CN115698251A - 需氧发酵系统及使用其的方法 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及用于生产全细胞和生物分子的集成甲醇合成和发酵系统，以及使用该系统的方法。在一个实施方案中，装置包含入口端口；泵，其与入口端口流体连通以从发酵容器泵入发酵液；冷却系统；与冷却系统流体连通的曝气系统；以及出口端口，以将发酵液重新引入发酵容器中。

Description

需氧发酵系统及使用其的方法
对相关申请的交叉引用
本申请要求于2020年05月21日提交的美国临时专利申请号63/028,167的优先权，其公开内容通过引用其整体在此并入。
技术领域
本公开涉及生物分子生产，并且更具体地，涉及经由发酵过程生产生物分子，如蛋白质和单细胞蛋白(全细胞)的系统和方法。
背景技术
生物分子通常是由生物体产生的复杂大分子，包括但不限于肽、蛋白质、酶、脂肪酸、类胡萝卜素、类黄酮、碳水化合物和生物聚合物(例如聚羟基脂肪酸酯，包括聚羟基丁酸酯、甲壳素、纤维素和短梗霉多糖)。经由发酵进行的生物分子合成是一种确立已久的过程，其利用多种类型的单细胞生物，包括细菌、酵母、哺乳动物细胞和藻类，通常但不仅仅在严格温度条件、需氧或厌氧条件以及其他条件下在密闭容器中生长。除了复杂的生物分子，更简单的分子，包括低分子量的醇类、酸类和酮类，通常经由发酵产生。
过去几十年的技术进步已允许用于许多生物类型的基因工程，这引导它们产生选定的分子。替代地，未改变的细胞也天然产生多种生物分子，并且经常作为散装蛋白质或酶的来源生长。生物分子，包括但不限于上述蛋白质和其他分子，既可以排出到单细胞生物生长的发酵培养基中，也可以保留在细胞内。在前一种情况下，可以使用技术包括但不限于超滤、沉淀、离心和高效液相色谱法(HPLC)将生物分子与发酵培养基分离。在后一种情况下，期望的生物分子可能保留在全细胞内(其通常是干燥的)，或经由细胞裂解/破裂或其他众所周知的分离和纯化过程进行分离。经由发酵过程生产的蛋白质的应用包括生物制药、分析蛋白、工业酶和用于人和动物营养的散装蛋白质(称为“单细胞蛋白”或“SCP”)。其他发酵应用包括但不限于生产营养补充剂、用在包装中的生物聚合物和医学应用。
发明概述
以下概述提出本公开的各个方面的简化概述，以便提供对这些方面的基本理解。本概述不是对公开的广泛综述。其意图是既不确定本公开的关键或重要元素，也不描述公开的特定实施方案的任何范围或权利要求的任何范围。其意图是以简化形式提出本公开的一些概念，作为后面提出的更详细描述的前序。
本公开的方面涉及系统和方法，其用于改善用于生产全细胞产物或生物分子的大规模需氧发酵系统的温度控制和溶解氧水平。
在一个方面，发酵系统包含：发酵容器；和与所述发酵容器流体连通的外部环路。在至少一个实施方案中，外部环路包含：一个或多个入口端口；一个或多个泵，其与一个或多个入口端口流体连通以从发酵容器泵入发酵液；一个或多个出口端口，以将发酵液重新引入所述发酵容器；冷却装置；和曝气装置，其与冷却装置流体连通。
在至少一个实施方案中，曝气装置位于冷却装置和泵的上游。在至少一个实施方案中，冷却装置位于曝气装置和泵的上游。
在至少一个实施方案中，曝气装置配置为将含氧气体引入发酵液中。在至少一个实施方案中，含氧气体包括纯化氧、空气，或氧与其他气体的混合物。
在至少一个实施方案中，曝气装置包括射流曝气器、表面曝气器或细气泡扩散器中的一种或多种。
在至少一个实施方案中，曝气装置包括纳米气泡发生器，该纳米气泡发生器配置为产生具有小于约200纳米的中位直径的氧气泡。
在至少一个实施方案中，冷却装置的入口与泵的出口流体连通。在至少一个实施方案中，冷却装置包含：一个或多个管，发酵液可以流过该一个或多个管；以及热交换器，其与一个或多个管热连通。
在至少一个实施方案中，热交换器包含一个或多个热管。在至少一个实施方案中，至少一个热管的近端与一个或多个管热连通。在至少一个实施方案中，至少一个热管的远端与冷却剂热连通。
在至少一个实施方案中，热交换器包括壳管式热交换器、逆流式热交换器、平行流式热交换器、板式热交换器、板翅式热交换器、相变式热交换器或微通道式热交换器中的一种或多种。在至少一个实施方案中，热交换器配置为使冷却剂流过与所述一个或多个管热连通的夹套。
在至少一个实施方案中，冷却剂包括空气、冷冻水或制冷剂中的一种或多种。在至少一个实施方案中，冷却剂进一步与激冷器热连通，以维持冷却剂的温度低于发酵液的温度。
在至少一个实施方案中，激冷器包括吸附式激冷器。
在至少一个实施方案中，冷却装置进一步包含位于冷却装置的入口侧和/或出口侧的温度传感器。
在至少一个实施方案中，发酵系统进一步包含用于将培养基引入发酵液的培养基计量装置。在至少一个实施方案中，培养基包含甲醇、甲烷、葡萄糖、右旋糖、乙醇、糖、甘油或酵母提取物中的一种或多种。在至少一个实施方案中，培养基包含甲醇。
在至少一个实施方案中，发酵系统进一步包含一个或多个甲醇传感器。
在至少一个实施方案中，发酵系统进一步包含一个或多个溶解氧传感器。
在至少一个实施方案中，发酵系统进一步包含用于连续分离存在于发酵液中的全细胞的一部分的分离装置。在至少一个实施方案中，分离装置的入口与发酵液和至少两个出口流流体连通。在至少一个实施方案中，第一出口流提供返回装置的全细胞消减流的至少一部分并且第二出口流提供从装置中去除的全细胞浓缩流。
在至少一个实施方案中，发酵系统进一步包含用于分离存在于发酵液中的清洁发酵液的一部分的分离装置，该清洁发酵液含有由发酵液中的细胞产生的生物分子。在至少一个实施方案中，分离装置的入口与发酵液和至少两个出口流流体连通。在至少一个实施方案中，第一出口流提供返回装置的清洁发酵液消减流并且第二出口流提供从装置中去除的清洁发酵液浓缩流。
在至少一个实施方案中，分离装置包括沉淀器、微量过滤器、超滤器、纳米过滤器、错流过滤器、离心机或连续流离心机中的一种或多种。
在至少一个实施方案中，发酵系统进一步包含CO2去除装置。在至少一个实施方案中，CO2去除装置配置为从发酵液中提取溶解CO2的一部分。
在至少一个实施方案中，CO2去除装置包括气体交换膜。
在至少一个实施方案中，冷却装置配置为维持发酵液的温度在20℃和40℃之间。
在至少一个实施方案中，曝气装置配置为维持发酵液的溶解氧水平高于15％。
在至少一个实施方案中，一个或多个入口端口位于一个或多个出口端口的上方。在至少一个实施方案中，一个或多个出口端口与发酵容器的底部部分流体连通。
在至少一个实施方案中，一个或多个出口端口装有扩散器。
在另一个方面，发酵系统包含：发酵容器；和至少一个外部环路，其与发酵容器流体连通。在至少一个实施方案中，外部环路包含：冷却装置；曝气装置，其与冷却装置流体连通。在至少一个实施方案中，冷却装置和曝气装置布置在不同的外部环路内。
在另一个方面，需氧发酵的方法包括利用上述任何实施方案的发酵系统生产全细胞产物和/或生物分子。在至少一个实施方案中，生物分子包括蛋白质、酶、类胡萝卜素、维生素、生物聚合物、脂质、纤维素、经由发酵过程产生的其它分子，或其组合。在至少一个实施方案中，需氧发酵包括甲基营养生物的生长。在至少一个实施方案中，甲基营养生物包括酵母。在至少一个实施方案中，酵母包括巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)。在至少一个实施方案中，需氧发酵包括细菌的生长。在至少一个实施方案中，细菌包括食甲基嗜甲基菌(Methyophilus methylotrophus)、扭脱甲基杆菌(Methylobacterium extorquens)、喜甲烷甲基单胞菌(Methylomonas methanolica)或甲烷假单胞菌(Pseudomonas methanolica)中的一种或多种。在至少一个实施方案中，生物分子从发酵液中排出并分离，或保留在全细胞内。
在另一个方面，方法包括：将发酵液从发酵容器接收到一个或多个外部环路的入口端口；使发酵液流过冷却装置；使发酵液流过曝气装置；和使发酵液经由一个或多个出口端口离开装置并重新引入发酵容器中。
在至少一个实施方案中，发酵液在曝气装置之前流过冷却装置。在至少一个实施方案中，发酵液在冷却装置之前流过曝气装置。
在至少一个实施方案中，曝气装置将含氧气体引入发酵液中。在至少一个实施方案中，含氧气体含氧气体包括纯化氧、空气，或氧与其他气体的混合物。
在至少一个实施方案中，曝气装置包括射流曝气器、表面曝气器或细气泡扩散器中的一种或多种。
在至少一个实施方案中，曝气装置包括纳米气泡发生器，该纳米气泡发生器配置为产生具有小于约200纳米的中位直径的氧气泡。
在至少一个实施方案中，冷却装置包含：一个或多个管，发酵液流过该一个或多个管；和热交换器，其与该一个或多个管热连通。
在至少一个实施方案中，热交换器包含一个或多个热管。在至少一个实施方案中，至少一个热管的近端与一个或多个管热连通。在至少一个实施方案中，至少一个热管的远端与冷却剂热连通。
在至少一个实施方案中，热交换器包括壳管式热交换器、逆流式热交换器、平行流式热交换器、板式热交换器、板翅式热交换器、相变式热交换器或微通道式热交换器中的一种或多种。在至少一个实施方案中，热交换器使冷却剂流过与一个或多个管热连通的夹套。
在至少一个实施方案中，冷却剂包括空气、冷冻水或制冷剂中的一种或多种。在至少一个实施方案中，冷却剂进一步与激冷器热连通，以维持冷却剂的温度低于发酵液的温度。
在至少一个实施方案中，激冷器包括吸附式激冷器。
在至少一个实施方案中，冷却装置进一步包含位于冷却装置的入口侧和/或出口侧的温度传感器。
在至少一个实施方案中，该方法进一步包括经由培养基计量装置将培养基引入发酵液中。在至少一个实施方案中，培养基包含甲醇、甲烷、葡萄糖、右旋糖、乙醇、糖、甘油或酵母提取物中的一种或多种。在至少一个实施方案中，培养基包括甲醇。
在至少一个实施方案中，该方法进一步包括将存在于发酵液中的全细胞的一部分分离成全细胞消减流和全细胞浓缩流。在至少一个实施方案中，将全细胞消减流提供回装置中。在至少一个实施方案中，将全细胞浓缩流从装置中去除。
在至少一个实施方案中，该方法进一步包括将存在于发酵液中的清洁发酵液的含生物分子部分分离成清洁发酵液消减流和清洁发酵液浓缩流。在至少一个实施方案中，将清洁发酵液消减流提供回装置中。在至少一个实施方案中，将清洁发酵液浓缩流从装置中去除。
在至少一个实施方案中，该方法进一步包括从发酵液中提取溶解CO2的一部分。
在至少一个实施方案中，冷却装置维持发酵液的温度在20℃和40℃之间。
在至少一个实施方案中，曝气装置维持发酵液的溶解氧水平高于15％。
在另一个方面，用于从甲基营养生物生产全细胞蛋白的方法包括：在连续的时间点测量湿细胞重量(WCW)；确定生物量生长的最大速率，该生物量生长测量为发酵容器内生物量质量的增加，该增加是发酵容器内发酵液体积的任何增加的原因；以相当于生物量生长的最大速率的速率提取全细胞。
在至少一个实施方案中，该方法进一步包括通过取WCW和生物量体积的乘积的时间导数来确定生物量生长的最大速率。
在至少一个实施方案中，该方法进一步包括调节暴露于分离装置的发酵液的流速，使得维持对应于生物量生产的最大速率的细胞密度。
在至少一个实施方案中，该方法进一步包括裂解提取的全细胞的一部分。在至少一个实施方案中，将裂解的全细胞的产物引入生长培养基中。在至少一个实施方案中，将生长培养基引入发酵液中或用于不同的发酵过程中。在至少一个实施方案中，甲基营养生物包括巴斯德毕赤酵母。在至少一个实施方案中，甲基营养生物包括食甲基嗜甲基菌、扭脱甲基杆菌、喜甲烷甲基单胞菌或甲烷假单胞菌中的一种或多种。
在另一个方面，上述发酵系统的任何实施方案可以适应于执行上述方法的任何实施方案。
在另一个方面，上述系统的任何实施方案可包括上述分离装置的任何实施方案。
如本文所用，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数引用，除非上下文另有明确说明。因此，例如，提到“一种蛋白质”可以包括单一蛋白质、单一类型的多种蛋白质和两种或两种以上不同蛋白质的混合物。
同样，如本文所用，术语“约”与测量的数量有关，是指测量的数量的正常变化，正如本领域的普通技术人员在进行测量和行使与测量的目标和测量设备的精度相称的谨慎程度方面所预期的。在至少一个实施方案中，术语“约”包括所列的数字±1％，因此“约10”将包括9.9至10.1以及其间的所有值。
同样，如本文所用，“蛋白质”具有其在本领域中的普通和惯用含义，包括，并且是指多肽(即至少由两个氨基酸通过肽键彼此连接的串)。多肽可以包括天然氨基酸、非天然氨基酸、合成氨基酸、氨基酸类似物及其组合。术语“肽”通常是指长度小于约50个氨基酸的多肽。蛋白质可以包括氨基酸以外的部分(例如，糖蛋白)，并且可以经加工或修饰。蛋白质可以是如由细胞产生的完整多肽链，也可以是其功能部分。蛋白质可以包括多于一条多肽链，其可以是化学连接的(例如通过二硫键)、非化学连接的(例如通过氢键)或两者。多肽可以含有L-氨基酸、D-氨基酸或两者，并且可以含有本领域已知的各种氨基酸修饰或类似物。
附图说明
本公开在附图的图中通过示例的方式而不是限制的方式进行说明，其中：
图1是说明基于碳源的放热和需氧量的图。
图2A是说明根据本公开的至少一个实施方案的用于生长全细胞和/或合成生物分子的示例性发酵系统的框图。
图2B是说明根据本公开的至少一个实施方案的包含多个外部环路的示例性发酵系统的框图。
图3A是说明根据本公开的至少一个实施方案的示例性外部环路的组件的框图；
图3B是说明根据本公开的至少一个实施方案的进一步示例性外部环路的组件的框图；和
图4是说明根据本公开的至少一个实施方案的生产生物分子或全细胞的方法的流程图。
发明详述
单细胞蛋白(SCP)是已经用于动物和人类消费的确立技术，尽管其规模远小于传统的蛋白质来源。使用高蛋白含量(60-80％)的甲基营养微生物在甲醇底物上发酵的SCP提供了潜在的解决方案来生产增长的人口所需的蛋白质，同时大大减少农业足迹。也可以通过培养各种微生物和藻类，优选其生物量中含有超过30％蛋白质并且可以提供必需氨基酸的健康平衡的微生物和藻类来提供蛋白质。微生物蛋白一般被称为SCP，尽管一些生产微生物，诸如丝状真菌或丝状藻类，可能是多细胞的。糖、糖衍生物或甘油常被用作生长细胞的碳和能量来源(具有额外的氮、盐和其他营养添加剂)。一些生物可以利用其他分子作为碳和能量来源。例如，甲基营养菌是可以利用甲醇或其他简单醇作为碳和能量来源的微生物。
除了直接作为SCP使用外，微生物在用于升级发酵食品的蛋白质含量或质量时，有助于蛋白质需求。虽然，微生物蛋白质提供目前人营养中相对较小的比例，但对蛋白质增长的全球需求很可能使SCP变得越来越重要。高生长速率或利用独特底物(诸如CO2、甲烷或甲醇)的能力导致提供比传统农业高得多的效率和/或可持续性的过程。
尽管用于动物饲料的SCP来源的范围比批准用于人类消费的更广并正在扩大，SCP目前由有限数量的微生物物种生产。衍生自藻类、真菌(包括酵母)和细菌的产物均在使用或开发中。生产步骤通常包括(a)营养培养基的制备，(b)培养，包括固态发酵，(c)SCP的分离和浓缩，和在某些情况下的干燥，以及(d)将SCP最终加工成成分和产品。用于人类消费的SCP通常由食品级底物生产，并且必须始终考虑监管问题。
已经考虑广泛的真菌用作SCP。来自酵母属(Saccharomyces)、镰刀菌属(Fusarium)和球拟酵母属(Torulopsis)的产物是市售的。作为SCP生长的真菌通常含有30-50％的蛋白质。甲基营养酵母，例如巴斯德驹形氏酵母(Komagataella pastoris)(以前称为巴斯德毕赤酵母)，从甲醇生产生物量和蛋白质。细菌用作SCP也具有很长的历史，特别是在动物饲料中。按干重计算，细菌SCP通常含有50-80％的蛋白质。与真菌一样，细菌SCP具有较高的核酸含量(8-12％)，特别是RNA，因此在用作食品/饲料之前需要加工。除蛋白质外，细菌SCP还提供一些脂质和B族维生素。
所有发酵应用对成本非常敏感，并且完全市场采用取决于将成本降低到低于替代品。用于人和动物营养的大规模散装蛋白质应用特别具有成本敏感性，因为它们与廉价的豆粕竞争，豆粕是基于植物的蛋白质的最大来源，并且是动物饲料中的主要组分。
目前，将发酵容器维持在最佳微生物生长温度(约28℃)的最常用方法是通过使用与冷却剂(通常为冷冻水)在其中流动的发酵容器的外表面的全部或一部分连接的冷却套管。然而，发酵容器的表面积与体积比随容器尺寸增加而降低，因为体积随r3(其中r是容器的近似半径)增加而增加，而表面积随r2增加而增加。因此，维持给定温度所需的热流必须相应增加，并成为实际工程限制。
类似地，随着细胞生长速率和细胞密度升高时需氧量(即微生物使用的氧气的量)增加，维持足够的溶解氧水平是一个挑战。此外，随着体积增加，在整个发酵容器中维持均匀的氧合是一个挑战。常规的曝气技术包括通过发酵液鼓泡空气或纯化氧。然而，由于气泡的大小并且大多数气泡到达上表面并离开发酵液而没有完全转移氧气，常规曝气的氧转移速率相对较差。在高细胞浓度下观察到粘度升高时，鼓泡本身变得更具挑战性和能量密集。
上述热控制和氧合问题对于使用甲醇补料的巴斯德毕赤酵母的发酵特别有问题。巴斯德毕赤酵母使用醇氧化酶(AOX)代谢甲醇用于能量和生物量积累，AOX使溶解氧与甲醇反应形成甲醛，而甲醛又反过来是下游代谢反应的底物。醇氧化是升高的耗氧量和生热两者的来源(参见图1)。
目前系统的这些和其他局限性通过本公开来解决，本公开描述了改善用于生产全细胞产物或生物分子的大规模需氧发酵系统的温度控制和溶解氧水平的装置、包含装置的系统以及方法。生物分子的非限制性示例包括蛋白质、酶、类胡萝卜素、维生素、生物聚合物、脂质、纤维素、经由发酵过程产生的其他分子，以及其组合。需氧发酵包括但不限于甲基营养生物的生长，每种甲基营养生物的非限制性示例包括酵母(诸如巴斯德毕赤酵母)以及细菌，诸如食甲基嗜甲基菌、扭脱甲基杆菌、喜甲烷甲基单胞菌、甲烷假单胞菌等。在至少一个实施方案中，生物分子可以从发酵液中排出和分离，或保留在全细胞内。然后，含有生物分子的全细胞可以分离和干燥，或者替代地经由细胞分离、裂解和生物分子纯化进行提取。关于蛋白质，应用包括生产异源蛋白质/肽生物制药、工业酶和分析性蛋白，以及可以提取或保留在全细胞内并用作人和动物营养添加剂的本体蛋白质。
如本文所用，“发酵液”是指包含全细胞、水、培养基、由全细胞排出的生物分子和发酵容器内的其他组分的水性溶液/悬浮物。发酵液可以分离成全细胞级分和清洁发酵液。清洁发酵液包括水、培养基、由细胞排出的生物分子和其他成分。
同样，如本文所用，“培养基”是指包含所需的碳和化学能量来源(通常是葡萄糖、糖、甲醇、甘油或其他含碳分子中的一种或多种)、水，和任选地含氮分子(例如氨盐)、磷酸盐以及其他盐和营养物质(包括任选的酵母提取物)中的一种或多种以促进微生物生长的溶液。
图2A是说明根据本公开的至少一个实施方案的用于生长全细胞和/或合成生物分子的示例性发酵系统100的框图。发酵系统100包括用于处理的外部环路102，其经由入口端口108和出口端口120与发酵容器104流体连通。外部环路102包括各种组件，其用于处理从入口端口108接收的发酵液(例如，靠近发酵容器104的上部)，以及经由出口端口120将经处理的发酵液重新引入发酵容器104中(例如，靠近发酵容器104的下部)。下文根据图3A和3B更详细地描述外部环路102的组件。
图2B是说明根据本公开的至少一个实施方案的包含多个外部环路的示例性发酵系统200的框图。例如，如所例示，发酵系统200包含外部环路102和外部环路202(其可以与外部环路102相同或相似)，该外部环路202经由入口端口208和出口端口220与发酵容器104流体连通。需要理解的是，使用两个外部环路是示例性的，并且可以存在额外的外部环路。进一步需要理解的是，发酵系统100和200未按比例绘制，可以设计为任何合适的尺寸，并且可以根据本领域普通技术人员的期望进行修改。需要理解的是，发酵系统100和200的组件中的一个或多个可以是任选的。在至少一个实施方案中，每个发酵系统100或200的一些或全部功能可以是自动化的。
图3A是说明根据本公开的至少一个实施方案的外部环路102的组件的框图。除外部环路102和发酵容器104外，发酵系统100进一步包括与外部环路102流体连通的激冷器106。
在至少一个实施方案中，外部环路102包括与发酵容器104流体连通的入口端口108、一个或多个泵110，其通过外部环路102在回路中推动较高温度的脱氧发酵液112、从发酵液112去除热量的冷却装置114、将氧从含氧气体入口118溶解于发酵液112中的曝气装置116以及出口端口120，其将冷却的并充氧的发酵液112返回到发酵容器104中。在至少一个实施方案中，冷却装置114先于曝气装置116，因为氧在包括发酵液112的冷却水性溶液中比在更热的水性溶液中更容易溶解。在至少一个其他实施方案中，曝气装置116先于冷却装置114。在至少另一个实施方案中，出口端口120装有扩散器，其有助于发酵液的混合。在优选的实施方案中，入口端口108(和附加入口端口，如果存在)位于出口端口120(和附加出口端口，如果存在)上方，使得发酵液112重新引入到发酵容器104的较低部分或底部。
在至少一个实施方案中，发酵容器104可以进一步配备有混合装置126、消泡机构、传感器阵列(用于测量，例如温度、浊度、氧合、CO2、MeOH等的传感器)，或本领域普通技术人员将理解的其他组件。
在至少一个实施方案中，泵110与入口端口108流体连通，但需要理解的是，可以将其他泵放置于回路中(例如，在冷却装置114或曝气装置116之后)，以便于维持适当的流速。
在至少一个实施方案中，冷却装置114包括热交换器122，发酵液112中的热能经由冷却剂管线124从该热交换器122中传递至通过激冷器106循环的冷却剂中。可以修改各种技术，用于与本实施方案使用，包括但不限于管壳式设计，对于管壳式设计来说发酵液112流过其中有冷却剂流动的夹套内的一个或多个管。在至少一个实施方案中，冷却剂可以是冷冻水、空气或制冷剂。在至少一个实施方案中，冷却剂可以以相同的方向或逆流方式流动。可以修改用于与本实施方案一起使用的其他示例性热交换器包括翅或板设计，在翅或板设计中导热金属热耦合到供发酵液112流过的一个或多个传导管上。热量可以从发酵液112流向翅或板，该翅或板反过来通过气流、冷冻水或制冷剂进行冷却。在所有情况下，热交换器可以设计使得冷却剂保持在同一相中或交替发生相变(例如蒸发)。
在至少一个实施方案中，可以使用热管以高效地将热量从近端传递到远端。在此类实施方案中，将近端放置于与发酵液112热连通，而远端与冷却剂热连通。热管通常是其中有工作流体和芯的金属管。近端的热量导致工作流体吸收热量并蒸发，然后其行进至近端，在此处冷凝并将热量释放到冷却剂中。然后，冷凝的工作液经由毛细管作用送回到热管的近端。在至少一个实施方案中，激冷器106可以包括延伸到发酵容器中的一个或多个热管，并且可以包括一个或多个混合叶轮，其包括但不限于径向流盘式叶轮、桨式混合器和螺旋混合器。
在至少一个实施方案中，热量从冷却剂中被去除，并通过激冷器106释放到环境中。在至少一个实施方案中，激冷器可以包括但不限于由热能(包括蒸汽、太阳能或天然气、石油或其他燃料的燃烧)驱动的吸附式激冷器。
在至少一个实施方案中，将发酵液112的温度维持在10℃-50℃、20℃-30℃、25℃-35℃或26℃-29℃之间。
在至少一个实施方案中，曝气装置116用于将氧溶解到发酵液112中。可以从提供空气、纯化氧，或氧与其他气体，诸如CO2、氩、N2或其他气体种类(诸如挥发性有机化合物)的混合物的含氧气体入口118接收氧。可以使用本领域已知的技术任选地生成纯化氧，该技术包括但不限于利用吸附剂，诸如分子筛、沸石和其他材料的变温吸附和变压吸附系统。
在至少一个实施方案中，可以经由多种方法将含氧气体引入发酵液112中，该方法包括但不限于鼓泡、射流曝气、喷雾、喷洒发酵液112通过含氧气体或本领域已知的其他方法。在至少一个实施方案中，通过生成纳米级气泡(例如，小于200纳米)将氧引入到发酵液112中，这些气泡足够小以具有有助于将其维持在悬浮物中的表面电荷。与该领域的常规方法相比，已证明纳米气泡极大地增加氧转移至少3倍(例如，参见美国专利申请公布号2016/0236158A1和2014/0191425A1)。
在至少一个实施方案中，维持发酵液112的溶解氧水平高于5％、高于10％、高于15％、高于20％、高于25％或高于30％。
在至少一个实施方案中，当使用多个外部环路时(例如，如在发酵系统200中)，图3A中所例示的一个或多个组件可以在多个外部环路间分离。例如，在至少一个实施方案中，曝气装置116可以布置在与热交换器122不同的外部环路中(例如，曝气装置116可以布置在外部环路102内，而热交换器122可以布置在外部环路202内)。在此类实施方案中，热交换器122和曝气装置116的位置可以变化，条件是发酵系统100或200包括至少一个热交换器122和至少一个曝气装置116。在至少一个实施方案中，可能存在多个曝气装置116和热交换器122。
图3B是例示了根据本公开的至少一个实施方案的为外部环路102的修改型式的外部环路152的框图。外部环路152进一步包括：培养基计量装置154，其用于将生长培养基156引入发酵液112中；分离装置158，其用于从发酵液112中去除全细胞的一部分作为滤液流160或清洁发酵液的一部分(包括悬浮在清洁发酵液中的生物分子)作为滤液流160；CO2去除装置162，其用于从发酵液112中提取CO2至CO2流164；一个或多个温度传感器166；一个或多个氧传感器168；一个或多个CO2传感器170；和一个或多个甲醇传感器172(如果生长培养基130中包含甲醇，则可能存在)。在至少一个实施方案中，示例性甲醇传感器172可以由Raven Biotech或Sartorious Stedim Biotech提供。在至少一个实施方案中，示例性氧传感器168可以由Hach、Sensorex、Hamilton或Process Instruments提供。在至少一个实施方案中，示例性CO2传感器170可以由Mettler Toledo、Anton-Paar或Martek Instruments提供。
在至少一个实施方案中，将培养基计量装置154配置为将生长培养基156引入发酵液112中。生长培养基156的非限制性示例可能包括碳和能量来源、盐(包括硝酸盐和/或磷酸盐)、生物素、酵母提取物或其他组分。碳和能量来源可能包括但不限于葡萄糖、右旋糖、其他糖、甘油、甲烷、甲醇、乙醇及其组合。
现在描述了巴斯德毕赤酵母的示例性生长培养基。生长培养基(根据所用碳源称为缓冲甘油复合培养基(BMGY)或缓冲甲醇复合培养基(BMMY))包含1％酵母提取物、2％蛋白胨、100mM磷酸钾(pH 6.0)、1.34％酵母含氮碱(含硫酸铵)。BMGY进一步包含0.75％甘油，而BMMY进一步包含1％甲醇。
现在描述了进一步的示例性生长培养基，其为FM22粉末和PMT1盐的混合物。FM22粉末(Sunrise Science Products，目录号4090)含有：磷酸二氢钾(42.9g/L)、硫酸铵(5g/L)、脱水硫酸钙(1g/L)、硫酸钾(14.3g/L)和无水硫酸镁(5.71g/L)。对于高细胞密度发酵，可以以68.9g/L使用FM22粉末。PTM1盐含有：生物素(0.2g/L)、硼酸(0.02g/L)、无水氯化钴(相当于0.28g/L)、硫酸铜·5H2O(6g/L)、无水硫酸铁(35.51g/L)、硫酸镁·H2O(3g/L)、碘化钠(0.08g/L)、钼酸钠·2H2O(0.2g/L)和氯化锌(20g/L)。PTM1盐可以用5mL/L的H2SO4以65.3g/L溶解，4mL/L的混合物用于高细胞密度发酵。
在至少一个实施方案中，分离装置158将全细胞的全部或一部分从发酵液中移入全细胞浓缩滤液流160中，同时经由第二全细胞消减流将剩余细胞返回发酵液中。分离装置158的非限制性示例包括沉淀、微量过滤、超滤、纳米过滤、离心、恒流离心和本领域已知的其他技术。
分散在发酵液112中的生物体可能或可能不将蛋白质或其他生物分子排出到发酵液112中。可以从发酵容器104中将具有含全细胞的发酵液112的全部或一部分提取至输出流中。在至少一个实施方案中，可以经由细胞分离装置将输出流分离成浓缩全细胞流和全细胞消减流。在至少一个实施方案中，全细胞消减流可以再循环回发酵容器104中。在至少一个实施方案中，可以对浓缩全细胞流进行裂解，然后纯化以分离可以引入干燥装置中的期望生物分子。在至少一个实施方案中，将浓缩全细胞流(全细胞内具有蛋白质、油和/或其他生物分子)引入干燥装置中以产生干燥的全细胞。细胞分离装置的示例性和非限制性示例包括离心机、连续流离心机和过滤器，诸如平均孔径小于全细胞平均直径的微量过滤器和超滤器。在至少一个实施方案中，干燥装置可以经由过热蒸汽干燥系统直接完成，或通过使用蒸汽热驱动加热的空气干燥器间接完成。在至少一个实施方案中，加热的空气干燥器可以另外包括喷雾干燥装置，使得水合的全细胞或排出的生物分子喷雾到暴露于来自过热蒸汽或干燥空气的高温下的液滴中。其他非限制性示例性干燥过程包括冷冻干燥和冻干。
在至少一个实施方案中，分离成滤液流160的全细胞的一部分在全细胞浓度(在发酵液112内测量为湿细胞重量(WCW))的0％至1％之间。在至少一个实施方案中，分离成滤液流160的全细胞部分在全细胞浓度(在发酵液112内测量为WCW)的0％至10％之间。在至少一个实施方案中，分离成滤液流160的全细胞部分在全细胞浓度(在发酵液112内测量为WCW)的0％至25％之间。在至少一个实施方案中，分离成滤液流160的全细胞部分在全细胞浓度(在发酵液112内测量为WCW)的0％至<50％之间。在至少一个实施方案中，分离成滤液流160的全细胞部分在全细胞浓度(在发酵液112内测量为WCW)的0％至99％之间。
当产物以生物分子(例如蛋白质或其他生物分子)的形式悬浮在清洁发酵液中时，分离装置158将清洁发酵液的一部分从发酵液中移至清洁发酵液浓缩滤液流160中，同时经由第二清洁发酵液消减流将剩余部分返回至发酵液112中。非限制性示例包括微量过滤、纳滤、离心、恒流离心和本领域已知的其他技术。
在至少一个实施方案中，发酵系统100进一步包括排出的生物分子分离装置，其接收滤液流160，该滤液流160包含发酵液112、全细胞和从全细胞排出的生物分子。排出的生物分子分离装置可以是离心机、错流过滤器或能够从液体部分和较小分子量部分中分离出较高分子量蛋白质的其他装置。在至少一个实施方案中，排出的生物分子分离装置可以将输出流分离成含生物分子的流(可以提供给生物分子纯化装置)和重新引入发酵容器104的生物分子消减流(含有发酵液112和全细胞)。在至少一个实施方案中，生物分子纯化装置可以使用以下技术中的一种或多种来获得纯化的生物分子，包括但不限于超滤、纳米过滤、错流过滤、反渗透、超离心、沉淀、色谱法和高压液相色谱法。
在至少一个实施方案中，分离成滤液流160的清洁发酵液的一部分在浓度在清洁发酵液浓度(在发酵液112内测量为(100％-WCW))的0％至1％之间。在至少一个实施方案中，分离成滤液流160的清洁发酵液的一部分在清洁发酵液浓度(在发酵液112内测量为(100％-WCW))的0％至10％之间。在至少一个实施方案中，分离成滤液流160的清洁发酵液的一部分在清洁发酵液浓度(在发酵液112内测量为(100％-WCW))的0％至25％之间。在至少一个实施方案中，分离成滤液流160的清洁发酵液的一部分在清洁发酵液浓度(在发酵液112内测量为(100％-WCW))的0％至50％之间。在至少一个实施方案中，分离成滤液流160的清洁发酵液的一部分在清洁发酵液浓度(在发酵液112内测量为(100％-WCW))的0％至99％之间。
在至少一个实施方案中，将CO2去除装置162配置为从发酵液112中去除衍生自微生物需氧呼吸的CO2。例如，CO2去除装置162可以利用多胺或CO2选择性膜。例如，在美国专利号5,271,743和8,647,569中描述了可以改良用于与本实施方案使用的CO2去除装置。在至少一个实施方案中，选择性CO2膜可以包括任选地涂有硅氧烷的一个或多个中空透气纤维，并且可以任选地在发酵液112中旋转以减少气体边界层并促进气体转移到中空纤维中。
散装单细胞蛋白的经济生产需要培养基原料向生物量的最大转化为最小操作成本(OPX)，以及生物量增长率的最大化。应注意的是，生物量生长不仅涉及细胞/生物量密度(浓度)的增加，还涉及发酵容器内发酵液体积的增加，因为培养基添加并转化为生物量(例如，发酵容器内的发酵液体积随时间增加)。总生物量(例如，生物量密度乘以体积)根据S形曲线增加，其中首先在低细胞密度下缓慢增加，随后是快速扩增期，在中等细胞密度下具有峰生长速率，随后是在高细胞密度下生长较慢的阶段，因为细胞竞争氧和碳分子以及其他营养物。因此，在与最大生长相对应的细胞密度下发生最佳经济生产。这可以通过取发酵内生物量的导数作为时间的函数来确定，其中每个时间点的生物量是WCW乘以发酵容器内的发酵体积。使用本领域已知的方法测量WCW，非限制性示例包括使用分光光度计在550纳米处测量吸光度来测量光密度(OD)。
在至少一个实施方案中，为了将发酵容器104内的WCW维持在与最大生物量增加相对应的细胞密度下，可以调整分离装置158以与WCW和体积的乘积的峰时间导数相同的速率去除全细胞。最大的异源蛋白(或其他发酵)生产发生在不同的并且通常高得多的细胞密度下。然而，除分离装置158设置为在WCW和体积的乘积的导数(低于上述最大生物量率)对应于最大异源或发酵产物率下的细胞密度时去除全细胞外，可以应用与上述相同的过程。
用酵母提取物富集生长培养基可以加快生长速度。因此，该过程任选地包括经由分离装置158从发酵液112中取出全酵母细胞的一部分，裂解细胞以形成提取物，并将该提取物引入生长培养基156中。应理解的是，上述酵母提取物可以用于获得该酵母提取物的相同发酵运行中，或替代地立即用于不同的发酵运行中或贮存用在随后的不同发酵运行中。
图4是说明根据本公开的至少一个实施方案的生产生物分子或全细胞的方法400的流程图。在至少一个实施方案中，可以使用发酵系统100或发酵系统200完成方法400。
在模块410，将发酵液(例如，来自发酵容器104的发酵液112)接收到装置的入口端口(例如，外部环路102或152的入口端口108，或外部环路202的入口端口208)。
在模块420，发酵液流过冷却装置(例如，冷却装置114)。在至少一个实施方案中，发酵液的流动由泵(例如，泵110)驱动。
在至少一个实施方案中，冷却装置包括供发酵液流过的一个或多个管，以及与一个或多个管热连通的热交换器。在至少一个实施方案中，热交换器包括一个或多个热管，其中至少一个热管的近端与一个或多个热管热连通。在至少一个实施方案中，至少一个热管的远端与冷却剂热连通。在至少一个实施方案中，热交换器包括壳管式热交换器、逆流式热交换器、平行流式热交换器、板式热交换器、板翅式热交换器、相变式热交换器或微通道式热交换器中的一种或多种。
在至少一个实施方案中，热交换器使冷却剂流过与一个或多个管热连通的夹套。在至少一个实施方案中，冷却剂包括空气、冷冻水或制冷剂中的一种或多种。在至少一个实施方案中，冷却剂进一步与激冷器热连通，以维持冷却剂的温度低于发酵液的温度。
在至少一个实施方案中，激冷器包括吸附式激冷器。在至少一个实施方案中，冷却装置进一步包含位于冷却装置入口侧和/或出口侧的温度传感器。
在至少一个实施方案中，冷却装置维持发酵液的温度在20℃至40℃之间。
在模块430，发酵液流过曝气装置(例如，曝气装置116)。在至少一个实施方案中，发酵液在曝气装置之前流过冷却装置。在至少一个实施方案中，发酵液在冷却装置之前流过曝气装置。
在至少一个实施方案中，发酵液中的含氧气体，可能包括纯化氧、空气或氧与其他气体的混合物。在至少一个实施方案中，曝气装置包括射流曝气器、表面曝气器或细气泡扩散器中的一种或多种。在至少一个实施方案中，曝气装置包括纳米气泡发生器，该纳米气泡发生器配置为在发酵液中产生具有小于约200纳米的中位直径的氧气泡。
在至少一个实施方案中，通过培养基计量装置(例如，培养基计量装置154)将培养基引入发酵液中。在至少一个实施方案中，培养基包含甲醇、甲烷、葡萄糖、右旋糖、乙醇、糖、甘油或酵母提取物中的一种或多种。在至少一个实施方案中，培养基包含甲醇。
在至少一个实施方案中，曝气装置维持发酵液的溶解氧水平高于15％。
在至少一个实施方案中，将存在于发酵液中的全细胞的一部分分离成全细胞消减流和全细胞浓缩流。在至少一个实施方案中，将全细胞消减流提供回装置中，并且将全细胞浓缩液流从装置中去除。
在至少一个实施方案中，将存在于发酵液中的清洁发酵液的含生物分子部分分离成清洁发酵液消减流和清洁发酵液浓缩流。在至少一个实施方案中，将清洁发酵液消减流提供回装置中，并将清洁发酵液浓缩流从装置中去除。
在至少一个实施方案中，从发酵液中提取溶解CO2的一部分。
在模块440，发酵液通过装置的出口端口(例如，外部环路102或152的出口端口120，或外部环路202的出口端口220)离开，并重新引入发酵容器104中。
在上述描述中，阐述了许多具体细节，诸如具体材料、尺寸、过程参数等，以提供对本公开的实施方案的全面理解。特定特征、结构、材料或特性可以在一个或多个实施方案中以任何适当的方式组合。本文使用的“示例”或“示例性”一词是指作为示例、情况或例示。本文描述为“示例”或“示例性”的任何方面或设计不一定被解释为优于其他方面或设计的优选或优势。相反，使用“示例”或“示例性”一词意在以具体的方式提出概念。正如本申请中所使用的，术语“或”是指包容性“或”而不是排他性“或”。也就是说，除非另有说明，或从上下文中清楚，否则“X包括A或B”是指任何自然的包容性排列。也就是说，如果X包括A；X包括B；或X包括A和B，则在上述任何情况下满足“X包括A或B”。此外，术语“一个”、“一种”、“该”和类似的指代在描述本文所讨论的材料和方法的背景下(尤其是在以下声明的背景下)的使用应解释为涵盖单数和复数，除非本文另有说明或上下文明显矛盾。
除非本文另有说明，否则本文中值的范围的复述仅旨在作为单独提及范围内每个单独值的简短方法，并且将每个单独值纳入说明书中，如同在本文中单独复述一样。本文所述的所有方法均可以按照任何适当的顺序进行，除非本文另有说明或上下文明显矛盾。
在本说明书中，凡提及“一个实施方案”、“某些实施方案”、“一个或多个实施方案”、“实施方案”或“一些实施方案”，均意味着与实施方案相关的特定特征、结构、材料或特性包含在本公开的至少一个实施方案中。因此，本说明书中“在一个或多个实施方案中”、“在某些实施方案中”、“在一个实施方案中”或“在实施方案中”等短语在不同地方的出现不一定是指本公开的相同实施方案。此外，特定特征、结构、材料或特性可以在一个或多个实施方案中以任何适当的方式组合。
可以理解的是，上述描述旨在提供例示性信息，而非限制性信息。对于本领域技术人员来说，在阅读和理解上述描述后，许多其他实施方案将是显而易见的。因此，本公开的范围应参照所附权利要求以及此类权利要求有权享有的全部同等物范围来确定。使用本文提供的任何和所有示例或示例性语言(例如，“诸如”)仅旨在说明某些材料和方法，并且不对范围造成限制。说明书中的任何语言均不得解释为表明任何未要求保护的元素对公开材料和方法的实践至关重要。
尽管本文所公开的实施方案是参照特定实施方案来描述的，但应当理解的是，这些实施方案仅仅是对本公开的原则和应用的说明。对于本领域技术人员来说显而易见的是，可以对本公开的方法和装置进行各种修改和变化而不偏离本公开的精神和范围。因此，本公开旨在包括在所附权利要求及其等同物范围内的修改和变更，并且上述实施方案仅用于说明而非限制目的。

Claims (63)

1.发酵系统，其包含：
发酵容器；和
与所述发酵容器流体连通的外部环路，其中所述外部环路包含：
一个或多个入口端口；
一个或多个泵，其与所述一个或多个入口端口流体连通以从所述发酵容器泵入发酵液；
一个或多个出口端口，以将所述发酵液重新引入所述发酵容器；
冷却装置；和
曝气装置，其与所述冷却装置流体连通。
2.权利要求1所述的发酵系统，其中所述曝气装置位于所述冷却装置和所述泵的上游。
3.权利要求1所述的发酵系统，其中所述冷却装置位于所述曝气装置和所述泵的上游。
4.权利要求1所述的发酵系统，其中所述曝气装置配置为将含氧气体引入所述发酵液中，其中所述含氧气体包括纯化氧、空气，或氧与其他气体的混合物。
5.权利要求1所述的发酵系统，其中所述曝气装置包括射流曝气器、表面曝气器或细气泡扩散器中的一种或多种。
6.权利要求1所述的发酵系统，其中所述曝气装置包括纳米气泡发生器，所述纳米气泡发生器配置为产生具有小于约200纳米的中位直径的氧气泡。
7.权利要求1所述的发酵系统，其中所述冷却装置的入口与所述泵的出口流体连通，并且其中所述冷却装置包含：
一个或多个管，所述发酵液能流过所述一个或多个管；和
热交换器，其与所述一个或多个管热连通。
8.权利要求7所述的发酵系统，其中所述热交换器包含一个或多个热管，其中至少一个热管的近端与所述一个或多个管热连通，并且其中所述至少一个热管的远端与冷却剂热连通。
9.权利要求7所述的发酵系统，其中所述热交换器包括壳管式热交换器、逆流式热交换器、平行流式热交换器、板式热交换器、板翅式热交换器、相变式热交换器或微通道式热交换器中的一种或多种，其中所述热交换器配置为使冷却剂流过与所述一个或多个管热连通的夹套。
10.权利要求8所述的发酵系统，其中所述冷却剂包括空气、冷冻水或制冷剂中的一种或多种，其中所述冷却剂进一步与激冷器热连通，以维持所述冷却剂的温度低于所述发酵液的温度。
11.权利要求10所述的发酵系统，其中所述激冷器包括吸附式激冷器。
12.权利要求1所述的发酵系统，其中所述冷却装置进一步包含位于所述冷却装置的入口侧和/或出口侧的温度传感器。
13.权利要求1所述的发酵系统，其进一步包含：
培养基计量装置，其用于将培养基引入发酵液。
14.权利要求13所述的发酵系统，其中所述培养基包含甲醇、甲烷、葡萄糖、右旋糖、乙醇、糖、甘油或酵母提取物中的一种或多种。
15.权利要求13所述的发酵系统，其中所述培养基包含甲醇。
16.权利要求1所述的发酵系统，其进一步包含：
一个或多个甲醇传感器。
17.权利要求1所述的发酵系统，其进一步包含：
一个或多个溶解氧传感器。
18.权利要求1所述的发酵系统，其进一步包含：
分离装置，其用于连续分离存在于所述发酵液中的全细胞的一部分，其中所述分离装置的入口与所述发酵液和至少两个出口流流体连通，并且其中第一出口流提供返回所述装置的所述全细胞消减流的至少一部分并且第二出口流提供从所述装置中去除的全细胞浓缩流。
19.权利要求1所述的发酵系统，其进一步包含：
分离装置，其用于分离存在于所述发酵液中的清洁发酵液的一部分，所述清洁发酵液含有由所述发酵液中的细胞产生的生物分子，其中所述分离装置的入口与所述发酵液和至少两个出口流流体连通，并且其中第一出口流提供返回所述装置的清洁发酵液消减流并且第二出口流提供从所述装置中去除的清洁发酵液浓缩流。
20.权利要求18所述的发酵系统，其中所述分离装置包括沉淀器、微量过滤器、超滤器、纳米过滤器、错流过滤器、离心机或连续流离心机中的一种或多种。
21.权利要求1所述的发酵系统，其进一步包含：
CO2去除装置，其中所述CO2去除装置配置为从所述发酵液中提取溶解CO2的一部分。
22.权利要求21所述的发酵系统，其中所述CO2去除装置包括气体交换膜。
23.权利要求1所述的发酵系统，其中所述冷却装置配置为维持所述发酵液的温度在20℃和40℃之间。
24.权利要求1所述的发酵系统，其中所述曝气装置配置为维持所述发酵液的溶解氧水平高于15％。
25.权利要求1所述的发酵系统，其中所述一个或多个入口端口位于所述一个或多个出口端口的上方，并且其中所述一个或多个出口端口与所述发酵容器的底部部分流体连通。
26.权利要求1所述的发酵系统，其中所述一个或多个出口端口装有扩散器。
27.发酵系统，其包含：
发酵容器；和
至少一个外部环路，其与所述发酵容器流体连通，其中所述外部环路包含：
冷却装置；和
曝气装置，其与所述冷却装置流体连通，
其中所述冷却装置和所述曝气装置布置在不同的外部环路内。
28.需氧发酵的方法，其包括利用权利要求1-27中任一项的发酵系统来生产全细胞产物和/或生物分子。
29.权利要求28所述的方法，其中所述生物分子包括蛋白质、酶、类胡萝卜素、维生素、生物聚合物、脂质、纤维素、经由发酵过程产生的其它分子，或其组合。
30.权利要求28所述的方法，其中所述需氧发酵包括甲基营养生物的生长。
31.权利要求30所述的方法，其中所述甲基营养生物包括酵母。
32.权利要求31所述的方法，其中所述酵母包括巴斯德毕赤酵母。
33.权利要求31所述的方法，其中所述需氧发酵包括细菌的生长。
34.权利要求33所述的方法，其中所述细菌包括食甲基嗜甲基菌、扭脱甲基杆菌、喜甲烷甲基单胞菌或甲烷假单胞菌中的一种或多种。
35.权利要求28所述的方法，其中所述生物分子从所述发酵液中排出并分离或保留在所述全细胞内。
36.方法，其包括：
将发酵液从发酵容器接收到一个或多个外部环路的入口端口；
使所述发酵液流过冷却装置；
使所述发酵液流过曝气装置；和
使所述发酵液经由一个或多个出口端口离开所述装置并重新引入所述发酵容器中。
37.权利要求36所述的方法，其中所述发酵液在所述曝气装置之前流过所述冷却装置。
38.权利要求36所述的方法，其中所述发酵液在所述冷却装置之前流过所述曝气装置。
39.权利要求36所述的方法，其中所述曝气装置将含氧气体引入所述发酵液中，其中所述含氧气体包括纯化氧、空气，或氧与其他气体的混合物。
40.权利要求36所述的方法，其中所述曝气装置包括射流曝气器、表面曝气器或细气泡扩散器中的一种或多种。
41.权利要求36所述的方法，其中所述曝气装置包括纳米气泡发生器，所述纳米气泡发生器配置为在所述发酵液中产生具有小于约200纳米的中位直径的氧气泡。
42.权利要求36所述的方法，其中所述冷却装置包含：
一个或多个管，所述发酵液流过所述一个或多个管；和
热交换器，其与所述一个或多个管热连通。
43.权利要求42所述的方法，其中所述热交换器包含一个或多个热管，其中至少一个热管的近端与所述一个或多个管热连通，并且其中所述至少一个热管的远端与冷却剂热连通。
44.权利要求42所述的方法，其中所述热交换器包括壳管式热交换器、逆流式热交换器、平行流式热交换器、板式热交换器、板翅式热交换器、相变式热交换器或微通道式热交换器中的一种或多种，其中所述热交换器使冷却剂流过与所述一个或多个管热连通的夹套。
45.权利要求44所述的方法，其中所述冷却剂包括空气、冷冻水或制冷剂中的一种或多种，其中所述冷却剂进一步与激冷器热连通，以维持所述冷却剂的温度低于所述发酵液的温度。
46.权利要求45所述的方法，其中所述激冷器包括吸附式激冷器。
47.权利要求36所述的方法，其中所述冷却装置进一步包含位于所述冷却装置的入口侧和/或出口侧的温度传感器。
48.权利要求36所述的方法，其进一步包括：
经由培养基计量装置将培养基引入所述发酵液中。
49.权利要求48所述的方法，其中所述培养基包含甲醇、甲烷、葡萄糖、右旋糖、乙醇、糖、甘油或酵母提取物中的一种或多种。
50.权利要求48所述的方法，其中所述培养基包含甲醇。
51.权利要求36所述的方法，其进一步包括：
将存在于所述发酵液中的全细胞的一部分分离成全细胞消减流和全细胞浓缩流，其中将所述全细胞消减流提供返回所述装置中，并且其中将所述全细胞浓缩流从所述装置中去除。
52.权利要求36所述的方法，其进一步包括：
将存在于所述发酵液中的清洁发酵液的含生物分子部分分离成清洁发酵液消减流和清洁发酵液浓缩流，其中将所述清洁发酵液消减流提供返回所述装置中，并且其中将所述清洁发酵液浓缩流从所述装置中去除。
53.权利要求36所述的方法，其进一步包括：
从所述发酵液中提取溶解CO2的一部分。
54.权利要求36所述的方法，其中所述冷却装置维持所述发酵液的温度在20℃和40℃之间。
55.权利要求36所述的方法，其中所述曝气装置维持所述发酵液的溶解氧水平高于15％。
56.用于从甲基营养生物生产全细胞蛋白的方法，所述方法包括：
在连续的时间点测量湿细胞重量(WCW)；
确定生物量生长的最大速率，所述生物量生长测量为发酵容器内生物量质量的增加，所述增加是所述发酵容器内发酵液体积的任何增加的原因；和
以相当于所述生物量生长的最大速率的速率提取全细胞。
57.权利要求56所述的方法，其进一步包括：
通过取WCW和生物量体积的乘积的时间导数来确定所述生物量生长的最大速率。
58.权利要求57所述的方法，其进一步包括：
调节暴露于分离装置的发酵液的流速，使得维持对应于生物量生产的最大速率的细胞密度。
59.权利要求56所述的方法，其进一步包括：
裂解所述提取的全细胞的一部分，其中将所述裂解的全细胞的产物引入生长培养基中。
60.权利要求59所述的方法，其中将所述生长培养基引入所述发酵液中或用在不同的发酵过程中。
61.权利要求56所述的方法，其中所述甲基营养生物包括巴斯德毕赤酵母。
62.权利要求56所述的方法，其中所述甲基营养生物包括食甲基嗜甲基菌、扭脱甲基杆菌、喜甲烷甲基单胞菌或甲烷假单胞菌中的一种或多种。
63.权利要求1-27中任一项的所述发酵系统，其适应于执行权利要求36-56中任一项的方法。
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