ）、１０％ＦＢＳ、１％ペニシリン－ストレプトマイシン混合溶液（１００００ｕｎｉｔｓ／ｍＬ ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ，１０ｍｇ／ｍＬ ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）を含む９６ウェル培養プレートに５．０×１０＾５個の細胞を播種し、試験当日に培地上清をＢｕｆｆｅｒ（Ｄ－ＰＢＳ ｗｉｔｈｏｕｔ Ｃａ ａｎｄ Ｍｇ）にて置換し、３７℃で１時間インキュベートした。この際、サンプルをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に溶解させ、細胞に暴露した。サンプルの最終濃度を表１～３に示す。サンプル無添加時（Ｂｌａｎｋ）のＧＬＰ－１分泌量を１００％とし、サンプル添加時のＧＬＰ－１分泌促進率を算出した。ＧＬＰ－１分泌量は、ＧＬＰ－１活性型（高感度）アッセイキット（（株）免疫生物研究所製）を使用して測定した。
ＢＥＣのＧＬＰ－１分泌促進活性（Ｎ＝５）を、表１に示す。表１及び後記の表２～４には、平均及び標準誤差（ＳＥＭ）を示した。ＮＣＩ－Ｈ７１６細胞におけるＧＬＰ－１分泌量は、５４．１１±４．８３ｐＭ（Ｂｌａｎｋ）だった。一方、ＢＥＣに暴露されたＮＣＩ－Ｈ７１６細胞におけるＧＬＰ－１分泌量は、添加量に比例して増加した。このことから、ＢＥＣは小腸下部の腸内分泌細胞であるＬ細胞に作用し、ＧＬＰ－１の分泌量を上昇させることが示唆された。
なお、表１～４の各表に記載のＧＬＰ－１分泌促進活性の試験は、それぞれ別の日に実施した。例えば、表１に示す試験は、表２～４の試験とは別の日に実施した。
なお、表１～４の各表に記載のＧＬＰ－１分泌促進活性の試験は、それぞれ別の日に実施した。例えば、表１に示す試験は、表２～４の試験とは別の日に実施した。
ＢＥＣ分画物のＧＬＰ－１分泌促進活性（Ｎ＝５）を表２に示す。サンプル濃度について、凍結乾燥ＢＥＣ１ｍｇから回収した分画物（サンプル１～３）の重量を、「ＢＥＣ １ｍｇ／ｍＬ相当」と記載した。
１ｍｇ／ｍＬのＢＥＣを暴露した際のＧＬＰ－１分泌活性は、Ｂｌａｎｋと比較して１３７．５９％であった。一方、分画物における活性は、分子量３～１００ｋＤａ分画物（サンプル２）に集中しており、分子量３ｋＤａ未満の分画物（サンプル３）と１００ｋＤａを超える分画物（サンプル１）には活性が見られなかった。この結果より、ＢＥＣが持つＮＣＩ－Ｈ７１６細胞におけるＧＬＰ－１分泌促進活性は、分子量３～１００ｋＤａ分画物に集中しており、分子量３～１００ｋＤａの画分が活性本体であることが示唆された。
１ｍｇ／ｍＬのＢＥＣを暴露した際のＧＬＰ－１分泌活性は、Ｂｌａｎｋと比較して１３７．５９％であった。一方、分画物における活性は、分子量３～１００ｋＤａ分画物（サンプル２）に集中しており、分子量３ｋＤａ未満の分画物（サンプル３）と１００ｋＤａを超える分画物（サンプル１）には活性が見られなかった。この結果より、ＢＥＣが持つＮＣＩ－Ｈ７１６細胞におけるＧＬＰ－１分泌促進活性は、分子量３～１００ｋＤａ分画物に集中しており、分子量３～１００ｋＤａの画分が活性本体であることが示唆された。
表３に、ＢＥＣコラゲナーゼ処理物（サンプル４）のＧＬＰ－１分泌促進活性（Ｎ＝５）を示す。表３の「ＢＥＣ」は、調製例１でコラゲナーゼを添加せず調製したサンプル（凍結乾燥ＢＥＣ）のＧＬＰ－１分泌促進活性である。表３の「コラゲナーゼ」は、調製例１でＢＥＣを添加せずにコラゲナーゼ処理して調製したサンプル（コラゲナーゼの対照サンプル）のＧＬＰ－１分泌促進活性である。ＢＥＣをコラゲナーゼ処理したサンプル４ではＢＥＣのＧＬＰ－１分泌促進活性が消失したことから、ＢＥＣの活性本体であるＧＬＰ－１分泌促進活性を示す成分は、コラーゲンが加水分解された分子量３～１００ｋＤａのペプチド（コラーゲン加水分解物）であることが示された。
＜実施例２＞
（サンプル処理）
凍結乾燥ＢＥＣの水溶液を、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－３０ ｋＤａ（公称分画分子量：３０ｋＤａ、メルク社製、ダルムシュタット、ドイツ）に入れ、３５００ｒｐｍで２時間遠心分離した。
遠心分離後の上清は凍結乾燥し、凍結乾燥物を分子量が３０ｋＤａを超える乾固物（サンプル５）とした。
遠心分離後の下層は、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－３ ｋＤａ（メルク社製、ダルムシュタット、ドイツ）に入れ、３５００ｒｐｍで５時間遠心分離した。遠心分離後の上清を凍結乾燥し、凍結乾燥物を分子量３～３０ｋＤａの乾固物（サンプル６）とした。
（サンプル処理）
凍結乾燥ＢＥＣの水溶液を、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－３０ ｋＤａ（公称分画分子量：３０ｋＤａ、メルク社製、ダルムシュタット、ドイツ）に入れ、３５００ｒｐｍで２時間遠心分離した。
遠心分離後の上清は凍結乾燥し、凍結乾燥物を分子量が３０ｋＤａを超える乾固物（サンプル５）とした。
遠心分離後の下層は、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－３ ｋＤａ（メルク社製、ダルムシュタット、ドイツ）に入れ、３５００ｒｐｍで５時間遠心分離した。遠心分離後の上清を凍結乾燥し、凍結乾燥物を分子量３～３０ｋＤａの乾固物（サンプル６）とした。
（活性確認）
サンプルのＧＬＰ－１分泌促進活性の測定を、実施例１と同様の方法で実施した。表４に結果を示す。サンプル濃度について、凍結乾燥ＢＥＣ１ｍｇから回収した分画物（サンプル５～６）の重量を、「ＢＥＣ １ｍｇ／ｍＬ相当」と記載した。
サンプルのＧＬＰ－１分泌促進活性の測定を、実施例１と同様の方法で実施した。表４に結果を示す。サンプル濃度について、凍結乾燥ＢＥＣ１ｍｇから回収した分画物（サンプル５～６）の重量を、「ＢＥＣ １ｍｇ／ｍＬ相当」と記載した。
ＢＥＣから得た分子量３～３０ｋＤａの画分、及び、分子量が３０ｋＤａを超えて１００ｋＤａ以下の画分のいずれにもＧＬＰ－１分泌促進活性があることを確認した。また、ＢＥＣの活性画分である分子量３～１００ｋＤａの画分に含まれるコラーゲン加水分解物のうち、分子量３～３０ｋＤａの画分のコラーゲン加水分解物の活性がやや強いことを確認した。
＜実施例３＞
ペプチド解析
（前処理操作）
調製例１で得たサンプル２（分子量３～１００ｋＤａの画分の凍結乾燥品）を０．５９ｍｇ秤量し、水１００μＬで溶解させた。溶解後溶液を限外ろ過カートリッジ（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ ０．５ｍＬ ３０ｋ）に全量添加し、遠心分離（１４，０００Ｇ、室温）を行い、約３０μＬまで濃縮した。濃縮したサンプルに５０ｍＭ炭酸水素アンモニウムを１００μＬ添加し、遠心分離（１４，０００Ｇ、室温）を行い、約３０μＬまで濃縮した。この操作を３回繰り返し、濃縮した溶液を回収した。さらに、ろ液をＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ ０．５ｍＬ ３ｋに全量添加し、遠心分離（１４，０００Ｇ、室温）を行い、約３０μＬまで濃縮し、濃縮した溶液を回収した。各限外ろ過後の溶液に１００ｍＭジチオトレイトール溶液１μＬを添加して５６℃で１時間静置した。静置後５５０ｍＭヨードアセトアミド溶液１５μＬを添加し、遮光状態で４５分間振とうした。５０ｍＭ炭酸水素アンモニウムを全量９５μＬになるように加えた後１００ｎｇ／μＬトリプシン溶液を５μＬ添加して３７℃で一晩静置し、トリプシン処理物を得た。トリプシン処理物に、１０％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）溶液を１μＬ添加した。調製後サンプルをＭｏｎｏＳｐｉｎ Ｃ１８（ＧＬ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）にアプライし０．１％ＴＦＡ溶液で洗浄後、０．１％ＴＦＡ含有６０％アセトニトリル溶液で溶出した。溶出液をＳｐｅｅｄＶａｃにより減圧乾固し、０．１％ギ酸含有２％アセトニトリル溶液１００μＬに再溶解後、０．２２μｍフィルターでろ過したろ液をバイアルに移し、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ試料とした。
ペプチド解析
（前処理操作）
調製例１で得たサンプル２（分子量３～１００ｋＤａの画分の凍結乾燥品）を０．５９ｍｇ秤量し、水１００μＬで溶解させた。溶解後溶液を限外ろ過カートリッジ（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ ０．５ｍＬ ３０ｋ）に全量添加し、遠心分離（１４，０００Ｇ、室温）を行い、約３０μＬまで濃縮した。濃縮したサンプルに５０ｍＭ炭酸水素アンモニウムを１００μＬ添加し、遠心分離（１４，０００Ｇ、室温）を行い、約３０μＬまで濃縮した。この操作を３回繰り返し、濃縮した溶液を回収した。さらに、ろ液をＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ ０．５ｍＬ ３ｋに全量添加し、遠心分離（１４，０００Ｇ、室温）を行い、約３０μＬまで濃縮し、濃縮した溶液を回収した。各限外ろ過後の溶液に１００ｍＭジチオトレイトール溶液１μＬを添加して５６℃で１時間静置した。静置後５５０ｍＭヨードアセトアミド溶液１５μＬを添加し、遮光状態で４５分間振とうした。５０ｍＭ炭酸水素アンモニウムを全量９５μＬになるように加えた後１００ｎｇ／μＬトリプシン溶液を５μＬ添加して３７℃で一晩静置し、トリプシン処理物を得た。トリプシン処理物に、１０％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）溶液を１μＬ添加した。調製後サンプルをＭｏｎｏＳｐｉｎ Ｃ１８（ＧＬ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）にアプライし０．１％ＴＦＡ溶液で洗浄後、０．１％ＴＦＡ含有６０％アセトニトリル溶液で溶出した。溶出液をＳｐｅｅｄＶａｃにより減圧乾固し、０．１％ギ酸含有２％アセトニトリル溶液１００μＬに再溶解後、０．２２μｍフィルターでろ過したろ液をバイアルに移し、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ試料とした。
（測定条件）
ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ条件
使用装置：
ダイレクトフローｎａｎｏＬＣシステム Ｅａｓｙ－ｎＬＣ １０００ＴＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）
トラップカラム：Ａｃｃｌａｉｍ ＰｅｐＭａｐ（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）
分析力ラム：ＮＡＮＯ ＨＰＬＣ ＣＡＰＩＬＬＡＲＹ ＣＯＬＵＭＮ（日京テクノス（株））
液体クロマトグラフ質量分析計 Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ Ｐｌｕｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）
ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ条件
使用装置：
ダイレクトフローｎａｎｏＬＣシステム Ｅａｓｙ－ｎＬＣ １０００ＴＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）
トラップカラム：Ａｃｃｌａｉｍ ＰｅｐＭａｐ（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）
分析力ラム：ＮＡＮＯ ＨＰＬＣ ＣＡＰＩＬＬＡＲＹ ＣＯＬＵＭＮ（日京テクノス（株））
液体クロマトグラフ質量分析計 Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ Ｐｌｕｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）
移動相
Ａ液：０．１％ギ酸溶液
Ｂ液：０．１％ギ酸含有アセトニトリル溶液
流速：３００ｎＬ／ｍｉｎ
グラジエント：０－２０％Ｂ／０－８０ｍｉｎ、２０－４５％Ｂ／８０－１１０ｍｉｎ、４５－９５％Ｂ／１１０－１１１ｍｉｎ、９５％Ｂ／１１１－１２０ｍｉｎ
イオン化モード：ＥＳＩ Ｐｏｓｉｔｉｖｅ
測定範囲：ｍ／ｚ ３５０－１４５０
測定モード：Ｄａｔａ Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｓｃａｎ
注入：２μＬ
Ａ液：０．１％ギ酸溶液
Ｂ液：０．１％ギ酸含有アセトニトリル溶液
流速：３００ｎＬ／ｍｉｎ
グラジエント：０－２０％Ｂ／０－８０ｍｉｎ、２０－４５％Ｂ／８０－１１０ｍｉｎ、４５－９５％Ｂ／１１０－１１１ｍｉｎ、９５％Ｂ／１１１－１２０ｍｉｎ
イオン化モード：ＥＳＩ Ｐｏｓｉｔｉｖｅ
測定範囲：ｍ／ｚ ３５０－１４５０
測定モード：Ｄａｔａ Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｓｃａｎ
注入：２μＬ
（解析条件）
解析ソフトウェア：Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ ２．５（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）
検索エンジン：Ｍａｓｃｏｔ ２．７．０（Ｍａｔｒｉｘ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．）
データーベース：ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ
生物種：Ｇａｌｌｕｓ Ｇａｌｌｕｓ
検索条件：
Ｅｎｚｙｍｅ：Ｔｒｙｐｓｉｎ
Ｎｏｎｅ（酵素条件指定なし）
Ｓｔａｔｉｃ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｃａｒｂａｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ（Ｃ）
Ｄｙｎａｍｉｃ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｏｘｉｄａｔｉｏｎ（Ｍ），Ｏｘｉｄａｔｉｏｎ（Ｐ），Ｄｅａｍｉｄａｔｅ（Ｎ，Ｑ）
Ｍａｓｓ Ｖａｌｕｅ：Ｍｏｎｏｉｓｏｔｏｐｉｃ
Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｍａｓｓ Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ：±１０ｐｐｍ
Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｍａｓｓ Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ：±０．０２Ｄａ
Ｍａｘ Ｍｉｓｓｅｄ Ｃｌｅａｖａｇｅｓ：１（Ｅｎｚｙｍｅ Ｔｒｙｐｓｉｎ）、０（Ｅｎｚｙｍｅ Ｎｏｎｅ）
Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｔｙｐｅ：ＥＳＩ－ＴＲＡＰ
解析ソフトウェア：Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ ２．５（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）
検索エンジン：Ｍａｓｃｏｔ ２．７．０（Ｍａｔｒｉｘ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．）
データーベース：ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ
生物種：Ｇａｌｌｕｓ Ｇａｌｌｕｓ
検索条件：
Ｅｎｚｙｍｅ：Ｔｒｙｐｓｉｎ
Ｎｏｎｅ（酵素条件指定なし）
Ｓｔａｔｉｃ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｃａｒｂａｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ（Ｃ）
Ｄｙｎａｍｉｃ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｏｘｉｄａｔｉｏｎ（Ｍ），Ｏｘｉｄａｔｉｏｎ（Ｐ），Ｄｅａｍｉｄａｔｅ（Ｎ，Ｑ）
Ｍａｓｓ Ｖａｌｕｅ：Ｍｏｎｏｉｓｏｔｏｐｉｃ
Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｍａｓｓ Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ：±１０ｐｐｍ
Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｍａｓｓ Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ：±０．０２Ｄａ
Ｍａｘ Ｍｉｓｓｅｄ Ｃｌｅａｖａｇｅｓ：１（Ｅｎｚｙｍｅ Ｔｒｙｐｓｉｎ）、０（Ｅｎｚｙｍｅ Ｎｏｎｅ）
Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｔｙｐｅ：ＥＳＩ－ＴＲＡＰ
（解析結果）
ショットガン解析を実施した。測定データをトリプシン消化条件及び酵素条件指定なしでそれぞれ解析を行った結果、主要なタンパク質として、表５に示すＣｏｌｌａｇｅｎ、Ｍｙｏｓｉｎ、Ａｃｔｉｎ等が共通して同定された。また、酵素条件指定なしの解析結果においてトリプシン消化以外の要因で切断されたと考えられるペプチドが確認された。
ショットガン解析を実施した。測定データをトリプシン消化条件及び酵素条件指定なしでそれぞれ解析を行った結果、主要なタンパク質として、表５に示すＣｏｌｌａｇｅｎ、Ｍｙｏｓｉｎ、Ａｃｔｉｎ等が共通して同定された。また、酵素条件指定なしの解析結果においてトリプシン消化以外の要因で切断されたと考えられるペプチドが確認された。
また、分子量３～１００ｋＤａの画分をトリプシン処理したトリプシン処理物に、表６に示すコラーゲン由来のペプチドが含まれることが分かった。
表６中、“Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ”は、“Ｓｅｑｕｅｎｃｅ”に示すアミノ酸配列における修飾を示す。配列の両端の［ ］内のアミノ酸は、Ｍａｓｔｅｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ａ０Ａ１Ｄ５ＰＹＵ１のタンパク質又はＡｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ａ０Ａ５Ｈ１ＺＲＪ７のタンパク質）中の当該配列のアミノ末端側のアミノ酸及びカルボキシル末端側のアミノ酸を示す。
表６中、“Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ”における“Ｏｘｉｄａｔｉｏｎ”［Ｐ］は、プロリンが酸化されていることを示し、“Ｏｘｉｄａｔｉｏｎ”［Ｍ］はメチオニンが酸化されていることを示す。
“Ｄｅａｍｉｄａｔｅｄ”［Ｎ］は、アスパラギンが脱アミノ化されていることを示す。“Ｏｘｉｄａｔｉｏｎ”及び“Ｄｅａｍｉｄａｔｅｄ”の前の数字は、ペプチド中の酸化されたアミノ酸残基の数であり、「Ｐ」、「Ｍ」及び「Ｎ」の後ろの数字は、アミノ酸配列中のアミノ酸の番号を示す。
“Ｄｅａｍｉｄａｔｅｄ”［Ｎ］は、アスパラギンが脱アミノ化されていることを示す。“Ｏｘｉｄａｔｉｏｎ”及び“Ｄｅａｍｉｄａｔｅｄ”の前の数字は、ペプチド中の酸化されたアミノ酸残基の数であり、「Ｐ」、「Ｍ」及び「Ｎ」の後ろの数字は、アミノ酸配列中のアミノ酸の番号を示す。
Ｎｏ．Ａ１～Ａ１０のペプチドの同定されたアミノ酸配列は表６の“Ｓｅｑｕｅｎｃｅ”に示す配列である（配列番号１～１０）。
Ｎｏ．Ａ１のペプチドでは、“Ｓｅｑｕｅｎｃｅ”に示す配列中のプロリン（Ｐ）のうちの３つが酸化されてヒドロキシプロリン（３－ヒドロキシプロリン又は４－ヒドロキシプロリン）となっていた。つまり、Ｎｏ．Ａ１のペプチドは、配列番号１に示すアミノ酸配列において、８～９番目、１１～１２番目、１５番目、２０番目、２６番目及び２９番目のプロリン（プロリン残基）のうちの３つが酸化された（ヒドロキシプロリンである）アミノ酸配列からなるペプチドである。アミノ酸（アミノ酸残基）の番号は、Ｎ末端からのアミノ酸番号である。
Ｎｏ．Ａ１のペプチドでは、“Ｓｅｑｕｅｎｃｅ”に示す配列中のプロリン（Ｐ）のうちの３つが酸化されてヒドロキシプロリン（３－ヒドロキシプロリン又は４－ヒドロキシプロリン）となっていた。つまり、Ｎｏ．Ａ１のペプチドは、配列番号１に示すアミノ酸配列において、８～９番目、１１～１２番目、１５番目、２０番目、２６番目及び２９番目のプロリン（プロリン残基）のうちの３つが酸化された（ヒドロキシプロリンである）アミノ酸配列からなるペプチドである。アミノ酸（アミノ酸残基）の番号は、Ｎ末端からのアミノ酸番号である。
Ｎｏ．Ａ２のペプチドは、配列番号２に示すアミノ酸配列において、２～３番目、５番目、８～９番目及び１４～１５番目のプロリンのうちの３つが酸化され、かつ、６番目のメチオニンが酸化されたアミノ酸配列からなるペプチドである。
Ｎｏ．Ａ３のペプチドは、配列番号３に示すアミノ酸配列において、２～３番目、１８番目、２０番目、２３～２４番目及び２６番目のプロリンのうちの４つが酸化され、かつ、１５番目のアスパラギンが脱アミノ化されたアミノ酸配列からなるペプチドである。
Ｎｏ．Ａ４のペプチドは、配列番号４に示すアミノ酸配列において、６番目、１２番目、２１番目及び２４番目のプロリンが酸化され、かつ、２番目のアスパラギンが脱アミノ化されたアミノ酸配列からなるペプチドである。
Ｎｏ．Ａ５のペプチドは、配列番号５に示すアミノ酸配列において、１２番目のプロリンが酸化され、かつ、３番目、８番目、１５番目及び１７番目のプロリンのうちの２つが酸化されたアミノ酸配列からなるペプチドである。
Ｎｏ．Ａ３のペプチドは、配列番号３に示すアミノ酸配列において、２～３番目、１８番目、２０番目、２３～２４番目及び２６番目のプロリンのうちの４つが酸化され、かつ、１５番目のアスパラギンが脱アミノ化されたアミノ酸配列からなるペプチドである。
Ｎｏ．Ａ４のペプチドは、配列番号４に示すアミノ酸配列において、６番目、１２番目、２１番目及び２４番目のプロリンが酸化され、かつ、２番目のアスパラギンが脱アミノ化されたアミノ酸配列からなるペプチドである。
Ｎｏ．Ａ５のペプチドは、配列番号５に示すアミノ酸配列において、１２番目のプロリンが酸化され、かつ、３番目、８番目、１５番目及び１７番目のプロリンのうちの２つが酸化されたアミノ酸配列からなるペプチドである。
Ｎｏ．Ａ６のペプチドは、配列番号６に示すアミノ酸配列において、１８番目のプロリンが酸化されたアミノ酸配列からなるペプチドである。
Ｎｏ．Ａ７のペプチドは、配列番号７に示すアミノ酸配列において、３番目のプロリンが酸化され、かつ、１２番目、１４番目、２１～２１番目のプロリンのうちの２つが酸化されたアミノ酸配列からなるペプチドである。
Ｎｏ．Ａ８のペプチドは、配列番号８に示すアミノ酸配列において、３～４番目、６番目、１２～１３番目、１５～１６番目、１８番目のプロリンのうちの４つが酸化されたアミノ酸配列からなるペプチドである。
Ｎｏ．Ａ９のペプチドは、配列番号９に示すアミノ酸配列において、３番目、５番目、８番目、１４～１５番目、２１番目のプロリンのうちの３つが酸化されたアミノ酸配列からなるペプチドである。
Ｎｏ．Ａ１０のペプチドは、配列番号１０に示すアミノ酸配列において、１５番目、２４番目及び３０番目のプロリンが酸化され、かつ、２番目、１１～１２番目、１７番目のプロリンのうちの１つが酸化されたアミノ酸配列からなるペプチドである。
Ｎｏ．Ａ７のペプチドは、配列番号７に示すアミノ酸配列において、３番目のプロリンが酸化され、かつ、１２番目、１４番目、２１～２１番目のプロリンのうちの２つが酸化されたアミノ酸配列からなるペプチドである。
Ｎｏ．Ａ８のペプチドは、配列番号８に示すアミノ酸配列において、３～４番目、６番目、１２～１３番目、１５～１６番目、１８番目のプロリンのうちの４つが酸化されたアミノ酸配列からなるペプチドである。
Ｎｏ．Ａ９のペプチドは、配列番号９に示すアミノ酸配列において、３番目、５番目、８番目、１４～１５番目、２１番目のプロリンのうちの３つが酸化されたアミノ酸配列からなるペプチドである。
Ｎｏ．Ａ１０のペプチドは、配列番号１０に示すアミノ酸配列において、１５番目、２４番目及び３０番目のプロリンが酸化され、かつ、２番目、１１～１２番目、１７番目のプロリンのうちの１つが酸化されたアミノ酸配列からなるペプチドである。
Ｎｏ．Ａ１～Ａ５のペプチドは、Ｃｏｌｌａｇｅｎ ａｌｐｈａ－１（Ｉ）（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． Ａ０Ａ１Ｄ５ＰＹＵ１）に由来するペプチドであった。Ｃｏｌｌａｇｅｎ ａｌｐｈａ－１（Ｉ）（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ａ０Ａ１Ｄ５ＰＹＵ１）のアミノ酸配列を、配列番号１１に示す。
Ｎｏ．Ａ６～Ａ１０のペプチドは、Ｃｏｌｌａｇｅｎ ａｌｐｈａ－２（Ｉ）（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ａ０Ａ５Ｈ１ＺＲＪ７）に由来するペプチドであった。Ｃｏｌｌａｇｅｎ ａｌｐｈａ－２（Ｉ）（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ａ０Ａ５Ｈ１ＺＲＪ７）のアミノ酸配列を、配列番号１２に示す。
Ｎｏ．Ａ６～Ａ１０のペプチドは、Ｃｏｌｌａｇｅｎ ａｌｐｈａ－２（Ｉ）（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ａ０Ａ５Ｈ１ＺＲＪ７）に由来するペプチドであった。Ｃｏｌｌａｇｅｎ ａｌｐｈａ－２（Ｉ）（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ａ０Ａ５Ｈ１ＺＲＪ７）のアミノ酸配列を、配列番号１２に示す。
配列番号１～１０のアミノ酸配列を示す。
GFSGLQGPPGPPGAPGEQGPSGASGPAGPR（配列番号１）、GPPGPMGPPGLAGPPGEAGR（配列番号２）、GPPGSAGAAGKDGLNGLPGPIGPPGPR（配列番号３）、GNDGAPGAAGPPGPTGPAGPPGFPGAAGAK（配列番号４）、GSPGADGPIGAPGTPGPQGIAGQR（配列番号５）、GETGPTGAIGPIGASGPPGPVGAAGPAGPR（配列番号６）、GLPGIAGATGEPGPLGVSGPPGAR（配列番号７）、VGPPGPAGITGPPGPPGPAGK（配列番号８）、GEPGPVGPSGFAGPPGAAGQPGAK（配列番号９）、GPSGEAGAAGPPGTPGPQGILGAPGILGLPGSRGER（配列番号１０）
GFSGLQGPPGPPGAPGEQGPSGASGPAGPR（配列番号１）、GPPGPMGPPGLAGPPGEAGR（配列番号２）、GPPGSAGAAGKDGLNGLPGPIGPPGPR（配列番号３）、GNDGAPGAAGPPGPTGPAGPPGFPGAAGAK（配列番号４）、GSPGADGPIGAPGTPGPQGIAGQR（配列番号５）、GETGPTGAIGPIGASGPPGPVGAAGPAGPR（配列番号６）、GLPGIAGATGEPGPLGVSGPPGAR（配列番号７）、VGPPGPAGITGPPGPPGPAGK（配列番号８）、GEPGPVGPSGFAGPPGAAGQPGAK（配列番号９）、GPSGEAGAAGPPGTPGPQGILGAPGILGLPGSRGER（配列番号１０）
Claims (13)
- ニワトリ由来の、分子量が３～１００ｋＤａのコラーゲン加水分解物を含有する、血糖値上昇抑制用組成物。
- 前記コラーゲン加水分解物の分子量が、３～３０ｋＤａである、請求項１に記載の組成物。
- 前記コラーゲン加水分解物の分子量が、３０～１００ｋＤａである、請求項１に記載の組成物。
- 前記コラーゲン加水分解物をトリプシンで処理して得られるトリプシン処理物が、配列番号１～１０のいずれかのアミノ酸配列からなるペプチド、及び、配列番号１～１０のいずれかのアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸残基が修飾されたアミノ酸配列からなるペプチドからなる群より選択される少なくとも１種のペプチドを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の組成物。
- ＧＬＰ－１の分泌を促進する、請求項１～３のいずれか一項に記載の組成物。
- 経口組成物である、請求項１～３のいずれか一項に記載の組成物。
- 容器詰飲料である、請求項１～３のいずれか一項に記載の組成物。
- 糖尿病の患者又は糖尿病の発症のリスクがある対象のための、請求項１～３のいずれか一項に記載の組成物。
- 「血糖値の上昇を抑制」及び「ＧＬＰ－１の分泌促進を介してインスリンの初期分泌を向上し、食後血糖値の上昇をゆるやかにする」からなる群より選択される少なくとも１の機能の表示を付した、請求項１～３のいずれか一項に記載の組成物。
- ニワトリ由来の、分子量が３～１００ｋＤａのコラーゲン加水分解物を投与することを含む、血糖値上昇抑制方法。
- ニワトリ由来の、分子量が３～１００ｋＤａのコラーゲン加水分解物を投与することを含む、ＧＬＰ－１分泌促進方法。
- ニワトリ由来の、分子量が３～１００ｋＤａのコラーゲン加水分解物の、血糖値上昇を抑制するための使用。
- ニワトリ由来の、分子量が３～１００ｋＤａのコラーゲン加水分解物の、ＧＬＰ－１分泌を促進するための使用。
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| JP2013043887A (ja) * | 2011-08-26 | 2013-03-04 | Bhn Kk | 血圧降下剤 |
| WO2016129174A1 (ja) * | 2015-02-09 | 2016-08-18 | 株式会社ファーマフーズ | ヒアルロン酸産生促進剤 |
| CN111961115A (zh) * | 2020-07-27 | 2020-11-20 | 宁波大学 | 一种鲜味肽及其制备方法和应用 |
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