CN100581633C - 来自全细胞生物转化的反应溶液的处理方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种反应溶液的处理方法，所述反应溶液包含全细胞催化剂、含水组分和有机组分，其中所述反应溶液是由采用全细胞催化剂的氧化还原反应产生的反应溶液，所述有机组分包含超过90%(w/w)的光学活性醇作为待富集的产物，所述方法用以下步骤处理所述反应溶液：a)将pH值调节到小于4；b)在有助滤剂的情况下过滤所述反应溶液以获得滤饼和水相，优选所述助滤剂在所述反应溶液中；c)任选地：进一步富集和/或纯化包含在所述有机组分中的产物。

Description

来自全细胞生物转化的反应溶液的处理方法

技术领域

本发明涉及一种反应溶液的处理方法，该溶液包含全细胞催化剂、含水组分和有机组分，其中有机组分包含待富集的产物。本发明特别涉及一种由全细胞生物转化得到的反应溶液的处理方法，该溶液包含全细胞催化剂、含水组分和相对于总量比例＞50g/L的有机组分。

背景技术

使用全细胞催化剂(在别处也称作全细胞生物催化剂)的生物转化已经被证明是用于精细化学品合成的很有吸引力的生产技术(概况参见例如：S.Buchholz，H.

″Ganzzellbiokatalyse″在Angewandte Mikrobiologie，第8章，Springer-Verlag，Berlin，2006，161f页)。与分离酶相比，尤其是净化的酶，重组体全细胞催化剂通常代表更有成本效益型的催化剂，因为通过直接使用在发酵中获得的生物质，在全细胞催化剂的生产中处理和纯化步骤被省略(相比于通过利用分离酶)。另外，在氧化还原反应中使用全细胞催化剂允许反应在不添加外部的昂贵辅助因素的情况下进行(参见WO/2005/121350)，然而辅助因素的添加在使用分离酶的反应中是必要的。

目前包含全细胞催化剂的生物转化反应溶液的各种处理方法已众所周知。普遍的问题是在萃取操作中乳状液的形成，以及漫长、不经济的处理时间，尤其是萃取和/或过滤时间，例如即使在实验室规模也要好几个小时或甚至不能分离这些混合物，特别是结果形成稳定乳状液时。G.K.Leppchen，T.Daussmann，M.Bertau，Chem.Ing.Techn.2004，76，1739-1742G.K.Leppchen，T.Daussmann，M.Bertau，Chem.Ing.Techn.2004，76，1739-1742的研究可以引用为典型实例，其中在具有高细胞密度的全细胞生物转化的萃取过程中，主要的问题在于与有机溶剂接触时稳定凝胶和粘液的形成。其相应的结果是需要将该产品随后通过蒸馏来纯化，在后续处理中产生较大的损失，从而整个处理的经济性降低、成本高昂。

另外，在从2004年起对生物转化溶液的后续处理的综述，Yazbeck等人(D.R.Yazbeck，C.A.Mart inez，S.Hu，J.Tao，Tetrahedron：Asymmetry 2004，15，2757-2763)详细地谈及因形成乳状液而带来的通常复杂产品分离。需要指出为避免该问题并非有很多使用方便的技术可利用，因此在该体系中更需要能更好提高后续处理的方法。

因此，对通常能避免上述限制的处理方法存在相当大的兴趣。迄今为止，已有下列方法公开：

在2-苯乙醇的全细胞催化合成中，为了避免甚至在＜10g/L的低的底物或产物的浓度时乳状液形成的发生，Serp等人使用合成树脂的固定物(immobilizate)来萃取，其中有机溶剂(癸二酸二丁酯)是包封的(enclosed)(D.Serp，U.von Stockar，I.W.Marison，Biotechnol.Bioeng.2003，82，103-110)。通过在合成树脂的固定物被吸收，2-苯乙醇产物从反应介质中原位去除。然而，这种使用包封在固定物中的方法是昂贵和高成本的。此外，用于溶液的产物浓度较低(＜10g/L)。

另一种处理乳状液的方法使用若干串联设置的旋液分离器(L.-Q.Yu，T.A.Meyer，B.R.Folsom，EP 900 113，1999)，所述乳状液包含有机相、水相和全细胞催化剂。来自一个旋液分离器的溢出输送到下一个旋液分离器，以便水相可以与有机相和生物催化剂分离。然而，该方法需要高的成本支出，是相对昂贵的。

近来，Bertau等人公开了通过使用适合的酶作为破乳化剂可以避免与有机溶剂接触时稳定的凝胶和粘液(G.K.Leppchen，T.Daussmann，M.Bertau，Chem.Ing.Techn.2004，76，1739-1742和G.

K.Leppchen，T.Daussmann，M.Bertau，Biotechnol.Bioeng.2004，87，525-536)。在这种情况下，通过由全细胞催化剂得到的通过微生物释放进入该介质的生物乳化剂，凝胶形成的问题可以被抑制。然而，缺点是需要另外添加酶组分，特别是仅在较大费用下得到时。另一个问题是发生副反应，由添加的蛋白酶所引起(G.K.Leppchen，T.Daussmann，M.Bertau，Chem.Ing.Techn.2004，76，1739-1742)。优选存在例如酯基，以及酰胺基的裂解。

作为替代方案，Hanson等人公开了在生物转化之后使用助滤剂来实现(R.L.Hanson，S.Goldberg，A.Goswami，T.P.Tully，R.N.Patel，Adv.Synth.Catal.2005，347，1073-1080)。根据该方法，减少有机酮底物是在中性pH值(pH7)下用全细胞催化剂和约20g/L反应量的底物并使用相对于有机底物使用量10倍的高价格的助滤剂Amberlite XAD-16来实现的。虽然使用Amberlite XAD-16经证明是适合的，然而在没有这些助滤剂的情况下使用乙基乙酸乙酯或MTBE直接萃取经证明是不可行的，这会导致乳状液问题。然而，Hanson等人的方法的缺陷是具有局限性，例如高价格的AmberliteXAD-16作为助滤剂相对于有机组分10倍用量的高消耗量，甚至对于仅约为20g/L的低比例的有机酮底物时。

发明内容

因此本发明的技术问题是提供快速、简单、廉价和有效的处理由全细胞生物转化产生的反应溶液的方法，所述方法基于合理价格的溶剂或添加剂，需要很少的成本支出。本发明特别提供一种方法，用于处理包含全细胞催化剂、含水组分和相对于总量比例＞50g/L的有机组分的反应溶液，避免目前工艺水平的上述缺点。具体来说，该方法适合于处理由使用全细胞催化剂氧化还原反应产生的反应溶液，其中有机组分包含＞90％(w/w)的光学活性醇。

本发明的技术问题是通过一种处理反应溶液的方法来解决的，所述反应溶液包含全细胞催化剂、含水组分和有机组分，其中所述反应溶液是由采用全细胞催化剂的氧化还原反应产生的反应溶液，所述有机组分包含超过90％(w/w)的光学活性醇作为待富集的产物，使用以下步骤处理反应溶液：

a)将pH值调节到小于4；

b)在有助滤剂的情况下过滤反应溶液以获得滤饼和水相，优选所述助滤剂在所述反应溶液中；

c)任选地：进一步富集和/或纯化包含在所述有机组分中的产物。

令人惊讶地发现通过将反应溶液pH值降低到小于4，在有助滤剂的情况下进行过滤，极大的提高了反应溶液的过滤速度。特别地，惊奇也是因为只降低pH值(实施例4＝比较例)，和在有助滤剂存在但没有降低pH值的情况下(实施例2、3＝比较例)过滤，从在全细胞催化反应中形成的乳状液开始，两者都存在不令人满意的产品分离/成品处理。在这种情况下助滤剂优选存在于反应溶液中。因此优选在过滤(在将pH值调节至小于4之前或之后)之前将助滤剂添加到反应混合物中，如根据本发明的实施例6所示。然而另一选择为-在将该反应混合物pH值调节到低于4之后-该反应混合物可以使用装有助滤剂的过滤器来过滤(参见例如实施例5)。

因此，基于合理价格的溶剂或添加剂，本发明提供一种快速、简单、廉价和有效的处理由全细胞生物转化产生的反应溶液的方法，仅需要低成本支出。根据本发明的方法尤其适合于处理反应溶液，该溶液包含全细胞催化剂、含水组分和具有相对于总量比例＞50g/L的有机组分，并且特别用于由用全细胞催化剂的氧化还原反应产生的反应溶液的处理，其中有机组分包含超过90％(w/w)的光学活性醇。

另外，优选方法具有以下步骤：

b1)使用有机溶剂或有机溶剂的混合物洗涤在过滤期间获得的滤饼；

b2)任选地：使用步骤b1)中获得的滤液或新添加的有机溶剂或有机溶剂的混合物萃取步骤b)中获得的所述水相以获得有机相，并从所述有机相中除去所述有机溶剂；和

b3)从所述有机组分中除去有机溶剂。

在反应溶液中被处理的有机组分应理解为反应所需要的最终产物，其可以与相应的起始产品和/或任何形成的副产物混合，最终产物是例如光学活性醇，所述醇由相应的酮在由全细胞催化剂的催化反应之后获得。通常，在反应之后需要的最终产物存在于作为与起始产品例如以95％∶5％(w/w)的比例、97％∶3％(w/w)或更高比例混和的混合物的有机组分中。

另外，所述方法优选其中有机组分包含超过90％(w/w)，特别优选超过95％(w/w)的光学活性醇。

具体来说，根据本发明的方法克服现有技术中将产物从被处理的反应溶液中分离的问题，其中所述反应溶液包括包含全细胞催化剂、含水组分和包含待富集产物的有机组分的乳状液。

进一步优选在反应溶液中全细胞催化剂的比例不高于75g/L，优选不高于50g/L，特别优选不高于30g/和更加特别是优选不高于25g/L(g是指生物质的湿重)。在该情况下全细胞催化剂在反应溶液中的比例至少为10g/L，特别地至少为20g/L(克是指生物质的湿重)是特别优选的。

所有已知的助滤剂可以作为助滤剂使用。在另一个优选方法中，助滤剂选自纤维素、硅胶、硅藻土、珍珠岩、方晶石、过滤用石英砾、活性碳、炭、木粉、基于合成树脂的助滤剂和它们的混合物。使用硅藻土、方晶石、过滤用石英砾和这些组分的混合物作为助滤剂是特别优选的。相当特别优选的，产品名为Celite Hyflo Supercel的产品作为助滤剂使用。

在根据本发明方法的一个优选实施方案中，调节反应溶液pH值小于3，优选pH值为2-3，特别优选pH值为2.5-3。

在本方法的进一步变化中，MTBE(甲基叔丁基醚)和/或ETBE(乙基叔丁基醚)和/或乙酸乙酯用作洗涤滤饼和/或萃取含水组分的有机溶剂。

在一种优选方法中，有机组分的比例相对于反应溶液总量大于50g/L，优选大于100g/L。

具体实施方式

本发明使用以下实施例解释，然而并非限定保护的范围。

实验实施例的普遍解释

为解决现有技术的问题进行以下测试：

以下测试代表比较例：按照Hanson等人的方法(Adv.Synth.Catal.2005，347，1073-1080)，助滤剂在进行生物转化之后使用。代替Hanson等人使用的Amberlite XAD-16，使用价格更有吸引力的助滤剂Celite Hyflo Supercel(＝商品名)。然而，该方法被证明是不适合于有机组分比例大于50g/L的生物转化(实施例2＝比较例)。在中性pH值-范围(pH值6.5-7.0)进行生物转化之后，形成稳定乳状液，其不能以可实行的方式使用助滤剂(以在过滤器上硅藻土层的形式)处理，导致非常缓慢的过滤，过滤时间为6.5小时，此外在萃取操作中的随后相分离也是非常缓慢的，超过5小时。另外，获得20.1％的低分离收率。

如果将助滤剂Celite Hyflo Supercel搅拌进入pH值为6.5-7的反应溶液然后过滤混合物，观察到同样地不令人满意的长达7小时的过滤时间(实施例3＝比较例)。获得的分离收率是再次不令人满意的，为55.4％。

另外，没有使用助滤剂的相应的测试即使将pH值降低到4也不会提供显著的过滤，以致于在这种情况下过滤不得不中断(实施例4比较例)。

相比之下，通过根据本发明的方法进行处理，实现了较短的过滤时间和高的分离收率(实施例5和6)。例如，如果将pH值在生物转化完成之后首先调节到pH值2.4，生成的反应混合物通过装有大约层厚为0.5cm的硅藻土(Celite Hyflo Supercel)的过滤器过滤，然后用有机溶剂洗涤，水相另外经受萃取处理，则获得79.2％的分离收率(实施例5)。此外，在该方法中获得小于5分钟的短的过滤时间。

如果将生物转化之后的pH值调节到pH值2.6，将Celite HyfloSupercel添加到反应混合物然后过滤，滤饼用有机溶剂洗涤，水相经受萃取处理，也获得高分离收率(78.4％)(实施例6)。在实例6中，再次获得小于5分钟的短的过滤时间。

实验实施例：

实施例1(制备处理测试用的反应混合物的普遍测试规格；500mM的底物浓度)：

在一个Titrino反应容器中(制造商：Metrohm)，将在WO/2005/121350中公开的全细胞催化剂E.coli DSM14459(pNO5c，pNO8c)以对应于大约50g/L生物质浓度(实施例2和3)或大约25g/L(实施例4-6)、右旋葡萄糖(相对于所用的对氯乙酰苯的量为1.05-6当量)和3.87g对氯乙酰苯(相对于所用的磷酸盐缓冲液的量，相应使用0.5M的底物浓度)在室温下添加到50ml的磷酸盐缓冲液中，其中所述全细胞催化剂E.coli DSM14459包含从Lactobacilluskefir中得到的(R)-乙醇脱氢酶和从Thermoplasma acidophilum(嗜酸细胞)得到葡糖脱氢酶。反应混合物在室温下搅拌22h，通过添加氢氧化钠溶液(2M NaOH)将pH值保持恒定在6.5-7.0的范围内。样品以定期的间隔取样，通过高压液相色谱法测定转化率。在22h的反应时间之后，产物(R)-(4-氯苯基)乙基-1-醇的转化率大于99％。然后反应混合物用于处理测试。

实施例2(比较例)

由实施例1描述的方法制备的反应溶液(乳状液)(双倍批量)在真空下通过一个孔径大小为40-200μm、装有大约0.5cm厚层的硅藻土(Celite Hyflo Supercel)的Schott玻璃滤器过滤。需要6.5小时的过滤时间。非常浑浊的滤液用3×50mL MTBE萃取，形成一个混合相，导致超过5小时的非常缓慢的分离。用硫酸镁干燥组合的有机相、过滤然后在真空中除去有机溶剂(50℃，真空喷水)，以20.1％的分离收率获得需要的产物。

实施例3(比较例)

将100ml MTBE和1.5g硅藻土(Celite Hyflo Supercel)添加到通过实施例1描述的方法制备的反应溶液(乳状液)中。在搅拌5分钟之后，在真空下过滤。需要7小时的过滤时间。然后滤饼用50mlMTBE洗涤。将洗液添加到非常浑浊的滤液中，生成物混合物用2×50ml MTBE萃取。用硫酸镁干燥组合的有机相之后过滤，然后在真空中除去有机溶剂(50℃，真空喷水)，以55.4％的分离收率获得需要的产物。

实施例4(比较例)

当生物质发生絮凝时，将浓盐酸添加到由实施例1描述的方法制备的反应溶液(乳状液)(0.6倍批量)中直到将pH值调节到4.0。然后在真空下过滤，但是由于凝胶形成而没有发生显著的过滤，并且因此过滤被中断。

实施例5(根据本发明的实施例)：

当生物质发生絮凝时，将浓盐酸添加到由实施例1描述的方法制备的反应溶液(乳状液)(0.6倍批量)中直到将pH值调节到2.4。然后在真空下通过过滤器过滤，该过滤器装有大约层厚0.5cm的硅藻土(Celite Hyflo Supercel)，观察到取得小于5分钟的非常快速的过滤。然后滤饼用30ml MTBE洗涤，并进一步添加45ml到浑浊的滤液中。存在良好的相分离。在进一步用75ml MTBE萃取之后，组合的有机相用硫酸镁干燥、过滤，然后在真空下除去有机溶剂(50℃，真空喷水)，以79.2％的分离收率获得所需的产物。

实施例6(根据本发明的实施例)

当生物质发生絮凝时，将浓盐酸添加到由实施例1描述的方法制备的反应溶液(乳状液)(0.6倍批量)中直到将pH值调节到2.6，添加2g硅藻土(Celite Hyflo Supercel)。然后在真空下过滤，观察得到良好的小于5分钟的过滤。然后滤饼用2×80mL MTBE洗涤，(最初的含水)滤液用两种有机洗涤相(2×80mL)洗涤，在各种情况下观察到良好的相分离。组合的有机相用硫酸镁干燥、过滤，然后在真空下除去有机溶剂(50℃，真空喷水)，以78.4％的分离收率获得需要的产物。形成的产物的对映体过量值大于99.8％ee。

Claims (7)

1.一种用于处理反应溶液的方法，所述反应溶液包含全细胞催化剂、含水组分和有机组分，其中所述反应溶液是由采用全细胞催化剂的氧化还原反应产生的反应溶液，所述有机组分包含超过90重量％的光学活性醇作为待富集的产物，其特征在于以下步骤：

a)将pH值调节到小于4；

b)在有助滤剂的情况下过滤所述反应溶液以获得滤饼和水相；

c)任选地：进一步富集和/或纯化包含在所述有机组分中的所述产物。

2.权利要求1的方法，其中被处理的所述反应溶液是全细胞催化剂、含水组分和包含待富集产物的有机组分的乳状液。

3.权利要求1的方法，其中在所述反应溶液中所述全细胞催化剂

的比例不高于75g/L，其中g是指生物质的湿重。

4.权利要求1的方法，其中使用的所述助滤剂选自纤维素、硅胶、硅藻土、珍珠岩、活性碳、炭、木粉、基于合成树脂的助滤剂和它们的混合物。

5.权利要求1的方法，其中硅藻土、方晶石、过滤用石英砾以及这些组分的混合物用作助滤剂。

6.权利要求1的方法，其中将所述反应溶液pH值调节低于3。

7.权利要求1的方法，其中相对于所述反应溶液的总量，所述有机组分的比例超过50g/L。