JP5690486B2 - 熱安定性炭酸脱水酵素及びその用途 - Google Patents
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Description
a)配列番号2又は配列番号4のアミノ酸配列と少なくとも94%の同一性を、あるいは番号6のアミノ酸配列と少なくとも91%の同一性を、あるいは番号8のアミノ酸配列と少なくとも96%の同一性を、あるいは番号10のアミノ酸配列と少なくとも87%の同一性を、あるいは配列番号12のアミノ酸配列と少なくとも97%の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド;
b)中程度にストリンジェントな条件のもと、
i)配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10及び配列番号12から成る群から選択される成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、
ii)成熟酵素をコードする、配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9及び配列番号11の領域から成る群から選択されるポリヌクレオチド配列、
iii)成熟酵素をコードする、配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9及び配列番号11の領域から成る群から選択されるポリヌクレオチド配列に含まれるcDNA配列、
iv)少なくとも100個の連続した配列から成る、(i)、(ii)又は(iii)の部分配列、あるいは
v)(i)、(ii)、(iii)又は(iv)の相補鎖、
とハイブリダイズする核酸配列がコードするポリペプチド;及び
c)炭酸脱水酵素活性を有する(a)又は(b)のフラグメント、
から成る群から選択される、単離ポリペプチド、を提供する。
本発明の1つの観点は、CO2含有媒体、例えばガス、液体又は多相混合物からCO2を抽出するための熱安定性炭酸脱水酵素の使用に関する。本発明は、特に、CO2含有媒体の温度が、ヒト又はウシ赤血球から単離した市販の炭酸脱水酵素、例えばCA−I又はCA−IIの至適温度を超える場合に有用である。
用語「古細菌起源」とは、古細菌由来の分子、例えばポリペプチド、核酸、DNA及びRNAを含む。修飾された又は突然変異した分子であって、親分子が本来古細菌に由来していたものを含むことも意図されている。前記の修飾された又は突然変異した分子の起源は尚も認識可能なものであるべきであり、好ましくはポリペプチド及び核酸配列は少なくとも親分子と少なくとも60%同一であり、より好ましくは親分子と少なくとも65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%同一である。
現在、2つの熱安定性炭酸脱水酵素、すなわち、最大75℃まで熱安定であると報告されているメタノバクテリウム・サーモアウトトロフィカム(Methanobacterium thermoautotrophicum)ΔH由来のβクラスのAC(Cab)(Smith and Ferry, 1999, J. Bacteriol. 181 : 6247-6253)及びメタノサルシナ・サーモフィラのTM−1由来のγクラスの炭酸脱水酵素(Cam)が知られている。Camは1994年に最初に単離され(Alber and Ferry, 1994, Proc. Natl. Acad Set. USA 91 : 6909-1913)、そして1996年には、15分間55℃で加熱して安定であることが証明された(Alber and Ferry, 1996, J. Bacteriol. 178: 3270-3274)。Camは、γクラスで唯一単離された酵素であり、その発見以来多くのキャラクタリゼーション研究に使用されている。しかしながら、これらの酵素の熱安定性をなんらかの技術的用途に活用することが示唆されたことはない。US2004/025913は、CO2可溶化及び濃縮過程におけるCam並びに熱安定性でないヒトCAのアイソフォームIVの使用を開示しているがCamがCA−IVより好ましいことは何ら示唆されていない。
本発明の配列と類似の、バチルス・クラウシイKSM−K16由来のポリペプチド配列は、NCBIデータベースにおいて受入番号Q5WD44で開示されている(配列番号14として表す)。当該配列は、Kaoが実施した、バチルス・クラウシイKSM−K16についてのゲノム配列決定プロジェクトに由来するヌクレオチド配列から翻訳されたものである。他のαクラス炭酸脱水酵素との類似性に基づき、このヌクレオチド配列はαクラスに割り当てられたが、本発明者の知る限りでは、未だ発現もキャラクタリゼーションも行われていない。従って、本明細書の実施例において初めてこのヌクレオチド配列をクローニングし、そしてそのポリペプチドを発現させ、そして当該ポリペプチドが50℃超の温度に15分〜2時間加熱した後も炭酸脱水酵素を保持していることを証明した。
(i)配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10及び配列番号12から成る群から選択される成熟酵素をコードするヌクレオチド、
(ii)成熟酵素をコードする、配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9及び配列番号11の領域から成る群から選択されるポリヌクレオチド配列、
(iii)成熟酵素をコードする、配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9及び配列番号11の領域から成る群から選択されるポリヌクレオチド配列に含まれるcDNA配列、
(iv)少なくとも100個の連続した配列から成る、(i)、(ii)又は(iii)の部分配列、あるいは
(v)(i)、(ii)、(iii)又は(iv)の相補鎖、
とハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、に関する(Sambrook, Fritsch, and Maniatis, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d edition, Cold Spring Harbor, New York)。
などがある。
とハイブリダイズする核酸配列がコードするポリペプチド;及び(c)炭酸脱水酵素活性を有する(a)又は(b)のフラグメント、から成る群から選択される、単離ポリペプチド、である。
本発明はまた、ポリヌクレオチド、特に単離ポリヌクレオチドであって、本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んで成るか、又は当該ヌクレオチド配列から成る単離ポリヌクレオチドに関する。好ましい観点において、本発明のヌクレオチド配列は、配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9及び配列番号11から成る群から選択される。別の好ましい観点において、ヌクレオチド配列は、配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9及び配列番号11から成る群から選択されるポリヌクレオチドの成熟ポリペプチドコード領域である。本発明はまた、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10及び配列番号12から成る群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド又はその成熟ポリペプチドであり、これはそれぞれ、配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9及び配列番号11とはそれぞれ遺伝コードの縮重が原因で異なる。本発明はまた、配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9及び配列番号11の群から選択される部分配列であって、それぞれ、炭酸脱水酵素活性を好ましくは高温で有する配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10又は配列番号12のフラグメントをコードする部分配列に関する。
i)配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9及び配列番号11の領域から成る群から選択されるポリヌクレオチド配列、
ii)列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9及び配列番号11の領域から成る群から選択されるポリヌクレオチド配列に含まれるcDNA配列、
iii)配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10及び配列番号12に含まれる相当の成熟ポリペプチドの機能を有する分泌型成熟ポリペプチドをコードする(i)又は(ii)の部分配列、あるいは
iv)(i)、(ii)、又は(iii)又はの相補鎖、
とハイブリダイズする単離ポリヌクレオチド、に関する(Sambrook, Fritsch, and Maniatis, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d edition, Cold Spring Harbor, New York)。
本発明はまた、本発明の核酸コンストラクトを含んで成る組換え発現ベクターに関する。本発明の核酸コンストラクトは、本発明の単離ポリヌクレオチドであって、好ましくは1又は複数の制御配列と適合する条件のもと適当な宿主細胞においてコード配列の発現を指示する当該制御配列と作用可能に連結したものを含んで成る。あるいは、本発明のポリヌクレオチド配列又は当該ポリヌクレオチド配列を含んで成る核酸コンストラクトは、発現に適したベクター内に挿入されてもよい。発現ベクターを作る際、コード配列は、当該コード配列が発現に適した制御配列と作用可能に連結されるようベクター内に配置される。制御配列は、ベクターによって、又はベクター内に挿入された核酸コンストラクトによって提供されうる。
本発明はまた、本発明の核酸コンストラクトを含んで成る組換え宿主細胞であって、ポリペプチドの組換え産生に有利に使用される細胞に関する。本発明のヌクレオチド配列を含んで成るベクターは、当該ベクターが上述のように染色体組込み体として又は自己複製染色体外ベクターとして維持されるよう宿主細胞内に導入される。
本発明はまた、本発明の炭酸脱水酵素を調製する方法であって、(a)炭酸脱水酵素をコードするヌクレオチド配列を含んで成る宿主細胞であって、当該炭酸脱水酵素を発現し、分泌することができる宿主細胞の株を培養し、そして(b)炭酸脱水酵素を回収すること、を含んで成る方法に関する。特定の態様において、宿主細胞は、野生型のバチルス・クラウシイ株であり、これは炭酸脱水酵素コード遺伝子を本質的に含んでいる。より好ましい野生型の株は、NCIB10309として寄託されたバチルス・クラウシイ株である。別の態様において、宿主細胞は上述の組換え宿主細胞である。
本発明は、本発明の炭酸脱水酵素及び好ましくは賦形剤を含んで成る組成物、並びに当該組成物を調製するための方法であって、本発明のポリペプチドと賦形剤とを混合することを含んで成る方法、を提供する。
B.クラウシイ炭酸脱水酵素のクローニング及びB.サブチリスにおける発現
炭酸脱水酵素配列は、異なるバチルス・クラウシイ株由来のゲノムDNAをPCRスクリーニングすることで同定した。B.クラウシイ株由来のゲノムDNAは、Qiagen Blood DNAキットを用い、取扱説明書のプロトコールに従うことで調製した。
PCR(1)は総量50マイクロリットルで実施し、以下の試薬を添加した。1マイクロリットルのゲノムDNA調製物(鋳型)、10ピコモルの各プライマー(Bcaf1及びBcar1)、dNTP及びExpandポリメラーゼ/バッファー#1(Roche)。PCR条件は94℃で2分間;94℃で15秒間を9サイクル;55℃で45秒間;68℃で1分間;続いて68℃で10分間;4℃で20分間、そしてPCRプログラムの終了まで15℃であった。
PCR(2)は、プライマー及び鋳型がそれぞれ10pmolの各プライマーblcaTSP及びbvl1362rev並びに1μlのPCR(1)(配列番号1、7、9、11及び13)由来の精製産物で置き換えられた点を除き、PCR(1)と同一のパラメーターを用いて実施した。
PCR(3)において、B. リシェニフォルミス由来のαアミラーゼ(AmyL)のシグナルプチドを、WO99/43835(本明細書で援用する)に記載のSOE融合によって、PCR(2)で得られた炭酸脱水酵素をコードするDNAとインフレームで融合した。炭酸脱水酵素をコードする配列を含む、PCR(3)から得られたヌクレオチドフラグメントは、相同組換えによって、バチルス・サブチリスの宿主細胞ゲノム内に組み込まれた。この遺伝子コンストラクトを、トリプルプロモーターシステム(WO99/43835に記載のもの)の制御下で発現させた。クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子はマーカーとして使用した(Diderichsen et al., 1993, Plasmid ZQ: 312-315 Diderichsen et al., 1993, Plasmid ZQ: 312-315に記載のとおり)。
B.ハロデュランス由来のCAのクローニング
B.ハロデュランス由来のCA(配列番号16)は、実施例1に従い、以下の修飾を加えてクローニングした。スクリーニングは実施しなかった。その代わりに、B.ハロデュランスのC−125株(JCM9153)のゲノムDNAを鋳型として使用し、PCR(2)のプライマーは、
酵素精製
6個の組換え炭酸脱水酵素(実施例1に記載のとおりクローニングした配列番号2、8、10、12及び14並びに実施例2に記載のとおりクローニングした配列番号16)は、同一の手順で精製した。培養ブロスを遠心し(26,000×g、20分)、そして上清をWhatman 0.45 micro-mフィルターででろ過した。0.45 micro-mのろ液は約pH7であり、そして伝導度は約20mS/cmであった。0.45 micro-mのろ液をG25セファデックスクロマトグラフィーにより10mMのHEPES/NaOH、pH7.0に移し、そして10mMのHEPES/NaOH、pH7.0で平衡化した100mLのQ−セファロースFFカラムにアプライした。カラムを平衡バッファーで洗浄した後、結合したタンパク質を線形のNaCl勾配(0→0.5M)により3倍超のカラム量で溶出した。画分は溶出の間回収し、そしてこれらの画分は炭酸脱水酵素活性について試験した(実施例4を参照のこと)。CA活性を有する2つのピークを同定した。N末端の配列決定により、最初の溶出ピークがスーパーオキシドジスムターゼを含んでおり、そして第二の溶出ピーク(ピークB)は炭酸脱水酵素を含んでいたことが明らかとなった。ピークBは、脱イオン水で7回希釈し、そして、10mMのHEPES/NaOH、pH7.0で平衡化した40mlのSOURCE 30Qカラムにアプライした。カラムを平衡バッファーで洗浄した後、結合したタンパク質を線形のNaCl勾配(0→0.5M)により3倍超のカラム量で溶出した。当該カラム由来の溶出画分をCA活性について試験し、そしてポジティブな画分をSDS−PAGEによって解析した。クーマシーブルー染色したSDS−PAGEゲル上で支配的なバンドを示すことが明らかとなった画分を炭酸脱水酵素バッチ内にプールした。配列番号2、8、10及び12に相当するCAの酵素純度は80%純粋であると推定され、そして配列番号14及び16に相当する酵素は95%超純粋であった。
炭酸脱水酵素活性の検出
炭酸脱水酵素の検出のための試験は、Wilbur, 1948, J. Biol. Chem. 176: 147-154に記載されていたものである。条件設定は、式1
pニトロフェニルアセテートによる炭酸脱水酵素活性についての動態アッセイ
実施例3に記載のようにして得られた20マイクロリットルの精製CA酵素サンプル(0.01%のTriton X−100で希釈したもの)をマイクロタイタープレート(MTP)ウェルの底に据えた。本アッセイは、室温において、200マイクロリットルのパラ−ニトロフェノールアセテート(pNp−アセテート、Sigma, N-8130)基質溶液をMTPウェルに添加することで開始した。当該基質溶液は、アッセイ直前に、100マイクロリットルのpNP−アセテートストック溶液(50mg/mlのpNPアセテート/DMSO。冷凍保存)と、4500マイクロリットルのアッセイバッファー(0.1M Tris/HCl、pH8.0)とを混合することで調製した。OD405の増大をモニタリングした。当該アッセイに、バッファーブラインド(CAサンプルの代わりに20マイクロリットルのアッセイバッファー)を含めた。前記サンプルとバッファーブラインドとの間のOD405の増大の差異を炭酸脱水酵素活性の尺度とした(CA活性=ΔOD405(サンプル)−ΔOD405(バッファー))。
温度安定性アッセイ
精製したCA酵素(実施例3に記載のとおりに得られた配列番号2、8、10、12、14及び16)を50mMのHEPES/NaOH、pH7.5で10回平衡化し、そしてアリコートを15分間異なる温度(15〜80℃)でインキュベートした。配列番号14のCA酵素は更に、異なる温度で2時間インキュベートした。温度安定性アッセイの結果を表2に示す。M.サーモフィラ、B.ハロデュランス及びB.クラウシイ由来のCAは、はっきりと、ヒトCAIIよりも高い温度安定性を示した。更に、B.クラウシイのCAは、M.サーモフィラのCAよりも温度安定性の点で優れていた。ヒトCAII及びM.サーモフィラについてのデータはAlber and Ferry, 1996, J. Bacteriol. 178: 3270-3274のものを採用した。
精製したCA酵素(実施例3に記載のとおりに得られた配列番号14及び16)を50mMのHEPES/NaOH、pH7.5中で約1mg/mlに希釈した。DSCは90℃/時間のスキャン速度及び20℃〜90℃のスキャン範囲で実施した。B.クラウシイ(配列番号14)及びB.ハロデュランス(配列番号16)のCAの融点は、それぞれ67.4℃及び63.1℃であった。
アミノ末端タンパク質配列決定
精製した組換えCA(実施例3に記載のとおりに得られた配列番号2、8、10、12、14及び16)は、エドマン配列決定により配列決定した。決定した配列を表3に示す。B.ハロデュランス由来のCA(配列番号16)(配列番号16の18位から開始する切断型の酵素が精製後に得られた)を除く、全ての配列が予想した成熟ペプチド配列と一致していた。組換えCAのタンパク質の分子量は、エレクトロスプレーイオン化飛行時間型質量分析(ES−TOF−MS)によって決定した。
Wilbur-Andersonアッセイを用いた熱安定性
配列番号2、8、10、12及び14に相当する精製したCA酵素及びウシ炭酸脱水酵素(Sigma、カタログ番号C3934)の熱安定性を測定した。CAは、実施例3に記載のように得られた。
中空糸バイオリアクター内での混合ガス流からのCO2の抽出
排ガスと似ているガス流からCO2を選択的に回収するよう、研究室規模の液膜含有中空糸バイオリアクター(HFB)を配置した。
多孔性疎水性中空糸膜は、ガス流と膜液体との間に高い接触表面積を提供する。その結果、液体の炭酸化又は液体からのCO2の除去が容易になる。選択したモジュールは、0.18m2の活性表面積及び0.01×0.04micro-mの平均孔径を有する2300のパラレルな中空糸から成る(Membrana, North Carolina, USAから購入したLiquicel(登録商標)MiniModule(登録商標) 1x5.5)。これらの膜は工業規模にスケールアップするのが容易であり、そして廃水処理及び飲料用の炭酸化のための産業で使用されている。バイオリアクターの配置の略図を図1に示す。当該配置において、膜液体を、容積移送式ポンプを用いて中空糸の内腔を通過させた。液体の流速は約2ml/分に設定した。15%CO2(9立方センチメーター/分(CCM))及び85%N2(51CCM)(フィードガス)の混合物を含むガス流は、中空糸のフィード側に逆流して進入し、処理したガス流(洗浄済みガス)は、中空糸のスィープ側でモジュールを励起させた。2つの質量流量制御装置を使用して、実験を通じて一貫した濃度を有する窒素と二酸化炭素とを混合した。質量流量計を使用して、洗浄したガス及びフィードガスがリアクターを出る際の流れをモニタリングした。ガス並びに液体の流れ及び圧力は、液体が、前記モジュール内の気相及び液相の泡に進入するのを防ぐために調節された。
島津2010ガスクロマトグラフと熱伝導検出器及びガスサンプリングバルブをCO2濃度測定に使用した。キャピラリーCarboxen Plot1010カラムを使用して窒素及び二酸化炭素を検出した。カラムを等温となるよう35℃で7分間加熱し、温度を20℃/分の速度で200℃にまで増大させ、そしてこれを200℃で2分間維持した。インジェクターと検出器の温度を230℃で維持した。カラムの流速を1ml/分とし、分割比を10対1とし、そしてキャリアーガスをヘリウムとした。窒素及び二酸化炭素のピークは、それぞれ6.4分及び15.3分の保持時間で検出した。CO2ピークは、Scott Specialty gases (Pennsylvania, USA)から購入した、3つの二酸化炭素のスタンダード、1000pm、1%及び10%CO2/窒素を用いて較正した。
最初に、1Mの炭酸水素ナトリウム(pH8)を膜液体として選択した。しかしながら、炭酸水素ナトリウム溶液はこのpHでCO2により飽和していることが明らかとなり、その結果、水和反応(炭酸化)に全く適していなかった。pH9以上の1M炭酸水素ナトリウム溶液は、二酸化炭素/炭酸水素で飽和していなかったので、CO2水和により適していた。1Mの炭酸水素ナトリウム(pH9.0)を、酵素を含まないコントロール溶液として使用した。別の実験では、中空糸を脱イオン(DI)水ですすいだ後、8部の1M炭酸水素ナトリウム(pH9.6)+2部の配列番号14の炭酸脱水酵素(0.6gの純粋な酵素タンパク質/Lの最終的なCA濃度に相当)の溶液を膜液体として使用した。これらの膜液体を用いたフィードガス及び洗浄済みガス中CO2濃度はGCで解析した。各実験は、異なるモジュールを用いて少なくとも3回繰り返し、そしてGCに対し少なくとも3回のインジェクションを行った。
表5は、各膜液体を用いて集めたデータを示す。HFCLMBを出た洗浄済みガス中の二酸化炭素濃度は、膜液体中の炭酸水素ナトリウムコントロール溶液のpHに大きく依存していることが明らかとなった。炭酸水素溶液のpHの増大は、二酸化炭素から炭酸水素への水和速度を増大させる。
中空糸CLMバイオリアクター内の混合ガス流からのCO2抽出
バイオガス組成と似ているガス流からCO2を選択的に回収するよう、研究室規模の液膜含有中空糸バイオリアクター(HFB)を配置した。
島津2010ガスクロマトグラフと水素炎イオン化検出器及びガスサンプリングバルブをCH4濃度測定に使用した。キャピラリーCarboxen Plot1010カラムを使用してメタンを検出した。カラムを等温となるよう200℃で3.5分間加熱した。インジェクターと検出器の温度を230℃で維持した。カラムの流速を2.35ml/分とし、分割比を20対1とし、そしてキャリアーガスをヘリウムとした。水素及び空気の流量は、それぞれ45mL/分及び450mLとした。メタンのピークは、1.9分の保持時間で検出した。CH4ピークは、Scott Specialty gasesから購入した、4つのメタンのスタンダード、1000pm、1%、10%及び99%メタン/窒素を用いて較正した。
使用した膜液体は、コントロールについては、1Mの炭酸水素ナトリウム(pH9.3)であった。炭酸脱水酵素及び濃度は実施例9に記載のとおりとした。
表6は、CO2−CH4混合物を用いて集めたデータを示す。これから、ガス流から除去したCO2量が、炭酸脱水酵素を膜液体に添加した場合、室温では実質的に増大したことが分かる。従って、バイオリアクター内で回収されたCO2量は有意に増大し、その結果、出ガス流中のメタン含量は有意に増大した。
膜液体中にMEAを含む中空糸膜バイオリアクター内での混合ガス流からのCO2の抽出
本実験は、常用の二酸化炭素吸収剤に対する炭酸脱水酵素の添加の効果を実証するものである。
使用したコントロールの膜液体は、モノエタノールアミン溶液(MEA)/水とした(1%v/v)。これを、0.3gの純粋な酵素タンパク質/L溶液に相当する10部のCAと1部のMEAと89部の水とを含むMEA−CA水溶液から構成される膜液体と比較した。
データを表7に示す。要約すると、1%MEA溶液を含むHFBは、フィードガス中の全CO2の48.6%を除去することができた。0.3g/Lの炭酸脱水酵素を添加することで、1%MEA溶液中のCO2除去が84.3%に増大した。
[項1]
二酸化炭素含有媒体から二酸化炭素を抽出するための、メタノサルシナ・サーモフィラ株TM-1 (DSM 1825)由来のγクラスの炭酸脱水酵素を除く、細菌又は古細菌又は真菌を起源とする熱安定性炭酸脱水酵素の使用。
[項2]
前記炭酸脱水酵素が、炭酸脱水酵素のα、β、及びγクラスから選択される、項1に記載の使用。
[項3]
前記炭酸脱水酵素がαクラスの炭酸脱水酵素又はβクラスの炭酸脱水酵素である、項1又は2に記載の使用。
[項4]
前記炭酸脱水酵素がαクラスの炭酸脱水酵素である、項1又は2に記載の使用。
[項5]
α炭酸脱水酵素がバチルス・クラウシイKSM−K16由来の炭酸脱水酵素(NCBI受入番号Q5WD44又は配列番号14)又はバチルス・ハロデュランス由来の炭酸脱水酵素(NCBI受入番号Q9KFW1又は配列番号16)と少なくとも60%同一である、項4に記載の使用。
[項6]
前記αクラスの炭酸脱水酵素が:
a)配列番号2又は配列番号4のアミノ酸配列と少なくとも94%の同一性を、あるいは番号6のアミノ酸配列と少なくとも91%の同一性を、あるいは番号8のアミノ酸配列と少なくとも96%の同一性を、あるいは番号10のアミノ酸配列と少なくとも89%の同一性を、あるいは番号12のアミノ酸配列と少なくとも97%の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド;
b)中程度にストリンジェントな条件のもと、
i)配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10及び配列番号12から成る群から選択される成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、
ii)成熟酵素をコードする、配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9及び配列番号11の領域から成る群から選択されるポリヌクレオチド配列、
iii)成熟酵素をコードする、配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9及び配列番号11の領域から成る群から選択されるポリヌクレオチド配列に含まれるcDNA配列、
iv)少なくとも100個の連続した配列から成る、(i)、(ii)又は(iii)の部分配列、あるいは
v)(i)、(ii)、(iii)又は(iv)の相補鎖、
とハイブリダイズする核酸配列がコードするポリペプチド;及び
c)炭酸脱水酵素活性を有する(a)又は(b)のフラグメント、
から成る群から選択される、単離ポリペプチドである、項4に記載の使用。
[項7]
前記αクラスの炭酸脱水酵素が、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、又は配列番号12と少なくとも97%同一のアミノ酸配列を有する単離ポリペプチド、あるいはその機能的フラグメントである、項4〜6のいずれか1項に記載の使用。
[項8]
前記炭酸脱水酵素がβクラスの炭酸脱水酵素である、項1に記載の使用。
[項9]
β炭酸脱水酵素が、メタノバクテリウム・サーモアウトトロフィカムΔH由来のβクラスの炭酸脱水酵素(NCBI受入番号Q50565)、又はNCBI受入番号Q5WE01として同定されたバチルス・クラウシイKSM−K16由来のβクラスの炭酸脱水酵素、又はバチルス・ハロデュランス由来のβクラスの炭酸脱水酵素(NCBI受入番号Q9K7S3)と少なくとも60%同一である、項8に記載の使用。
[項10]
前記熱安定性炭酸脱水酵素が、少なくとも45分間、45℃超の温度で活性を維持する、項1〜9のいずれか1項に記載の使用。
[項11]
前記熱安定性炭酸脱水酵素がバイオリアクター内で使用される、項1〜10のいずれか1項に記載の使用。
[項12]
前記バイオリアクターが含有液膜(CLM)を含んで成る、項11に記載の使用。
[項13]
前記膜液体が、少なくとも9.0のpHを有する炭酸水素バッファーである、項11又は12に記載の使用。
[項14]
前記二酸化炭素含有媒体がガスである、項1〜13のいずれか1項に記載の使用。
[項15]
前記二酸化炭素含有媒体が多相混合物である、項1〜12のいずれか1項に記載の使用。
[項16]
二酸化炭素含有ガス又は多相混合物が燃焼から放出される、項14又は15に記載の使用。
[項17]
前記ガスが煙道ガスである、項16に記載の使用。
[項18]
前記二酸化炭素含有ガス又は多相混合物が天然ガス又は合成ガスである、項14又は15に記載の使用。
[項19]
前記二酸化炭素含有ガスがバイオガスである、項14に記載の使用。
[項20]
前記二酸化炭素含有媒体が液体である、項1〜12のいずれか1項に記載の使用。
[項21]
二酸化炭素の抽出が45℃〜60℃の温度で実施される、項1〜20のいずれか1項に記載の使用。
[項22]
高温で炭酸脱水酵素を有する単離ポリペプチドであって:
a)配列番号2又は配列番号4のアミノ酸配列と少なくとも94%の同一性を、あるいは番号6のアミノ酸配列と少なくとも91%の同一性を、あるいは番号8のアミノ酸配列と少なくとも96%の同一性を、あるいは番号10のアミノ酸配列と少なくとも89%の同一性を、あるいは番号12のアミノ酸配列と少なくとも97%の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド;
b)中程度にストリンジェントな条件のもと、
i)配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10及び配列番号12から成る群から選択される成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、
ii)成熟酵素をコードする、配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9及び配列番号11の領域から成る群から選択されるポリヌクレオチド配列、
iii)成熟酵素をコードする、配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9及び配列番号11の領域から成る群から選択されるポリヌクレオチド配列に含まれるcDNA配列、
iv)少なくとも100個の連続した配列から成る、(i)、(ii)又は(iii)の部分配列、あるいは
v)(i)、(ii)、(iii)又は(iv)の相補鎖、
とハイブリダイズする核酸配列がコードするポリペプチド;及び
c)炭酸脱水酵素活性を有する(a)又は(b)のフラグメント、
から成る群から選択される、単離ポリペプチド。
[項23]
配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、又は配列番号12のアミノ酸配列に対し、少なくとも97%の同一性を有するアミノ酸配列を有する、項22に記載のポリペプチド。
[項24]
前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、成熟酵素をコードする、配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9及び配列番号11の領域から成る群から選択されるか、あるいは遺伝子コードの縮重が原因で異なっているその配列、から選択される、項22に記載のポリペプチド。
[項25]
炭酸脱水酵素活性が、45℃超の温度で少なくとも15分間維持される、項22〜24のいずれか1項に記載のポリペプチド。
[項26]
炭酸脱水酵素活性が、45℃超の温度で少なくとも30日間維持される、項25に記載のポリペプチド。
[項27]
項22〜26のいずれか1項に記載のポリペプチドを含んで成る組成物。
[項28]
炭酸脱水酵素がマトリックス上に固定されている、項27に記載の組成物。
[項29]
前記マトリックスが、ビーズ、繊維、ファイバー、膜、粒子、多孔性表面、ロッド及びチューブの群から選択される、項28に記載の組成物。
[項30]
二酸化炭素の回収に利用可能であることを特徴とする、項27〜29のいずれか1項に記載の組成物。
[項31]
項22〜25のいずれか1項で規定されているポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する、単離ポリヌクレオチド。
[項32]
a)中程度にストリンジェントな条件のもと、DNA群と、
i)配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9及び配列番号11から成る群から選択されるポリヌクレオチド配列、
ii)配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9及び配列番号11から成る群から選択されるポリヌクレオチド配列に含まれているcDNA配列、あるいは
iii)(i)又は(ii)の相補鎖、
とをハイブリダイズさせ;そして
b)ハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、高温で炭酸脱水酵素活性を有するポリペプチドをコードするものを単離すること、
によって得られる単離ポリヌクレオチド。
[項33]
発現宿主において前記ポリペプチドの産生を指示する1又は複数の制御配列と作用可能に連結した、項31又は32のポリヌクレオチドを含んで成る核酸コンストラクト。
[項34]
項33に記載の核酸コンストラクトを含んで成る組換え発現ベクター。
[項35]
項33に記載の核酸コンストラクト、又は項34に記載の組換え発現ベクター、を含んで成る組換え宿主細胞。
[項36]
a)野生型の状態で前記ポリペプチドを産生することができる株を培養して、当該ポリペプチドを産生し;そして
b)当該ポリペプチドを回収すること、
を含んで成る、項22〜26のいずれか1項に記載のポリペプチドを産生するための方法。
[項37]
a)項35で規定された組換え宿主細胞を、前記ポリペプチドの産生を誘導する条件のもと培養し;そして
b)当該ポリペプチドを回収すること、
を含んで成る、項22〜26のいずれか1項に記載のポリペプチドを産生するための方法。
[項38]
前記リアクターが、少なくとも9.0のpHを有する炭酸水素バッファー及び炭酸脱水酵素を含んで成る、二酸化炭素を抽出するためのバイオリアクター。
[項39]
前記バッファーがアミンベースのCO 2 吸収化合物を更に含んで成る、項38に記載のバイオリアクター。
[項40]
前記炭酸水素バッファーが、膜液体の構成成分である、項38又は39に記載のバイオリアクター。
[項41]
前記膜液体が含有液膜(CLM)に含まれている、項40に記載のバイオリアクター。
[項42]
前記炭酸脱水酵素が、膜液体1L当たり1g未満の濃度で添加される、項40又は41に記載のバイオリアクター。
[項43]
前記炭酸脱水酵素が熱安定性炭酸脱水酵素である、項38〜42のいずれか1項に記載のバイオリアクター。
[項44]
前記熱安定性炭酸脱水酵素が、項44に記載の炭酸脱水酵素である、項38〜42のいずれか1項に記載のバイオリアクター。
[項45]
前記アミンベースのCO 2 吸収化合物が10%未満である、項39〜44のいずれか1項に記載のバイオリアクター。
[項46]
前記アミンベースの吸収化合物がモノエタノールアミンである、項45に記載のバイオリアクター。
Claims (15)
- 二酸化炭素含有媒体から二酸化炭素を抽出するための、配列番号14のアミノ酸配列と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を有するαクラスの熱安定性炭酸脱水酵素の使用。
- 前記αクラスの炭酸脱水酵素が:
a)配列番号2又は配列番号4のアミノ酸配列と少なくとも94%の同一性を、あるいは配列番号6のアミノ酸配列と少なくとも91%の同一性を、あるいは配列番号8のアミノ酸配列と少なくとも96%の同一性を、あるいは配列番号10のアミノ酸配列と少なくとも90%の同一性を、あるいは配列番号12のアミノ酸配列と少なくとも97%の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド;並びに
b)高ストリンジェントな条件のもと、
i)配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10及び配列番号12から成る群から選択される成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、
ii)配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9及び配列番号11内の成熟酵素をコードする領域から成る群から選択されるポリヌクレオチド配列、
iii)配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9及び配列番号11内の成熟酵素をコードする領域から成る群から選択されるポリヌクレオチド配列に含まれるcDNA配列、
iv)少なくとも100個の連続したヌクレオチドから成る、成熟酵素をコードする(i)、(ii)又は(iii)の部分配列、あるいは
v)(i)、(ii)、(iii)又は(iv)の相補鎖、
とハイブリダイズする核酸配列がコードするポリペプチドから成る群から選択される、単離ポリペプチドである、請求項1に記載の使用。 - 前記熱安定性炭酸脱水酵素がバイオリアクター内で使用される、請求項1又は2に記載の使用。
- 前記二酸化炭素含有媒体がガス又は多相混合物である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の使用。
- 二酸化炭素含有ガス又は多相混合物が天然ガス又は合成ガス又は燃焼若しくは発酵から放出されたガスである、請求項4に記載の使用。
- 高温で炭酸脱水酵素活性を有する単離ポリペプチドであって:
a)配列番号2又は配列番号4のアミノ酸配列と少なくとも98%の同一性を、あるいは配列番号6のアミノ酸配列と少なくとも96%の同一性を、あるいは配列番号8のアミノ酸配列と少なくとも99%の同一性を、あるいは配列番号10のアミノ酸配列と少なくとも94%の同一性を、あるいは配列番号12のアミノ酸配列と少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド
から成る群から選択される、単離ポリペプチド。 - 前記ポリペプチドの精製又は固定化を補助するタグが前記ポリペプチドに付加されている、請求項6に記載のポリペプチド。
- タグがポリヒスチジンタグである、請求項7に記載のポリペプチド。
- 請求項6〜8の何れか一項に記載のポリペプチドを含んで成る組成物。
- 炭酸脱水酵素がマトリックス上に固定されている、請求項9に記載の組成物。
- 請求項6〜8の何れか一項で規定されているポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する、単離ポリヌクレオチド。
- 請求項11に記載のポリヌクレオチドを含んで成る組換え発現ベクター。
- 請求項11に記載のポリヌクレオチド、又は請求項12に記載の組換え発現ベクター、を含んで成る組換え宿主細胞。
- a)請求項13で規定された組換え宿主細胞を、前記ポリペプチドの産生を誘導する条件のもと培養し;そして
b)当該ポリペプチドを回収すること、
を含んで成る、請求項6〜8の何れか一項に記載のポリペプチドを産生するための方法。 - 二酸化炭素を抽出するためのバイオリアクターであって、pH9.0超の炭酸水素緩衝液と、配列番号14のアミノ酸配列と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を有するαクラスの炭酸脱水酵素とを含むバイオリアクター。
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