JP5715169B2 - ジペプチジルペプチダーゼiv阻害剤およびその中間体の製造方法 - Google Patents
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Description
a.フェニルアラニンデヒドロゲナーゼおよび/またはギ酸デヒドロゲナーゼを製造し得る微生物の発酵ブロスを製造し;
b.該ブロスをミクロ流動化(microfluidization)させて、得られた細胞から活性を放出させ、PDHおよび/またはFDH活性を有するミクロ流動化ブロスを得;
c.細胞破砕物を凝集させてDNAおよび不要なタンパク質を除去するために、該ブロスを凝集剤で処理することにより清浄化し;
d.清浄化ブロスを濾過し;そして
e.該ブロスを濃縮して、PDHについて少なくとも約400IU/ml、FDHについて少なくとも約20IU/mlのPDH/FDH活性を有する部分精製された酵素濃縮物を得ること
を含む方法が提供される。
a.以下の構造:
b.反応物のpHを水酸化ナトリウムで約7.0〜約8.6、好ましくは8.0+/−0.2に維持して、望ましくない過剰アンモニウムイオンを実質的に含まない所望のアミン体を得ること
を含む方法が提供される。
a.以下の構造を有するアミノ酸(αS)−α−アミノ−3−ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン−1−酢酸:
の水溶液を提供し;そして
b.上記水溶液をジ−tert−ブチルジカルボネートと処理してBOC保護アミン体を得ること
を含む方法が提供される。
a.部分精製されたフェニルアラニンデヒドロゲナーゼ/ギ酸デヒドロゲナーゼ酵素(PDH/FDH)を製造し(上述のように);
b.以下の構造1:
c.反応混合物のpHを水酸化ナトリウムで約7.0〜約8.6、好ましくは8.0+/−0.2に維持して、望ましくない過剰アンモニウムイオンを実質的に含まない所望のアミン2:
d.アミノ酸中間体2を単離せずに、上記水溶液をジ−tert−ブチルジカルボネートと処理して構造3のBOC保護アミンを得ること
を含む方法が提供される。
本発明の部分精製PDH/FDH酵素濃縮物の製造実施においては、PDHおよび/またはFDH活性を発現している微生物を発酵させる。発酵ブロスを、8000〜約30000psiの範囲内、好ましくは約12000〜約20000psiの圧力下で、約4℃〜30℃の範囲内、好ましくは約8℃〜約15℃、より好ましくは40℃以下の温度でブロスを維持しながら操作するミクロフルイダイザー(microfluidizer)を通すことになろう。全ブロスは、好ましくは珪藻土(例えば、Dicalite(Grefco Minerals,Inc.の登録商標)およびセライト(World Minerals,Inc.の登録商標))などの濾過助剤およびポリエチレンイミン水溶液などの凝集剤または加熱などの他の凝集因子をブロスに加えることによりDNAおよび他の高分子タンパク質を除去して、清浄化されるであろう。次いで、この混合物をフィルタープレスを用いて濾過し、濾液を回収する。濾過ケーキを水で洗浄し、その水を回収して濾液に加えるが、それら全てを清浄化ブロスと称する。
プラスミドpBMS2000-PPFDH-PDHmodの構築
発現ベクターpBMS2000-PPFDH-PDHmodの2工程構築を用いた。適合性の制限エンドヌクレアーゼ開裂部位とともにP.pastorisのFDH遺伝子の5’末端および3’末端を含むオリゴヌクレオチドプライマー:
FDHおよびPDHmodの発現
pBMS2000-PPFDH-PDHmodをエシェリキア・コリ(Escherichia coli) JM110に形質転換した。振盪フラスコでの検討においてJM110(pBMS2000-PPFDH-PDHmod)をMT5培地(2.0% Yeastamine、4.0%グリセロール、0.6%リン酸ナトリウム[二塩基性]、0.3%リン酸カリウム[一塩基性]、0.125%硫酸アンモニウム、0.0256%硫酸マグネシウム[七水和物;滅菌1M溶液からオートクレーブ後に添加]、および50μg/mLの硫酸カナマイシン[濾過滅菌した50mg/mL溶液からオートクレーブ後に添加])中、28℃、250rpmで18時間増殖させた。600nmでの光学密度(OD600)を記録し、0.35の開始OD600を与えるに十分な細胞を新鮮なMT5/カナマイシン培地に加えた。OD600が0.8〜1.0となるまで、フラスコを250rpm、28℃で振盪した。滅菌濾過した1Mイソプロピルチオ−β−D−ガラクトピラノシド(IPTG)を最終濃度35μMで加えることにより両遺伝子の発現を誘導し、発酵を24〜48時間続けた。細胞を6,500×gで5分間遠心分離することによってペレット化し、等容量の50mMギ酸アンモニウム(pH7.0)で1回洗浄し、再度ペレット化した。細胞を−20℃で凍結保存するか、または直ちに用いた。ペレットを50mMリン酸アンモニウム(pH7.0)中、10mL/g(湿細胞重量)で再懸濁し、Fisher Scientific Model 50 Sonic Dismembrator(Fisher Scientific、Pittsburgh、PA)(マイクロチップで動力設定15)を用いて3×15秒間超音波処理した。細胞破砕物は、13,000×gにて室温で5分間遠心分離することによりペレット化した。
作業容量:16リットル
温度:28℃
換気:1.0vvm
圧力:690mbar
攪拌:500rpm
必要に応じてNH4OHを用いてpHを6.8に調節
発泡は必要に応じてUCON(Dow Chemical Companyにより製造されたフルオロカーボン溶媒混合物)を添加して調節した。
単離した(部分精製)PDH/FDH酵素濃縮物を用いた、3−ヒドロキシ−α−オキソトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン−1−酢酸(式1)からの(αS)−α−アミノ−3−ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン−1−酢酸(式2)を介した(αS)−α−[[(1,1−ジメチルエトキシ)カルボニル]アミノ]−3−ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン−1−酢酸(式3)の短縮(telescoped)製造
エシェリキア・コリ(Escherichia coli) JM110(pBMS2000-PPFDH-PDHmod)の発酵ブロス(30リットル)を4000Lタンク発酵(実施例2と類似した方法を用いて製造)から得、マイクロフルイダイザー(MicrofluidicsモデルM-110Y、作動圧力12,000〜20,000psi)に通し(1回)、ブロスの温度を40℃以下に保ちながら細胞から活性を放出させた。ミクロ流動化ブロスのPDH/FDH活性は、PDHについては32IU/ML、FDHについては8IU/mlであった。
3−ヒドロキシ−α−オキソトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン−1−酢酸(式1)(1.00kg;4.46mol)を20L容器に加え、次いで水(5L)を加えた。この混合物を攪拌し、10N NaOHでpHを調節してpH〜8として溶液を得た。Darco KBBカーボン(100g)を加え、混合物を5分間攪拌し、次いで5μの濾紙を用いてブフナー漏斗で濾過した。フィルターを水で洗浄し(2×1L)、濾液および洗液を合わせて透明な溶液を得た。
(αS)−α−アミノ−3−ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン−1−酢酸(式2)の溶液の一部(477.5g;2.12mol)にジ−tert−ブチルジカルボネート(1.022kg;4.68mol)を加えた。この混合物を、pHスタット滴定器で10N NaOHを用いてpHを10に調節し維持しながら周囲温度で攪拌した。反応はBoc2Oの添加後4時間で完了し、このとき残存する出発物質は1.0%未満であった。
フェニルアラニンデヒドロゲナーゼアッセイA
フェニルアラニンデヒドロゲナーゼアッセイAは、40℃で1mL中に以下のものを含んでいた:0.4mM NADH、5mMフェニルピルビン酸ナトリウム、HClでpH8.75に調節した0.75M NH4OH。吸光度の低下を340nmでモニターした。酵素活性単位は、吸光度の変化速度に基づき、μモル/分として計算した。
フェニルアラニンデヒドロゲナーゼアッセイB
フェニルアラニンデヒドロゲナーゼアッセイBは、40℃で1mL中に以下のものを含んでいた:1mM NAD、10mM L−フェニルアラニン、1N NaOHでpH10.0に調節した0.1M K2HPO4。吸光度の増加を340nmでモニターした。酵素活性単位は、吸光度の変化速度に基づき、μモル/分として計算した。
フェニルアラニンデヒドロゲナーゼアッセイC
フェニルアラニンデヒドロゲナーゼアッセイCは、40℃で1.0mL中に以下のものを含んでいた:0.4mM NADH、50mM 3−ヒドロキシ−α−オキソトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン−1−酢酸(1当量のNaOH溶液に溶解)、HClでpH8.75に調節した0.75M NH4OH。吸光度の低下を340nmでモニターした。酵素活性単位は、吸光度の変化速度に基づき、μモル/分として計算した。
ギ酸デヒドロゲナーゼアッセイ
ギ酸デヒドロゲナーゼアッセイは、40℃で1mL中に以下のものを含んでいた:1mM NAD、100mMギ酸アンモニウム、100mMリン酸カリウム緩衝液(pH8.0)。吸光度の増加を340nmでモニターした。酵素活性単位は、吸光度の変化速度に基づき、μモル/分として計算した。
式M':
A.ZnCl2触媒された臭化アダマンチル(式A)のカップリング
乾燥容器に7.5kgの臭化アダマンチルを入れた。次いで、塩化メチレン(22.5リットル)を室温で加えて固形の臭化アダマンタンを溶解した。溶解は吸熱性であるので、次の工程の前に反応混合物の温度を20℃に戻した。次いで、反応混合物に塩化亜鉛(1.05kg)を入れ、20℃で約5分間攪拌した。次いで、反応温度を20〜25℃に維持しながら反応混合物にトリス(トリメチルシロキシ)エチレン(15.3kg)を入れ、得られた混合物を2時間攪拌した。この混合後にトリス(トリメチルシロキシ)エチレン(5.10kg)を加えた。この添加の間、温度を30℃以下に維持した。反応液をさらに12〜15時間、20〜25℃に維持し、この時点で反応混合物を塩化メチレン(15L)で希釈し、0〜5℃に冷却した。次いで、反応混合物を半飽和NH4Cl溶液を用いて、最初は滴下の様式により処理した。添加の間、温度を30℃未満に維持した。濃い懸濁液が得られた。この懸濁液に酢酸エチル(93.75L)を加えた。混合物を15分間激しく攪拌すると、有機層と水層は分離した。有機層を保存し、水層を酢酸エチル(各洗浄で18.75L)で2回洗浄した。次いで、酢酸エチル洗液および有機層を合わせ、水(37.5L)、次いで食塩水で半飽和した水(37.5L)で洗浄した。有機層を再び分離し、蒸発させて結晶を生成させた。次いで、22.5Lの最終容量でヘプタンへの溶媒交換を行った。得られた懸濁液を5〜10℃に1時間冷却し、生成物のα−ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン−1−酢酸(式B)を濾過により得た。α−ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン−1−酢酸(式B)の収量は6.96kg(33.11mol,95%)であった。
まず不活性雰囲気を反応器内に生じさせた。次いで、反応器にメタノール(35.00L)、次いでα−ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン−1−酢酸(式B)(14.00kg)を入れて懸濁液を生成した。懸濁液を0〜5℃に冷却し、塩化アセチルを反応混合物の温度が5〜10℃に維持されるような様式で加えた。塩化アセチルの添加完了後、反応混合物を20〜25℃に温め、20〜25℃で2時間攪拌した。次いで、反応混合物を真空下、40℃で濃縮すると薄い油状物が得られた。この油状物を酢酸エチル(71.96L)に溶解し、室温に戻した。得られた混合物を水(各洗浄で28.78L)で2回洗浄し、各洗浄後に有機層と水層とを分離した。有機層を保存し、一方、水層は合わせて3N NaOH溶液でpH9.5に調節した。次いで、合わせた水層を酢酸エチル(各抽出に14.39L)で2回抽出した。各抽出後の有機層を分離し、保存した有機層と合わせた。次いで、これら合わせた有機層を飽和重炭酸ナトリウム溶液(28.78L)、次いで食塩水(43.18L)で洗浄した。次いで、全ての揮発成分を真空下、40℃で除去し、静置により結晶化する無色から薄黄色の油状物が得られた。この油状物は、13.29kg(59.26mol,89%)のα−ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン−1−酢酸メチルエステル(式C)を含んでいた。
三頸フラスコ(22L)は、メカニカルスターラー、温度プローブおよび滴下漏斗を備えており、窒素を一晩パージした。次いで、塩化オキサリル(500mL,5.73mol)を加え、次いでCH2Cl2(8L)を加えた。得られた溶液をアセトン/ドライアイス浴で−69℃に冷却した。次いで、内部温度を−60℃以下に維持しながら、ジメチルスルホキシド(DMSO;700mL,9.86mol)の溶液を約30分かけてゆっくり加えた。温度を−60〜−70℃に維持しながら、溶液を20分間攪拌した。内部温度を−60℃以下に維持しながら、CH2Cl2(1.7L)中のα−ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン−1−酢酸メチルエステル(式C)(990g,4.42mol)の溶液を約30分間かけてゆっくりと加えた。得られた溶液を30分間攪拌した。次いで、NEt3(3L,21.5mol)を加えてトリエチルアミン塩酸塩の重いスラリーを生成した。反応混合物を室温に温め、水(1L)を加えてトリエチルアンモニウム塩(TEA塩)を溶解させた。次いで、反応混合物を丸底フラスコに移し、濃縮減量してジクロロメタン(DCM)およびNEt3を除去した。EtOAc(12L)を加え、得られた水層および有機層を分離した。有機層を水(各洗浄に2L)で3回洗浄し、次いで食塩水で洗浄した(2L)。次いで、有機層を無水Na2SO4で蒸発乾燥させてα−オキソトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン−1−酢酸メチルエステル(式D)のわずかに黄色の固体を得た。収率は約104%であった。
エルレンマイヤーフラスコに95〜98%H2SO4(495mL)を入れ、氷浴で8℃に冷却した。次いで、HNO3(30mLの水に50mLの70%HNO3を加えることにより調製した50%を47.5mL)をフラスコに加え、混合物を再び氷浴で8℃に冷却した。固体のα−オキソトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン−1−酢酸メチルエステル(式D)(100g,0.45mol)を30〜60分かけて少しずつ混合物に加え、28℃未満の温度を維持した。氷浴で冷却しながら、反応混合物を攪拌した。反応の進行を薄層クロマトグラフィー(TLC)または高速液体クロマトグラフィー(HPLC)のどちらかでモニターした。TLCについては、シリカゲルを用い、溶媒はEtOAc/MeOH/ヘキサン(9/1/10);KMnO4であった。HPLCについては、4.6×50mm、C18、3ミクロン、120オングストロームカラムを、10%アセトニトリル/H2Oから100%アセトニトリルへの7分間での勾配、2.5mL/分の流速で用いた。モニター波長は200nmであった。反応が完了したら(約1時間後)、冷水(1.5L)およびEtOAc(500mL)を加えて反応をクエンチした。さらに水およびEtOAc(各500mL)を加えて水層と有機層との分離を助けた。次いで、水層を3等量(各500mL)のEtOAcで抽出した。有機層を合わせて、食塩水(400mL)で洗浄した。次いで洗浄した有機層を減圧下で濃縮して3−ヒドロキシ−α−オキソトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン−1−酢酸メチルエステル(式1a)を含む130gの黄色の油状残渣を得た。
実施例Dの黄色の油状残渣をテトラヒドロフラン(300mL)に溶解し、氷浴で5℃に冷却した。温度を30℃以下に維持しながら、1リットルの1N水酸化ナトリウムを溶液にゆっくりと加えてpHを約7に調節した。次いで、さらに500mLの1N NaOHを加えてpHを約14に調節した。次いで、氷浴で冷却しながら反応混合物を攪拌し、反応の進行を実施例23に記載のようにTLCまたはHPLCによりモニターした。約30分後に反応が完了したら、EtOAc(500mL)を加え、水層と有機層を分離した。水層をさらに500mLのEtOAcで洗浄した。水層を濃HClで酸性にした。溶液がpH7に達したときにEtOAc(500mL)を加え、次いでpHが0.7に達するまでさらに濃HClを加えた。添加した濃HClの全量は150mLであった。次いで、水層をEtOAc(4×400mL)で抽出し、合わせた有機層を400mLの水、次いで400mLの食塩水で洗浄した。次いで、洗浄した有機層をMgSO4で乾燥させ、濃縮した。収量は薄黄色の固体が88gであった。この固体を100mLのEtOAcおよび300mLのヘプタンに30分間攪拌しながら溶解し、次いで濾過および風乾すると85gの褐色の固体(85%;3−ヒドロキシ−α−オキソトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン−1−酢酸(式1))が得られた。
1.ジクロロ(3−ヒドロキシアダマンタン−1−イル)酢酸メチルエステル(式VIII)の製造
10N HNO3の調製:100mL容の容量フラスコに濃HNO3(88.25g,〜62.58mL,〜1.0mol)を入れ、氷浴で冷却した。水(35mL)を加えた。混合の熱が放散した後、溶液を室温に温めた。次いで、フラスコに水をマークのところまで満たして10N HNO3を得た。
計算値:C, 53.25; H, 6.18; Cl, 24.18%
実測値:C, 53.24; H, 6.24; Cl, 24.31%
1H NMR (500.16MHz, CDCl3)δ3.857 (s, 3H), 2.298 (br m, 2H), 1.824 (s, 2H), 1.793 (d, 4H, =2.75Hz), 1.682, 1.629 (br AB q, 4H), 1.529 (m, 3H) ppm
13C NMR (127.78 MHz, CDCl3)δ165.929, 94.281, 68.932, 54.150, 44.478, 44.529, 44.020, 35.750, 34.759, 30.149 ppm
Lab HPLC:
YMC ODS-A S3 120Å(4.6×50mm),λ=200nm, 2.5ml/分
溶媒:A = 水中の0.2%H3PO4
B = 水中の90%CH3CN
勾配:10分間で20%Aから100%Bへ
圧を均等にする滴下漏斗およびアルゴン導入口を備えた250mL容三頸フラスコに、上記工程1に記載の方法により製造したジクロロ(3−ヒドロキシアダマンタン−1−イル)酢酸メチルエステル(式VIII)(15g,51.16mmol)を入れ、次いでテトラヒドロフラン(30mL,不安定化)を加えた。数分攪拌した後、式VIIIのメチルエステルの大部分は溶解して濁った溶液を生成した。この溶液に蒸留水(30mL)を加えると、ゆるい懸濁液が生成した。滴下漏斗に1N NaOH(69mL、69mmol、式VIIIの化合物の投入量に対して〜1.35当量)を入れた。NaOHを70分かけて滴下により加えてほぼ無色の溶液を得、これを周囲温度で攪拌した。
元素分析値:C12H16Cl2O3 [55465-020-31、TR46373]
計算値:C, 64.27%; H, 7.19%
実測値:C, 64.19%; H, 7.09%
元素分析値:C12H16Cl2O3 [55465-023-15、TR46905]
計算値:C, 64.27%; H, 7.19%
実測値:C, 64.42%; H, 7.04%
反応容器にエタノール(49.0L)を入れ、−5℃に冷却した。次いで、混合物の温度が0℃を超えない方法で反応容器に塩化チオニル(4.97kg)を入れた。塩化チオニルの添加完了後、混合物を再び−5℃に冷却し、添加の間に温度が0℃と−5℃との間に維持されるようにL−ピログルタミン酸(式E)を少しずつ加えた。酸添加後、反応混合物を20〜25℃に加熱し、5時間攪拌した。次いで、反応混合物を最初の容量の約15%まで真空下(Tmax 45℃)で蒸発させた。次いで、残存する油状物をトルエン(49L)に溶解した。次いで、トルエン溶液を約10℃に冷却し、最大温度が20〜25℃となるようにトリエチルアミン(8.45kg)をゆっくり加えた。得られた懸濁液を30分間攪拌し、次いで濾過した。濾過ケークをトルエン(約5L)で洗浄した。濾液を50℃、真空下で全量約10Lまで減らした。シクロヘキサン(8L)を50℃でゆっくり加え、その後に約30℃に冷却することにより結晶化を開始した。種晶生成後、混合物を20〜25℃に冷却し、シクロヘキサンの2回目の8L分を入れた。次いで、混合物を6〜8℃に冷却し、1時間攪拌し、得られた結晶を濾去した。この結晶をシクロヘキサン(各4L)で2回洗浄した。収量は、無色針状物としてのL−ピログルタミン酸エチルエステル(式F)が4.89kg(82%)であった。
L−ピログルタミン酸エチルエステル(式F)(5.00kg)を室温でトルエン(24.97L)に溶解した。次いで、この溶液に4−ジメチルアミノピリジン(0.19kg)を加えた。次いで、反応混合物の温度が25℃を超えないような方法でトルエン(24.97L)に溶解した無水BOC(7.29kg)の溶液を反応混合物に入れた。完全に添加した後、反応混合物を25℃で3時間攪拌した。次いで、反応混合物に半飽和NaHCO3溶液(49.94L)を入れ、10分間激しく攪拌し、その後に有機層と水層を分離した。分離した有機層を水(24.97L)で2回洗浄した。次いで、有機層を真空下、最高50℃で溶媒から蒸発させた。残存する無色からわずかに黄色がかった油状物は静置すると結晶化した。理論的収量は、(5S)−2−オキソピロリジン−1,5−ジカルボン酸,1−(1,1−ジメチルエチル),5−エチルエステル(式G)8.18kg(31.81mol)であった。
(5S)−2−オキソピロリジン−1,5−ジカルボン酸,1−(1,1−ジメチルエチル),5−エチルエステル(式G)(4.80kg)をトルエン(30.97L;Kf max 0.01%水)に溶解し、−50℃に冷却した。この溶液に反応温度が−45℃を超えないような方法で、SuperHydride(LiEt3BH:THF中に1M;19.96L)を入れた。添加完了後、混合物を−45〜−50℃で30分間攪拌した。次いで、温度が−45℃を超えないような方法で反応混合物にN−エチルジイソプロピルアミン(DIPEA;14.47L)を加えた。ジメチルアミノピリジン(0.030kg)を固体として混合物に加えた。次いで、反応温度が−45℃を超えないような方法で反応混合物に無水トリフルオロ酢酸(TFAA)(4.70kg)を加えた。添加完了後、反応混合物を20〜25℃に1時間内温め、この温度でさらに2時間維持した。次いで、反応混合物を0℃に冷却し、反応温度が5℃を超えないような方法でゆっくりと水(48.00L)を入れた。次いで、水層と有機層を分離し、有機層を再び48Lの水(0〜5℃)で洗浄した。次いで、有機層を蒸発させ、40℃で脱気した。黄味を帯びた油状物が、4,5−ジヒドロ−1H−ピロール−1,5−ジカルボン酸,1−(1−ジメチルエチル),5−エチルエステル(BOC−DHPEE)(式G’)の収量4.5kg(18.66mol、100%)で得られた。
4,5−ジヒドロ−1H−ピロール−1,5−ジカルボン酸,1−(1,1−ジメチルエチル),5−エチルエステル(BOC−DHPEE)(式G’)(6.00kg)およびエタノール(24.00L)から製造した溶液を0〜5℃に冷却し、この温度で水(20.87L)中の水酸化リチウム水和物(2.09kg)の溶液でゆっくりと処理して濁った溶液を生成した。次いで、この濁った溶液を20〜25℃に温め、この温度で2時間攪拌した。次いで、反応混合物を最高温度40℃、真空下で約10.5Lの容量まで蒸発させ、水(24.00L)およびt−ブチルメチルエーテル(TBMEまたはMTBE、24L)を入れ、10分間混合した。得られた有機層と水層を分離し、水層に再び24LのTMBEを入れた。次いで、この混合物を5〜10℃に冷却し、激しく攪拌しながらH3PO4 85%−水(1:4)を用いてpHを2.3〜2.3に調節した。この工程の間、安定性のために温度を5〜10℃に維持した。得られた有機層と水層を分離した。有機層を保存し、水層を、予め5〜10℃に冷却した24LのTBMEで再び抽出した。得られた有機層を保存していた有機層と合わせ、ジイソプロピルエチルアミン(DIPEA)(4.82kg)を入れた。次いで、溶液を蒸発させ、最高温度30℃、真空下で脱気した。収量は7.84kg(22.88mol,92%)[N−BOCデヒドロプロリン*DIPEA(BOC−DHP)]であった。
実施例Iに記載の鹸化によって合成したBOC−DHPは、水を含んでいるかもしれない。従って、反応を行う前にトルエンとの共沸蒸留を適用した。しかし、試薬が過剰なため、原料は水を除去する前のBOC−DHPの量に基づいて計算した。共沸蒸留では、BOC−DHPをトルエンを用いて約30%溶液まで希釈した。トルエンを真空下、40℃で除いた。次いで、処理したBOC−DHP(6.00kg)をTHF(48.0L)に溶解した。この溶液にDIPEA(2.26kg)を入れ、反応混合物を−20〜−25℃に冷却した。次いで、塩化メシル(3.01kg)をゆっくり加えた。この添加の間に塩酸DIPEAが沈殿した。次いで、得られた懸濁液を−20℃で2時間攪拌し、次いで表面下の気体導入口によりアンモニアで飽和させた。アンモニアを添加する間、反応物を0℃に加熱した。飽和後、反応混合物を20℃に加熱し、3時間攪拌した。攪拌後、反応混合物を濾過して塩酸塩を除去した。濾過ケークをTHF(12L)で数回洗浄した。濾液を真空下、最高温度40℃で濃縮し、次いで塩化メチレン(33.33L)に溶解した。この溶液を水(26.66L)で洗浄した。得られた有機層と水層を分離し、水層を塩化メチレン(各20L)で2回抽出した。得られた有機層を合わせ、真空濃縮および脱気して過剰のヒューニッヒ塩基を除去した。収量は(5S)−5−アミノカルボニル−4,5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−カルボン酸 1−(1,1−ジメチルエチル)エステル(BOC−DHPA)(式G”)について、3.35kg(15.77mol,90%)であった。
第一の反応器である反応器Aに、塩化メチレン(18.0L)に溶解した(BOC−DHPA)(式IV)(4kg)を入れ、20℃に維持した。第二の反応器である反応器Bには塩化メチレン(18.00L)を入れ、−30℃に冷却した。次いで、反応器Bにジメトキシエタン(DME)(3.36kg)、次いでトルエン中のジエチル亜鉛(15.36kg)の30%溶液を−30〜−25℃の温度に維持しながら入れた。次いで、反応温度を−30〜−25℃に維持しながら、ジヨードメタン(19.99kg)を反応器Bに入れた。ジヨードメタンの添加完了後、混合物を−30〜−25℃で45分間攪拌した。次いで、この混合物を冷却パイプ(−20〜−25℃)により反応器Aに入れた。反応が完了するまで反応器Aの反応温度が22〜24℃に維持されるように、約5%の部分にて添加をゆっくりと行った。反応完了後、反応器Aの混合物を5〜10℃に冷却した。次いで、この反応混合物に、反応温度が15℃を超えない方法で飽和重炭酸塩溶液(21.6L)をゆっくりと入れた。この添加後、反応混合物を少なくとも1時間攪拌すると、その間に沈殿が生成した。懸濁液を濾過した。得られた濾過ケークを容器に戻し、塩化メチレン(14.4L)で30分間再度スラリー化し、再度濾過した。この第二の濾過後、濾過ケークをさらに塩化メチレン(7.2L)で洗浄した。次いで、濾液を水層と有機層に分離し、有機層を半飽和食塩水(21.6L)で洗浄した。次いで、溶媒を最高温度30℃で真空除去し、ヘプタンと交換した。ヘプタン中の粗生成物のスラリーが得られた。溶媒交換後のこの懸濁液の最終容量は14.4Lであった。粗生成物を濾過により単離した。濾過ケークをヘプタン(2.9L)で洗浄し、次いで真空乾燥して一定の重量とした。粗生成物の収量は2.76kg(12.2mol,72%)[1S−(1α,3β,5α]−3−アミノカルボニル)−2−アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン−2−カルボン酸 1,1−ジメチルエチルエステル(式H)であった。精製するため、この粗物質を8倍量の酢酸ブチル/ヘプタンの1:1混合物中に20〜22℃で4時間スラリー化した。この物質を濾過し、濾過ケークを約1倍量のヘプタンで洗浄した。収量は2.11kg(9.33mol,55%)[1S−(1α,3β,5α]−3−アミノカルボニル)−2−アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン−2−カルボン酸 1,1−ジメチルエチルエステル(式H)であった。
メカニカルスターラーおよび熱電対を備えた100mLの二頸フラスコに[1S−(1α,3β,5α]−3−アミノカルボニル)−2−アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン−2−カルボン酸 1,1−ジメチルエチルエステル(式H)(5.0g,22.1mmol)およびTHF(20mL)を入れた。次いで、HCl(EtOAc中2.5M,25mL,62.5mmol)を懸濁液に加えた。得られた溶液を室温で18時間攪拌すると、その間に沈殿が観察された。反応の完了をHPLCによりモニターした。メチルt−ブチルエーテル(MTBE)(30mL)を懸濁液に加え、攪拌をさらに30分間続けた。次いで、懸濁液をN2保護下に濾過して白色固体を得、これをMTBE(20mL)で洗浄した。該固体をオーブン中、減圧下で48時間乾燥させて、(1S,3S,5S)−2−アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン−3−カルボキサミドの塩酸塩(式J;3.6g,100%)を得た。
遊離酸(式3)を製造するための好ましい方法を実施例3に記載する。別法として、以下の方法を用いて遊離酸を製造することができる:
(αS)−α−アミノ−3−ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン−1−酢酸(式2)(469g,2.08mol)を、温度プローブおよびpHプローブを備えた相分離器中、氷冷1N NaOH(5L,5mol,2.4当量)に溶解した。THF(2.5L)を溶液に加えた。次いで、固体のBoc2Oを加え、反応混合物を周囲温度で約1時間攪拌した。次いで、EtOAc(4L)を攪拌しながら加え、得られた有機層と水層を分離した。水層のpHを濃HClで7に調節した。次いで、EtOAc(4L)を加え、さらにHClを加えてpHを約1に下げた。添加した濃HClの全量は510mLであった。有機層と水層を再び分離し、水層をEtOAc(3×3L)で抽出した。次いで、有機層を合わせ、水(3L)および食塩水(3L)で洗浄した。次いで、洗浄した有機層をNa2SO4で乾燥し、エバポレーターにおいて室温で濃縮して乾燥させた。収量は(αS)−α[[(1,1−ジメチルエトキシ)カルボニル]アミノ]−3−ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン−1−酢酸(式3)について542gであった。
温度計、メカニカルスターラーおよび気体導入口を備えた2L容の三頸フラスコに、(αS)−α[[(1,1−ジメチルエトキシ)カルボニル]アミノ]−3−ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン−1−酢酸(式3)(50g,153.8mmol)を入れた。THF(200mL)を加え、攪拌して透明な溶液を得た。この溶液をアセトン−ドライアイス−水浴で−6℃に冷却した。次いで、塩化メタンスルホニル(Mes−Cl)(13.1mL,169mmol、1.1当量)を一度に加え、次いでジイソプロピルエチルアミン(94mL,539mmol,1.1当量)を加えた。このジイソプロピルエチルアミンは約4分かけてゆっくり加えて内部温度を8℃以下に保った。全ての酸が混合無水物に変換されるまで、反応混合物を0℃で攪拌した。次いで、(1S,3S,5S)−2−アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン−3−カルボキサミド塩酸塩(32.5g、200mmol,1.1当量)およびヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBT)(1.04g,7.6mmol,0.05当量)を一度に加え、フラスコを冷浴から取り出した。反応混合物を室温で2時間攪拌し、次いで室温で終夜放置した。
実施例Nの反応混合物にピリジン(6当量,922mmol,74.6mL)を加え、反応混合物を冷浴で−8℃に冷却した。次いで、温度を10℃以下に維持しながら、無水トリフルオロ酢酸(TFAA)(4当量,616mmol,87mL)を6分かけてゆっくり加えた。反応液を24℃で0.5時間攪拌し、HPLC(30mL,0.5mL AcN,0.5mL H2O)で実施例Nの化合物(K)の消失についてチェックした。
3−シアノ−(αS)−α−(3−ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]−1−デシル)−β−オキソ−(1S,3S,5S)−2−アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン−2−エタンカルバミン酸 1,1−ジメチルエチルエステル(式L)(5.0g,12.04mmol)を、温度計、メカニカルスターラー、および気体導入口を備えた三頸フラスコに入れた。EtOAc(約45〜50mL)を加えて透明な溶液とした。濃HCl(3.00mL,37%w/w%,36.14mmol,3当量)を室温で加え、固体が生成するまで反応混合物を攪拌した。次いで、水(30mL)を加え、混合物を1〜2分間攪拌した。この反応混合物を分液漏斗に移し、反応混合物の層を、明確に相が分割するまで分離させた。温度を25℃以下に維持しながら、水層を25%NaOHで約6より低いpHに調節した。
実施例Oの化合物(L)(300g,0.723mol、効力90.6%)、塩化メチレン(3L)、メタノール(288mL,7.23mol)および濃塩酸(36%)(288mL、7.23mol)を、メカニカルスターラー、温度プローブおよびN2ガス導入口を備えた三頸の12Lフラスコに入れた。反応温度を約20〜約25℃の範囲に維持しながら反応を行った。反応混合物を18時間攪拌し、2層に分離し、上部の水層を回収した。水層に塩化メチレン(6L)および水(720mL)を加え、5N NaOH(〜600mL)を滴下して加えてpHを9.0〜10.5に調節した。
Claims (1)
- 以下の構造:
a.以下の構造を有するアミノ酸(αS)−α−アミノ−3−ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.1 3,7 ]デカン−1−酢酸:
当該提供方法は、
i.以下の構造:
ii.反応混合物のpHを水酸化ナトリウムで調整し、望ましくない過剰なアンモニウムイオンを実質的に含まない所望のアミン体を得ること
を特徴とする方法であって、
b.上記水溶液をジ−tert−ブチルジカルボネートと処理してBOC保護アミン体を得ることを
を含む方法であって、
3−ヒドロキシ−α−オキソトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン−1−酢酸、ギ酸アンモニウム、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、ジチオスレイトールおよび部分精製されたフェニルアラニンデヒドロゲナーゼ/ギ酸デヒドロゲナーゼ酵素の水溶液を35〜40℃の範囲内の温度に温めて24〜48時間の範囲内の時間、7.8〜8.2の範囲内のpHで維持してアミン体を製造する、方法。
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