CN116803973A - 一种四乙酰植物鞘氨醇的提取方法 - Google Patents
一种四乙酰植物鞘氨醇的提取方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种四乙酰植物鞘氨醇(TAPS)的提取方法，通过对发酵液进行稀释，降低原料粘度；再通过酸化、升温，让发酵液中细胞内TAPS有效的溶出；酸性条件下，TAPS结构中的氨基，与阳离子树脂实现交换，实现TAPS的初步提取；用酸性溶液解吸，得到TAPS的盐溶液；经浓缩，再调至碱性，TAPS以碱的形式结晶；最后用纯化水洗脱产品中的盐分，得到最终产品。
Description
技术领域
本发明涉及提纯技术领域，具体涉及一种四乙酰植物鞘氨醇的提取方法。
背景技术
鞘脂类物质广泛存在于动植物、真菌、原核动物和病毒中，是细胞膜的重要组成部分。鞘脂类物质有3种，包括神经酰胺、鞘磷脂和鞘糖脂，是由长链氨基醇、脂肪酸、磷酸胆碱组成的两性脂类。在鞘磷脂酶的作用下，所有鞘磷脂最终被降解为神经酰胺。神经酰胺在维持皮肤屏障的水不通透性和防止SC的感染和干燥方面起着至关重要的作用。其于胆固醇、胆固醇硫酸酯和游离脂肪酸在人类皮肤中可以保护皮肤避免物理和化学有害物，但是，皮肤的神经酰胺含量随着年龄的增长而减少。因此给皮肤补充神经酰胺对保护皮肤方面有着着重要作用。
而对已经鉴定的神经酰胺结构进行分析，发现其长链氨基醇分为神经鞘氨醇(Sphingosine)、二氢鞘氨醇(dihydrosphingosine)、植物鞘氨醇(phytosphingosine)和6-OH鞘氨醇(6-hydroxy sphingosine)等等。因此鞘氨醇作为人类鞘脂中主要的鞘氨醇类碱成分，其对鞘脂类物质合成重要性不言而喻，并且具有相当大的商业应用价值。鞘氨醇乙酰化产物四乙酰植物鞘氨醇(TAPS)，自从1960年Wickerham和Stodola发现酵母可以产生四乙酰植物鞘氨醇以来，现有技术不断在对TAPS进行研究。TAPS在体外可刺激葡糖苷神经酰胺的合成，葡糖苷神经酰胺具有保护功能，有助于加强皮肤屏障功能，抑制炎症、抑制血管生成，淡化黑眼圈。四乙酰基植物鞘氨醇溶解性良好，可与多种化妆品原料复配，适用于抗老、修护以及眼霜等产品。TAPS作为起始原料合成植物鞘氨醇、神经酰胺，已经实现了商业化生产，但因为价格昂贵，还没有实现大规模生产。
之前已经开了一些合成TAPS的合成途径，如化学合成或者从天然来源物质分离纯化等等。但是通过化学及分离纯化的合成TAPS是极其昂贵的，而且不能用于食品以及化妆品。因此，现有技术的研究方向转到了生物合成路线。通过生物工程手段，成功的开发出了多种工程菌株，通过发酵工程，实现了TAPS的生物合成，基本具备了工业化生产条件。但是，在实际应用时却发现，通过发酵获得含有TAPS的发酵液，想要从发酵液中获得纯度较高的TAPS产品则难度较大，通常需要通过高速均质机对细胞破壁，然后用大量的有机溶剂进行萃取，再经硅胶柱层析才能得到高纯度的产品，在这一生产过程中，有机溶剂用量大、安全风险高、环保压力大、生产成本高，不适用工业化生产。
发明内容
为了解决现有技术对含有TAPS发酵液进行提纯时有机溶剂用量大、需要硅胶柱层析才能获得高纯度产品、安全和环保风险高、生产成本高、不利于工业化生产的问题，本发明公开了一种四乙酰植物鞘氨醇的提取方法，通过如下工艺路线对含有四乙酰植物鞘氨醇的发酵液进行提纯，获得发酵液中的四乙酰植物鞘氨醇：
优选地，具体包括如下步骤：
步骤1：获取含有四乙酰植物鞘氨醇的发酵液，用水稀释1～2倍，升温至20～60度；加入浓盐酸搅拌，调节pH至2～5；破坏细胞结构，在不使用细胞破碎设备及有机溶剂得情况下即可将TAPS释放至水相中。
步骤2：向步骤1处理后的发酵液中加入阳离子树脂，搅拌2～5小时，使阳离子树脂充分吸附TAPS，过40目筛回收阳离子树脂；因本过程不涉及化学反应，TAPS收率≥98％。
步骤3：用水对阳离子树脂进行洗脱，直至洗脱后的水pH值为5～7，除去水溶性杂质；用醋酸溶液对阳离子树脂进行洗脱，并收集洗脱液；其中，醋酸溶液的体积为阳离子树脂体积的4～10倍，醋酸溶液的浓度为0.3～1.0mol/L；通过柱洗脱，可除去90％以上的水溶性杂质。
步骤4：对步骤3收集到的洗脱液进行减压浓缩，使其浓缩至洗脱液原体积的1/8～1/3，得到浓缩液；再用氢氧化钠溶液调节浓缩液的pH至9～11，去除羧酸根离子，释放不溶于水的TAPS，降温至10℃以下，结晶3～5h，过滤收集粗品。进一步优选的，氢氧化钠溶液的质量分数为10％。
步骤5：将步骤4收集的粗品用5～10倍纯化水在10℃以下洗涤2～5小时，除去残留氢氧化钠，过滤收集固体，经过真空干燥得到所述四乙酰植物鞘氨醇。
优选地，在步骤1中，在20～60℃条件下进行搅拌2～5h，将pH调节至2.5；搅拌温度进一步优选为55℃。
优选地，在步骤2中，所述阳离子树脂为强酸性阳离子树脂。
优选地，所述阳离子树脂用量为1克TAPS添加10-50克树脂。
优选地，在步骤2中，搅拌吸附在20～30℃条件下进行。
优选地，所述步骤3中，在洗脱过程中，控制洗脱流速为1/200～1/20树脂体积/min。其中，1/200～1/20树脂体积/min是指每分钟的流量为树脂体积的1/200～1/20，例如树脂体积为100ml，流速为0.5～5ml/min。
优选地，所述步骤4中，在30～60℃条件下减压浓缩后用氢氧化钠溶液调pH至9-11。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1、本发明通过对发酵液的稀释、升温，调节pH，使细胞内的TAPS溶出，避免使用高速均质机破壁，更有利于工业化生产；利用离子交换法，避免使用大量的有机溶剂，降低安全和环保风险，减少废气排放；同时，本发明通过离子交换法对目标产物进行提取，使获得的产品纯度高，不需要进行硅胶柱分离，可以大幅度降低成本，更适合工业化大规模生产。
2、本发明所述提取方法对含有TAPS的发酵液进行提取，TAPS的收率大于80％；产品的纯度大于90％，远远优于目前市售产品的纯度，具有更高的商业价值。
附图说明
图1为市售样品1的HPLC图谱。
图2为市售样品2的HPLC图谱。
图3为实施例1的HPLC图谱。
图4为实施例2的HPLC图谱。
图5为实施例3的HPLC图谱。
图6为实施例4的HPLC图谱。
图7为实施例5的HPLC图谱。
图8为实施例6的HPLC图谱。
图9为实施例7的HPLC图谱。
图10为实施例8的HPLC图谱。
具体实施方式
下面将结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
一、一种四乙酰植物鞘氨醇的提取方法
本发明通过如下工艺路线对含有四乙酰植物鞘氨醇的发酵液进行提纯，获得发酵液中的四乙酰植物鞘氨醇：
在具体实施时，包括如下步骤：
步骤1：获取含有四乙酰植物鞘氨醇的发酵液，用水稀释1～2倍后，加入浓盐酸搅拌，调节pH至2～5；在步骤1中，在20～60℃条件下进行搅拌2～5h，将pH调节至2～5；进一步优选，搅拌温度50℃；进一步优选，TAPS溶出pH为3.0。
步骤2：向步骤1处理后的发酵液中加入阳离子树脂，搅拌2～5小时，使阳离子树脂充分吸附TAPS，过40目筛回收阳离子树脂；在步骤2中，所述阳离子树脂为强酸性阳离子树脂。所述阳离子树脂用量为1克TAPS添加10-50克树脂。进一步优选的，所述阳离子树脂为001×12强酸性阳离子树脂；进一步优选的，搅拌吸附在20～30℃条件下进行；进一步优选的，搅拌吸附在30℃条件下进行；进一步优选的，阳离子树脂最佳用量为1克TAPS添加16.6克树脂。
步骤3：对阳离子树脂进行洗脱，用饮用水对阳离子树脂进行冲洗，至洗脱水pH为5～7；用醋酸溶液对阳离子树脂进行洗脱，并收集洗脱液；其中，柱洗脱采用玻璃层析柱进行，醋酸溶液的体积为阳离子树脂体积的4～10倍，醋酸溶液的浓度为0.3～1.0mol/L；进一步优选的，阳离子树脂洗脱水pH为6.0；进一步优选的，醋酸溶液浓度为0.3mol/L。
步骤4：对步骤3收集到的洗脱液进行减压浓缩，使其浓缩至洗脱液原体积的1/8～1/3，得到浓缩液；再用氢氧化钠溶液调节浓缩液的pH至9～11盐析，降温至10℃以下，结晶3～5h，过滤收集粗品；其中，氢氧化钠溶液的质量分数为10％；在洗脱过程中，控制洗脱流速为1/200～1/20树脂体积/min。进一步优选的，减压浓缩温度为45℃；进一步优选的，浓缩液盐析pH为11。
步骤5：将步骤4收集的粗品用纯化水在10℃以下打浆2～5小时，过滤收集固体，经过真空干燥得到所述四乙酰植物鞘氨醇。
二、实施例
实施例1
步骤1：取TAPS发酵单位12克/升的发酵液5升，加饮用水10升稀释，浓盐酸调节pH3.0，加热至50℃，搅拌3小时；降温至30℃；
步骤2：投入20目规格001×12阳离子Na型树脂1000克，搅拌吸附3小时，检测废液单位小于0.1克/升；过40目筛，回收树脂，装入离交柱，饮用水洗涤至pH6；
步骤3：用纯化水配制的0.3mol/L醋酸解吸，TCL检测，收集含TAPS溶液5.2升；
步骤4：减压浓缩解吸液至1000毫升；控制温度45℃，用10％的氢氧化钠溶液调节pH11，过程中有大量晶体析出；缓慢降温至10℃以下，继续搅拌结晶3小时；过滤，收集TAPS含水粗品120克；
步骤5：将上述含水粗品，加入800毫升纯化水，10℃以下，搅拌洗涤3小时；过滤，收集TAPS湿品110克，55℃减压干燥，得成品52克。收率86.7％。
实施例2
步骤1：取TAPS发酵单位12克/升的发酵液5升，加饮用水10升稀释，浓盐酸调节pH4.0，加热至50℃，搅拌3小时；降温至30℃；
步骤2至步骤4与实施例1相同；
步骤5：将上述含水粗品，加入800毫升纯化水，10℃以下，搅拌洗涤3小时；过滤，收集TAPS湿品102克，55℃减压干燥，得成品51.06克。收率85.1％。
实施例3
步骤1：取TAPS发酵单位12克/升的发酵液5升，加饮用水10升稀释，浓盐酸调节pH5.0，加热至50℃，搅拌3小时；降温至30℃；
步骤2至步骤4与实施例1相同；
步骤5：将上述含水粗品，加入800毫升纯化水，10℃以下，搅拌洗涤3小时；过滤，收集TAPS湿品112克，55℃减压干燥，得成品51.54克。收率85.9％。
根据实施例1、实施例2、实施例3的结果，TAPS溶出的最佳pH为3.0。
实施例4
步骤1：取TAPS发酵单位12克/升的发酵液5升，加饮用水10升稀释，浓盐酸调节pH3.0，加热至50℃，搅拌3小时；降温至30℃；
步骤2：投入20目规格001×12阳离子Na型树脂800克，搅拌吸附3小时，检测废液单位小于0.1克/升；过40目筛，回收树脂，装入离交柱，饮用水洗涤至pH6；
步骤3至步骤4与实施例1相同；
步骤5：将上述含水粗品，加入800毫升纯化水，10℃以下，搅拌洗涤3小时；过滤，收集TAPS湿品95克，55℃减压干燥，得成品48.96克。收率81.6％。
实施例5
步骤1：取TAPS发酵单位12克/升的发酵液5升，加饮用水10升稀释，浓盐酸调节pH3.0，加热至50℃，搅拌3小时；降温至30℃；
步骤2：投入20目规格001×12阳离子Na型树脂1200克，搅拌吸附3小时，检测废液单位小于0.1克/升；过40目筛，回收树脂，装入离交柱，饮用水洗涤至pH6；
步骤3至步骤4与实施例1相同；
步骤5：将上述含水粗品，加入800毫升纯化水，10℃以下，搅拌洗涤3小时；过滤，收集TAPS湿品120克，55℃减压干燥，得成品51.78克。收率86.3％。
根据实施例1、实施例4、实施例5结果，阳离子树脂用量为1000克为最优选。
实施例6
步骤1：取TAPS发酵单位12克/升的发酵液5升，加饮用水10升稀释，浓盐酸调节pH3.0，加热至50℃，搅拌3小时；降温至30℃；
步骤2：投入20目规格001×12阳离子Na型树脂1000克，搅拌吸附3小时，检测废液单位小于0.1克/升；过40目筛，回收树脂，装入离交柱，饮用水洗涤至pH6；
步骤3：用纯化水配制的0.5mol/L醋酸解吸，TCL检测，收集含TAPS溶液5.2升；
步骤4与实施例1相同；
步骤5：将上述含水粗品，加入800毫升纯化水，10℃以下，搅拌洗涤3小时；过滤，收集TAPS湿品115克，55℃减压干燥，得成品50.1克。收率83.5％。
根据实施例1和实施例6结果，醋酸浓度0.3mol/L为最优选。
实施例7
步骤1：取TAPS发酵单位12克/升的发酵液5升，加饮用水10升稀释，浓盐酸调节pH3.0，加热至50℃，搅拌3小时；降温至30℃；
步骤2：投入20目规格001×12阳离子Na型树脂1000克，搅拌吸附3小时，检测废液单位小于0.1克/升；过40目筛，回收树脂，装入离交柱，饮用水洗涤至pH6；
步骤3：用纯化水配制的0.3mol/L醋酸解吸，TCL检测，收集含TAPS溶液5.2升；
步骤4：减压浓缩解吸液至1000毫升；控制温度45℃，用10％的氢氧化钠溶液调节pH9，过程中有大量晶体析出；缓慢降温至10℃以下，继续搅拌结晶3小时；过滤，收集TAPS含水粗品100克；
步骤5：将上述含水粗品，加入800毫升纯化水，10℃以下，搅拌洗涤3小时；过滤，收集TAPS湿品95克，55℃减压干燥，得成品48.6克。收率81.0％。
实施例8
步骤1：取TAPS发酵单位12克/升的发酵液5升，加饮用水10升稀释，浓盐酸调节pH3.0，加热至50℃，搅拌3小时；降温至30℃；
步骤2：投入20目规格001×12阳离子Na型树脂1000克，搅拌吸附3小时，检测废液单位小于0.1克/升；过40目筛，回收树脂，装入离交柱，饮用水洗涤至pH6；
步骤3：用纯化水配制的0.3mol/L醋酸解吸，TCL检测，收集含TAPS溶液5.2升；
步骤4：减压浓缩解吸液至1000毫升；控制温度45℃，用10％的氢氧化钠溶液调节pH10，过程中有大量晶体析出；缓慢降温至10℃以下，继续搅拌结晶3小时；过滤，收集TAPS含水粗品120克；
步骤5：将上述含水粗品，加入800毫升纯化水，10℃以下，搅拌洗涤3小时；过滤，收集TAPS湿品120克，55℃减压干燥，得成品50.4克。收率84％。
根据实施例1、实施例7、实施例8结果，TAPS盐析pH11为最优选。
对实施例制备得到的产品和市售样品的纯度进行分析，得到如下结果：
表1
从表1可以看出，本发明所述方法在提取TAPS时能够达到较高的收率，尽可能多的从发酵液中提取TAPS；同时，本发明对所述方法进行了进一步优化，在提升TAPS收率的同时提升TAPS的纯度，本发明通过对发酵液的稀释、升温，调节pH，使细胞内的TAPS溶出，避免使用高速均质机破壁，更有利于工业化生产；利用离子交换法，避免使用大量的有机溶剂，降低安全和环保风险，减少废气排放；同时，本发明通过离子交换法对目标产物进行提取，使获得的产品纯度高，不需要进行硅胶柱分离，可以大幅度降低成本，更适合大规模生产。
最后需要说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制技术方案，本领域的普通技术人员应当理解，那些对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本技术方案的宗旨和范围，均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (8)
1.一种四乙酰植物鞘氨醇的提取方法，其特征在于，通过如下工艺路线对含有四乙酰植物鞘氨醇的发酵液进行提纯，获得发酵液中的四乙酰植物鞘氨醇：
2.根据权利要求1所述四乙酰植物鞘氨醇的提取方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
步骤1：获取含有四乙酰植物鞘氨醇的发酵液，用水稀释后，加热升温至20～60℃，加入浓盐酸搅拌，调节pH至2～5；
步骤2：向步骤1处理后的发酵液中加入阳离子树脂，搅拌吸附2～5小时，过筛回收阳离子树脂；
步骤3：用水对阳离子树脂进行洗脱，直至洗脱后的水pH值为5～7；用醋酸溶液对阳离子树脂进行洗脱，并收集洗脱液；其中，醋酸溶液的体积为阳离子树脂体积的4～10倍，醋酸溶液的浓度为0.3～1.0mol/L；
步骤4：对步骤3收集到的洗脱液进行减压浓缩，使其浓缩至洗脱液原体积的1/8～1/3，得到浓缩液；再用氢氧化钠溶液调节浓缩液的pH至9～11，降温至10℃以下，结晶3～5h，过滤收集粗品；其中，氢氧化钠溶液的质量分数为10～30％；
步骤5：将步骤4收集的粗品用纯化水在10℃以下洗涤2～5小时，过滤收集固体，经过真空干燥得到所述四乙酰植物鞘氨醇。
3.根据权利要求2所述四乙酰植物鞘氨醇的提取方法，其特征在于，在步骤1中，在20～60℃条件下进行搅拌2～5h，将pH调节至2～5。
4.根据权利要求2所述四乙酰植物鞘氨醇的提取方法，其特征在于，在步骤2中，所述阳离子树脂为强酸性阳离子树脂。
5.根据权利要求4所述四乙酰植物鞘氨醇的提取方法，其特征在于，所述阳离子树脂的用量为1克TAPS添加10-50克树脂。
6.根据权利要求2所述四乙酰植物鞘氨醇的提取方法，其特征在于，在步骤2中，搅拌吸附在20～30℃条件下进行。
7.根据权利要求2所述四乙酰植物鞘氨醇的提取方法，其特征在于，所述步骤3中，在洗脱过程中，控制洗脱流速为1/200～1/20树脂体积/min。
8.根据权利要求2所述四乙酰植物鞘氨醇的提取方法，其特征在于，所述步骤4中，在30～60℃条件下减压浓缩后用氢氧化钠溶液调pH至9-11。
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