JP5705800B2 - 超音波による分析対象の凝集及びフローサイトメトリの応用 - Google Patents

Description

（関連出願）
この出願は、仮出願番号６０／５９２，１６９、出願日２００４年７月２９日、発明の名称「フローサイトメトリ内の超音波分析対象の凝集および応用」の優先権を主張する。
（連邦の権利に関する記述）
この発明は、米国エネルギー省によって与えられた契約書番号Ｗ−７４０５−ＥＮＧ−３６の下で政府の支援によって行われた。政府は、発明の所定の権利を有する。

本発明は一般に超音波エネルギーの使用に関し、より詳細には、流体内で分析対象を凝集させるための超音波エネルギーの使用に関する。

用語「分析対象」はこの明細書全体で用いられ、この発明の利用者にとって意味のある粒子として定義される。用語「粒子」は非常に小さな物質の単位として定義され、生体細胞、細胞小器官、有機／無機分子、および微小球を含むが、それらには限定されない。

流体内の音響圧の節面（acoustic pressure nodal）または腹面において、流体内に均一に懸濁した粒子を凝集させるために音響定在波を使用することは、A.Kundt、およびO.Lehmann「液体の円筒カラム内の縦振動および音響像」、Annalen der Physik und Chemie（Poggendorff’s Annalen），１５３，１−１１（１８７４）に記載されている。しかし、KundtおよびLehmannは、懸濁粒子を含むことを超音波の可視化を増大させるためだけに使用している。

音響放射力は、流体内の粒子を非侵襲的に配置、凝集、または分別するために用いられる。流体充填キャビティ内に懸濁させた粒子は超音波照射に曝されて時間平均ドリフト力を受け、前記ドリフト力は、粒子と周囲の流体の間の音響コントラスト比に依存する音響照射力ポテンシャル内の最小域まで粒子を移動する。平面波の場合、音響照射力ポテンシャルの最小域に対応する位置は、その圧力の節面および腹面である。音響波内には他の力も存在し、粒子にトルクをかけて粒子のスピンまたは配向をもたらす。隣接する粒子による音場（sound field）の散乱のため、粒子間の二次的力も凝集した塊内に粒子を集めるために役立つ。

音響定在波の使用を含む微小流体素子は、解析前にサンプルから粒子を濾過したり、規制された流体チャネル内に粒子を分離および配置するために用いられる。生体細胞の音響凝集は、汚染のない高速な、実時間測定を提供する完全自動解析システム内に組み込むことができる。

本発明は、流体内に懸濁させた粒子を配置、凝集、または分別するために音響力を用いる装置および方法である。この発明の一実施例は、圧電セラミック振動子で駆動した長い円筒流体充填ガラス管の低次結合構造／キャビティモードを用いて、流体充填キャビティ内の特徴的双極子である共振圧力場を生成する。従って、流体内の粒子は、共振超音波場によって生成された放射力ポテンシャルの最小域に向かって駆動される。円筒形状は、平面、共焦点、または進行波場を用いる場合に比べて、振動子／反射体システムを正確に位置合わせする必要がなくなる。円筒形状の別の利点は、円筒全体の励起によってもたらされるキャビティ内のより低いエネルギー密度が、流体内のキャビテーション、対流（convection）、および熱勾配を低減することである。

Raghavaraoらの米国特許番号６０９０２９５（公告日２０００年７月１８日）、「水溶液を音響的に分離する方法および装置」には、少なくとも二つの水相からなる水溶液を分離するために音響エネルギーを用いることを開示している。ここでは、大量の音響エネルギー（１．２〜１．８ＭＨｚで４〜６Ｗ／ｃｍs）を振動子から水溶液内に送って分離している。これは、共振モードを利用せずに水溶液内に節（nodal）位置を生成し、細胞構造等の傷つきやすい粒子を破壊するようなエネルギー範囲であるので本発明とは異なっている。

Tramplerらの米国特許番号５７１１８８８（公告日１９９８年１月２７日）、「懸濁粒子の分離用の多層圧電共振器」には、音響エネルギーを用いて流体内に懸濁させた粒子を分離する方法を開示している。しかし、キャビティが、本発明はシステムの正確な位置合わせを必要とする長方形ではない点が、Tramplerらが開示しているものとは異なり、その代わりにその構造およびキャビティからなる結合システムの円筒対称音響モードを用いて、求められる共振および音響放射力ポテンシャル内の対応する最小値を設定する。

本発明の様々な目的、利点および新規な特徴は以下の詳細な説明に示され、その内容により当業者には部分的に明らかになるか、もしくはこの発明の実施例によって理解される。本発明の目的および利点は、特に請求項に記載された手段および組み合わせによって実現され達成される。

本発明の目的に従って、具体例に示され広く説明されているように、本発明は音響放射圧を用いて、管を通して流れる流体内の分析対象を凝集させるための装置および対応する方法を含んでいる。装置は任意波形発生器を有し、前記任意波形発生器は高周波電気信号を振動子に出力し、前記振動子は高周波電気信号を音響信号に変換して音響信号を管に結合させる。音響信号は管内で音響放射圧に変換され、音響放射圧は流体内の分析対象を凝集させる。

本発明は、音響放射圧を用いて、流体内に懸濁させた分析対象を配置、凝集、または分別するための装置および方法である。管の自然共振周波数を用いて、管の軸中心上に所定の分析対象を凝集させる。管に取り付けた振動子は、音響エネルギーを提供する。別の実施例では、共振周波数を保持する電子的フィードバック、および自動温度補償のために追加の振動子を用いることもできる。

（理論）
音場内の粒子に働く放射力の最初の定量的解析において、King,L.V.の「球体上の音響放射について」、Proc.R.Soc.A.,１４７，２１２−２４０，（１９３３）では音響放射力のみを考慮していた。Kingは非圧縮性球体を仮定し、波長より小さな半径を備えた粒子上への放射力は進行波内より定在波内でより大きくなることに着目した。

L.P.Gorkovの「音響場（acoustical field）および理想流体内の微小粒子に作用する力について」、Soviet Physics-Doklady,６，７７３−７７５（１９６２）では、節位置または腹位置（anti-nodal positions）に粒子を移動させる力について、粒子の圧縮性の影響を含めるようにKingの解析を拡張した。

R.K.Gould、W.T.Coakleyの「懸濁液内の微小粒子上への音響力の影響」、Proceedings of the 1973 Symposium on Finite Amplitude Wave Effects in Fluids、編集L.Bjorno,Pergamon,Guildford,１９７４，ｐｐ．２５２−２５７は、さらに浮力と音響ストリーミングを含めるようにKingの解析を拡張した。

最後に、K.Higashitani、M.Fukushima、Y,Matsuno、「平面定在超音波場内の懸濁粒子の移動」、Chem.Eng.Sci.３６，１１８７−１１９２（１９８１）は、微小粒子の拡散を考慮する項を展開した。これらの著者の発見に従って、超音波場内の粒子移動の定量的理解が得られた。

任意の場内の希釈懸濁液の場合、非相互作用粒子に対するGorkovの理論は、平衡粒子分布の優れた解析を提供する。音響場の密度ρ_ｆの流体内の半径ｒ、密度ρ_ｐの微小球状粒子に作用する時間平均ポテンシャルは、次式のように定義されている。

ここで、ｃｆとｃｐは各々流体および所定の粒子の音響速度であり、ｐ_inとｖ_inは粒子が配置された点における波動内の圧力および速度の平均二乗変動（mean-square fluctuations）である。平面波の場合、所定の粒子および流体の密度および音響速度の間の関係に依存して、所定の粒子は圧力腹（anti-node）点または圧力節（node）点のいずれかに移動する傾向がある。音響場の速度および圧力は、以下に説明するグローバル行列（global matrix）法等の方法を用いて導くことができる。

ここで図１ａを参照すると、円筒多層システムは、D.C.Ricks、H.Schmidtの「リング状の力によって励起された円筒多層シェル用の数値的に安定なグローバル行列法」、J.Acoust.Soc.Am.９５，３３３９−３３４９（１９９４）によって開示されている直接グローバル行列方式を用いてモデル化できる。多層材料はｎ＝１〜Ｎまで番号が付けられ、層１はｒ＝０を含み、層Ｎは無限に広がっている。変数ｒｎは層ｎとｎ＋１の間の境界に対応する。全ての層は等方性および均一な粘弾性で、ラメ定数（Lame constants）λ_ｎ、μ_ｎおよび密度ρ_ｎを備えていると仮定する。添字は、定数によって記述される層数を指している。層が固体であれば、変位場ｕ_ｎは次の三次元弾性力学方程式によって決定される。

変数ｆ_ｎは、層ｎの単位体積当たりに加えられる力を指している。層ｎ内の縦波と剪断波の速度は、次式で説明されるようにラメ定数に関連付けられる。

各々縦波および剪断波に対応する波数であるｈ_ｎとｋ_ｎは、角周波数ωと音速によって表される。ここで、Ｃ_inは所定の弾性材料内の縦波の速度であり、Ｃ_snは所定の弾性材料内の剪断波の速度である。

流体内には剪断力は存在せず、μ_ｎ＝０であるので、流体内ではＣ_snとｋ_ｎを含む任意の項は無視される。周波数（ω）の時間調和振動場（time harmonic field）は調和関数（フーリエ級数）の無限和として記述されるので、一般性を損なわずに時間依存のリング状の力ｅｋ^−ｉωｔで仮定できる。従って、点または線加振（point or line excitation）を含む他の強制関数の時間依存性は、周波数上でフーリエ積分を用いることによって時間調和力から合成できる。同様に、ｅ^ｉνθの角度依存性が仮定され、ここでνは次数である。変位場は、斉次解および特解の線形重ね合わせ（linear superposition）として表すことができる。層が空間全体に広がっている場合、斉次解（homogeneous solution）は層ｎのリング状の力から生じる波源のない波であり、特解（particular solutions）に加算すると境界条件を満足する。従って、斉次場は次式によって決定される。

この場は、ヘルムホルツ方程式を満たすスカラ変位ポテンシャル（scalar displacement potentials）によって表すことができる。この問題は、さらに半径および方位座標に低減できる。

任意の二つのベッセル関数およびハンケル関数は得られる微分方程式を満たすが、その解は第一形式Ｈ⁽¹⁾ _ｖのベッセルおよびハンケル関数によって表されることが数値安定性によって決定される。係数は、各層の境界条件を用いて決定される。グローバル行列は均一波に関連した未知の変位と応力を用いて構成され、振幅ベクトルによって記述され、強制的励起による特解の結果の変位および応力に等しく設定される。係数の解は、グローバル行列にクラメールの公式を適用することによって決定される。

ここで図１ｂを参照すると、グローバル行列を生成する境界条件は次式のようになる。

変数Ｒ１とＲ２は、各々管の内径と外径である。境界条件は、内側の境界Ｒ１において変位の連続性を要求する。半径方向の応力は、Ｒ１において連続である。円筒には流体が充填されているので、Ｒ１における流体と固体の界面には剪断応力は存在しない。システムは外面において駆動されるので、半径方向および角度方向の応力は連続であり、外側の境界Ｒ２における特解と等しくなる。

要素の有限な幅は、特解の強制関数に対して、点θ＝３π／２ラジアンについてのガウス重み関数を適用することによって計算において考慮される。

従って、上記の境界値問題は、線駆動管の動きを記述するために数値的に解決される。その結果を用いて、管の外側境界および管内のキャビティの振動挙動を予測する。さらに、これを用いて管が粒子を凝集させる性能を記述し、効率的な凝集に必要な動きを予測する。

ここで図２を参照すると、内径ｒ＝２．２ｍｍ、外径Ｒ＝３．９７ｍｍの円筒ガラス管１０に軸方向に接続するように第一振動子２０を取り付けた。好ましい実施例では、管１０に用いられる材料には、ガラス、プラスチック、金属、または結晶性固体が含まれる。管の構造の長さ全体を励起するので、管の長さが長いほど細長い構造によって生成される流体の音響場内の粒子の滞留時間も増大する。

一実施例では、第一振動子２０の寸法は、長さ３０ｍｍ、厚さ３ｍｍ、および幅１．５ｍｍであり、インピーダンス解析器を用いた測定によって決定した対応する厚さモードの共振は４２０ｋＨｚであった。この例で用いた第一振動子２０はジルコン酸チタン酸塩であるが、圧電セラミック、圧電塩、圧電高分子、圧電結晶、超磁歪材料、または電磁振動子を含む、当業者には既知の任意の振動子から選択できる。強制振動の周波数として定義されるシステムの共振（システムによって吸収され、内部に伝達される振動エネルギーの増大によって特徴付けられるもの）は、ガラス管１０内で観察される粒子の凝集点を見出すために、関数発生器６０の駆動周波数を走査することによって約４１７ｋＨｚであると決定された。

同様に、ガラス管１０に接続するように取り付けた第二振動子４０は、システムの構造的音響モードの共振に駆動周波数を調整するために用いた。なお、別の実施例では、第二振動子４０は電子フィードバックを提供し、システムの共振周波数および自動周囲温度補償を維持するために用いられる。調整信号は、オシロスコープ５０上で観察される。調整は、駆動周波数を変更し、オシロスコープ５０上で観察される調整信号を最大にすることによって実現される。第二振動子４０も、圧電セラミック、圧電塩、圧電高分子、圧電結晶、超磁歪材料、または電磁振動子から選択できる。

第一振動子２０は３０Ｖの任意波形発生器６０を用いて駆動し、任意波形発生器６０は高周波電気信号を提供し、前記電気信号は増幅するために７５Ｗの電力増幅器７０を介して送った。なお、電力増幅器７０はこの発明の実施には不要であるが、好ましい実施例には含まれる。任意波形発生器６０には、異なる周波数の様々な電圧波形を生成可能な、当業者には既知の任意の電源回路を用いることができる。第一振動子２０内への一般的な駆動信号の振幅は、１０〜１２Ｖｐｐおよび８０ｍＡであった。信号電流は、第一振動子２０と直列の１０Ω抵抗器８０にかかる電圧から測定した。

１０μｍ粒子（標準偏差０．７μｍ）の粒子を蒸留水に約０．０２５体積％の濃度まで希釈し、それから重力給水システムを用いて流速５〜２５ｍｍ／秒でガラス管１０を介して流した。液体は微小流体システム内で予想される条件を最も正確に模倣するために脱ガスせず、給水液だめ内にある間、溶液内の粒子の懸濁を維持するためにほんのわずかに撹拌した。

ガラス管１０の外側境界面の変位は、上記の理論的モデルを用いて計算した。結合構造／キャビティモードが管の外面の変位によって定義されるような特徴的双極子となると管の中心軸に粒子凝集が発生する。計算によって、このモードは上記の構成では周波数４１７ｋＨｚで発生することが決定された。ガラスの材料特性は、ソーダ石灰ガラスに対して屈折率、密度、縦方向の音速、および熱膨張係数を適合させることによって決定した。ガラスに対して、縦方向の音速は５９００ｍ／秒、剪断方向の音速は３３００ｍ／秒、および密度は２．４３ｇ／ｃｍ^３を用いた。計算に用いた空気の音速と密度の値は、各々３４０ｍ／秒と１０^−６ｇ／ｃｍ^３であった。水の音速は１４８７ｍ／秒、密度は１ｇ／ｃｍ^３であると仮定した。システムの予備実験的モデル化によって、最大の音響凝集効率を備えた特定の構造モードの正確な識別を可能にする。

図３を参照すると、角度走査装置１００を用いてガラス管１０の表面振動を決定し、ガラス管１０の外側境界上での所望のモードの励起を確認可能にする。ガラス管１０は、コンピュータ制御の角度ステッピングモータステージ１１０に取り付け、細い振動子（ピンデューサ１２０）を用いて探針した。ハンダ１２５の半球はピンデューサ１２０に貼り付け、ガラス管１０との点接触を確保して信号の角度積分を最小にした。ガラス管１０との一定の接触を保持するために、ピンデューサ１２０はバネ１２７上に取り付けた。

図４を参照すると、データを収集するために、コンピュータ制御の１２ビットデジタルオシロスコープ５０を用いた。管１０は上記の装置を用いて、空気充填の場合と水充填の場合の両方で測定した。得られる凝集パターンの画像は、底部照射顕微鏡１４０と１２８０×１０２４、１２ビットデジタルカメラ１５０を用いて撮影した。

理論的予想および実験的測定は、まず空気を充填したガラス管１０を用いて行い、その後、流れる水を充填したガラス管１０を用いて両方の構成の外側境界の状態を比較した。

図５は、空気充填ガラス管１０の外側境界の理論予測の表面変位を示している。実験で見出された対応する測定表面変位は、図６に示されている。極軸の周りの区分は単位°で与えられ、放射軸は両方の図で変位の絶対値を示している。約１２０°の相対角度における三つの主要な葉部、および正反対のより小さな葉部が、計算結果および測定結果の両方で見られる。測定データのより大きな角度的広がりは、駆動振動子２０の角度方向の結合の幅によるものであった。

ガラス管１０に流水を充填した場合、図６に示した四つの葉状外部変位は、図７に示した理論的予測結果、および図８に示した実験的外側境界変位の両方に見られるように強い双極子に畳み込まれる。従って、円筒管の好ましい振動モードは双極子であることが結論付けられた。

それから、流水に粒子（ラテックス微小球）を加えた。図９は、第一振動子２０に電圧を印加する前の粒子凝集パターンを示している。その後、駆動振動子６０を用いて、管１０に０．８〜０．９Ｗ印加した。図６を参照すると、ほんの数粒子の直径にわたる粒子凝集ライン２００を形成するのに約５秒かかった。

０．０２〜０．２重量％の様々な濃度範囲の粒子を調べた。凝集時間には有意な違いは観察されなかったが、０．１重量％より高濃度の粒子を含む実験では既に議論した二次的力によって塊の増大を示した。なお、塊も中心に集中していたが、１Ｗ未満の電力レベルでは分離しなかった。

粒子の凝集は低い入力電力を用いて観察され、従来技術で説明した機器の本質的な注意深い振動子／システムの位置合わせは不要であった。従来、キャビティ内で対向する振動子を用いる場合、振動子の位置を用いてキャビティの共振を調整する。時間が経つと、振動子はシステムに対する小さな衝撃によって位置ズレする。さらに、従来の音響凝集法では、１／４波長整合層と１／２波長キャビティを用いて、軸非対称システムを注意深く位置合わせする必要がある。システムの本質的に対称な形状を用いれば、注意深い位置合わせを行う必要がなくなる。

従来の音響分離および操作技術では、音響場は励起振動子と同一線上のみに存在している。流動システムでは、音響場内の粒子の滞留時間は振動子の物理的サイズによって制限される。この制限のため大量のエネルギーを振動子に投入することで、この時間的に短い相互作用を補償する必要がある。この流体内に大量のエネルギーを投入することは、大きな温度のバラツキ、キャビテーション、および対流をもたらす。

しかし、この発明では管の構造全体を励起することによって、活性領域は振動子のサイズによっては限定されず、むしろ構造のサイズによって限定される。音響場はこのより大きな体積全体に分散され、フローストリーム内に著しく低い音響エネルギー密度がもたらされる。従って、温度効果は誘導されず、場内の粒子の滞留時間は劇的に増大する。

システムの双極子モードへの凝集の一致が示された。弾性力学方程式を二次元に低減することは、適切な簡略化であることが示された。振動のグローバル行列モデルの正当性も示した。粒子凝集に対する最適な材料特性および幾何的パラメータの決定に、このモデルを適用できることが証明された。

ここで図１１を参照すると、例１のガラス管と比較するために厚壁円筒水晶管１５をテストした。水晶管１５の内径ｑｒは２．０ｍｍ、外径ｑＲは７．８５ｍｍであった。第一振動子２０は、図１と同様に水晶管１５に軸方向に接続するように取り付けた。

水晶管１５の材料特性は、縦音速５７００ｍ／秒、横音速２６５０ｍ／秒、および密度２．６５ｇ／ｃｍ^３であった。空気および水の特性は例２に対しても、例１で用いたものと同様のものを用いた。理論的モデルの外側境界表面振動は、図１２に示した水晶管１５に対しては４６２ｋＨＺにおいて双極子を予測した。実際の表面振動測定は、図１３に示した結果をもたらした。図からわかるように、予測結果と実験結果の間に良好な一致があった。図１２に示したように、水晶内の双極子振動の予測強度は、図９に示したガラスのものより大きくなることに注意することは価値がある。従って、入力電力が等しい場合、水晶管は流水内で粒子をより密に集束させることがわかると予想される。

双極子振動と凝集の間のこの主張を確認するために、水晶管を介して粒子を供給し、４６２ｋＨｚにおいて凝集パターンを画像化した。得られた粒子凝集パターンの顕微鏡写真は、図１４に示されている。なお、双極子は凝集が発生する周波数には対応しており、さらにガラスに対して水晶を用いると、凝集した粒子３００はより集束した線を形成する。

（応用）
低電力音響凝集の最も一般的な前提は、１／４波長整合層を必要とすることである。この種のシステムでは、入射音響外乱は整合層内で共振的に増幅され、より高いエネルギー伝達効率をもたらす。しかし、進行波の場合でも、適切な配置のための平面または共焦点幾何形状の本質的な位置合わせの問題がそのプロセスをより困難にする。

円筒壁の１／４波長の厚さよりかなり小さいところで駆動することによって生成された強励起キャビティモードの生成は、いくつかの用途に対してやや興味ある可能性を提供する。例えば、様々な細胞の種類についての生物学的研究に焦点を当てる傾向の増大と共に、生体細胞や細胞小器官の別個の集団を区別、解析、および定量化する機能が著しく重要になっている。フローベースのサイトメトリおよび細胞選別は、固有の化学的マーカの発現に基づいて細胞の識別、解析、および精製を可能にする固有の技術である。さらに、細胞および微小球のアレイの両方での生化学的反応のフローサイトメトリ解析は、生物医学、生化学およびゲノム分析で広く用いられている急成長分野である。

この発明の流体力学的集束によって提供される非常に微細な配置は、フローサイトメトリを用いた正確な測定の重要な用途である。図１５を参照すると、既存のフローサイトメトリは流体力学的集束を用いて、高線速度（１〜１０ｍ／秒）で移動する分析対象（直径５〜１０μｍ）の細く集束し凝集させたサンプルストリームを生成し、密に集束させた（直径１０〜１００μｍ）レーザビーム（またはアークランプ等の他の密に集束させた光源）を照射する。レーザとサンプルストリームの相互作用によって形成された調査体積内では、高開口率光学系（例えば、顕微鏡の対物レンズまたは非球面レンズ）および光電子増倍管（ＰＭＴ）、アバランシェフォトダイオード（ＡＰＤ）、フォトダイオード等の高感度光検出器、およびＣＣＤまたはＣＭＯＳアレイシステム等のアレイベースの検出器を用いて、分析対象との相互作用による蛍光の複数の波長帯域を備えた光散乱を収集する。それから、収集した波長帯域を既知の元素および分子に関連した波長帯域のライブラリと比較し、分析対象の化学的組成を識別する。

細胞や微小球（直径１０μｍ以下）等の解析下の分析対象は、調査体積から自由な蛍光体をほとんど除去する。従って、非拘束の蛍光プローブからのバックグラウンドは低く、分離ステップなしで粒子関連プローブの高感度測定を可能にする。フローサイトメトリは、既存の流速（ｍ／秒）における最小数百個の蛍光体と、低い流速（ｃｍ／秒）を備えた単一蛍光体を検出できる。既存のサイトメトリの高線速度と小さな調査体積は数μｓという通過時間をもたらし、蛍光および散乱信号を記録するために、最大２０ＭＨｚの速度で動作する高速アナログデジタル変換器（ＡＤＣ）の使用を必要とする。なお、当業者は、超伝導量子干渉素子（ＳＱＵＩＤ）または巨大磁気抵抗（ＧＭＲ）検出器を備えたフローサイトメトリを用いて、ラマン光散乱の収集や磁気モーメントの検出等の別の様式を利用することもできる。

この発明は、既存の流体力学的集束を用いるのではなく、解析用の分析対象を音響的に集束するために用いられる。音響集束は、流体力学的シースの必要性をなくし、さらに低線速度で高解析速度を可能にする。ここで図１６を参照すると、音響集束フローサイトメトリでは、この発明は既存のサイトメトリの流体力学的集束ノズルの代わりに用いられ、分析対象の密に集束した凝集サンプルストリームを実現する。従って、サンプルストリームは既存のフローサイトメトリと同一の方法で調べられるが、サンプルストリームを集束させるためのシースフローおよび関連装置を必要とせず、機器の携帯性を向上させ消耗品コストを低減できる。

図１６に示したようなシースフローのないフローサイトメトリ内の音響集束を示す結果は、図１７ａと１７ｂに示されている。図１７ａは、未集束の流体ストリーム内の均一に着色した蛍光微小球から収集した測定蛍光の一次元ヒストグラムをグラフ的に示している。図１７ｂは、この発明を実施し音響的に集束した流体ストリーム内の均一に着色した蛍光微小球から収集した測定蛍光の一次元ヒストグラムをグラフ的に示している。ｘ軸は測定した蛍光強度ビンに対応し、ｙ軸は各ビン内の粒子の数に対応している。レーザは、円筒キャビティ内の均一に着色した蛍光粒子（直径１０μｍ）を照射するために用いた。

図１７ａは、微小球が流れるストリームの特定の領域に集束されないため、集束したレーザビームが流れるストリームを横切る際、その強度を変化させることによって励起されることを示している。ムラのある照射は、放射された蛍光の高いバラツキの度合によって示されるようなランダム配置によるものである。蛍光値の広い分布は、微小球がサンプルストリーム内にランダムに配置されていることを示している。

それに対し、図１７ｂは、この発明によって提供された音響放射圧が流体ストリーム内の対象蛍光微小球を整列させ、全ての微小球が均一な照射を受けることをグラフ的に示している。図１７ｂはこれを、蛍光強度の分布が密なピークを構成することで示し、微小球が集束されたレーザ光の同様の強度によって励起されることを示す。この結果は、従来技術のフローサイトメトリで用いられる流体力学的集束と同様に、音響放射圧を用いてサンプルコア内に分析対象を整列できることを示している。

さらに、この発明で分析対象の集束および凝集の両方を行う際、低い線速度で多くの分析対象を解析できる。例えば、直径２００μｍのチャネルを介したサンプルの容積送出速度が７５μｌ／分であれば、コア速度（２×平均速度）は８ｃｍ／秒になる。これは、既存の集束フローサイトメトリ（通常１〜１０ｍ／秒の範囲）よりずっと遅い。従って、この発明を用いると、２０μｍの調査体積を介した通過時間は約２５０μ秒になる。この遅い通過時間（既存のシステムより２０〜１００倍遅い）はより低速のデータ捕捉システムを用いた分析対象の解析速度を可能にし、安価でより小さく必要電力も少なくなる。この発明のよって提供される通過時間の拡大は、光信号のより長い収集を可能にし、既存のシステムより高感度の測定を提供する。

さらに、音響集束の凝集効果は、既存のフローサイトメトリシステムを用いると時間的制約のために解析が困難になる非常に低濃度のサンプルの解析を可能にする。例えば、直径が大きな集束チャンバを用いて、ｍｌ／分という体積流量でサンプルを送出できる。これは、最も一般的な流体力学的フローシステム（μｌ／分）に比べて非常に高いサンプル送出速度であり、法医生物学や他の用途で一般に見られるような極めて低濃度のサンプルの解析を可能にする。フローチャンバの直径を増大させることによって、さらに低濃度のサンプルを効率的に解析できる。実際、集束チャンバの直径は、解析するサンプルの予測濃度に応じて調整できる。

この発明の以上の説明は、例示および説明のために提示され、包括的なものでも開示した正確な形態に発明を限定するものでもなく、以上の開示内容の観点から明らかに様々な修正および変形が可能である。

実施例は発明の原理を最も良く説明できるように選択および記述してあり、従って、その実際の応用によって、他の当業者は想定される特定の使用に適応するように、様々な実施例および様々な修正を伴ってこの発明を最も良く利用できる。発明の範囲は、添付の請求項によって定義されるものとする。

図１ａ円筒積層システムの断面図である。 図１ｂ円筒積層システムの断面図である。 図２はこの発明を実施するためのガラス管を用いる実験的構成の概略図である。 図３はガラス管の表面振動の測定に用いられる角度走査装置の概略図であり、前記ガラス管はこの発明を実施するために用いられる。 図４はガラス管を介して流れる水内の粒子濃度パターンの画像化に用いられる底部照射顕微鏡の概略図であり、前記ガラス管はこの発明を実施するために用いられる。 図５は空気充填ガラス管の予測した外側境界面の変位を示すグラフである。 図６は空気充填ガラス管の実験的に測定した外側境界面の変位を示すグラフである。 図７は水充填ガラス管の予測した外側境界面の変位を示すグラフである。 図８は水充填ガラス管の実験的に測定した外側境界面の変位を示すグラフである。 図９はこの発明の実施前に、ガラス管を介して流れる水内の１０μｍ粒子の顕微鏡写真である。 図１０はこの発明を実施している際、ガラス管を介して流れる流体内の１０μｍ粒子の凝集を示す顕微鏡写真である。 図１１はこの発明を実施するための水晶管を用いた実験的構成の概略図である。 図１２は水充填水晶管の予測した外側境界面の変位を示すグラフである。 図１３は水充填水晶管の実験的に測定した外側境界面の変位を示すグラフである。 図１４は４６２ｋＨｚにおいて、水晶管を介して流れる水内で凝集させた１０μｍ粒子の顕微鏡写真である。 図１５は従来技術の既存のフローサイトメトリ構成の概略図である。 図１６はこの発明を用いたフローサイトメトリ構成の概略図である。 図１７ａは未集束の流体ストリーム内で、均一に着色した蛍光微小球から収集した蛍光の一次元ヒストグラムのグラフである。 図１７ｂは音響的に集束した流体ストリーム内で、均一に着色した蛍光微小球から収集した蛍光の一次元ヒストグラムのグラフである。

Claims (27)

1. 音響放射圧を使用して流体内で分析対象を凝集させるための装置であって、
   高周波電気信号を出力するための波形発生器と、
   １体の音響信号発生振動子と、
   本質的に軸対称構造を有する管と、を備え、
   前記１体の音響信号発生振動子は、前記管に音響的に結合し、且つ、前記高周波電気信号を音響信号に変換することに使用され、前記管を軸周りで自然共振させ、前記管の構造全体を励起する周波数を与え、
   前記管は、当該管内で前記音響信号を前記音響放射圧に変換し、前記音響放射圧によって生成された共振圧力場の放射力ポテンシャルの最小域に向けて前記管内で前記分析対象を凝集させることを特徴とする装置。
2. 前記管は、弾性材料を備えることを特徴とする請求項１記載の装置。
3. 前記駆動振動子の形状は円筒型であることを特徴とする請求項１記載の装置。
4. 前記波形発生器は、異なる周波数の様々な電圧波形を生成可能な任意の電源回路から選択されることを特徴とする請求項１に記載の装置。
5. 前記波形発生器の出力を増幅するために電力増幅器をさらに備えることを特徴とする請求項１に記載の装置。
6. 共振周波数を維持すると共に周囲温度の変動を補償するために、前記音響放射圧をモニターするためのモニター用（第二）振動子をさらに備えることを特徴とする請求項１に記載の装置。
7. 前記第二振動子は、圧電セラミック、圧電塩、圧電高分子、圧電結晶、超磁歪材料及び電磁振動子からなる群から選択されることを特徴とする請求項６に記載の装置。
8. 音響放射圧を使用して流体内で分析対象を凝集させるための方法であって、
   単一の音響信号発生振動子を使用して、本質的に軸対称構造を有する管内に前記音響放射圧を発生させるステップと、
   前記管を通して前記分析対象を含む流体を流すステップと、
   前記振動子を駆動し、前記管を軸周りで自然共振させ、前記管の構造全体を励起する周波数を与えることによって前記管の外側境界面の移動を促すステップと、
   前記音響放射圧によって生成された共振圧力場の放射力ポテンシャルの最小域に向けて前記管内で前記分析対象を凝集させるステップと、を含む方法。
9. 前記外側境界面の移動をモニターするステップと、
   モニター用振動子によって、共振周波数を維持すると共に周囲温度の変動に適応するように前記音響放射圧を調整するステップと、をさらに含むことを特徴とする請求項８に記載の方法。
10. 分析対象を解析するためのフローサイトメータであって、
    前記分析対象の流体サンプルストリームを受領するためのインレットを有する管と、
    前記管に結合した音響信号発生振動子であって、当該音響信号発生振動子は、音響信号を前記管に発生させて、前記管を軸周りで自然共振させ、前記管の構造全体を励起する周波数を与えることによって前記管の外側境界面の移動を促すことが可能な音響放射圧を前記管内に引き起こすことにより、前記音響放射圧によって生成された共振圧力場の放射力ポテンシャルの最小域に向けて前記流体サンプルストリーム内で前記分析対象を凝集させる、音響信号発生振動子と、
    前記分析対象を分析するための光学機器であって、前記分析対象を分析するために蛍光の複数の波長帯域と共に光散乱を形成するための光源を備える光学機器と、
    前記分析対象の分子構成を決定するために、前記形成された光散乱及び蛍光の複数の波長帯域を受領する収集光学機器と、を備えることを特徴とするフローサイトメータ。
11. 前記管は、本質的に軸対称構造を有していることを特徴とする請求項１０に記載のフローサイトメータ。
12. 前記管は円筒形状であることを特徴とする請求項１０に記載のフローサイトメータ。
13. 前記波形発生器は、異なる周波数の様々な電圧波形を生成可能な任意の電源回路から選択されることを特徴とする請求項１０に記載のフローサイトメータ。
14. 前記波形発生器の出力を増幅するために電力増幅器をさらに備えることを特徴とする請求項１０に記載のフローサイトメータ。
15. 共振周波数を維持すると共に周囲温度の変動を補償するために、前記音響放射圧をモニターするための、モニター用（第二）振動子をさらに備えることを特徴とする請求項１０に記載のフローサイトメータ。
16. 前記第二振動子は、圧電セラミック、圧電塩、圧電高分子、圧電結晶、超磁歪材料及び電磁振動子からなる群から選択されることを特徴とする請求項１５に記載のフローサイトメータ。
17. 前記光源がレーザであることを特徴とする請求項１０に記載のフローサイトメータ。
18. 前記光源がアークランプであることを特徴とする請求項１０に記載のフローサイトメータ。
19. フローサイトメトリの方法であって、
    管のインレットに分析対象を含有する流体ストリームを供給するステップと、
    前記管を音響放射圧に曝露して、前記管を軸周りで自然共振させ、前記管の構造全体を励起する周波数を与えることによって前記管の外側境界面の移動を促すことにより、前記音響放射圧によって生成された共振圧力場の放射力ポテンシャルの最小域に向けて前記流体ストリーム内で前記分析対象を凝集するステップと、
    フローサイトメータによって前記分析対象を解析するステップと、を含む方法。
20. 前記外側境界面の移動をモニターするステップと、
    共振周波数を維持すると共に周囲温度の変動に適応するように前記音響放射圧を調整するステップと、をさらに含むことを特徴とする請求項１９に記載の方法。
21. フローサイトメトリの方法であって、
    管のインレットに分析対象を含有する流体ストリームを供給するステップと、
    前記管を音響放射圧に曝露して、前記管を軸周りで自然共振させ、前記管の構造全体を励起する周波数を与えることによって前記管の外側境界面の移動を促すことにより、前記音響放射圧によって生成された共振圧力場の放射力ポテンシャルの最小域に向けて前記流体ストリーム内で前記分析対象を凝集するステップと、
    光学機器で前記分析対象を解析するステップと、を含み、
    前記分析対象を解析するステップは、光散乱及び蛍光の複数の波長帯域を形成する光源に前記分析対象を曝露すること、光検出器で光散乱及び蛍光の複数の波長帯域を収集すること、及び、前記収集した波長帯域を識別して前記分析対象の分子構造を決定すること、
    を含むことを特徴とする方法。
22. 前記分析対象を分析するステップは、磁気モーメント信号を収集して、前記分析対象の分子構造を決定するステップを含んでいることを特徴とする請求項２１に記載の方法。
23. 分析対象を解析するためのフローサイトメータであって、
    前記分析対象の流体ストリームを受領するためのインレットを有する管と、
    前記管に音響的に結合した単一の音響信号発生振動子であって、当該単一の駆動振動子は、前記管内に音響放射圧を引き起こす音響信号を発生させることにより、前記管を軸周りで自然共振させ、前記管の構造全体を励起する周波数を与えることによって前記管の外側境界面の移動を形成して、前記音響放射圧によって生成された共振圧力場の放射力ポテンシャルの最小域に向けて前記流体ストリーム内で前記分析対象を凝集させる、音響信号発生振動子と、
    前記分析対象を解析するために前記管に流動可能に接続されたフローサイトメータと、
    を備えることを特徴とするフローサイトメータ。
24. 前記外側境界面の移動をモニターし、共振周波数を維持すると共に周囲温度の変動に適応するように前記音響放射圧を調整するためのモニター用振動子をさらに備えることを特徴とする請求項２３に記載のフローサイトメータ。
25. 前記管は、本質的に軸対称構造を有していることを特徴とする請求項２３に記載のフローサイトメータ。
26. 前記管は、円筒形状を有していることを特徴とする請求項２５に記載のフローサイトメータ。
27. 音響放射圧を使用して流体内で分析対象を凝集させるための装置であって、
    高周波電気信号を出力するための波形発生器と、
    １体の音響信号発生振動子と、
    本質的に軸対称構造を有する管と、を備え、
    前記１体の音響信号発生振動子は、前記管に音響的に結合し、且つ、前記高周波電気信号を音響信号に変換することに使用され、前記管を軸周りで自然共振させ、前記管の構造全体を励起する周波数を与え、
    前記管は、当該管内で前記音響信号を前記音響放射圧に変換し、前記音響放射圧によって生成された共振圧力場の放射力ポテンシャルの最小域に向けて前記管内で前記分析対象を凝集させ、
    前記流体が流動する前記管の振動モードにおいて前記管の外側境界面変位が双極子を示すように、前記管の内径、外径及び駆動周波数が定められていることを特徴とする装置。