ES2231267T3 - Procedimiento para la obtencion de bacterio-rodopsina. - Google Patents

Abstract

Procedimiento para la extracción de la bacterio- rodopsina a partir de las halobacterias, en donde las halobacterias en un medio de cultivo que contiene extracto de levadura, fracciones hidrolizadas de albúmina y/o fuentes de nitrógeno que contienen aminoácidos o péptidos, son sometidas a una fermentación y en donde en un primer paso de microfiltración las halobacterias y el medio de cultivo se separan entre sí, las halobacterias obtenidas se lisan y en un segundo paso de microfiltración se separan los componentes celulares de peso molecular pequeño, de la bacteriorodopsina.

Description

Procedimiento para la obtención de bacterio-rodopsina.

La presente invención se refiere a un procedimiento para la obtención de la bacteriorodopsina a partir de las halo-bacterias.

La bacteriorodopsina es un pigmento de la membrana de las halobacterias que contiene retinal. La bacteriorodopsina actúa como una bomba de protones dependiente de la luz dirigida al medio circundante desde el interior celular. La absorción de un fotón libera mediante un cambio transitorio de la configuración de la proteína para el transporte dirigido de un protón a la parte externa de la célula. Con ello cambia el color de la proteína de violeta a amarillo. Mediante la absorción de un protón del interior de la célula se pasa de nuevo el estado original en el intervalo de unos pocos milisegundos. La molécula de bacteriorodopsina que está organizada en una distribución cristalina bidimensional en forma de una llamada membrana púrpura en la membrana celular, representa en consecuencia pues, un transformador de energía lumínica. Esta propiedad y su notable estabilidad en estado aislado abren un gran número de aplicaciones técnicas. Así, la bacteriorodopsina puede encontrar utilización en forma de una membrana púrpura como alimentador óptico transitorio en el procesado de datos, en la obtención de biosensores o bio-chips y como elemento de conexión electroóptica. El gradiente de protones electroquímico que se origina en la iluminación, podría ser utilizado para una bomba macroscópica de iones, p. ej., también para la obtención de hidrógeno molecular.

Una condición indispensable esencial para los trabajos de investigación acerca de la utilización y el aprovecha-miento comercial de la bacteriorodopsina la constituye sin embargo la disponibilidad de más grandes cantidades de bacteriorodopsina con la mayor pureza posible y con un coste financiero lo más pequeño posible.

La síntesis de la bacteriorodopsina es inducida por muchos Archaea halófilos en determinadas condiciones de cultivo, como escasez de oxígeno y luz, cuando el crecimiento fotosintético se convierte en alternativa del crecimiento aeróbico. Se dispone de cepas que en la oscuridad y con limitación del oxígeno expresan constitutivamente la bacteriorodopsina. Las especies de Halobacterium salinarum más empleadas necesitan para su crecimiento, aminoácidos como fuente de C y N en el medio de cultivo, de manera que por regla general deben emplearse componentes del medio de cultivo como la peptona, de todas maneras con una influencia fuertemente negativa sobre los costes del medio de cultivo. Puesto que el H. salinarum, criado en el biorreactor por el procedimiento de lotes en constante aireamiento, solamente al final de la fase logarítmica, forma bacteriorodopsina, los organismos tenían hasta ahora en consecuencia muy poca productividad en conjunto. A partir de Sumper et al. (Angewandte Chemie ("Química general") 88 (1976), 203 a 210) y Oesterhelt (en DasSarma S., Fleischmann E. M., Hrsg.: Archaea-Halophiles, a laboratory manual ("Archaea-halófilos, un manual de laboratorio"), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York 1995) se conocen procedimientos para la obtención de bacteriororopsina mediante centrifugación para la separación celular, diálisis y centrifugación por gradientes de densidad o también conocidos por filtración sobre gel. Los procedimientos descritos tienen sin embargo una gran cantidad de pasos de procedimiento, los cuales deben efectuarse en instalaciones diferentes uno después de otro, de manera que el proceso de purificación cuesta tiempo y material así como un intenso trabajo.

Otra dificultad en el cultivo del Halobacterium salinarum es la inestabilidad genética de las cepas de laboratorio hasta aquí conocidas, es decir, la capacidad para la expresión de la bactriorodopsina puede irse perdiendo en el transcurso de la multiplicación de las células, y con ello hacer imposible el cultivo continuo juntamente con la formación de bacteriorodopsina.

La patente SU 626583 describe el cultivo de bacterias halófilas y su fermentación para la extracción de la bacteriorodopsina, introduciendo luz adicional durante el cultivo. Procedimientos para la extracción de la bacterio-rodopsina de las bacterias halófilas son ya conocidos a partir de la patente SU 762392. La patente SU 1363778 describe la adición de determinadas sales como estimulantes del crecimiento para el Halobacterium halobium. A partir de la patente EP 0 406 850
se conocen procedimientos de preparación de las membranas púrpura que contienen la bacteriorodopsina. Finalmente, la patente CN 1 033 463 describe la preparación y la inmovilización de la bacterio-rodopsina a partir del Halobacterium halobium sobre membranas sólidas.

Ninguna de las publicaciones de patentes citadas da a conocer un procedimiento con un coste adecuado y de fácil realización, que con poco gasto de aparatos permita preparar la bacteriorodopsina con la mayor pureza y eficiencia posibles.

La invención toma como base el problema técnico de preparar un procedimiento que haga posible de manera sencilla y con un gasto adecuado, la extracción de la bacterio-rodopsina con un elevado rendimiento y pureza.

La presente invención soluciona el problema técnico fundamental, mediante la puesta a punto de un procedimiento para la extracción de la bacteriorodopsina de las halo-bacterias, en el cual las halobacterias se someten a una fermentación en un medio de cultivo con adición de extracto de levadura, fracciones hidrolizadas de albúmina de huevo y/o fuentes de nitrógeno que contienen aminoácidos o péptidos, un subsiguiente primer paso de microfiltración en el que las halobacterias y el medio de cultivo se separan entre sí, lisado de las halobacterias obtenidas y en un segundo paso de microfiltración la separación de componentes celulares de pequeño peso molecular de la fracción que contiene la bacteriorodopsina. Los dos pasos de microfiltración pueden efectuarse de preferencia en uno solo y con el mismo módulo de microfiltración o en dos diferentes módulos de micro-filtración, eventualmente con diferentes anchos de poro.

El procedimiento según la invención, constituye una posibilidad particularmente favorable en cuanto a los costes para la extracción de la bacteriorodopsina, en la cual es posible de forma y manera sencilla, con poco gasto de aparatos, y la posibilidad de una ampliación a escala sin problemas, la extracción de la bacteriorodopsina a partir de las halobacterias con gran pureza y eficacia. El procedimiento según la invención es muy apropiado para un funcionamiento continuo en el cual la invención hace también posible un procedimiento por lotes, discontinuamente o semicontinuamente, o respectivamente, un procedimiento por lotes repetidos. Sorprendentemente pudo comprobarse que el empleo de extracto de levadura y/o fracciones de albúmina de huevo hidrolizada, como fuente de nitrógeno o respectivamente aminoácidos, hacía posible por lo menos frente a la peptona habitualmente utilizada, invariable, que en la mayoría de los casos se obtuviera una mejor productividad de la bacterio-rodopsina, de forma que los costes de la materia prima extracto de levadura importaban solamente una décima parte de los costes de la peptona. Según la invención, el medio de cultivo empleado en el procedimiento según la presente invención no contiene ninguna peptona.

En conexión con la presente invención se comprende dentro de las halobacterias, las archaebacterias que se encuentran en líquidos fuertemente salados, por ejemplo en mares salados. Las halobacterias se caracterizan por su necesidad de altas concentraciones de sal común tanto en el medio circundante como también altas concentraciones en el interior de las células así como la falta de un sáculo de mureína. Representantes típicos de las Halobacterias son los Halobacterium salinarum y el Halobacterium cutirubrum.

En una forma de ejecución particularmente preferida comprende la invención el empleo del Halobacterium salinarum. La invención abarca también los mutantes, cepas recombinantes u otros, p. ej., trasgénicos, organismos anfitriones, los cuales son apropiados para la formación de bacteriorodopsina.

En conexión con la presente invención, se abarca con el nombre de bacteriorodopsina, una cromoproteína la cual contiene retinal sensible a la luz como cromóforo. En una forma de ejecución preferida de la presente invención, la bacteriorodopsina procede de las halobacterias, en particular de sus membranas púrpura. Naturalmente la invención abarca también en el concepto de bacteriorodopsina, las variaciones, modificaciones, derivados o trozos rotos o respectivamente fragmentos de la bacteriorodopsina así como otras rodopsinas como las últimamente llamadas cromoproteínas con retinal sensible a la luz como cromóforo. La invención abarca tanto la bacteriorodopsina obtenida por el procedimiento natural como la obtenida por el procedimiento de técnica genética en células anfitrionas adecuadas. La invención abarca por lo tanto también las mutaciones con aminoácidos, deleciones, inserciones, inversiones o modificaciones producidas por derivatizaciones de la bacteriorodopsina conocida, así como fusiones de fragmentos o de moléculas completas de bacterio-rodopsina con otros componentes de proteínas como péptidos señal u otros péptidos o proteínas. La invención comprende también derivatizaciones de la bacteriorodopsina con hidratos de carbono, grasas u otras moléculas.

En conexión con la presente invención, se entiende por fermentación un cultivo, es decir, el conjunto de todas las reacciones en un cultivo de microorganismos, que comprendan el consumo de un substrato, la formación de productos y/o la formación de biomasa.

En conexión con la presente invención, se entienden bajo el nombre de extractos de levadura las materias solubles contenidas en las células de levadura, en particular, el extracto técnico de levadura o el extracto de levaduras para alimentos, extractos puros de levadura para cultivos, extractos de levadura de suero de leche o extractos de levaduras de cerveza.

En conexión con la presente invención se comprenden entre las fracciones hidrolizadas de albúmina de huevo, los hidrolizados de albúmina de huevo, es decir, productos de hidrólisis de proteínas. Según la invención, se trata en particular de productos de una hidrólisis alcalina, ácida o enzimática. Según la invención, entre las fracciones de albúmina de huevo hidrolizadas se comprenden también aquellas fracciones de albúmina de huevo, que han sido obtenidas mediante hidrólisis parcial. En particular, la invención prevé el empleo de albúmina de leche como una fracción hidrolizada de albúmina.

Tanto el extracto de levadura como también la fracción de albúmina hidrolizada se emplean según la invención como fuentes de nitrógeno, aminoácidos y/o carbono, en el medio de cultivo. Sorprendentemente pueden alcanzarse con ello por lo menos las mismas proporciones de crecimiento de las halo-bacterias, pero también ventajosas mayores tasas de crecimiento. Por lo tanto, las halobacterias pueden fermentarse también con adición de otras fuentes, de preferencia con costes más favorables, que contengan aminoácidos o péptidos, p. ej., el agua de harina de maíz o el agua de semilla de algodón.

Los otros componentes del medio de cultivo así como sus concentraciones corresponden a los componentes habitualmente empleados en un medio de cultivo de halobacterias. Un medio de cultivo de esta clase puede contener por ejemplo cloruro de sodio, sulfato de magnesio, citrato trisódico, cloruro de potasio y peptona o extracto de levadura, así como agua, en particular con un valor del pH de 7,0 a 8,5, de preferencia 7,2 a 7,5.

La fermentación tiene lugar de preferencia en un margen de temperaturas de 35 - 50ºC, en particular a 37ºC.

Según la invención, en un primer paso de microfiltración tiene lugar una separación del medio de cultivo acuoso de las halobacterias, conduciendo el líquido de cultivo que contiene las bacterias a través de un módulo de filtro de membrana, en el cual las halobacterias están incluidas en el producto retenido. Los microorganismos separados y concentrados se lisan a continuación de manera ventajosa, por ejemplo mediante adición de agua, la cual mediante penetración osmótica destruye la célula, o mediante tratamiento enzimático, y/o tratamiento con ultrasonidos. La invención prevé en una versión preferida que después de efectuar un paso de lavado opcional con agua o con tampón, se hidrolice el ADN liberado por la lisis celular mediante adición de ADNasa (desoxirribonucleasa). A continuación puede preverse otro paso de lavado mediante p. ej., agua o tampón.

La invención prevé además que en un segundo paso de microfiltración la suspensión de reacción obtenida después de la lisis, se someta a otro paso de filtración por membrana, de manera que los componentes celulares moleculares de bajo peso molecular se separan con adición de agua varias veces, o respectivamente se separan por lavado de los fragmentos de membrana púrpura que contienen la bacteriorodopsina.

En el producto retenido queda esencialmente la fracción de membrana que contiene la bacteriorodopsina, la cual en particular después de la absorción en un tampón adecuado, en una forma de ejecución preferida de la invención, en un tercer paso de microfiltración, de preferencia en un módulo de microfiltración con otro ancho de poro en particular más grande, puede separarse ventajosamente en una parte que contiene fragmentos de membrana púrpura grandes y fragmentos de membrana púrpura pequeños.

La invención prevé también que la microfiltración se efectúe de preferencia en sucesivos diferentes pasos. Según la invención es particularmente preferido a este respecto utilizar módulos de filtros de membrana o respectivamente filtros de diferentes anchos de poro, entre los cuales se prefieren los anchos de poro de 2,0 a 0,05 \mum. En una versión particularmente preferida se prefieren para el primer y el segundo paso de microfiltración, anchos de poro de 0,2 \mum y para el tercer paso de microfiltración, anchos de poro de 0,8 \mum.

En otra versión preferida de la invención los módulos de filtros de membrana, que están en conexión con la presente invención, también llamados módulos de microfiltración, se construyen como módulos filtrantes en forma tubular, o sea módulos de tubos, módulos de membrana plana o módulos enrollados. Los filtros de membrana pueden ser filtros de membrana orgánicos o inorgánicos, los cuales se emplean de preferencia con la técnica de flujo transversal (filtración de flujo tangencial), en particular estáticamente o en rotación/oscilación.

En conexión con la presente invención, se entiende por técnica de flujo transversal, aquella en la que la filtración se efectúa de forma que la solución o suspensión a filtrar es conducida tangencialmente sobre la membrana, es decir perpendicularmente a la dirección de paso del líquido a través de la membrana.

En conexión con la presente invención, se designa con el nombre de membrana del filtro, por ejemplo una membrana tubular o membrana plana, obtenida por ejemplo de cerámica, polímero, etc. En conexión con la presente invención, se entiende como módulo la colocación de la membrana en una carcasa con entrada y salida, juntas estancas, bridas, etc, en donde la carcasa p. ej., puede estar construida de acero inoxidable o plástico.

Según la invención se pueden emplear con particular preferencia, membranas cerámicas de microfiltración con 2,0 a 0,05 \mum de tamaño de poro.

Según la invención, se prefiere un flujo de filtrado de aproximadamente 30 litros/m^{2} hora, en donde naturalmente pueden emplearse también velocidades mayores. Después de la lisis de las células, prevista según la invención, el flujo de filtrado aumenta con la eliminación por lavado de los componentes celulares en una versión de la invención hasta 100 litros/m^{2} hora. Según la invención es posible mediante esta forma de proceder, mantener la membrana púrpura en el concentrado y purificarla de los componentes del medio y de los componentes celulares de bajo peso molecular.

La invención se refiere en otra versión preferida a un procedimiento citado anteriormente, en donde después de la adición de extracto de levaduras en el medio de cultivo a emplear, las precipitaciones de fosfatos de calcio o magnesio que aparecen eventualmente, o bien se eliminan antes de la fermentación mediante sedimentación, centrifugación o filtración, o bien después de la fermentación al efectuar la separación de la bacteriorodopsina, se disuelven mediante una disminución del valor del pH y se distribuyen por el producto permeado.

La invención se refiere en una versión particularmente preferida, a un procedimiento citado anteriormente, en donde durante la fermentación tiene lugar una cierta aireación y en donde la fermentación tiene lugar a una presión parcial de oxígeno <= 20%, de preferencia inferior al 10%, o sea en condiciones aeróbicas limitadas por arriba.

En una versión preferida, la presión parcial de oxígeno se ajusta mediante una regulación de la velocidad de aireación o del numero de revoluciones del agitador y se mantiene tan pronto el cultivo ha alcanzado un máximo de densidad celular. Según la invención es previsible que no tenga lugar ninguna especial iluminación de los micro-organismos, por ejemplo mediante una luz blanca, en el reactor de fabricación.

La invención prevé un procedimiento por lotes, discontinuamente, semicontinuamente es decir por lotes repetidos, o de forma continua. Es particularmente preferido el procedimiento continuo, mediante el cual se alcanza un rendimiento considerablemente elevado en bacteriorodopsina, por ejemplo un aumento de 1,9 BR/l hora (BR \approx OD ml/l = OD_{560 \ mm} x volumen de las cubetas (en ml/volumen de la muestra (1); OD ml x 0,42 = mg de BR, o sea, de bacteriorodopsina), en un funcionamiento por lotes, y a aproximadamente 3,2 BR/l hora, en un procedimiento de funcionamiento continuo. A esto hay que añadir todavía una elevación de la eficacia del funcionamiento continuo mediante la supresión del período de preparación necesario en el funcionamiento por lotes.

El procedimiento según la invención, en particular la fermentación, puede tener lugar en tipos de biorreactores de diferente clase de construcción. Según la invención se prefiere emplear reactores en lazo, de pobre cizallamiento con una pequeña energía de registro.

Puesto que todas las cepas de laboratorio conocidas hasta la fecha de Halobacterium salinarum tienen tendencia a una inestabilidad genética que dificulta un cultivo continuo o respectivamente lo hace imposible, la presente invención proporciona en una versión preferida uno de los procedimientos antes citados, en el cual como material de partida para el cultivo según la invención de las halobacterias, de preferencia en condiciones aeróbicas limitadas, se emplea un precultivo anaeróbico de halobacterias. La invención se refiere también a un procedimiento para la extracción de la bacteriorodopsina de las halobacterias, en donde en un primer paso en condiciones anaeróbicas o microaerófilas se obtiene un cultivo fototrófico de halobacterias, el cual sirve de punto de partida para la fermentación que tiene lugar a continuación en condiciones aeróbicas limitadas. A este respecto, el crecimiento fototrófico en condiciones microaerófilas o anaeróbicas se aprovecha para la obtención de inóculos en una escala de 5 litros. El crecimiento fototrófico del Halobacterium salinarum tiene lugar únicamente cuando las células producen una cantidad suficiente de bacteriorodopsina. Las células que por una inestabilidad genética tienen inactivado el gen bop que codifica la bacteriorodopsina, no pueden crecer.

Las investigaciones de la estabilidad efectuadas en células individuales muestran que una multiplicación de un cultivo de 1 a 10^{16} células en condiciones aeróbicas, conduce a la pérdida de la síntesis de la bacteriorodopsina, mientras que en condiciones anaeróbicas el ensayo fue interrumpido a 1:10^{40}, sin que todavía ninguna célula hubiera sido detectada sin producción de bacteriorodopsina. Si se emplea ahora como material de partida para un cultivo aeróbico continuo, un precultivo anaeróbico (1 litro), su estabilidad aumenta alrededor del factor 10^{24}. Esto es suficiente para generar también en los medios de extracto de levadura prácticamente cualquier cantidad de células que se desee.

La invención prevé en una versión particularmente preferida, que el medio de cultivo o bien los componentes del mismo después de la separación de las halobacterias, o sea el producto permeado del primer paso de microfiltración, pueda emplearse de nuevo, es decir reciclarse, después de efectuar un acondicionamiento del medio de cultivo, en el procedimiento según la invención como medio de cultivo para la fermentación. El procedimiento según la invención se puede efectuar pues con respecto al medio de cultivo empleado o de los componentes del mismo, en forma cíclica, o sea presenta en un ciclo, una regeneración o una recirculación del medio de cultivo mediante lo cual se consigue un considerable ahorro de costes así como una simplificación del procedimiento mediante una reutilización de las sales. En el paso de acondicionamiento del medio efectuado según la invención, particularmente preferido, se eliminan los componentes que son desfavorables y desventajosos para otra utilización del medio de cultivo. Así, por ejemplo si el medio de cultivo consumido contenía una elevada concentración de iones amonio, ésta podía disminuirse por ejemplo mediante una separación con vapor de agua o preevaporación con contactores de membrana. Otras substancias indeseables pueden separarse p. ej., mediante centrifugación, filtración, precipitación, sedimentación, etc. El medio consumido que hay que reponer en el acondiciona- miento del medio puede reponerse directamente de nuevo en el paso de fermentación después del acondicionamiento. En una ejecución particularmente preferida de la invención se pueden añadir, aunque también puede preverse, al medio de cultivo regenerado y después de la separación de substancias indeseables por ejemplo por sedimentación, filtración o centrifugación, determinados productos auxiliares y/o extracto de levadura y/o fracciones de albúmina hidrolizada.

Otras versiones ventajosas de la invención pueden extraerse de las reivindicaciones secundarias.

La invención se aclarará con más detalle a la vista de las figuras y los ejemplos de las versiones correspondientes.

La única figura muestra esquemáticamente el curso del procedimiento según la invención.

La figura muestra un biorreactor 10, depósitos de tampón 20, 30, 40, 50 y los módulos de microfiltración 3 y 5, así como un depósito intermedio para el medio de cultivo 60.

El biorreactor 10 es un reactor de caldera de agitación de 5 litros de MBR con un volumen lleno de 4 litros, sondas de pH y de oxígeno, regulación del pH y regulación manual de la pO_{2} mediante el caudal de aire. En el caso del funcionamiento continuo tiene lugar una regulación del grado de llenado mediante el peso del reactor y la bomba de vaciado con una afluencia de medio constante mediante una bomba de dosificación (no representada).

Como inóculo se emplea la cepa "S9" de Halobacterium salinarum, 200 ml (densidad óptica OD_{578 \ nm} aproximadamente 1,2).

El medio estaba compuesto como sigue: 250 g de cloruro de sodio, 20 g de sulfato de magnesio, 3 g de citrato trisódico, 2 g de cloruro de potasio, 10 g de peptona L34 (Oxoid) o extracto de levadura Ohly KAT y agua hasta 1 litro de volumen total. La regulación del pH a un valor de 7,5 se logró mediante HCl 1M ó respectivamente NaOH 1M. A esto siguió el desgasificado con aire (40 litros/hora, 0,17 vvm). El número de revoluciones del agitador a paletas fué de 350 upm. Con ello se consiguió la fermentación de un lote mediante aproximadamente 90 horas hasta una OD_{587 \ nm} de 1,5, en donde la presión parcial del oxígeno fué < 15%. A continuación se conmutó a un funcionamiento continuo con una velocidad de flujo D = 0,02 litros/hora permaneciendo la presión parcial de oxígeno por debajo del 20%. Esto dió en 300 horas de tiempo total, 20 litros de caldo de fermentación.

Después de la fermentación las halobacterias se pasan a un tanque de tampón 20, en donde el vaciado del biorreactor 10 se efectúa también en funcionamiento continuo. En un primer paso de filtración por un módulo de microfiltración 3, construido en forma de módulo de tubos, las halobacterias son separadas del medio de cultivo, es decir se separa el medio, y las bacterias se concentran por un factor 20. Se emplea un módulo de tubos de cerámica Cerasiv con canales de 19 x 4 mm, con una superficie activa de 0,2 m^{2} (superficie de membrana) y 0,2 \mum de ancho de poro. Se ajusta una velocidad de sobrecorriente de 2 m/segundo, una duración de la filtración de 4 horas con un rendimiento de separación de aproximadamente 30 litros/m^{2} hora. En el tanque de tampón 20 se efectúa con un volumen 5 veces mayor de agua la lisis de las células y se añade ADNasa (Fluka, nº 31135, 0,5 mg/litro). En el mismo tanque de tampón 20 se eliminan en otro paso de microfiltración por el mismo módulo de microfiltración 3, los componentes celulares de bajo peso molecular mediante eliminación por lavado del producto permeado (conductividad eléctrica < 100 mS/cm^{2}). A continuación, se lava dos veces con agua, o respectivamente se filtra. En el producto retenido permanecen los fragmentos de membrana púrpura, mientras los pequeños componentes de las células y del medio se separan. El rendimiento de la separación aumenta en el transcurso del paso de filtración a aproximadamente 100 litros/m^{2} hora. En consecuencia disminuye todavía más el tiempo necesario para los pasos individuales. El depósito de tampón 30 sirve para el almacenamiento intermedio del producto retenido que contiene la bacteriorodopsina. Mediante el empleo de anchos de poro adecuados pueden separarse más los fragmentos de membrana de bacteriorodopsina, p. ej., mediante el módulo de microfiltración 5 (módulo de tubos cerámicos, p. ej., Cerasiv ó ATECH) con un ancho de poro de p. ej., 0,8 \mum en una parte A de alto peso molecular de bacteriorodopsina relativamente pura y en una parte B de bajo peso molecular de bacteriorodopsina. La velocidad de la sobrecorriente fue de 2 metros/segundo.

Para el funcionamiento continuo del biorreactor son necesarios dos tanques 20, uno para recoger y otro para filtrar o respectivamente para acabados.

El medio de cultivo conteniendo sal separado en el primer paso de microfiltración en el módulo de microfiltración 3, es decir el producto permeado, puede ser utilizado de nuevo mediante un paso de acondicionamiento. Para ello se añaden al mismo en un depósito 40, substancias auxiliares, extracto de levadura y/o fracciones de albúmina hidrolizadas, al medio consumido y eventualmente se eliminan las substancias nocivas como p. ej., los iones amonio. Las precipitaciones que pueden aparecer durante el acondicionamiento del medio se separan por ejemplo, mediante un dispositivo de separación 9 por sedimentación, filtración o centrifugación, del medio de cultivo regenerado. Las precipitaciones separadas se reúnen en un depósito 50, mientras que el medio de cultivo regenerado R eventualmente con medio de cultivo nuevo N se almacena en un depósito intermedio 60 para, según sea necesario, ser introducido en el biorreactor 10.

Claims (16)

1. Procedimiento para la extracción de la bacterio-rodopsina a partir de las halobacterias, en donde las halobacterias en un medio de cultivo que contiene extracto de levadura, fracciones hidrolizadas de albúmina y/o fuentes de nitrógeno que contienen aminoácidos o péptidos, son sometidas a una fermentación y en donde en un primer paso de microfiltración las halobacterias y el medio de cultivo se separan entre sí, las halobacterias obtenidas se lisan y en un segundo paso de microfiltración se separan los componentes celulares de peso molecular pequeño, de la bacteriorodopsina.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en donde las halobacterias se lisan mediante adición de agua.

3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, en donde en la lisis de las halobacterias, se hidroliza ADN libre mediante adición de ADNasa.

4. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la bacteriorodopsina obtenida según la reivindicación 1, se separa en un tercer paso de micro-filtración, en fragmentos de membrana púrpura grandes, y en segmentos de membrana púrpura pequeños.

5. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 4, en donde después de la adición del extracto de levadura y antes de la fermentación, se efectúa una sedimentación, centrifugación o filtración.

6. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 5, en donde después de la adición del extracto de levadura y después de la fermentación, durante la separación de la bacteriorodopsina, tiene lugar una disminución del valor del pH.

7. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 6, en donde la fermentación tiene lugar a una presión parcial de O_{2} <= 20%.

8. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 7, en donde en conexión con el primer paso de microfiltración para la separación de la bacteriorodopsina del medio de cultivo, el medio de cultivo separado es conducido a un paso de acondicionamiento.

9. Procedimiento según la reivindicación 8, en donde el medio de cultivo regenerado obtenido después del paso de acondicionamiento, es añadido a las halobacterias antes o durante la fermentación.

10. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 9, en donde en los pasos de microfiltración se emplean módulos de filtros de membrana con membranas de diferentes anchos de poro.

11. Procedimiento según la reivindicación 10, en donde el módulo de filtros de membrana son módulos de filtros de forma tubular, módulos angulares o módulos de membrana plana.

12. Procedimiento según la reivindicación 11, en donde los módulos de filtros de forma tubular son módulos de fibras hueca o módulos de tubos.

13. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 12, en el cual se utilizan las halobacterias de la clase Halobacterium salinarum y las variantes derivadas de la misma, en particular cepas mutantes y recombinantes.

14. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 13, en donde el procedimiento se efectúa continuamente, semicontinuamente o en lotes.

15. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, en donde por lo menos se efectúa un paso de microfiltración mediante la técnica del flujo a través.

16. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, en donde se emplea un cultivo fotótropo de halobacterias como cultivo de partida para la fermentación.