CN108374005A - 一种高活性碳酸酐酶及构建方法和应用 - Google Patents

一种高活性碳酸酐酶及构建方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种高活性碳酸酐酶及构建方法和应用，用于提升热稳型碳酸酐酶的CO2催化转化活性。本发明将Bacillus Clausii的碳酸酐酶的29位天冬氨酸、233位甘氨酸或83位天冬氨酸进行突变，突变位点为一个或一个以上。操作步骤为：首先对碳酸酐酶结构的性质进行分析，在此基础上对残基进行突变，构建含有目的基因的载体，然后对蛋白进行表达，分离纯化和复性，最后对酶活进行测定。本发明可有效提高在高温条件下CO2捕集转化效率。

Description

一种高活性碳酸酐酶及构建方法和应用
技术领域
本发明属于生物化学领域，主要涉及一种高活性碳酸酐酶及构建方法和应用。
背景技术
碳酸酐酶(CA)是含Zn2+的金属酶，它是一类可将CO2催化转化为HCO3-的水合酶催化剂。通常在没有催化剂条件下CO2的水合可逆反应的反应速率非常缓慢，碳酸酐酶可将反应速率从15秒提升到每秒106个反应。正是由于CA具备高效专一、环境友好等特点，近年来利用碳酸酐酶的CO2捕集技术受到越来越多的重视。根据氨基酸序列的不同，碳酸酐酶至少有α，β，γ，δ，ε和ζ等六种不同类型,不同种属CA酶的催化活性存在极大差异。
碳酸酐酶的引入可以大幅降低化学吸附解析过程的能源消耗，但过程中的高温工作环境、体系内重金属离子的存在都对CA的稳定性和活性产生极大影响，严重制约其应用。为此人们从嗜热古细菌种中筛选出三种热稳定型CA，分别为来自Methanosarcinathermophila的CAM，来自Methanobacterium thermoautotrophicum的CAB和来自Pyrococcus horikoshii的CAP。与人源CAII的失活温度50℃相比，CAM和CAB的失活温度有显著提高，分别为75℃和90℃。Novozymes从Bacillus Clausii获得了热稳定性高的碳酸酐酶，在80℃停留15分钟后残留酶活为17％。这些热稳定CA与天然人源CAII相比，尽管热稳定性能有所提升，但却牺牲了催化反应能力，催化反应常数降低了一至几个数量级。
为此，本专利提出以氨基酸作基本单元对高温酶进行突变，构建高活性的高温碳酸酐酶。
发明内容
为了提高CO2的水合可逆反应的反应速率，本发明公开一种高活性碳酸酐酶及构建方法和应用。
本发明公开一种高活性碳酸酐酶，一种高活性碳酸酐酶，其特征在于，将BacillusClausii的碳酸酐酶的29位天冬氨酸、233位甘氨酸和83位天冬氨酸中的一个或一个以上进行突变。
作为改进的技术方案，所述29位天冬氨酸由谷氨酸、丝氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸或苏氨酸中的一种取代。
作为改进的技术方案，所述233位甘氨酸由组氨酸、丝氨酸、色氨酸、赖氨酸或精氨酸中的一种取代。
作为改进的技术方案，所述83位天冬氨酸由谷氨酸、丝氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸或苏氨酸中的一种取代。
作为改进的技术方案，所述的碳酸酐酶应用于CO2的水合可逆反应。
本发明还提供上述高活性碳酸酐酶的构建方法，步骤如下：
步骤1：将Bacillus Clausii的碳酸酐酶进行突变；
步骤2：获得目的基因；
步骤3：获得含有目的基因的大肠杆菌BL21；
步骤4：扩大培养所述转化的大肠杆菌BL21，加入IPTG诱导表达，收集所述大肠杆菌BL21并裂解，获取裂解液和沉淀，利用SDS-PAGE和Western blot的方法对融合蛋白进行鉴定；
步骤5：使用镍柱分离表达所述融合蛋白，凝胶过滤纯化，用盐酸胍对所述融合蛋白进行复性；
步骤6：检测碳酸酐酶的酶活。
作为改进的技术方案，在所述步骤1中，对所述Bacillus Clausii的碳酸酐酶的29位天冬氨酸、233位的甘氨酸和83位天冬氨酸中的一个或一个以上进行突变。
作为改进的技术方案，在所述步骤2中，根据目的基因设计引物后，从所述Bacillus Clausii细胞中提取RNA，反转录得到cDNA，再利用所述引物进行PCR和琼脂糖凝胶电泳，扩增分离得到目的基因。
作为改进的技术方案，在所述步骤3中，将所述目的基因连接至克隆载体上，转化大肠杆菌DH5α，提取质粒并转化至大肠杆菌BL21中，并鉴定含有目的基因的大肠杆菌BL21。
作为改进的技术方案，在所述步骤5中，所述盐酸胍的浓度为0.3mol/L～0.6mol/L。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明做进一步说明。
实施例1
1)将Bacillus Clausii的碳酸酐酶的29位天冬氨酸和233位的甘氨酸进行突变，由谷氨酸和丝氨酸取代。
2)根据目的基因设计引物后从Bacillus Clausii细胞提取RNA，反转录得到cDNA；再利用设计的引物进行PCR和琼脂糖凝胶电泳，扩增分离得到目的基因。
3)再将基因连接至克隆载体上，转化大肠杆菌DH5α。转化子鉴定后，提取质粒；之后将其转化至大肠杆菌BL21中，并对转化子进行鉴定。
4)最后将BL21菌扩大培养，加入适当浓度的IPTG进行诱导表达；收集菌体并裂解，获取裂解液和沉淀，利用SDS-PAGE和Westernblot的方法对融合蛋白进行鉴定。
5)使用镍柱对表达的蛋白进行分离，之后进行凝胶过滤纯化。然后采用0.3mol/L盐酸胍对蛋白质进行复性。
6)在70℃进行测试碳酸酐酶应用于CO2的水合可逆反应的酶活，经计算得出，0.05mg/mL的突变体的碳酸酐酶蛋白的酶活为0.15U/mg。
实施例2
1)将Bacillus Clausii的碳酸酐酶的29位和83位的天冬氨酸和233位的甘氨酸进行突变，由丝氨酸、苏氨酸和色氨酸取代。
2)根据目的基因设计引物后从Bacillus Clausii细胞提取RNA，反转录得到cDNA；再利用设计的引物进行PCR和琼脂糖凝胶电泳，扩增分离得到目的基因。
3)再将基因连接至克隆载体上，转化大肠杆菌DH5α。转化子鉴定后，提取质粒；之后将其转化至大肠杆菌BL21中，并对转化子进行鉴定。
4)最后将BL21菌扩大培养，加入适当浓度的IPTG进行诱导表达；收集菌体并裂解，获取裂解液和沉淀，利用SDS-PAGE和Western blot的方法对融合蛋白进行鉴定。
5)使用镍柱对表达的蛋白进行分离，之后进行凝胶过滤纯化。然后采用0.5mol/L盐酸胍对蛋白质进行复性。
6)在80℃进行测试碳酸酐酶应用于CO2的水合可逆反应的酶活，经计算得出，0.05mg/mL的突变体的碳酸酐酶蛋白的酶活为0.16U/mg。
实施例3
1)将Bacillus Clausii的碳酸酐酶的83位天冬氨酸和233位的甘氨酸进行突变，由蛋氨酸和组氨酸取代。
2)根据目的基因设计引物后从Bacillus Clausii细胞提取RNA，反转录得到cDNA；再利用设计的引物进行PCR和琼脂糖凝胶电泳，扩增分离得到目的基因。
3)再将基因连接至克隆载体上，转化大肠杆菌DH5α。转化子鉴定后，提取质粒；之后将其转化至大肠杆菌BL21中，并对转化子进行鉴定。
4)最后将BL21菌扩大培养，加入适当浓度的IPTG进行诱导表达；收集菌体并裂解，获取裂解液和沉淀，利用SDS-PAGE和Western blot的方法对融合蛋白进行鉴定。
5)使用镍柱对表达的蛋白进行分离，之后进行凝胶过滤纯化。然后采用0.6mol/L盐酸胍对蛋白质进行复性。
6)在70℃进行测试碳酸酐酶应用于CO2的水合可逆反应的酶活，经计算得出，0.05mg/mL的突变体的碳酸酐酶蛋白的酶活为0.19U/mg。
实施例4
1)将Bacillus Clausii的碳酸酐酶的29位天冬氨酸进行突变，由苏氨酸取代。
2)根据目的基因设计引物后从Bacillus Clausii细胞提取RNA，反转录得到cDNA；再利用设计的引物进行PCR和琼脂糖凝胶电泳，扩增分离得到目的基因。
3)再将基因连接至克隆载体上，转化大肠杆菌DH5α。转化子鉴定后，提取质粒；之后将其转化至大肠杆菌BL21中，并对转化子进行鉴定。
4)最后将BL21菌扩大培养，加入适当浓度的IPTG进行诱导表达；收集菌体并裂解，获取裂解液和沉淀，利用SDS-PAGE和Western blot的方法对融合蛋白进行鉴定。
5)使用镍柱对表达的蛋白进行分离，之后进行凝胶过滤纯化。然后采用0.5mol/L盐酸胍对蛋白质进行复性。
6)在80℃进行测试碳酸酐酶应用于CO2的水合可逆反应的酶活，经计算得出，0.05mg/mL的突变体的碳酸酐酶蛋白的酶活为0.18U/mg。
实施例5
1)将Bacillus Clausii的碳酸酐酶的29位天冬氨酸进行突变，由半胱氨酸取代。
2)根据目的基因设计引物后从Bacillus Clausii细胞提取RNA，反转录得到cDNA；再利用设计的引物进行PCR和琼脂糖凝胶电泳，扩增分离得到目的基因。
3)再将基因连接至克隆载体上，转化大肠杆菌DH5α。转化子鉴定后，提取质粒；之后将其转化至大肠杆菌BL21中，并对转化子进行鉴定。
4)最后将BL21菌扩大培养，加入适当浓度的IPTG进行诱导表达；收集菌体并裂解，获取裂解液和沉淀，利用SDS-PAGE和Westernblot的方法对融合蛋白进行鉴定。
5)使用镍柱对表达的蛋白进行分离，之后进行凝胶过滤纯化。然后采用0.3mol/L盐酸胍对蛋白质进行复性。
6)在70℃进行测试碳酸酐酶应用于CO2的水合可逆反应的酶活，经计算得出，0.06mg/mL的突变体的碳酸酐酶蛋白的酶活为0.16U/mg。
实施例6
1)将Bacillus Clausii的碳酸酐酶的233位甘氨酸和83位天冬氨酸进行突变，由赖氨酸和谷氨酸取代。
2)根据目的基因设计引物后从Bacillus Clausii细胞提取RNA，反转录得到cDNA；再利用设计的引物进行PCR和琼脂糖凝胶电泳，扩增分离得到目的基因。
3)再将基因连接至克隆载体上，转化大肠杆菌DH5α。转化子鉴定后，提取质粒；之后将其转化至大肠杆菌BL21中，并对转化子进行鉴定。
4)最后将BL21菌扩大培养，加入适当浓度的IPTG进行诱导表达；收集菌体并裂解，获取裂解液和沉淀，利用SDS-PAGE和Westernblot的方法对融合蛋白进行鉴定。
5)使用镍柱对表达的蛋白进行分离，之后进行凝胶过滤纯化。然后采用0.3mol/L盐酸胍对蛋白质进行复性。
6)在70℃进行测试碳酸酐酶应用于CO2的水合可逆反应的酶活，经计算得出，0.06mg/mL的突变体的碳酸酐酶蛋白的酶活为0.17U/mg。
实施例7
1)将Bacillus Clausii的碳酸酐酶的233位甘氨酸和83位天冬氨酸进行突变，由精氨酸和丝氨酸取代。
2)根据目的基因设计引物后从Bacillus Clausii细胞提取RNA，反转录得到cDNA；再利用设计的引物进行PCR和琼脂糖凝胶电泳，扩增分离得到目的基因。
3)再将基因连接至克隆载体上，转化大肠杆菌DH5α。转化子鉴定后，提取质粒；之后将其转化至大肠杆菌BL21中，并对转化子进行鉴定。4)最后将BL21菌扩大培养，加入适当浓度的IPTG进行诱导表达；收集菌体并裂解，获取裂解液和沉淀，利用SDS-PAGE和Westernblot的方法对融合蛋白进行鉴定。
5)使用镍柱对表达的蛋白进行分离，之后进行凝胶过滤纯化。然后采用0.3mol/L盐酸胍对蛋白质进行复性。
6)在70℃进行测试碳酸酐酶应用于CO2的水合可逆反应的酶活，经计算得出，0.06mg/mL的突变体的碳酸酐酶蛋白的酶活为0.17U/mg。
实施例8
1)将Bacillus Clausii的碳酸酐酶的233位甘氨酸和83位天冬氨酸进行突变，由精氨酸和蛋氨酸取代。
2)根据目的基因设计引物后从Bacillus Clausii细胞提取RNA，反转录得到cDNA；再利用设计的引物进行PCR和琼脂糖凝胶电泳，扩增分离得到目的基因。
3)再将基因连接至克隆载体上，转化大肠杆菌DH5α。转化子鉴定后，提取质粒；之后将其转化至大肠杆菌BL21中，并对转化子进行鉴定。
4)最后将BL21菌扩大培养，加入适当浓度的IPTG进行诱导表达；收集菌体并裂解，获取裂解液和沉淀，利用SDS-PAGE和Westernblot的方法对融合蛋白进行鉴定。
5)使用镍柱对表达的蛋白进行分离，之后进行凝胶过滤纯化。然后采用0.3mol/L盐酸胍对蛋白质进行复性。
6)在70℃进行测试碳酸酐酶应用于CO2的水合可逆反应的酶活，经计算得出，0.06mg/mL的突变体的碳酸酐酶蛋白的酶活为0.16U/mg。
实施例9
1)将Bacillus Clausii的碳酸酐酶的233位甘氨酸和83位天冬氨酸进行突变，由精氨酸和半胱氨酸取代。
2)根据目的基因设计引物后从Bacillus Clausii细胞提取RNA，反转录得到cDNA；再利用设计的引物进行PCR和琼脂糖凝胶电泳，扩增分离得到目的基因。
3)再将基因连接至克隆载体上，转化大肠杆菌DH5α。转化子鉴定后，提取质粒；之后将其转化至大肠杆菌BL21中，并对转化子进行鉴定。
4)最后将BL21菌扩大培养，加入适当浓度的IPTG进行诱导表达；收集菌体并裂解，获取裂解液和沉淀，利用SDS-PAGE和Western blot的方法对融合蛋白进行鉴定。
5)使用镍柱对表达的蛋白进行分离，之后进行凝胶过滤纯化。然后采用0.3mol/L盐酸胍对蛋白质进行复性。
6)在70℃进行测试碳酸酐酶应用于CO2的水合可逆反应的酶活，经计算得出，0.06mg/mL的突变体的碳酸酐酶蛋白的酶活为0.18U/mg。

Claims (10)

1.一种高活性碳酸酐酶，其特征在于，将Bacillus Clausii的碳酸酐酶的29位天冬氨酸、233位甘氨酸和83位天冬氨酸中的一个或一个以上进行突变。
2.根据权利要求1所述的高活性碳酸酐酶，其特征在于，所述29位天冬氨酸由谷氨酸、丝氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸或苏氨酸中的一种取代。
3.根据权利要求1所述的高活性碳酸酐酶，其特征在于，所述233位甘氨酸由组氨酸、丝氨酸、色氨酸、赖氨酸或精氨酸中的一种取代。
4.根据权利要求1所述的高活性碳酸酐酶，其特征在于，所述83位天冬氨酸由谷氨酸、丝氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸或苏氨酸中的一种取代。
5.根据权利要求1～4任一项所述的高活性碳酸酐酶的应用，其特征在于，所述的碳酸酐酶应用于CO2的水合可逆反应。
6.根据权利要求1～4任一项所述的高活性碳酸酐酶的构建方法，其特征在于，步骤如下：
步骤1：将Bacillus Clausii的碳酸酐酶进行突变；
步骤2：获得目的基因；
步骤3：获得含有目的基因的大肠杆菌BL21；
步骤4：扩大培养所述转化的大肠杆菌BL21，加入IPTG诱导表达，收集所述大肠杆菌BL21并裂解，获取裂解液和沉淀，利用SDS-PAGE和Western blot的方法对融合蛋白进行鉴定；
步骤5：使用镍柱分离表达所述融合蛋白，凝胶过滤纯化，用盐酸胍对所述融合蛋白进行复性；
步骤6：检测碳酸酐酶的酶活。
7.根据权利要求6所述的高活性碳酸酐酶的构建方法，其特征在于，在所述步骤1中，对所述Bacillus Clausii的碳酸酐酶的29位天冬氨酸、233位的甘氨酸和83位天冬氨酸中的一个或一个以上进行突变。
8.根据权利要求6所述的高活性碳酸酐酶的构建方法，其特征在于，在所述步骤2中，根据目的基因设计引物后，从所述Bacillus Clausii细胞中提取RNA，反转录得到cDNA，再利用所述引物进行PCR和琼脂糖凝胶电泳，扩增分离得到目的基因。
9.根据权利要求6所述的高活性碳酸酐酶的构建方法，其特征在于，在所述步骤3中，将所述目的基因连接至克隆载体上，转化大肠杆菌DH5α，提取质粒并转化至大肠杆菌BL21中，并鉴定含有目的基因的大肠杆菌BL21。
10.根据权利要求6所述的高活性碳酸酐酶的构建方法，其特征在于，在所述步骤5中，所述盐酸胍的浓度为0.3mol/L～0.6mol/L。
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