JP5697832B2 - ホールセル−生体内変換からの反応溶液の後処理 - Google Patents
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Description
2−フェニルエタノールのホールセル触媒により触媒作用された合成の際の−<10g/Lの低い基質濃度又は生成物濃度ですら生じる−エマルションの形成を回避するためにSerp et al.は、有機溶媒(セバシン酸ジブチル)が包含されている合成樹脂固定化物を抽出のために使用した(D. Serp, U. von Stockar, I. W. Marison, Biotechnol. Bioeng. 2003, 82, 103-110)。この生成物2−フェニルエタノールはこの際、in situで前記合成樹脂固定化物中への取り込みを介してこの反応媒体から除去される。但し、固定化物中に包含された有機溶媒の使用下でのこの方法は、極めて煩雑であってかつ費用がかかる。加えて、前記溶液中でのこの利用される生成物濃度は低い(<10g/L)。
a)pH値を4より低く調整する工程;
b)濾過助剤の存在下で、有利には反応溶液中の濾過助剤の存在下で、反応溶液を濾過する工程;
c)選択的に、有機成分中に含有される生成物を更に濃縮及び/又は精製する工程
を有する後処理方法により解決される。
b1)有機溶媒又は有機溶媒の混合物を用いて、前記濾過の際に得られた濾滓を洗浄する工程;
b2)選択的に、工程b1)で得られた濾過物又は新規に添加された有機溶媒又は有機溶媒の混合物を用いて、工程a)で得られた濾過物の水性成分を抽出する工程;及び
b3)前記有機成分から有機溶媒を除去する工程
を有する。
公知技術の問題を解決するために以下の試験を実施した。
例1(後処理試験のための反応混合物の製造のための一般的な試験規定;基質濃度500mM):
Titrino反応容器(製造者:Metrohm)中で、リン酸緩衝液(0.1M、pH7.0に調整)50mLに室温で、WO2005121350に記載されたホールセル触媒E.Coli DSM14459 (pNO5c,pNO8c)((R)−アルコールデヒドロゲナーゼ、ラクトバチルス・ケフィア(Lactobacillus kefir)及び好熱好酸性腐食古細菌(Thermoplasma acidophilum)からのグルコースデヒドロゲナーゼを含有)を、バイオマス濃度約50g/L(例2及び3)又は約25g/L(例4〜6)に相当して、D−グルコース(使用されたp−クロロアセトフェノンの量に対して1.05〜6当量)及びp−クロロアセトフェノン3.87g(使用されたリン酸緩衝液の容積に対して基質濃度0.5Mに相当)を添加した。この反応混合物を22時間室温で撹拌し、その際このpHを苛性ソーダ液(2M NaOH)の添加により一定にpH範囲pH6.5〜7.0に維持した。規則的な間隔で試験体を取り出し、この変換をHPLCを用いて算出した。22時間の反応時間後に、生成物(R)−(4−クロロフェニル)エタン−1−オールへの変換率は99%より高かった。この反応混合物を引き続き、後処理試験のために使用した。
例1において記載された方法(2倍のバッチ容積)により製造された反応溶液(エマルション)を、40〜200μmの孔サイズを有し、約0.5cmの厚さのCelite層(Celite Hyflo Supercel)で負荷したSchottガラスフィルターを介して真空の適用下で濾過した。この際、6.5時間の濾過時間が必要であった。この−非常に濁った−濾過物を、3×50mL MTBEを用いて抽出し、この際、5時間にわたる極めてゆっくりとした分離を引き起こす混合相が生じた。硫酸マグネシウムによるこの一緒にした有機相の乾燥、濾過及びこの有機溶媒の真空(50℃、水ジェット真空)中での引き続く除去後に、20.1%の単離収率を有する所望の生成物を得た。
例1に記載された方法により製造された反応溶液(エマルション)をMTBE100mL及びCelite1.5g(Celite Hyflo Supercel)を混合した。5分間の撹拌後、引き続き真空の適用下で濾過した。この際、7時間の濾過時間が必要であった。引き続きこの濾滓をMTBE50mLで後洗浄した。この−非常に濁った−濾過物に前記洗浄溶液を添加し、この生じる混合物をMTBE2×50mLを用いて抽出した。硫酸マグネシウムによるこの一緒にした有機相の乾燥、濾過及びこの有機溶媒の真空(50℃、水ジェット真空)中での引き続く除去後に、55.4%の単離収率を有する所望の生成物を得た。
例1に記載された方法(0.6倍のバッチ容積)により製造された反応溶液(エマルション)を、pH4.0のpH値の調整まで濃塩酸と混合し、この際このバイオマスは凝結した。引き続き真空の適用下で濾過し、この際ゲル形成のために、さほど言及するほどでない濾過を行い、相応してこの濾過を中断した。
例1に記載された方法(0.6倍のバッチ容積)により製造された反応溶液(エマルション)を、pH2.4のpH値の調整まで濃塩酸と混合し、この際このバイオマスは凝結した。引き続き約0.5cmのCelite層(Celite Hyflo Supercel)で負荷したフィルターを介して真空の適用下で濾過し、この際、5分間よりも少ない極めて迅速な濾過が観察された。引き続きこの濾滓をMTBE30mLで後洗浄し、更なる45mLでもってこの濁った濾過物に添加した。この際、良好な相分離が行われた。MTBE75mLの更なる抽出後、この一緒にした有機相を硫酸マグネシウムを介して乾燥させ、濾過し、かつ引き続き真空中で有機溶媒を除去し(50℃、水ジェット真空)、この際所望の生成物を単離収率79.2%で得た。
例1に記載された方法により製造された反応溶液(エマルション)を、pH2.6のpH値の調整まで濃塩酸と混合し、この際このバイオマスは凝結し、そしてここにCelite(Celite Hyflo Supercel)2gを添加した。引き続き真空の適用下で濾過し、この際5分間よりも少ない良好な濾過が観察された。引き続きMTBE2×80mLでこの濾滓を後洗浄し、この(水性の、第一の)濾過物をこの両方の有機性洗浄相(2×80mL)で洗浄し、この際そのつど良好な相分離が観察された。この一緒にした有機相を硫酸マグネシウムにより乾燥させ、濾過し、かつ引き続き真空中で有機溶媒を除去し(50℃、水ジェット真空)、この際この所望の生成物を78.4%の単離収率で得た。この形成された生成物のエナンチオマー過剰は、99.8%eeよりも高かった。
Claims (14)
- ホールセル触媒、水性成分及び有機成分を含有する反応溶液を後処理するにあたり、前記有機成分が濃縮すべき生成物を含有する後処理方法において、次の工程:
a)pH値を4より低く調整する工程、
b)前記a)工程の後に、濾過助剤の存在下で、反応溶液を濾過する工程、
を特徴とし、後処理すべき前記反応溶液は、ホールセル触媒、水性成分及び濃縮すべき生成物を含有する有機成分からなるエマルションであり、
前記濾過助剤として、珪藻土、クリストバライト及び濾過珪砂並びにこれらの成分からの混合物が使用され、
前記有機成分が、前記反応溶液の全体の容積に対して、50g/Lよりも高い割合である後処理方法。 - 前記濾過助剤が前記反応溶液中に存在する、請求項1記載の方法。
- 前記b)工程の後に、次の工程:
1)有機溶媒又は有機溶媒の混合物を用いて、濾過の際に得られた濾滓を洗浄する工程、
2)工程1)で得られた濾過物又は新規に添加された有機溶媒又は有機溶媒の混合物を用いて、工程a)で得られた濾過物の水性成分を抽出する工程、及び
3)前記有機成分から有機溶媒を除去する工程
を更に有することを特徴とする、請求項1又は2記載の方法。 - 前記有機成分は、90%(m/m)より多く光学活性アルコールからなることを特徴とする、請求項1から3のいずれか1項記載の方法。
- 前記ホールセル触媒は、前記反応溶液中で75g/Lまでの割合であり、その際gは前記バイオマスの湿分質量に関するものであることを特徴とする、請求項1から4までのいずれか1項記載の方法。
- 前記割合が50g/Lまでである、請求項5記載の方法。
- 前記割合が30g/Lまでである、請求項6記載の方法。
- 前記割合が25g/Lまでである、請求項7記載の方法。
- 前記濾過助剤として、Celite Hyflo Supercelが使用される、請求項1から8までのいずれか1項記載の方法。
- 前記反応溶液が、pH3未満のpH値に調整されることを特徴とする、請求項1から9までのいずれか1項記載の方法。
- 前記反応溶液がpH2〜3のpH値に調整される、請求項10記載の方法。
- 前記反応溶液がpH2.5〜3のpH値に調整される、請求項11記載の方法。
- 前記濾滓の洗浄及び/又は前記水性成分の抽出のための有機溶媒として、MTBE(tert−ブチルメチルエーテル)及び/又はETBE(tert−ブチルエチルエーテル)及び/又は酢酸エチルエステルが使用されることを特徴とする、請求項3から12までのいずれか1項記載の方法。
- 前記有機成分の割合が、前記反応溶液の全体の容積に対して、100g/Lよりも高い、請求項1から13までのいずれか1項記載の方法。
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